JPS6348453A - クロマトグラフイ−用担体及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、アフィニティークロマトグラフィーをはじめ
として各種クロマトグラフィーに利用することのできる
クロマトグラフィー用担体、及び該クロマトグラフィー
用担体の製造方法に関する。

従来の技術 クロマトグラフィー技術の１つとして、アフィニティー
クロマトグラフィーは互いに特異的に相互作用を及ぼし
合う物質対の親和性を利用して分離・精製を行なうもの
であシ、例えば生体物質をその生物学的特性即ち分子上
のある特定の化学構造を識別して精製する場合に有用で
ある。

７フイニテイ一クロマトグラフイー用吸着担体（アフィ
ニティーグル）は、例えば不溶性の担体（マトリックス
）にスペーサーを結合させて得られる活性支持体の前記
ス被−サーにリガンドを結合させたものであシ、このリ
ガンドと互いに相互作用を及ぼし合う物質の組合せを選
択して吸着操作を行なう。

リガンドと吸着目的物質の組合せとしては、例えば次の
ような組合せが挙げられる。

酵素−基質、生成物、阻害剤、補酵素。

エフェクター、 抗原−抗体、 リセプターーアゴニスト、 核酸塩基対、 レクチン−糖（蛋白）、 金属キレート−蛋白質、 疎水性基−蛋白質、 ホスト−ダスト。

アフィニティークロマトグラフィーによる分離・精製や
分析において、 前記アフィニティークロマトグラフィー用活性支持体に
望まれる性質としては、非特異的吸着が少ないこと、高
い多孔性を有すること、リガンドの結合が容易であシ固
定化可能容量が大きいこと、化学的に安定で声域、塩濃
度、温度の広範な条件下で十分安定であシ体積変化がな
いこと、十分な機械的強度と安定性を有し流動特性が良
いこと、生物学的汚染に耐えること、などが挙げられる
。

従来よシアフィニティークロマトグラフィー用吸着担体
の基材として用いられているセルロース、デキストラン
、ポリアクリルアミド、アガロース等は、必ずしもこれ
ら望まれる性質を具有していない。とシわけ、硬さが不
足した所謂ソフトダルであるため流動特性が悪く、分離
特性が良くないという重大な欠点を有し、また寿命も短
い。

更に、近年用いられているシリカビーズは、硬さの点で
は満足できるものの、アルカリ性条件下では使用できな
いため、分離条件や溶出・洗浄の条件の選択に大きな制
約が加わるという問題点を有していた。

発明が解決しようとする問題点 本発明の目的は、前記従来のクロマトグラフィー用担体
の欠点を克服して、アフィニティークロマトグラフィー
用活性支持体として望まれる前述した諸性質を千金に具
有するクロマトグラフィー用担体及びその製造方法を提
供することにある。

問題点を解決するための手段 本発明によって上記目的を達成し得るクロマトグラフィ
ー用担体及びその製造方法が提供される。

即ち、本発明は、キトサン多孔性ビーズであって、該キ
トサンを構成するグルコサミンに基くアミノ基に、また
はキトサン多孔性ビーズを架橋処理したものであって、
該キトサンを構成するグルコサミンに基くアミノ基及び
／または架橋処理剤に基くアミノ基に、ω−カルボキシ
アルカノイル基が結合され、残アミノ基がアシル化され
ていることを特徴とするクロマトグラフィー用担体に関
する。

また、本発明は、キトサン多孔性ビーズであって、該キ
トサンを構成するグルコサミンに基くアミノ基に、また
はキトサン多孔性ビーズを架橋処理したものであって、
該キトサンを構成するグルコサミンに基くアミノ基及び
／または架橋処理剤に基くアミノ基に、アルカフジカル
２ン酸無水物を作用させ、次いで残アミノ基にモノカル
ボン酸無水物またはハロダン化アシルを作用させること
を特徴とするクロマトグラフィー用担体の製造方法に関
する。

以下、本発明のクロマトグラフィー用担体、及びその製
造方法について説明する。

本発明に係るキトサン多孔性ビーズは、甲殻類や昆虫類
などの甲皮に含まれるキチンを脱アセチル化処理して得
られるポリグルコサミンよ構成るものであシ、耐酸性を
持たせる為二官能性試薬、例えばジカルボン酸及びその
誘導体、ジアルデヒド、ジイソシアナート等を用いて架
橋処理を施したものも製造されておジ、例えば粒径０．
１〜３．０瓢、孔径５００〜３０００Ｘの多孔性ビーズ
として入手が可能である。このキトサン多孔性ビーズは
、一般に数μ〜数数１０上モル当量１１のグルコサミン
に基くアミ７基または架橋処理を施したものについては
架橋処理剤に基くものも含めてアミノ基を有しておシ、
これらのアミノ基はアルカンジカルボン酸無水物を作用
させることにより、カルがキシル基を有する活性支持基
に変換することができる。

反応の溶媒としては通常水が用いられるが、その他テト
ラヒドロフラン、ジオキサンなどのエーテル類、酢酸な
どのカルボン酸類、ピリジンなども用いられる。また、
特に触媒は用いないでもよいが、塩酸、硫酸などの酸や
、水酸化ナトリウムや炭酸カリウムなどのアルカリの添
加によシ反応液の−を調整することもできる。

反応に用いられるアルカンジカルボン酸無水物としては
、コハク酸無水物、グルタル酸無水物、アジピン酸無水
物、ピメリン酸無水物、スペリン酸無水物、アゼライン
酸無水物、セパシン酸無水物、１，１０−デカンジカル
ボン酸無水物、１．１２−ドデカンノカルボン酸無水物
、１．１４−テトラデカンジカルボン酸無水物などを例
示することができる。

反応条件については必ずしも制限はないが、−般に次の
ような条件を選択して反応を行なうのが好ましい。

キトサン多孔質ビーズの重量（ａ）とアルカンジカルボ
ン酸無水物の重量（ｂ）の比： ａ　：　ｂ　＝　１　：　０．０５〜１０、よシ好まし
くは、 ａ　：　ｂ　＝　１　：　０．１〜３、反応温度二　０
〜１５０℃、よシ好ましくは室温〜１００℃、反応時間
：　１〜６０時間、よシ好ましくは１〜３０時間、反応
圧カニ常圧〜１０　ａｔｍ、よシ好ましくは常圧。

反応後の後処理についても特別な要件は無く、Ｆ別、洗
浄等通常行なわれている方法にて適宜実施される。

以上によシ得られた力、ＶＺキシル基を有するキトサン
多孔質ビーズは、次いでモノカルボン酸無水物またはハ
ロゲン化アシルを作用させることによシ残余のアミノ基
をアシル化することができる。

このときの反応の条件は、前述のアルカンジカルボン酸
無水物の場合と同様にして行うことができるが、アシル
化剤としてハロゲン化アシルを用いる場合は溶媒として
は水板外のものを用いた方がよく、また触媒としてはア
ルカリが好ましい。

反応に用いられるモノカルボン酸無水物としては、無水
酢酸、無水プロピオン酸、無水酪酸などが例示され、ま
た、ハロダン化アシルとしては、塩化アセチル、臭化ア
セチル、塩化グロピオニル、塩化ブチリルなどを例示す
ることができる。

発明の効果 本発明によシ提供されるクロマトグラフィー用担体は、
既に結合されているカルがキシル基を有する活性支持基
を介してアフィニティクロマトグラフィー用配位子（リ
ガンド）を容易に共有結合させることが可能であシ、従
って７フイニテイクロマトグラフイー用の水不溶性活性
支持体として非常に有用なものである。

その上、前述したアフィニティークロマトグラフィー用
活性支持体に望まれる性質については、本発明に係るキ
トサン多孔質ビーズのもたらす親水的性質は例えば蛋白
質等と接触する際の疎水的非特異的吸着を抑え、またそ
の有孔構造はリガンドと吸着目的物質の相互作用の発現
に有利に作用しうろことが明らかである。

また本発明によシ提供されるクロマトグラフィー用担体
は、キトサン多孔質ビーズの有するアミノ基を完全にア
シル化することによシ、例えば蛋白質等と接触する際の
イオン的な非特異的吸着をも排除している為、リガンド
と吸着目的物質の選択性を更に高めたものとすることが
できる。

更に本発明により提供されるクロマトグラフィー用担体
は、化学的に中性で安定な共有結合によシリガントを結
合せしめうる為、通常供せられる臭化シアンやグルタル
アルデヒドを用いたものに比してアフィニティクロマト
グラフィー用吸着担体として目的物質の分離、溶出およ
び洗浄の条件下で全く何らの影響を受けることがないこ
とは大きな利点となる。これらの性質は特に高速アフィ
ニティクロマトグラフィー用の担体及び工業的分離精製
プロセス用の担体としては欠くべからざるものであシ、
本発明によシ提供されるクロマトグラフィー用担体の効
果は非常に大きい。

実施例 本発明によシ提供されるクロマトグラフィー用担体は、
前述の如くアフイニティクロマトグラフィー用の活性支
持体として有用なものであるが、以下に本発明のクロマ
トグラフィー用担体の製造法について代表的な例を示し
、更に具体的に説明する。但し、これらは説明の為の単
なる例示であって、本発明はこれらに何ら制限されない
ことは言うまでもない。

実施例１ 粒径０６１ｍのキトサン多孔性ビーズ（商品名ショウデ
ックスキトノセール、芳香族系架橋品）１．ＯＩに無水
グルタル酸１．０ｇの水５−における溶液を加え、４規
定水酸化ナトリウム水溶液を加えて−を６に調整した後
、室温で一日振盪した。ビーズを戸数し、０．１規定炭
酸水素ナトリウム水溶液、０．１規定塩酸及び水の順に
洗浄した。次いで、ビーズに０．２モル酢酸ナトリウム
水溶液５−を加え、無水酢酸０．５ｇを加えた後、室温
で２時間振盪した。ビーズを戸数し大量の水で洗い乾燥
させた。

コノビーズはトリニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム
による比色法でアミノを含まないことが確められた。中
和滴定によるカルボン酸の定量値は乾燥ビーズ１ｇ当り
０．３５ミリモルであった。

実施例２ 粒径０．３簡のキトサン多孔性ビーズ（商品名ショウデ
ックスキトノソール、脂肪族系架橋品）１．ＯＪに無水
コハク酸０．１１のジオキサン５づにおける溶液を加え
、次いでピリジン０．１ｇを加えて室温で６時間振盪し
た。ビーズを戸数口、ジオキサンで洗浄した後、塩化ア
セチル０．５Ｆのジオキサン５Ｔｎｔにおける溶液を加
え、トリエチルアミノ０．５ｇを加えて室温で３０分振
盪した。ビーズをＦ取しジオキサンで洗浄した後、大量
の水で洗い乾燥すせた。このビーズはトリニトロベンゼ
ンスルホン酸ナトリウムによる比色法でアミノを含まな
いことが確められた。中和滴定によるカルボン酸の定量
値は乾燥ピーズ１ｇ当、？０．８０ミ’、１モルであっ
た。

参考例１ 実施例１によシ得られたビーズ１．ＯＦを無水ジオキサ
ンで充分洗浄した後、無水ジオキサン４　ｍｌ中に加え
、更にＮ−ヒドロキシコハク酸イミド８０１Ｍ９及びジ
シクロへキシルカルボジイミド１４４■を加えて室温で
２時間振盪した。次いでビーズを戸数し無水ジオキサン
２０−、メタノール６ゴ、冷水３ｍｌの順で素早く洗浄
した。このビーズをコンカナバリンＡ　３０７ｎ９及び
メチル−α−マンノピラノシド４０１ｎ９の０．１ミリ
モル塩化カルシウム、０．１ミりモル塩化マンガン及び
ｏ、ｏｉモル炭酸水素ナトリウムの水２−による溶液に
加え、室温で２時間振盪後、４℃で１夜放置した。ビー
ズを戸取し、１モル塩化ナトリウム水溶液及び水で洗浄
した後、１モルトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）２−
に加え室温で１時間振盪した後、再びビーズを戸数して
水洗した。こうして得られた吸着担体は乾ｆｆｌビーズ
１ｇ当シコンカナバリンＡを１５ｍ９担持させているこ
とが未反応による回収コンカナバリンＡの量から確かめ
られた。

参考例２ 実施例２により得られたビーズについて参考例１のコン
カナバリンＡ３０■の溶液の代りに、プロティンＡ１０
ｍ９の０．０１モル炭酸水素ナトリウムの水２ｒｎｌＫ
おける溶液を用い、その他は同様の操作を行うことによ
り、乾燥ピーズ１ｇ白シプロナインＡを６．　Ｏｒｎ９
担持させている吸着担体を得ることができた。

特許出臥　昭和電工株式会社

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）キトサン多孔性ビーズであって、該キトサンを構
   成するグルコサミンに基くアミノ基に、またはキトサン
   多孔性ビーズを架橋処理したものであって、該キトサン
   を構成するグルコサミンに基くアミノ基及び／または架
   橋処理剤に基くアミノ基に、ω−カルボキシアルカノイ
   ル基が結合され、残アミノ基がアシル化されていること
   を特徴とするクロマトグラフィー用担体。
2. （２）キトサン多孔性ビーズであって、該キトサンを構
   成するグルコサミンに基くアミノ基に、またはキトサン
   多孔性ビーズを架橋処理したものであって、該キトサン
   を構成するグルコサミンに基くアミノ基及び／または架
   橋処理剤に基くアミノ基に、アルカンジカルボン酸無水
   物を作用させ、次いで残アミノ基にモノカルボン酸無水
   物またはハロゲン化アシルを作用させることを特徴とす
   るクロマトグラフィー用担体の製造方法。