JPS6336759B2 - - Google Patents

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JPS6336759B2
JPS6336759B2 JP54130965A JP13096579A JPS6336759B2 JP S6336759 B2 JPS6336759 B2 JP S6336759B2 JP 54130965 A JP54130965 A JP 54130965A JP 13096579 A JP13096579 A JP 13096579A JP S6336759 B2 JPS6336759 B2 JP S6336759B2
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JP
Japan
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glucose
concentration
reaction
enzyme
inhibitor
Prior art date
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JP54130965A
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English (en)
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JPS5550899A (en
Inventor
Meiatsuchiini Furanko
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ISUCHI SHEROTERAPIKO E BATSUCHINOJENO TOSUKANO SCLAVO SpA
Original Assignee
ISUCHI SHEROTERAPIKO E BATSUCHINOJENO TOSUKANO SCLAVO SpA
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Publication date
Application filed by ISUCHI SHEROTERAPIKO E BATSUCHINOJENO TOSUKANO SCLAVO SpA filed Critical ISUCHI SHEROTERAPIKO E BATSUCHINOJENO TOSUKANO SCLAVO SpA
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Publication of JPS6336759B2 publication Critical patent/JPS6336759B2/ja
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12QMEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/54Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving glucose or galactose

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  • Chemical & Material Sciences (AREA)
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  • General Health & Medical Sciences (AREA)
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  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はグルコースを動力学的に定量するため
に使用する新規な組成物に係わる。
イタリー国特許第986838号特許によれば、試薬
の特殊な組成物を使用することにより、グルコー
スを酵素的に定量できることは公知であり、この
方法はグルコースオキシダーゼ存在下でのグルコ
ースの変化反応、つづいて副生成物に対する反
応、中でも副生した過酸化水素によるパーオキシ
ダーゼの存在下における適当な物質の酸化反応を
利用するものである。
上記反応は次のとおりである。
(1) D−グルコース+O2GOD ―→ D−グルコノラクトン+H2O2 (2) H2O2+還元形色原体(無色) →H2O+酸化形色原体(有色) 上記特許明細書に開示された内容によれば、実
際には、グルコースの酵素的比色定量に際して
GOD−POD−色原体を使用して、一定時間毎に
分光光度計の目盛を続むか、あるいは各反応が完
了した時に測定を行なつている。
ここで指摘する如く、動力学的方式は、逆に、
反応の一部(ここでは反応自体はゼロ準位であり
かつVは一定である)における反応速度を測定す
るものである。
通常、この方法は過剰の基質を用いて酵素活性
を測定するために利用される。この場合、過剰の
基質を使用するため、酵素のすべての活性部位が
飽和され、反応は一定の初期速度で行なわれる。
このような条件下では、反応速度はもつぱら酵
素濃度に左右される。
たとえばグルコースの場合の如く、基質の濃度
を測定することについては、ゼロ準位反応が行な
われるようにかつ一定の反応速度条件下で反応を
行なうためには上記の如く酵素のすべての活性部
位を一定して係合させておくこと、すなわち過剰
の基質が存在することが必要であるため、動力学
的方式で行なう場合には非常な困難を伴う。
分析すべきサンプル中では基質の濃度は各サン
プルごとに異なり、また同一のサンプルにおいて
も反応の進行の間に変化するため、反応が部分的
に行なわれた際にサンプル中で見られる基質の最
低濃度に比例して酵素活性は常に非常に低いもの
であることが要求される。さらに、ゼロ準位の反
応を行なうためには酵素に比例して、基質は常に
過剰量で存在していなければならない。このよう
な条件下では、存在する酵素の活性が低いことを
考慮すれば、阻害剤による影響、酵素の変性、温
度変化、活性化等は反応の傾向および結果の正確
性および信頼性についてかなりの影響を及ぼす。
基質を動力学的に測定することは、組成物中に
おける試薬の交換および技術的および装置的な方
便を施すことにより、可能となる。
前者については、通常は試薬中の酵素活性を適
当なレベルまで低減させ、後者については、通常
は反応の非常に早い段階、すなわち特定の範囲内
では常に直線的である段階において非常に短時間
で分光光度測定を行なうようにしている。
この事実は、非常に一定した短時間の間隔で測
定を実施できる自動的または半自動的な装置を採
用することを意味する。これらの理由のため、基
質を定量するにあたつては、動力学的定量法は適
当な装置を使用する場合にしか一般的には利用さ
れず、この事実は無視できない制限を課するもの
である。
本発明者等は、グルコースの定時間比色定量に
用いる試薬中に導入したいくつかの物質がグルコ
ースオキシダーゼの阻害剤として作用するが、パ
ーオキシダーゼに関しては作用せず、したがつて
このような物質を反応式(1)におけるグルコースの
酸化速度を遅くするために使用できることを見出
し、本発明に至つた。このような反応速度の低下
は、反応系全体に関しては、あたかもGODが非
常に低い濃度で存在するかの如く、あるいは逆に
酵素に対しては基質(グルコース)が過剰量で存
在するかの如く作用し、この結果、反応は直線的
となりかつその速度も一定となる。
速度については、反応の進行につれて基質の濃
度が明らかにゼロとなるため、長時間一定の値を
維持できない。
しかしながら、添加する阻害剤の濃度を変える
ことによつて、“一定速度での反応”の持続時間
を充分長くすることができ、動力学的方式に従つ
てグルコースを手動的にも定量することが可能と
なる。もちろん、この場合、自動的または半自動
的な装置の使用を除外するものではない。
さらに詳述すれば、本発明は、動力学的方式に
より、グルコースを定量する際に使用する試薬組
成物に係わり、該組成物は、 −グルコースオキシダーゼおよびパーオキシダー
ゼ −緩衝剤システム −少なくとも1個のフエノール性水酸基をもつ芳
香環を分子中に含有する成分 −1−フエノール−5−ピラゾリノンから誘導さ
れる構造に結合した活性基を含有する成分、 および −グルコースオキシダーゼの活性を阻害する物
質、 を包含する。
さらに、本発明による組成物は単一試薬の形式
であつてもよく、また使用時に混合される各種の
試薬の別々の混合物でなるものであつてもよい。
準備段階においていずれの形式を使用することが
有利であるかは使用するものが決定できるが、い
ずれにしても、本発明の範囲内で選択できる。
GODに対して活性を阻害する性質をもちかつ
反応速度を低減させうるものとして見出された物
質は、硝酸塩、チオシアン酸塩、亜硫酸塩、亜セ
レン酸塩、セミカルバジドである。
これらの物質はPODに対する阻害力に基いて
3つのグループに分けられる。
グループA:PODを阻害しない物質(硝酸塩、
亜セレン酸塩、亜硝酸塩) グループB:濃度約0.1Mないし1MでPODを阻害
する物質(チオシアン酸塩) グループC:非常に低い濃度(約0ないし0.1M)
であつてもPODを阻害する物質(セミカルバ
ジド) グループAの物質はGODに対する所望の阻害
効果を得るに好ましい濃度で使用できる。グルー
プBの物質は約0ないし1Mの濃度でのみ使用で
きる。最後に、グループCの物質は約0ないし
0.1Mの濃度でのみ使用できる。
このようにすることによりPODの阻害を常に
防止でき、PODは反応システムに導入するGOD
阻害剤によつて影響されない。
例として、試薬Glu−Cinet中で硝酸アンモニ
ウムを使用する場合について述べる。
物 質 1 以下の組成をもつ試薬GOD−POD−色原体
(Glu−Cinet Sclavo) 組 成 リン酸塩緩衝剤 150 ミリモル GOD 18 単位/ml POD 1 単位/ml 4−アミノフエナゾン 0.4 ミリモル 4−ヒドロキシ安息香酸 10 ミリモル PH 7.5±0.2 注:PHは阻害剤の導入によつて変化する。
NH4NO3(1モル)を添加する場合にはPHは
7.5から6.9に低下する。しかしながら上記PH
値においてもこの試薬は動力学的方式におい
て有効に作用する。このようなPHの変動が限
界値5.5ないし9を越えない場合には、PHを
初期値に調整する必要はない。
2 分析用の純粋なNH4NO3 3 各種の濃度をもつ純粋なグルコースの標準溶
液 方 法 試薬Glu−Cinetを単独であるいはNH4NO3
添加して使用する。
使用法は次のとおりである。すなわち、試薬2
mlに標準溶液またはしよう液0.02mlを添加する。
素早く混合したのち、自動プログラマおよびコン
ピユータを具備する光度計を使用して反応速度の
測定を行なう。分析中、温度を前もつて定めた値
(たとえば30℃)に一定に保つ。
結 果 (a) NH4NO3の濃度を関数とする直線期間の持
続 第1図のプロツトからわかるように、たとえ
ばサンプル中のグルコースが300mg/c.cである
場合には、30℃において、直線期間は
NH4NO3=0g/dlについて約35秒から
NH4NO3=25g/dlについて約100秒となる。
室温(22℃)においては、NH4NO3=0g/
dlについて約25秒からNH4NO3=25g/dlに
ついて約280秒となる。
(b) サンプル中におけるグルコースの濃度を関数
とする直線期間の持続 第2図からわかるように、直線期間の持続性
はグルコースの濃度によつても左右され、持続
性は、グルコース濃度が低下するにつれて増大
する。ともかく、サンプル中のグルコースが
300mg/dlでありかつGlu−Cinet中でNH4NO3
=12.5g/dlであつても、直線期間は1分以上
であり、動力学的方式での測定を有効にかつ手
動的に実施するに充分である。
(c) 応答の直線性 徐々に濃度を高めたグルコースの各種標準液
についての定量を行なうことにより、Glu−
Cinet中でNH4NO3=12.5g/dlおよび
NH4NO3=25g/dlを使用したいずれの場合
にも、サンプル中のグルコースの濃度600mg/
dlまでは直線である応答(グルコース濃度に対
する反応速度)が得られた(第3図)。
(d) 感度 応答(グルコースに対する反応速度)の感度
は、試薬中の阻害剤の濃度が増加するにつれて
非直線的に低下する(第4図)。このように阻
害剤の濃度については直線期間についての所望
の持続性に基いて選択すべきであるが、阻害剤
の濃度をあまりにも高くする場合には感度を過
剰に低下させることとなることに注意しなけれ
ばならない。
上記した図面について、第1図のプロツトは試
薬Glu−Cinet中のNH4NO3の濃度(g/dl)を
横軸に、直線期間の持続性(秒)を縦軸について
のものである。曲線Aは反応温度22℃の場合であ
り、曲線Bは反応温度30℃の場合のものである。
また曲線A′およびB′は、サンプル中のグルコー
スの濃度=300mg/dlに係わり、一方曲線Aおよ
びBはサンプル中のグルコースの濃度=100mg/
dlに係わる。
第2図のグラフは基質の濃度(横軸)を関数と
する直線期間の持続性(秒)(縦軸)の関係を示
している。直線期間はグルコースの濃度の低下に
つれて長くなつている。図中、曲線AはGlu−
Cinet中NH4NO3=25g/dlの場合、曲線Bは
NH4NO3=12.5g/dlの場合のものを示す。
第3図のグラフは測定曲線(サンプル中のグル
コースの濃度(横軸)に対する反応速度)を示す
もので、これらの曲線はNH4NO3=12.5g/dl
(曲線A)およびNH4NO3=25g/dl(曲線B)
を使用した場合にも直線的である。
最後に、第4図のグラフは、Glu−Cinetにお
けるNH4NO3濃度を横軸に、相対感度(%)を
縦軸にプロツトしたものである。図面からわかる
ように、阻害剤NH4NO3の濃度が増加するにつ
れて感度は非直線的に低下する。
結 論 得られた結果に基いて、5ないし25g/dlの濃
度でNH4NO3を含有するGlu−Cinetを使用する
ことにより、サンプル中の各種のグルコース濃度
についても、直線期間の持続性と感度との間の満
足できる互換性が達成されることが確認された。
反応系において基質過剰の状態とするためには、
前述の従来法の1つによればGODの濃度自体を
低下させることもできるが、この方法に比べて、
本発明の酵素−阻害剤系を使用する場合には、操
作条件の変動による影響が少ないとの利点が得ら
れる。このような影響は、従来法の如く少量の酵
素を使用する場合には無視できないものである。
さらに詳しく述べれば、テストに供されるサンプ
ル中に自然の酵素阻害剤(本発明により意図的に
添加される阻害剤と区別するため「阻害剤B」と
称する)が存在する場合、少量の酵素を使用する
と阻害剤Bによつて阻害されるため、完全に誤つ
た結果を与えることになる。逆に、本発明により
意図的に添加する阻害剤(これを「阻害剤A」と
称する)と同時に多量の酵素を使用する場合に
は、テストに供されるサンプル中における阻害剤
Bの存在は、これによる錯体(酵素+阻害剤B)
の生成が反応 酵素+阻害剤A錯体(酵素+阻害剤A) の平衡を左にシフトさせるため、反応系中に存在
する酵素の濃度は実質的に変化しないことにな
り、従つてサンプル中の阻害剤Bの存在または不
存在はテストの結果に重大な影響を及ぼさない。
【図面の簡単な説明】
第1図はGlu−Cinet中のNH4NO3の濃度と直
線期間の持続性との関係を示すグラフ、第2図は
基質の濃度と直線期間の持続との関係を示すグラ
フ、第3図はグルコース濃度に対する反応速度の
関係を示すグラフ、および第4図はNH4NO3
濃度と相対感度との関係を示すグラフである。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 1 グルコースを動力学的に定量する際に使用す
    る組成物において、(a)グルコースオキシダーゼお
    よびパーオキシダーゼ、(b)緩衝剤、(c)少なくとも
    1個のフエノール性水酸基を有する芳香環を含有
    する成分、(d)1−フエニル−5−ピラゾリノンか
    ら誘導される構造に結合した活性基を含有する成
    分、および(e)硝酸塩、チオシアン酸塩、亜硫酸
    塩、亜セレン酸塩およびセミカルバジドでなる群
    から選ばれるグルコースオキシダーゼの活性を阻
    害する物質を包含することを特徴とする、グルコ
    ースを動力学的に定量するための組成物。
JP13096579A 1978-10-12 1979-10-12 Composition for dynamically and quantitatively determining glucose Granted JPS5550899A (en)

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IT28665/78A IT1099355B (it) 1978-10-12 1978-10-12 Composizione adatta alla determinazione in cinetica del glucosio

Publications (2)

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JPS5550899A JPS5550899A (en) 1980-04-14
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GB (1) GB2033082B (ja)
IT (1) IT1099355B (ja)

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