JPS633799A - 菌体外分泌による蛋白質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の背景） 〔従来技術〕 本発明は、遺伝子工学的手法を利用した菌体外分泌によ
る蛋白質の製造法に関する。

さらに具体的には、本発明は、アルカリ性ホスファター
ゼ由来のプロモーターをコードする遺伝子を具備すると
共に、その制御下にシグナル配列をコードする遺伝子を
も具備したベクターに、所望外来性蛋白質をコードする
遺伝子を組込んで組換ＤＮＡとし、これを宿主微生物（
以下微生物を単に「菌」と記すこともある）細胞内に移
入させることにより宿主の形質転換を行って形質転換体
を得て、これを−定条件下で培養することにより所望蛋
白質を宿主菌体外（培地中）に分泌させたのち、培地中
から所望蛋白質を回収することよりなる遺伝子工学的手
法による蛋白質の製造法に関する。

（先行技術） 現在、組換えＤＮＡ技術によって遺伝子工学的に有用物
質を生産する方法が確立されつつあり、具体的な方法に
ついては種々の成田や文献、公開特許公報および特許公
報を参照することができる。

このような手法による物質の生産方法は、通常、ベクタ
ーに所望物質をコードする遺伝子を組込んで造成した組
換えＤＮＡを用いて宿主微生物を形質転換し、得られた
形質転換体を培養したのち、所望物質を回収することよ
りなるものである。

このような方法によって非分泌性の蛋白質の生産を行う
場合は、微生物細胞内で産生された蛋白質は宿主菌のプ
ロテアーゼによって分解（ＰｒＯＣ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　７９．１
８３０−１８３３＜１９８２）　）される恐れがあるの
で所望蛋白質を安定かつ人世に得ることができないとい
う問題点があった。また、このような非分泌性の蛋白質
を回収するに際しては宿主微生物を物理的に破壊したの
ち、所望蛋白質の分離・精製を行うのであるから、−般
にこのような回収操作は複雑であり、そのため所望蛋白
質の収率が低かったり、活性を有するものは回収操作中
に失活する恐れもあるという問題点があった。そこで、
上記問題点に対処すべく、蛋白質の膜通過に関与するシ
グナル配列（蛋白質・核酸・醇素、２６．３８６〜３９
４　（１９８１））の作用を利用して、宿主微生物細胞
内で産生きれた蛋白質を細胞外あるいは細胞質膜外に分
泌させる方法が種々提案されたく特開昭５５−１９０９
２号、同５５−４５３９５号、同５６−１３７８９６号
、同５６−１４５２２１号、同５６−１５４９９９号各
公報等）。

ところで、上記シグナル配列を利用した遺伝子工学的手
法による蛋白質の製造において組換えＤＮＡが移入され
得る宿主微生物は、大腸菌が普通である。この大腸菌は
ダラム陰性菌であって、このような菌には細胞質膜およ
び外股がある（これらの膜間をペリプラズムという）と
ころ、このような菌に組換えＤＮＡを移入させて形質転
換体としてこの形質転換体を通常の培養に付すと、所望
蛋白質はべりブラズムに蓄積される。このペリプラズム
に蓄積された蛋白質は、オスモティック・ショック法（
Ｊ、　Ｒｉｏｔ、　Ｃｈｅｔ　２４０．３８６５（１９
６５））によってペリプラズムから菌体外へ放出させな
ければ回収することができない。このオスモティック・
ショック法は、まず遠心により菌体を回収したのち、こ
れを高濃度ショ糖液〔２０％シュークロース、３０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液（ＤＨ８，０）、１ｍＭエチレンジア
ミン四酢酸（ＥＤＴＡ））に懸濁させてから集菌し、さ
らにこの菌体を冷水に懸濁させ、そして水浴中で放置す
ることにより所望蛋白質を含む画分を菌体外に放出させ
、ついで遠心により上清（所望蛋白質を含む）を得る、
という方法である。そして所望蛋白質を回収するには、
さらにクロマトグラフィー等によってこの上清を処理す
ることになる。このように、従来から大腸菌のようなダ
ラム陰性菌を宿主とし、これに蛋白質の分泌様能を具備
した組換えＤＮＡを移入させて形質転換体を得て、これ
を培養することミニより所望蛋白質を生産させるという
方法は、ダラム陽性菌（枯草菌、酵母菌等）を宿主とし
た場合に比べ余分な処理操作（オスモティック・ショッ
ク法）が必要となる。

しかしながら、ダラム陽性菌を宿主とする場合は、ダラ
ム陰性菌に認められる上記のような問題点はないとして
も、菌体内に移入された組換えＤＮＡの安定性に問題点
を有する上、大腸菌はど宿主−ベクター系も開発されて
おらず、また菌の取扱いも大腸菌はど容易でない。

一つの解決策 従って、大腸菌のような一般的な菌株を宿主とし、効率
よくしかも大過に所望の蛋白質を製造すべく、本発明者
らは種々検討を重ねた結果、以下のような方法を確立し
ている。すなわち、その方法は、アルカリ性ホスファタ
ーゼ由来のプロモーターをコードする遺伝子（以下プロ
モーター遺伝子という）を具備し、その制御下にシグナ
ル配列をコードする遺伝子（シグナル遺伝子）をも具備
したベクターに、所望の外来性蛋白質をコードする遺伝
子（外来性蛋白質の構造遺伝子）を組込んで組換えＤＮ
Ａを造成し、この組換えＤＮＡを宿主微生物細胞内に移
入させて形質転換体となし、この形質転換体を一定条件
下で培養することによって所望蛋白質を菌体外（培養液
中）に分泌させ、これを回収する、という遺伝子工学的
手法による蛋白質の製造法である（特願昭６０−９５１
８１号および同６０−１２１２４９号の明細書参照。

以下、これらを「先願発明」という。）。

この方法は前記の問題点を解決したものとして有用なも
のであるが、技術というものの通性としてこの先願発明
もまた更なる改良と対象となりうる。

〔発明の概要〕

本発明は、上記先願発明の培養工程においてその培養条
件中、温度をシフトすることにより、所望蛋白質の産生
効率が向上することを見出して完成されたものである。

従って本発明による菌体外分泌による蛋白質の製造法は
、下記（Ａ）〜（Ｄ）の工程よりなること、を特徴とす
るものである。

（Ａ＞　　アルカリ性ホスファターゼ由来のプロモータ
ーをコードする遺伝子を具備すると共にその制御下にシ
グナル配列をコードする遺伝子をも具備し、かつ予定し
た宿主微生物細胞内で増殖可能なベクター、を用意する
こと。

（８）　　上記ベクターに外来蛋白質をコードする遺伝
子を組込んで組換えＤＮＡを造成し、ついでこの組換え
ＤＮＡを宿主微生物細胞内に移入させることにより宿主
の形質転換を行って、形質転換体を得ること。

（Ｃ）　　上記形質転換体を、微生物の増殖過程におけ
る対数増殖期後期から停止期前期にかけて蛋白質合成能
の誘導がおこるに必要な吊の無機燐を含有する培地での
培養に付し、その際に蛋白質合成能の誘導が起る前は低
温域で、蛋白質合成能誘導後は高温域で培養を行って、
両培養温度差が少なくとも４℃となるようにすること。

（Ｄ）　　上記培養終了後、培地中より産生外来性蛋白
質を回収すること。

効　　果 このように本発明は、ダラム陰性菌（大腸菌）を用いた
遺伝子工学的手法による蛋白質の造成にあたり、従来の
ように所望蛋白質をペリプラズムに留めることなく菌体
外（培地中）への分泌を行わせるべく、（イ）アルカリ
性ホスファターゼ由来のプロモーター遺伝子を具備し、
その制御下にシグナル遺伝子をも具備するものであって
、かつ（ロ）予定した宿主細胞内で増殖可能なベクター
を用意し、ついでこれに所望の外来性蛋白質の構造遺伝
子を組込んで組換えＤＮＡとし、これを宿主菌に移入さ
せることによって形質転換体を得て、これを−定条件下
（前記の工程（Ｃ）で）培養することにより所望蛋白質
を菌体外（培地中）に分泌させ、これを回収することか
らなる遺伝子工学的手法による蛋白質の製造方法に関す
るものである。

本発明の好ましい態様は、上記（イ）および（ロ）より
なるベクターが、そのシグナル遺伝子の下流側末端直後
に所望の外来性蛋白質の構造遺伝子を結合し得るように
仕組まれたものを用いる方法である。そして、シグナル
遺伝子の直後に外来性蛋白質の構造遺伝子の導入を容易
にしようとするならば、シグナル遺伝子の塩基対の少な
くとも一つを構成員の少なくとも一部として人工的に創
出された制限酵素認識部位を有するものを用いるとよい
。

この制限酵素ＷＸ識部位を創出するに当っては、ＤＮＡ
塩基対からなるコドンには縮重があるということを巧み
に利用することができる。すなわち、創出された制限酵
素認識／切断部位を該制限酵素で切断すれば、その切断
部位がシグナル遺伝子の下流側末端に接して存在する場
合は、該制限酵素切断端と相補性の端部を上流側に形成
させた外来性遺伝子を用意してこれを上記切断端におい
てシグナル遺伝子と結合させることによってシグナル遺
伝子の下流側に外来性遺伝子を直結させることができる
。また、シグナル遺伝子の切断部位が該遺伝子の下流側
末端より上流側に存在する場合は、該遺伝子の該切断部
位より下流側の部分を合成して外来性遺伝子の上流側に
結合した断片を用意して上記と同じ結合を行えば、−旦
切断されたシグナル遺伝子がＤＮＡの両鎖について復元
されると共にその下流側に外来性遺伝子が直結された構
造゛が実現される（詳細後記）。

このようなベクターに所望外来性蛋白質の構造遺伝子を
組込んで組換えＤＮＡとし、この組換えり、ＮＡで宿主
菌を形質転換して形質転換体を得て、これを−定条件下
（本発明の工程（Ｃ）により）で培養すれば、宿主菌が
大腸菌のようなダラム陰性菌であっても、所望蛋白質は
べりブラズムに蓄積することなく菌体外（培養液中）ま
で分泌される。そして培養中から所望外来性蛋白質を回
収することにより本発明目的が達成される。

従って、本発明は、下記の利点を有するものである。

（１）　遺伝子工学的手法による蛋白質の製造・回収工
程が簡素化される。

本発明の方法に従えば、上記（イ）および（ロ）の要件
を満すベクターに所望の外来性蛋白質の構造遺伝子を組
込んでなる組換えＤＮＡで宿主微生物を形質転換して形
質転換体を得てこれを培養すれば、所望蛋白質は成熟蛋
白質として（シグナル配列は蛋白質がペリプラズムに分
泌されるときに切断されている）培養液中まで分泌され
る。すなわち、形質転換された宿主微生物をオスモティ
ック・ショック法に付すことなく、培養液中から蛋白質
を回収するだけでよいのである。従って、遺伝子工学的
手法による蛋白質の製造・回収工程が簡素化されること
になる。

なお、本発明方法はダラム陽性菌にも適用されるのであ
るが、枯草菌のようなダラム陽性菌はべりプラズムがな
いので、本発明の方法に従えば所望蛋白質は培養液中に
まで分泌されるということはいうまでもない。

（２）　所望蛋白質の精製が容易である。

本発明の方法に従えば所望蛋白質は培養液中まで分泌さ
れ、その分泌の際にシグナル配列は膜酵素によって切断
されるのでシグナル配列が付着していない蛋白質が得ら
れる。ここで得られる蛋白質は、シグナル配列をコード
する遺伝子と所望蛋白質をコードする遺伝子との間に余
分な遺伝子（リンカ−としてＤＮＡＩ伝子）が存在すれ
ば、余分なアミノ酸を付着したままで分泌される。しか
しながら、本発明の一興体例で示されたようにシグナル
配列をコードする遺伝子の直後に所望蛋白質をコードす
る遺伝子を結合しておけば、所望蛋白質は余分なアミノ
酸が付着することなく完全な成熟蛋白質として培養液中
に分泌される。従って、形質転換体の培養を菌体が溶菌
していない時ＩＩに終了しておけば、培養液中には実質
的に所望蛋白質および培ｈａの構成成分のみが存在■る
ことになる。使用した培養液はその構成成分が判ってい
るのであるから、従って、目的蛋白質の精製は容易であ
る。

（３）　先願発明よりも蛋白質の生産効率がよい。

先願発明の工程（Ｃ）において培養温度を培養中にシフ
トすることにより生産効率の向上（先願発明の１．５〜
２倍）が実現した。

〔発明の詳細な説明〕

本発明は菌体外分泌による蛋白質の製造法に係るもので
あるところ、この方法は工程（Ａ）〜（Ｄ）よりなるも
のである。

工程（Ａ）／ベクターの用意 本発明に用いるベクターは、本発明の工程（Ｃ）におけ
る培養方法が、アルカリ性ホスファターゼが無機燐の存
在量により影響を受ける（　８ｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、３８．４６０（１９６０
））、Ｎａｔｔｌｒｅ、　１８３　。

１５２９（１９５９）　）という事実を利用するもので
あるところから、アルカリ性ホスファターゼ由来のプロ
モーター遺伝子を具備することが要件であり、そして、
さらに、蛋白質の分泌に関与するシグナル遺伝子をその
制御下に具備するものであり、また、予定した宿主細胞
内で増殖可能なもの（前記（イ）および（ロ）の要件を
満すベクター）であればよい。

そして、このようなベクターとして特に好ましいものは
、（イ）および（ロ）の必須要件を具備したうえ、シグ
ナル遺伝子の下流側末端直後に所望の外来性蛋白質の構
造遺伝子を結合させ得るように仕組れたものである。

この好ましいベクター（プラスミド）の具体例としては
、本発明者らの共同研究者によって先に提案されたプラ
スミドｐＴＡ５２９　（特願昭５８−１４０７４８号）
、ｏＴＡ１５２９　（特願昭５９−１５９７０３号）、
ｐＴＡ２５３９　（特願昭５９−２７９５８５号）等が
ある。これらのプラスミドはいずれもアルカリ性ホスフ
ァターゼ由来のプロモーターおよびシグナル配列（前二
者についてはアルカリ性ホスファターゼ由来、ｐＴＡ２
５３９はβ−ラクタマーゼ由来）を具備するものであり
、かつシグナル配列をコードする遺伝子の直後に外来性
蛋白質の構造遺伝子の結合が可能なものである。ここで
ｐＴＡ１５２９は、ｐＴＡ５２９［）ＹＫ２８３（Ｅ、
ｃｏｌｉ　　Ｋ１２Ｃ６００（ｐＹＫ２８３＞として微
工研に寄託（微工研条寄第５５６号）〕をもとにしてこ
れを組換ＤＮＡ技術において慣用されている方法（特に
、特願昭５８−１４０７４８号の明１Ｂ書に記載の方法
）に従って造成したもの）とｐＨ８１（このプラスミド
は、ｐＢＲ３２２（Ｅ、ｃｏ　Ｉ　１Ｋ１２Ｃ６００（
ＤＢＲ３２２）として微工研に寄託（微工研条寄第２３
５号）〕をｖ１限酵素ＥＣ０ＲＩおよびＨｉ　ｎｄｌ［
［で消化し、この　ＩＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄｌ［［部分
を下記の塩基配列（Ｉ）で示される合成リンカ−と置換
したもの（特開昭５９−７１６９２号公報参照））とか
ら造成したものである。このプラスミドの造成操作の詳
細は特願昭５９−１５９７０３号の明細書を参照された
い。

ＥｃｏＲＩ　　　８１）ａ　Ｉ　　　５Ｉｌａ　Ｉ　　
　Ｈｉｎｄ　１１！（Ｉ＞ ここで破線は制限酵素切断部位を示し、ＥＣＯＲ工等は
その切断を行う制限酵素の名称を示す。

また、ｐＴＡ２５３９は、ｐＴＡ１５２９のアンピシリ
ン耐性遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子に変換し、さら
にシグナル配列をβ−ラクタマーゼ由来のものに変換し
たプラスミドである。このプラスミド造成の詳細は、特
願昭５９−２７９５８５号の明１８書を参照されたい。

ここでｐＴＡ１５２９は下記の塩基配列（Ｉｔ）からな
るＤＮＡ部分を含むので、シグナル遺伝子の直後に外来
性蛋白質の構造遺伝子の結合が可能なプラスミドである
。

配列（ＩＩ）はシグナル遺伝子部分（１）とその下流側
に結合されたＤＮＡ部分（２）とからなっているが、本
発明の一実施態様でいう「シグナル配列をコードする遺
伝子の下流側末端直後に所望外来性蛋白質をコードする
遺伝子を結合させ得るよ〜うに仕組れたもの１とは、こ
のようなりＮＡ部分を含むものである。なお、本発明に
おいてＤＮＡに関して「下流側」というときは、５′→
３′鎖（■鎖）を上に３′←５′鎖（Ｏ鎖）を下に表示
したときの右側を意味する。

ｍ基配列（Ｉｆ）は、二本鎖ＤＮＡからなるＤＮＡ３！
伝子の一部を示すものであって、Ａ、Ｇ。

ＣおよびＴはそれぞれアデニン、グアニン、シトシンお
よびチミンを示しく前記の（Ｉ）も同様）、ＬｙＳＳＡ
　＋　ａおよびＴｒｐはそれぞれリジン、アラニンおよ
びトリプトファンを示す。この二本鎖ＤＮＡの区域（１
）はシグナル遺伝子部分であり、区域（３）はυ１限肝
素Ｈｉ　ｎｄｌｌｌの認識部位であり、破線はＨｉｎｄ
ｌ［［切断部位である。区域（２）は、シグナル遺伝子
の下流側の直後に結合されたＤＮＡ部分である。

本発明に用いるベクターは、シグナル遺伝子がアルカリ
性ホスファターゼ由来であるものである。

この遺伝子の塩基配列は、下流側末端のアラニンのコド
ンがＧＣＣである。

一方、上記塩基配列（Ｉ）は、アルカリ性ホスファター
ゼ由来の遺伝子の部分（１）の下流側末端のアラニンの
コドンＧＣＣをＧＣＴに、ざらに統（塩基Ｃ′をＴに改
変したものに相当する。アラニンのコドンには縮重があ
るから、改変後のＧＣＴもアラニンのコドンであり、従
って上記（ＩＩ）のＤＮＡ部分（１）は依然としてアル
カリ性ホスファターゼ由来のシグナル遺伝子に対応する
ＤＮＡである。

ところで、アルカリ性ホスファターゼ由来のシグナル遺
伝子は、その下流側末端のアラニンのコドンの上流側に
リジンのコドンＡＡＡおよび下流側にアルギニンのコド
ンＣＧＧを有する。

従って、アルカリ性ホスファターゼ由来のシグナル遺伝
子が本来布していた下流末端のアラニンのコドンＧＣＣ
をＧＣＴ４Ｃ改変し、さらにアラニンに統く塩ＭＣをＴ
に改変したことによって、この末端の塩基対と上流側の
４塩基対および下流側の１塩基対とで制限酵素Ｈｉｎｄ
ｎｌの認識部位（３）ＡＡＧＣＴＴが現出している。す
なわち、シグナル遺伝子には、少なくとも該末端の塩基
対を構成員の少なくとも一部とする制限酵素認識部位が
創出されている訳である。

ｐＴＡ１５２９の上記（ＩＩ）の具体例では、）１ｉｎ
ｄＩＩＩの認識部位（３）内の切断部位は破線で示した
通りであって、その位置はシグナル遺伝子とその下流側
直後に結合されていることあるべきＤＮＡ部分く上記ｐ
ＴＡ５２９に係る塩基配列（ＩＩ）では、既に結合され
ている区域（２））との間に存在している（切断部位の
位置は、二本鎖ＤＮＡの下流側のそれを意味する）。Ｉ
ＩＩ限酊素切断部位がこのような位置に存在することは
、本発明に用いるベクターにおいて最も好ましいことで
ある。何故ならば、この切断部位はそれを利用して外来
性蛋白質の構造遺伝子をこのシグナル遺伝子が発現して
生じる雑種ないし融合蛋白はシグナル配列とそれに続く
蛋白との間でシグナル・ペプチダーゼよって切断される
のであるから、制限酵素切断部位とシグナル・ペプチダ
ーゼ切断位置とがこのように一致していれば、上記ＤＴ
Ａ１５２９の例でいえば外来性蛋白質の構造遺伝子（こ
の例では、ＴｒｐののコドンＴＧＧで始まつている）の
■鎖の５′○側にＡＧＣＴを補なっておくだけで、Ｈｉ
ｎｄｌ消化後のシグナル遺伝子の粘着末端との間の結合
が可能だからである。なお、外来性遺伝子のｅ鎖の３′
　−側にも塩基を補なうことを厭わなければ、制限酵素
切断部位が上流側に存在してもよいことはいうまでもな
く、そのような切断部位の存在するベクターもまた本発
明に用いられる範囲内である。

「シグナル配列をコードする遺伝子」は、−般にシグナ
ル配列の種類に応じて各種の塩基配列のものがある。シ
グナル配列の具体例をいくつか挙げれば、β−ラクタマ
ーゼのもの（Ｐｒｏｃ、　Ｈａ口。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７５．３７３７
（１９７８））　、リボ蛋白のもの（同上、７４．１０
０４（１９７７））　、アルカリ性フォスファターゼの
もの（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｔ　　９６．４９
（１９７９）　）等がある。シグナル配列については、
「蛋白質・核酸・酵素」臨時増刊号（「遺伝子操作」）
、第２６巻、第４号、第３８６−３９４頁、を参照する
ことができる。しかしながら、本発明で使用する好まし
いシグナル配列は、アルカリ性ホスファターゼの塩基配
列のものおよびβ−ラクタマーゼ由来のものである。こ
のようなシグナル配列を具備する上記プラスミドであれ
ば、本発明の工程（Ｃ）の培養方法を利用することによ
り前記したような利点が得られるからである。

上記（ＩＦ）に示した本発明に用いプラスミド（ベクタ
ー）が具備するＤＮＡ遺伝子の一興体例は、アルカリ性
ホスファターゼ由来のＤＮＡを改変してつくったもので
あるから、シグナル遺伝子ＤＮＡの部分（１）の下流側
末端直後にアルカリ性ホスファターゼ由来のＤＮＡ部分
（２）が結合している。本発明の具体例は、このＤＮＡ
部分（２）が外来性蛋白質をコードする遺伝子に対応す
るＤＮＡ部分であるものである。

なお、この具体例の範躊に属する本発明に用いるプラス
ミドが具備するＤＮＡ遺伝子の一例は、シグナル遺伝子
部分が天然物由来の部分と合成された部分とからなるも
のである。すなわち、制限酵素切断部位より上流側が天
然物由来の部分であり、下流側が合成されたものである
。この場合の下流側の合成された部分は上記（■）した
ような切断部位の位置の場合には■鎖の４塩基（ＡＧＣ
Ｔ）であるが、切断部位がこれより上流側に存在すれば
Ｏ鎖にも合成部分が必要となることはいうまでもない。

工程（Ｂ）／形質転換体の造成 微生物の形質転換は、組換えＤＮＡ技術の分野における
公知の常法に従って行うことができる。

例えば、上記プラスミドに所望外来性蛋白質の構造遺伝
子を組込んで組換えＤＮＡ　（キメラプラスミド）とし
、これを用いて微生物を公知の方法〔例えシクシュナー
法（ＧｅｎｅｔｉＣＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、凹、１７
（１９７８））　）に従って形質転換したのち、所望の
形質転換体を取得（通常はプラスミドのマーカーを利用
する）する合目的的な任意の方法によって行うことがで
きる。

本発明によるこのようなキメラプラスミドによって形質
転換しつる微生物は、その菌体内で上記プラスミドが増
殖しうるちのであればよく、具体的には大Ｉ！菌、枯草
菌および醇母菌等がある。なかでも大腸菌が比較的よく
利用されており、そして本発明は大腸菌のようなダラム
陰性菌を宿主菌として用いるときに特に前記したような
効果を有するものである。大腸菌としては、例えば、Ｅ
、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２　　Ｃ６００（微工研条寄第１１
５号）、Ｅ、Ｃｏ１１　　Ｋ１２　　ＹＫ５３７（微工
研菌寄第７９４１号）、Ｅ、ｃｏｌｉＲＲｌ　（ＡＴＣ
Ｃ３１４４７）およびＥ。

ｃｏｌｉ　　ＨＢｌｏｌ（ＡＴＣＣ３３６９４）等があ
る。本発明の具体例では、Ｅ、ｃｏｌｉＫ１２　　ＹＫ
５３７を用いている。

本発明において使用したこのような形質転換体の具体例
は、プラスミドＥ）ＴＡ１５２９．（前記）に人工的に
合成したｈＥＧＦ　（後記）の構造遺伝子を組込んでキ
メラプラスミドｐＴＡ１５２２を造成し、ついでこのキ
メプラスミド（組換えＤＮＡ）を宿主菌Ｅ、ｃｏｌｉ　
　Ｋ１２　　ＹＫ５３７に移入させることにより造成し
た形質転換体Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２　　ＹＫ５３７（
ｐＴＡ１５２２）、Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＲＲＩ（ｐＴＡ１
５２２）およびＥ、ｃｏｌｉ　　ＨＢＩＯＩ（ＤＴＡ１
５２２）である。

なお、上記プラスミドに組込む所望外来性蛋白質をコー
ドする遺伝子としては、ホルモン、免疫関連物質、神経
ペプチドおよび酵素等のものが考えられる。これらの構
造遺伝子の調製方法としては、天然の染色体ＤＮＡより
取得する方法や、あるいは人工的に合成する方法等が考
えられ、実際の構造遺伝子の調製方法については棒々の
成書や文献を参照することができる。

本発明の一興体例においては、このような外来性蛋白質
の構造遺伝子としてヒト上皮細胞成長因子（ｈＥＧＦ／
ｈＵＧ、以下ｆｉＥＧＦと記す）をコードする遺伝子で
あって化学的に合成したもの（合成の詳細は特願昭５８
−１２３５２０号の明細書参照のこと）、を用いた。

工程（Ｃ）／微生物の培養 本発明の工程（Ｃ）による培養は、アルカリ性ホスファ
ターゼ由来のプロモーターを具備するベクター（プラス
ミド）に所望の外来性蛋白質の構造遺伝子を組込んでキ
メラプラスミド（組換えＤＮＡ）とし、これを宿主微生
物に移入させることにより形質転換した微生物の対象と
するものである。

そして、本工程の培養方法の特徴は、形質転換された微
生物が保持しているベクター（プラスミド）の性質、す
なわち無機燐量に依存して蛋白質合成能に誘導がかかっ
たり、かからなかったりする性質（前記Ｂ１０Ｃｈｅ１
．　Ｂ１０Ｅ）ｈｙｓ、　ＡＣｔａ、およびＮａｔｔｌ
ｒｅ）　、を巧みに利用して、単一の培養系において微
生物の増殖とそれに続く微生物による蛋白質誘導とをお
こなわせ、しかも培養途中で培！！温度を低温域から高
温地域ヘシフトさせることにより、所望蛋白質の産生効
率の向上を図るということである。

このような培養方法の詳細は、下記の通りである。

１）　培養法 本工程による微生物の培養方法は、典型的には、形質転
換された微生物を単細胞純粋分離培養し、ついで前培養
に付したのち（以上は微生物を培養する場合の公知の常
法であり、多数の文献や底置を参照することができる。

例えば、成占「微生物学実験法」　（講談社刊）、「微
生物実験法」　（共立出版刊）、「細胞学実習提要」　
（丸善刊）等がある。）、単一の培養系においてその培
養を行うことからなるものである。

この単一の培養系は通気撹拌培養の範躊に属するもので
あって、具体的には、培養系において菌を接種したのち
培地に無菌空気（必要に応じて純酸素を混入したもの）
を導入し、これを物理的に撹拌しつつ、ｐＨ，温度、溶
存酸素濃度等を、培養する微生物の生育条件に適合させ
て好適な条件下に維持しながら培養を行うことからなる
。

このような培養は通常はジャーファーメンタ−を用いて
行われ、そして適当なスケールアップが可能であること
はいうまでもない（底置「生物化学工学」　（上）、（
下）巻く東京大学出版会）参照〕。

２）　　培　　地 本工程に用いる培地組成は、ＬＢ培地（トリプトン、酵
母エキス、ＮａＣ１）を基本培地とし、必要に応じて他
の成分（例えばＭａＳＯ４・　、７Ｈ２０，抗生物質等
）を添加したものであって、さらに形質転換された微生
物の増殖過程における対数増殖期後期から停止期前期に
かけて蛋白質合成能の誘導を起すに必要充分口の無機燐
を含有するものより構成される。また、必要に応じて添
加する抗生物質として、本発明の具体例ではアンピシリ
ンを添加している。本発明の具体例において形質転換体
が保持しているプラスミドは、アンピシリン耐性遺伝子
を具備していて、形質転換体はアンピシリン耐性となっ
ている。従って、培養中でプラスミドが親藩した菌（耐
性がない）は培地中のアンピシリンによって成育が抑制
されるので、プラスミドを保持している宿主菌のみが成
育することになる。このように、培地への抗生物質の添
加は、宿主菌の生育上の便宜を図るための一手段である
。

３）　培養条件 （１）　培養温度 培養温度は、使用する微性物（形質転換体）の増殖また
は生育がＭ≠可能でかつ産生物が安定である範囲内の温
度であればよい。

本発明によれば、この温度範囲内において、培養温度？
低温域から高温域ヘシフトさせる。両温度域での培′７
！ｉ温度の差は、少なくとも４℃であるべきである。

ここで低温域とは、中温菌の場合は、２５℃〜３５℃程
度の範囲内であり、高温域とは３２℃〜４２℃程度の範
囲内をいう。例えば、本発明の一実施例において用いら
れた形質転換体が大腸菌のような場合は、低温域として
３０℃付近が好ましく、高温域としては３７℃付近が好
ましい。

そして、低温域から高温域へのＰＪ差温度のシフトは、
蛋白質の合成能の誘導の観点から行う。すなわち、蛋白
質の合成能の誘導が起る前は低温域で培養し、誘導後は
培養温度を高温域へ移行させる。培養温度を低温域から
高温域への移行は、培養液の熱容量が許す限り急速に行
うことが望ましい。そのための手段は任意のものであり
うるが、一つの手段は培養槽の外部熱媒体の温度を急速
に上昇させることである。他の手段としては、培養液を
低温培養槽、から高温培養槽へ移動させることである。

各温度域での培養温度は、微生物培養の常法に従えば実
質的に一定に保つことがふつうである。

培養温度シフトの時期の判断は、培養液中の無機燐量を
モニターすることによって行うのが便利である。すなわ
ち、培養開始より無機燐量を経時的に定量していき、そ
の量が最小になるまで（本発明の一実施例では約９時１
！りは低温域で培養し、それから急に培養温度を高温域
にシフトさせるのがよい。

（２）培養時間 本工程の培養時間は、培養温度を低温域から高゛温域ヘ
シフトさせた後であって、培養液中に分泌されている所
望物質の産生量が最大となる時間、が好ましい。そして
、さらに好ましい培養時間は、菌が溶菌せずにかつ所望
蛋白質が培養液中に予示に分泌されている時間である。

本発明の一興体例では、ｈＥＧＦを製造する場合は約２
０．５時間を採用している。それ以上培養を行うと、菌
体が溶菌し、菌体中の種々の雑多な物質が培地中に混入
するに到って所望蛋白質の回収が難しくなるからである
。このような培養時間の検討は、培地中のグルコースお
よび無機燐の定ｍ、ＯＤ　６６０の測定、生国数の測定
、ペリプラズム中および培養液中の産生物質の定量を指
標として行うことができる。グルコースの定量はグルコ
ースオキシダーゼ法（ニューグルコスタット「フジサワ
」のキットを利用。）により行うことができる。生国数
は、Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２　　ＹＫ５３７（ｐＴＡｌ
　５２２）の場合についていえばアンピシリンを含むし
一培地（前記）およびＬ−培地の寒天上に生育するコロ
ニー数を測定すればよい。そして、本発明の一実施例で
は、アンピシリン含有し一培地の寒天上に生育するコロ
ニー数に対するし一培地の寒天上に生育するコロニー数
の割合（％）をプラスミド保持率として算出している。

無機燐の定量はモリブデンブルー法（工場排水試験方法
：ＪＩＳ　　Ｋ　　０１０２）に従って行った。また、
培養液中の産物ｈＥＧＦの定量はまず培養液（１０ｓｉ
りをとり、これを遠心したのち上清をＲＲＡ法（後記）
に従って行い、ペリプラズム中のｈＥＧＦについては菌
体をオスモティック・ショック法（前記Ｊ、　Ｂｉｏｌ
、　Ｃｈｅｗ　）によって処理後、この溶液を遠心して
上清をラジオレセプターアッセイ（ＲＲＡ）法（Ｊ、　
Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔ、　２５７．３０５３（１９８２
））によって分析することにより行ったｈＥＧＦ定量の
詳細は後記参考例および特願昭５９−１５９７０３号明
ｌＩＩ書参照）。

なお、ここで菌体内で発現されたｈＥＧＦが菌体内（１
８胞質内）に存在しているかどうかをも調べた。

すなわち、上記オスモティック・ショック処理後、得ら
れた沈殿（菌体）を純水に再度懸濁させたのち、超音波
処理を行って菌体を破壊し、ついで遠心を行って上清を
得て、この上清を上記ＲＲＡ法に従って分析することに
より、菌体内（細胞質内）のｈＥＧＦを定】した。

（３）　培地のｐＨ ｐＨは微生物の生育可能な範囲であればよく、用いられ
る微生物によって適宜好ましいｐＨを設定すればよい。

大腸菌を用いる場合には、大腸菌の生育可能なｐＨは通
常４．６〜８．８であり、このうちｐＨ７，０〜８．０
の間が特に好ましい。

なお、ここで培養中のｐＨは変動するのがふつうである
が、−定ｐＨ付近に保っておくのが好ましい。

（４）　消泡剤 培養中発泡の著しいときは、消泡剤（高級アルコール、
植物油等）を添加するのが常套手段である。本発明の場
合において用いる消泡剤は無機燐の存在量によって微生
物の蛋白質合成能を制御するのであるから、無＊＊を含
有しないものであることが肝要である。そのような消泡
剤の具体例としては、「アンチホーム−ＡＦ−エマルジ
ョン」（半井化学）がある。

（５）　溶存酸素（Ｄｏ） 溶存酸素とは、液相中に溶解している分子状酸素のこと
をいう。

一般に通気撹拌培養に際しては、Ｄｏが過多の場合は微
生物の増殖は阻害され、−万〇〇が１１）９ｍ以下にな
っても同様に増殖が阻害されるということが知られてい
る。従うて、ＤＯｆｆｉを微生物生育の阻害因子となら
ないように制御することが好ましい。本発明の一興体例
の場合はＤｏコントロール装置〔オリエンタル電気−Ｆ
Ｃ−４型〕によりＤｏ猪を４１）ｌ）Ｉｍに保持してい
る。

工　／の 生成蛋白質の回収は、公知の常法に従って行うことがで
きる。

例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティク
ロマトグラフイー、電気泳動法、高速液体クロマトグラ
フィーあるいはこれらを種々組合せた方法等〔底口「生
化学実験講座１タンパク質の化学■」日本生化学会編、
東京化学同人刊（１９８２）参照）があり、ｍ製する蛋
白質あるいはペプチドの性質にあわせて適当なものを選
択して使用すればよい。

本発明の一実施例では、培養終了後の培養液を遠心し、
ついで得られる上滑を逆層カラムに通じてゲル濾過を行
ってｈＥＧＦが含有されている画分をＤＥＡＥ−ＴＯＹ
ＯＰＥＡＲＬ■（イオン交換）に通じることにより１Ｅ
ＧＦ画分を分離して、所、望両分を回収した。なお、本
発明の方法に従って産生された目的蛋白質をより多（し
かも効率よく回収しようとするならば、培養液中に分泌
される目的蛋白質の量が多くかつ菌体が溶菌していない
時期に培養を終了して、培養液中から目的蛋白質を回収
すると共に菌体を集菌後にオスモティック・ショック法
により処理後ペリプラズム中の目的蛋白質を回収すれば
よい。本発明方法によれば宿主菌体内で産生された目的
蛋白質は菌体内（細胞質中）に留ることなくペリプラズ
ム（少量）あるいは培養液中（大部分）のいずれかに分
泌されているので、この回収法によれば菌体内で産生さ
れた殆んどの蛋白質が回収されるであろう。なお、ペリ
プラズム中の蛋白質の回収は、例えば、本発明者らの共
同研究者らによって先に提案された特願昭６０−２２６
３０号の方法によればよい。

友−１−１ （１）　形質転換体の造成 下記の方法に従って形質転換体Ｅ、ｃｏｌｉＫ１２　　
ＹＫ５３７（ｐＴＡ１５２２）を造成した。

ｐＴＡ１５２９（造成の詳細は特願昭５９−１５９７０
３号の明りＩｌ書参照）５μ９を、５０μｍの緩衝液（
１０ｍＭトリス−塩ｉ！緩衝液（以下Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
＞＜ｐＨ７，５）、１０ｍＭＭｇＣｌ　　　５０ｍＭ　
　ＮａＣＩ）中で４単位の制限酵素Ｈｉｎｄｌｌｌ（タ
カラ〕　（以下Ｈｉ　ｎｄｌｌ）を用いて３７℃で１時
間加水分解した。ついで、エタノール沈殿を行い、得ら
れた沈殿物を、３０μｍの反応液（６７ｍＭ　　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＩＩＨ８，８）　、１６．６ｍＭｔｊｌ酸アン
モニウム〔以下（ＮＨ４）２Ｓ０４〕、６．７ｍＭエチ
レンジアミン四酢酸（以下ＥＤＴＡ）、０．６６ｍＭず
つのｄＡＴＰＳｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰ）中で１単
位のＴ４−　ＤＮＡポリメラーゼを用いて、３７℃で１
５分間処理した。ついで、エタノール沈殿物を、５０μ
ｍの反応液（６ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　　　　（ｐ
Ｈ８，０）　　　、　　６ｍＭ　　　　　Ｍ　　ｇ　Ｃ
ｌ　　　２．１５０ｍＭ　　ＮａＣ１）中で４単位の制
限酵素３ａｌ　　Ｉ（タカラ〕　（以下、３ａｌＪと記
す）を用いて３７℃で１時間加水分解した。反応終了後
、アガロースゲル電気泳動によって、３９００ｂｐのＤ
ＮＡ断片（第１図中■）を得た。

プラスミドｐＢＲ３２２−ｈＬＩＧ　（ｐＢＲａ２２　
（Ｅ、ｃｏ　ｌ　ｉ　　Ｋｌ　２　　Ｃ６００（ｐＢＲ
３２２）として寄託済み〔微工研条寄第２３５号〕）を
ＥＣ０ＲＩおよびＳａ　Ｉ　Ｉテ消化、したものに人工
的に合成したｈＥＧＦ構造逅伝子をＥＣ０ＲＩおよび５
ａｌＩで消化した断片を組み込んでもの〕５μ９を、５
０μｍの反応液（１００ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐ
Ｈ７，５）、５０ｍＭ　　Ｎａｃｌ、５０ｍＭ　　Ｍｇ
Ｃｌ２）中で４単位の制限酵素ＥｃｏＲＩ　（タカラ〕
を用いＹＫ５３７　（ｏＴＡ１５２２）を以下のように
して培養した。単細胞純粋分離したＥ、　Ｃｏ　Ｉ　ｉ
で３７℃で１時間加水分解したのち、上記と同様にＴ４
ＤＮＡポリメラーゼ処理を行い、さらに５ａｌＩ処理を
行ったのち、アガロースゲル電気泳動によって１６０ｂ
ｐのＤＮＡ断片（第１図中■）を得た。

上記で調製した二つのＤＮＡ断片（第１図中■および■
）を、３０μｍの反応液（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　
（ｐＨ７，５）、１０ｍＭＭｇＣ１２，１０ｍＭ　　Ｄ
ＴＴ、０．５ｍＭＡＴＰ）中で３００単位のＴ４ＤＮＡ
リガーゼ（タカラ〕を用いて１４℃で１６時間反応させ
た。

反応終了後、これで大腸菌に１２　　ＹＫ５３７の形質
転換を行って、目的のプラスミド〔以下ｐＴＡ１５２２
）（第１図中■）を含有する形質転換株（Ｅ、ｃｏｌｉ
　　Ｋ１２　　ＹＫ５３７（ｐＴＡｌ　５２２））を得
た。

（２）　形質転換体の培養 本発明者らの共同研究者らにより組換えＤＮＡ技術によ
ってプラスミドｐＴＡ１５２２を用いて形質転換された
微生物Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２ＹＫ５３７　（ｐＴＡｌ
　５２２）を以下のようにして培養した。単細胞純粋分
離したＥ、ｃｏｌｉＫ１２　　ＹＫ５３７（ｐＴＡ１５
２２）−白金耳をトリプト２ゴ０ ／リットル、ＮａＣ１　　５９／リツトル、アンピシリ
ン２０ｑ／リツトルからなる培地１００ｍに接種し、５
００ｄ容の坂ロコルペンで３７℃で一夜振盪培養を行っ
た。

次に、この培養？１ｋ１０ｄをとり、グルコース１０９
／リツトル、トリプトン１０９／リツトル、酵母エキス
５ｇリットル、ＭａＳＯ４・７８２０　　０、５ＳＦ／
リツトル、およびアンピシリン２０η／リツトルよりな
る培地２リツトルに接種し、３リツトル容のミニジャー
ファーメンタ−で培養した。培ｉｕｉ度は、無機燐聞が
最小になるまで（培養開始後約９時間）は３０℃付近と
し、それ以降は急激に３７℃に変換した。通気量は０、
　　５ｖｖｉ　　（　１　ｖｖｍはｉ　ＶＯＩｕ＋ｍｅ
−ＶＯＩｕ＋ａｅ−ｍｉｎｕｔｅのことで、１分間あた
り培養液１リツトルに対して１リツトルの空気が導入さ
れることを意味するものである。）、ｐＨは７．２（４
Ｎ　　ＮａＯＨまたは４Ｎ　　ＨＣＩで調整する）、溶
存酵素（Ｄｏ）濃度はＤＯコントロール装置により撹拌
速度を変化させて４　１）ＤＩ付近に保持した。培養は
、グルコースおよび無機燐の定量、生菌数の測定、菌体
内（細胞中）、ペリプラズム中および培養液中のｈＥＧ
Ｆの定量を経時的に行うことにより、培地中のｈＥＧＦ
の農がペリプラズム中のｈＥＧＦより多くなるまで（培
養開始から約２０．５時間）行った。グルコースの定量
はグルコースオキシダーゼ法にューグルコスタット「フ
ジサワ」のキットを用いた）に従って行った。生菌数は
アンピシリン２０ｔｔｔｙ／リツトルを含むし一培地（
トリプト２ゴ０ ＮａＣｌ　　５９／リツトル）の寒天プレート上に出現
するコロニーの数を測定することにより行った。０Ｄ６
６。は菌体量の指標として測定したちのであり、無機燐
の定量はモリブデンブルー法（前記）によって行った。

なお、この定ｍは、培養温度シフト時期の目安とするも
のである。菌体内（ｉｔ胞質中）、培養液中およびブリ
ベラダム中のｈＥＧＦの定量は下記の方法で行った。す
なわち 培養液１０ｄをとり、遠心分離したのら上清をＲＲＡ法
（下記）で分析することにより培養液中のｈＥＧＦを定
量し、ついでこのとき沈殿物として得られた菌体を２０
％シュークロース、０、０３Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（
ｐＨ８．０）、ＥＤＴＡ　　Ｏ．００１Ｍからなる溶液
２０威に懸濁させ、Ｖ温で１０分放置した。ついで、再
度遠心して集菌し、この菌体を２０ｍの冷ｕ１水（０℃
〜４℃）に懸濁させ、水中で１０分間放置した（オスモ
ティック・ショック法による処理）。そしてこの懸濁液
を遠心して上清を得、この上清をラジオリセブターアッ
セイ（ＲＲＡ）法によって分析することによりペリプラ
ズム中のｈＥＧＦを定量した。また、上記オスモティッ
ク・ショック処ＩＩ債に得られた沈殿物（菌体）を純水
１０ｄに再懸濁したのちこれを超音波処理（「クボタイ
ンソネーターモデル２００Ｍｊ　）（１０分間）を行っ
て菌体を破壊し、遠心（２７０００ｇ、３０分間）して
得られた上清をＲＲＡ法（下記）に従って分析すること
により、菌体中（細胞質中）のｈＥＧＦの定員を行った
。

ＲＲＡ法は、下記のようにして行った。まず、ヒト鼻咽
腔癌細胞由来のＫＢ［１ｆｆｄ　（ＡＴＣＣＩＩＱＣＣ
Ｌ１７）を８００ｄのフラスコ中でダルベツーコ変法イ
ーグル（ＤＭＥ）培地〔日永〕中でＦＩｉｌｌ培養を行
った。ついで培地を除き、０．０５％のＥＤＴＡを含む
リン酸平衡化塩溶液（ＰＢＳ）を用いて細胞をはがして
、細胞懸濁液を作成した。

その後、２０ｍＭヒーブス（Ｈｅｐｅｓ　）　　（Ｄ　
Ｈ７，４）を含むハンクス（Ｈａｎｋｓ）平衡塩類溶液
（ＨＢＳＳ）で２回細胞を洗浄した。細胞をパインディ
ング・ツルージョン（Ｂｉｎｄｉｎｇ　ｓｏｌｕｔｉｏ
ｎ）（ＤＭＥ培地培地２０上 ７、４＞−０．３５ｇ／リットルＮａＨＣＯ３”１００
μ９／ｄストレプトマイシン〕にｌｉ！！濁後、細胞数
を計算して３０万〜４０万１０．　２ａｌ！パインデイ
ング・ツルージョンとなる様調整し、チューブに０．２
ｄずつ分注した。ついで上記の３種の上清を各々および
　　Ｉ　−ｍＥＧＦ　（７１クス上皮細胞成長囚子（以
下ｍＥＧＦ））を含む試料液０、　２ｎｄ！をチューブ
に加えて、３７℃で１時間インキュベートした。細胞を
氷冷したＨＢＳＳで３°回洗浄後、１０％のトリクロ０
酢酸〔以下、ＴＣＡ）に懸濁させ、グラスフィルターを
用いて細胞を固定した。アセトンでＴＣＡを除いた後、
液体シンチレーションカウンターを用いて計数した。そ
してｈＥＧＦの逗をｍＥＧＦに換算した。

なお、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）は、細胞内
に存在する酵素である。従って、もしも菌体が溶菌して
いるならば、この酵素も菌体外に漏出しているであろう
と推察される。そこでβ−ｇａｌの定量を行うことによ
り、宿主菌（形質転換体）が溶菌しているかどうかを判
断した（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａ
ｐｐｌｉｅｄ　Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌｎｇｙａｎｄ　Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　、　１６、１４Ｇ−１５０（
１９８２）　、周り、５〜１２（１９８４））　　。

なお、β−ｇａｌの定量は、ミラーの方法〔底置Ｅｘｐ
ｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ。

３５５、　（１９７２）、コールド・スプリング・ハー
バ−・ラボラトリ−刊）に従って行ない、０Ｄ４２。で
その活性を示した。

これらの実験での培養時間、ＯＤ　　　、生菌数、無機
燐のｍ、グルコース量、ｈＥＧＦ（ｇ４体中（細胞質中
）、ペリプラズム中および培養液中）の吊およびβ−ｇ
ａｌの定は結果を表１に表す。

また、これらの結果を、図に示したものが第２図および
第３図（ａ）および（ｂ）である。第２図はグルコース
凹、生菌数、吸光度および無機燐の定積結果をプロット
したものであり、第３図は、全ｈＥＧＦ　（合計）、培
養液中のｈＥＧＦ，ペリプラズム中のｈＥＧＦおよび細
胞内のｈＥＧＦを測定したときの結果（ａ）および各々
の画分の全ｈＥＧＦｆｆｉに対する割合（ｂ）を示した
ものである。

これらの表および図より、培養開始４１２０．５時間後
に、培養液中のｈＥＧＦ量が最大となっていることがわ
かる。また、Ｉ８胞内に存在すべき酵素であるβ−ｇａ
ｌは、培養開始以来その細胞内の比率が一定であるとこ
ろから、菌体は破壊されていないであろうと示唆される
。従って、この培養工程では、培養開始後９時間目に培
養温度をシフトしたのち、さらに培！開始後２０．５時
間まで′培養を続けることにより５４．７１Ｒｇ／リッ
トルのｈＥＧＦを得ることができ、これは従来法の２倍
にも達していた。

（３）　蛋白質の回収 上記培養液１リツトルを遠心分離 （１２，０００ｇ、１０分）して上清を得て、これを逆
層クロマトグラフィー（カラムサイズ：直径４．１ａ＋
Ｘ長さ８　ａｎ　、樹脂：ｐｒｅｐ　　ＰＡＫ５００／
Ｃ１８逆層樹脂（ウォーターズ社））に付して所望蛋白
質画分を分離した。ついで、Ｆ記りロマトグラフィーに
よって得られた所望画分をＤＥＡＥ　−ＴＯＹＯＰＥＡ
ＲＬ■（カラムサイズ：直径１．５ｃＩＲＸ長さ２５　
ｃｔａ　）カラムに付したのち、博望蛋白質画分を分離
した。なお、ここで得られた所望蛋白質の両分の一部を
とってポリアクリルアミド電気泳動を行ったところ、ｈ
ＥＧＦ標品と同一位置にバンドが見られたので、所望蛋
白質ｈＥＧＦが回収されていることが示唆された。

比　　較　　例 本発明に係る培養法を確立すべく、培養温ｊ文を一定に
保った培養、培養途中に高温域から低温域へ、あるいは
低温域から高温域へシフトさせた培養等を行ってみた。

以下にそのときの結果を示す。

化１ｆ九ユ 培養温度を３０℃に保って培養を続けるということ以外
は全て、実施例と同様に実験を行った。

そのときの結果を第２表に示す。この結果より、培養液
中に分泌されたｈＥＧＦは２６．４＃＋９／リツトルが
最大であり、これは培養開始後２７時時間和得られたも
のであった。なお、表中の＊１〜＊４の意味は第１表と
同一である。

直蚊五ユ 培養温度を３７℃に保って培養を続けるということ以外
は全て実施例と同様に実験を行った。そのときの結果を
第３表に示す。この結果より、培養液中に分泌されたｈ
ＥＧＦは２８．６１Ｒ９／リツトルが最大であり、これ
は培養開始後２３時間目に得られたものであった。なお
、表中の＊１〜＊４の意味は第１表と同一である。

Ｌ狡亘ユ 培養開始から９時間後までは、培養温度を３７℃とし、
それ以降は培？＆湿度を急激に２５℃ヘシフトさせると
いうこと以外は、全て実施例と同様に実験を行った。そ
のときの結果を第４表に示す。

表中のネ１〜ネ４の意味は第１表と同一である。

この結果より、ｈＥＧＦは培養開始後３０．５時間で最
大の３．９０１９／リツトルとなった。なお、ここでは
β−ｇａ１に加えβ−ラクタマーゼ（ｂ　Ｉ　ａ）の定
量をも行っている。

ｂｌａの定量を行ったのは、ｂｌａはアルカリ性ホスフ
ァターゼ同様ペリプラズム酵素であってペリプラズムに
蓄積するものだからである。従って、所望蛋白質の培養
液中への分泌が菌体の溶菌によるものであれば、ｂｌａ
も培ｉ時間の経過とともに培養液中に漏出すると考えら
れる。菌体のペリプラズム中および培口液中のｂｌａの
定量は下記の通りである。すなわち、培養液中のｂｌａ
の定ｍは、培養液１０−をとって遠心し、上清を０．１
Ｍナトリウム−リン酸緩衝液（９日７，０）により適当
に希釈して！ナンブル溶液をつくり、その０．５ｄ（下
式ｖＩＲ１）にＰＡＤＡＣ（ｂ　Ｉ　ａの基質であって
、ｂｌａにより分解されて紫色→黄色に変化する。使用
に際しては、上記緩衝液に溶解させて００　　　’？３
．０となるように調整する（カルビオケム・ベーリング
社（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＨ−ＢＥＩＩＲＩＮＧ））　０
　、５　ｄを加えて３７℃で１０分（下式ｔ）程度反応
を行ったのち５分間煮沸し、直ちに水中で冷却し、つい
でｏＤ　　を測定した。

この測定値と対照（ザンプル溶液として上記緩衝液を上
記と同様にして測定したもの）の０Ｄ５６゜の測定値と
の差（ΔｏＤ　　）より、次式を用いてｂｌａの活性を
測定した。また、ペリプラズム中のｂｌａの測定は、上
記で得られた菌体をオスモティック・ショック法（前記
）に従って処理したのち、この溶液を０．１Ｍナトリウ
ム−リン酸緩衝液（ｐ）１７．Ｏ＞で適当に希釈して、
以下培養液中の ｂｌａの定量と同様に行った。

ここでユニットは、基質ＰＡＤＡＣ１μａ＋ｏｌのβ−
ラクタム環を１分間で加水分解づる酵素活性を１ユニツ
トとしたもので、ｔは反応時間（分）を、■はサンプル
溶液のｆｌｉ！　（ｄ）を示すものである（「蛋白質・
核酸・酵素」且、３９０〜４００　（１９７８））。こ
の表中のβ−ｇａｌおよびｂｌａの定置結果より、β−
ｇａｌはその大半が細胞内に留っていること、およびｂ
ｌａの大半がベリブラズに留っていることより、宿主菌
は破壊されていないことが示唆される。

比較例４ 培養開始から約９時間までは培養温度を３７℃とし、そ
れ以降は培養温度を３０℃にシフトするということ以外
は全て実施例と同様に実験を行った。そのときの結果を
第５表に示す。この結果より、培養液中へ分泌されたＥ
ＧＦは２７．７＃／リツトルが最大であり、これは培ｔ
＆開始後２９時間目に得られたものであった。なお、表
中の本１〜本３の意味は第１表と同一である。

工狡■１ 培養開始から約７時間までは培養温度を３７℃とし、そ
れ以降は培養温度を４０℃にシフトするということ以外
は実施例と同様に実験を行った。

そのときの結果を第６表に示す。この結果より、培養液
中へ分泌されたＥＧＦは２８．５ＩＩｔｇ／リットルが
最大であり、これは培養開始後２１時間口に得られたも
のであった。なお、表中の本１〜本３の意味は第１表と
同一である。

ルＪロ九旦 第７表 以上、実施例および比較例の結果より、培養温度のシフ
ト範囲、シフト時間、培養液中のＥＧＦｍが最大となっ
た培養時間およびそのときのＥＧＦｍ　＜Ｒｇ／Ｊ　）
を第７表にまとめた。これより、本実施例のように、低
温域から高温域へ培養をシフトさせる培養法によれば通
常の培養法（３７℃で一定）よりも２倍程度産生■の増
加が認められる。

関連微生物の菌学的性質および受託＃を号本発明におい
て開示された微生物の菌学的性質および受託番号は下記
の通りである。

受託年月日 （１）　　昭和５６年　６月　９日 （２）　　昭和５８年　４月３０日 （３）　　昭和５６年　６月　９日 （４）　　昭和５６年１１月１４日 本　通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所の受託
番号 ＊＊　　Ａ　Ｔ　ＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　
Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）の受託番号 鼠３」υ１亘 （１）　　　Ｅ、ｃｏｌｉ　　　Ｋ１２Ｃ６００この菌
は、グラム隙性桿菌で、胞子を作らず、通性嫌気性等の
大腸菌属の一般属性を有する他、Ｆ因子を含まず、サプ
レッサー遺伝子Ｅの機能を欠き、遺伝子組替えに関与す
るヌクレアーゼをコードするｒｅｃＢｃＬｆ伝子に欠陥
を有するものである。栄養要求性としては、トレオニン
とロイシンをその最小培地上での増殖に必要とする。ま
た、分類学上、腸内細菌科、大腸菌属に属するものであ
る。なＪ３、水筒に関する文献は以下の通りである。

（イ）　　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、３９．４４０（１９５４
）（口）　　Ｎａｔｕｒｅ、　　２１７．１１１０（１
９６８）（２）　　Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２Ｃ６００（
ｐＹＫこの菌は、ダラム陰性桿菌で、胞子を作らず、通
性嫌気性等の大腸菌属の一般属性を有する他、Ｆ因子を
含まず、サプレッサー遺伝子Ｅの機能を欠き、遺伝子組
替えに関与するヌクレアーゼをコードするｒｅｃＢＧ遺
伝子に欠陥を有するものである。栄養要求性としては、
トレオニンとロイシンをその最小培地上での増殖に必要
とする。

ｐｈＯＡ遺伝子のプロモーター−オペレーター領域ｐＡ
ＣＹＣ１７７由来の複製開始領域およσｐＢＲ３２２の
ｂ　Ｉ　ａ３１ｉ伝子から構成されたプラスミドｐＹＫ
２８３を含み、アンピシリンに対して耐性を示す。また
、分類学上、腸内細菌科、大腸菌属に属するものである
。

なお、プラスミドｐＹＫ２８３由来の形質を除けば、こ
の菌株の菌学的性質はその親株Ｅ。

ｃｏｌｉ　　Ｋ１２Ｃ６００のそれと同じである。

（３）　　Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２Ｃ６００（ｐＢＲこ
の菌は、ダラム陰性桿菌で、胞子を作らず、通性嫌気性
等の大腸菌属の一般属性を右づる他、Ｆ因子を含まず、
サプレッサー遺伝子Ｅの機能を欠き、遺伝子組替えに関
与するヌクレアーゼをコードするｒｅｃＢＣ遺伝子に欠
陥を有するものである。栄養要求性としては、トレオニ
ンとロイシンをその最小培地上でのｉ！！殖に必要とす
る。また、薬剤耐性プラスミドｐＢＲ３２２を含む。な
お、プラスミドｐＢＲ３２２に関してはＧｅｎｅ、　２
．９５（１９７７）、大腸菌Ｋｌ　２Ｃ６００に関して
は上記Ｎｕｔｕｒｅを参照することができる。ｐＢＲ３
２２由来の形質を除けば、Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２Ｃ６
００（ｐＢＲ３２２）の菌学的性質は親株のそれと同じ
である。

（４）　　Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２ＹＫ５３７大腸菌に
１２ＹＫ５３７は、公知株であるところの大腸菌に１２
株（）ｌｉｃｒｏｂｉｏｌｏｑｉｃａ！　ＩｔｅＶｉｅ
ＷＳ　。

４４．１〜５６（１９８０））の誘導体大腸菌Ｋｌ　２
ＲＲ１（Ｇｅｎｅ、　２．９５（１９７７）、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

ＡＣｔａ、　、６５５．２４３（１９８１）　）をさら
に改変したものであり、下記の性質を示し、他の性質に
ついてはに１２ＲＲ１のそれと異なるところのない菌株
である。（ｒｅｃＡｌ、ｐｈＯＡ８、ｐｒｏ＋）（５）
　　Ｆ：、ｃｏｌｉ　　ＨＢ１０１大腸菌に１２株（上
記）と大腸菌Ｂとをハイブリッドさせて造成した菌であ
り、下記の遺伝子型を有する。なおこの株に圓する文献
としてはＪ、　ｔ４ｏ１．　Ｂｉｏｌ、　４１．４５９
（１９６９）　８３よび）ｌｃｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏ
ｌ、、６８．２４Ｂ（１９７９）がある。

Ｆ”　、ｈｓｄｓ２０　（ｒ　　−、ｍＢ−）、ｒｅｃ
Ａｌ３、ａｒａ−１４、ｐｒＯＡ２、ｌ　ａｃＹｌ　、
ａａ　ｌ　Ｋ２、ｒｐｓＬ２０（３ｍ　　）、ｘｙ＋−
５、ｍｔ　ｌ　−１，５ｕＤＥ４４、λ− （６）　　Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＲＲＩ 大［ＩＨＢｌｏｌをｒｅｃＡ＋に改変したＥ。

ｃｏｌｉ　　）−１８１０１の誘導体である。従って、
遺伝子型は（Ｆ−、ｒｅＣＡ＋以外はＨＢｌｏｌと同一
）である。なお、この株に関する文献としてはｃａｎｅ
　２．９５（１９７７）およびＢｉｏｃｈｉｍｉｃａ′
ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　ＡＣｔａ　、　　６５５
．２４３（１９＆ｉ）がある。

【図面の簡単な説明】

第１図は、Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ１２Ｙ５３７を形質転換
するために使用したプラスミドｐＴＡ１５２２造成のた
めのフローチャートである。 第２図ならびに第３図＜ａ）および（ｂ）は、第１表の
結果をプロットした図面である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の工程（Ａ）〜（Ｄ）よりなることを特徴とす
   る、菌体外分泌による蛋白質の製造法。 （Ａ）アルカリ性ホスファターゼ由来のプロモーターを
   コードする遺伝子を具備すると共にその制御下にシグナ
   ル配列をコードする遺伝子をも具備し、かつ予定した宿
   主微生物細胞内で増殖可能なベクター、を用意すること
   。 （Ｂ）上記ベクターに外来蛋白質をコードする遺伝子を
   組込んで組換えＤＮＡを造成し、ついでこの組換えＤＮ
   Ａを宿主微生物細胞内に移入させることにより宿主の形
   質転換を行つて、形質転換体を得ること。 （Ｃ）上記形質転換体を、微生物の増殖過程における対
   数増殖期後期から停止期前期にかけて蛋白質合成能の誘
   導がおこるに必要な量の無機燐を含有する培地での培養
   に付し、その際に蛋白質合成能の誘導が起る前は低温域
   で、蛋白質合成能誘導後は高温域で培養を行つて、両培
   養温度差が少なくとも４℃となるようにすること。 （Ｄ）上記培養終了後、培地中より産生外来性蛋白質を
   回収すること。 ２、アルカリ性ホスファターゼ由来のプロモーターをコ
   ードする遺伝子を具備すると共にその制御下にシグナル
   配列をコードする遺伝子をも具備し、かつ予定した宿主
   微生物細胞内で増殖可能なベクターが、そのシグナル配
   列をコードする遺伝子の下流側末端直後に所望外来性蛋
   白質をコードする遺伝子を結合させ得るように仕組まれ
   たものである、特許請求の範囲第１項記載の菌体外分泌
   による蛋白質の製造法。 ３、工程（Ｂ）においてベクターに組込む外来性蛋白質
   をコードする遺伝子が、ヒト上皮細胞成長因子である、
   特許請求の範囲第１項または第２項のいずれかに記載の
   菌体外分泌による蛋白質の製造法。