JPS63246666A - ベンゾジアゼピン類の検査法、そのトレーサー、抗原および抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、液体、とくに尿、血清、血漿などの生物学的
液中のベンゾジアゼピン類の存在または量を測定する蛍
光偏光免疫検査方法および試薬、ならびにその試薬の製
造方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、（１）サ
ンプル中のベンゾジアゼピン類および／またはその代謝
物の存在または量を測定するための試薬（トレーサーお
よび抗体）、（２）その抗体を産生するために用いる免
疫原性化合物、（３）合成法（トレーサーおよび免疫原
性化合物の製法）、および（４）該検査を行なう分析方
法に関する。

先行技術 ベンゾジアゼピン類の薬物は、はとんど、第１図で示さ
れるベンゾジアゼピン環を有し、その５位に芳香族系置
換基を有している。これらは、鎮静剤、催眠剤、筋弛緩
剤、不安解消剤、抗てんかん剤として、またアルコール
中毒の治療剤として臨床的に用いられている。ベンゾジ
アゼピン類の１種であるジアゼパムは若干決意状態をも
たらし、それだけで禁制された用途に、あるいは他の禁
制化合物の混和剤として用いられる。

ベンゾジアゼピン類は、種々の形で代謝され、７−りロ
ルベンゾジアゼピン類では主として３位で脱アルキル化
が行なわれる。７−ニトロベンゾジアゼピン類は７−ア
ミノおよび７−アセトアミド形に代謝される。その水酸
化代謝産物は主としてグルクロン化結合体として***さ
れる。

ベンゾジアゼピン類を単独で摂取したことが原因で死者
が出たことはほとんどない。ベンゾジアゼピン類は安全
な化合物であると一般に考えられており、そのため、そ
の使用が促進された。ペン、　　フジアゼビン類は西洋
では全も頻繁に処方される薬の１つである。ベンゾジア
ゼピン類が広く使用されるために、悪用のほか、とき過
剰投与がなされるようになり、そのため、薬の乱用の試
験および救急室においてベンゾジアゼピン類の存在を検
査することが一般に行なわれている。そのためには、迅
速で信頼性があり、選択的かつ正確なベンゾジアゼピン
類およびその代謝物の検出方法が有用である。

最も頻繁に試験される生物学的液体は尿である。

尿サンプルは血液サンプルよりもずっと入手しやすく、
その他の生物学的液体は検査に使用するために広く調査
されていない。

以前は尿中に存在するベンゾジアゼピン類は薄層クロマ
トグラフィー（ＴＬＣ）によって検出するか、または高
性能クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）またはガスクロマ
トグラフィー（ＧＣ）を用いて血清またはプラズマ中の
濃度を確認する酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）によって
検出する方法が一般′的であった。これらの尿中の分析
方法には欠点がある。ＴＬＣ法はサンプルの抽出が必要
であり、検査時間が長い。ＥＩＡは酵素反応を含み、以
下の不利な点がある。ｌ）試薬がかなり不安定であり、
２）ＥＩＡにおける酵素反応生成物の吸光度測定値に影
響を与えるかもしれない生物学的サンプル中の成分（酵
素阻害剤または同様の反応を触媒する酵素など）が検査
結果に影響を与える、および、３）ＥＩＡで測定する吸
光度および生物学的サンプル中の成分（ビリルビンまた
はその他の発色団など）がこれらの検査から得られた結
果の正確さに影響する。

薬物およびその他の物質を検査する場合、フルオレセイ
ンの偏光競合的結合イムノアッセイはより満足な方法で
ある。典型的には、競合的結合イムノアッセイはテスト
サンプル中のリガンドを測定するために使用される（本
発明の目的には、「リガンド」は競合的結合イムノアッ
セイ技術を用いて定量すべき生物学的興味のある物質で
ある）。

ベンゾジアゼピン抗原共役物および抗体は、米国特許第
４，２４３．６５４号（シュナイダー（Ｓ　ｃｈｎｅｉ
ｄｅｒ）ら）、米国特許第４，０８３，９４８号（ダビ
ス（Ｄａｖｉｓ）ら）、米国特許第４．１９１．７３８
号（ディクソン（Ｄｉｘｏｎ））および米国特許第４゜
０４６．６３６号（ウールマン（Ｕｌｌｍａｎ）ら）に
開示されている。

本発明は前述の先行技術よりも優れた技術を提供するも
のであり、詳細には、サンプル中の１つまたはそれ以上
のベンゾジアゼピン類またはベンゾジアゼピン代謝物を
決定するために有用な、免疫原、選択性のある抗体、高
感度のフルオレセイントレーサー、抗体およびフルオレ
セイントレーサーの製造方法、およびトレーサーおよび
抗体を用いる検査方法を提供する。本発明に従って行な
われる検査は以下に説明する様に特に正確である。

発明の目的 本発明は、ベンゾジアゼピン類およびベンゾジアゼピン
類の代謝物を検査するために使用しうる抗体の生成に用
いるハプテンおよびイムノアッセイ、ベンゾジアゼピン
類およびその代謝物に対する代謝物に対するフルオレセ
イン偏光イムノアッセイに使用されるトレーサー、ハプ
テン、免疫原およびトレーサーの合成方法、ならびにこ
れらの検査を行なう方法に関する。

本発明は、まず、新規な構造を有する特異的なハプテン
および免疫原に関する。

本発明のハプテンおよび免疫原は、第２図に示す構造を
有する。

［式中、ＸはＣＨ，Ｎ、またはＣ−ハロゲン、Ｒ’は−
Ｈ，−ＣＨ，まｆニー＋１−Ｒ−Ｚ−Ｑ。

Ｒ２は−Ｈまたは−○Ｈ１ Ｒ３は一〇または非結合性電子対、 Ｒ４は、Ｒ１が−Ｈまたは−ＣＨ，の場合、−Ｒ−Ｚ−
Ｑ、またはＲ１が−Ｒ−Ｚ−Ｑの場合、ハロゲン、−Ｎ
ｏ、、−ＮＨ２または−ＮＨＣＯＣＨ。

であり、 Ｒは０〜２０個の炭素原子およびヘテロ原子からなる連
結基であり、それは１２個以下のへテロ原子を含む直鎖
または分枝鎖からなり、２個までの環状構造を含んでい
る。ただし、ヘテロ原子は４個を超えて連続して結合せ
ず、２個以上のイオウ原子または窒素原子および１個の
酸素原子が連続して結合してはいない、 ２はＣ＝０、Ｃ＝　Ｎ　ＨＳＮ　Ｈ１Ｎ　ＣＨｓ、Ｎ＝
Ｎ、Ｓｏ２またはＣＨ，であり、 Ｑは水素、ヒドロキシ、または該化合物がハプテンとし
て用いられる場合は除去しうる基である（本発明の目的
には、「除去しうる基」とはハロゲン、アシルオキシ基
（カルボン酸エステルを含む）、Ｎ−スクシンイミジル
オキシまたはＮ−７タルイミジルオキシ基、アルコキシ
またはフェノキシまたは置換フェノキシ基、Ｎ−イミダ
ゾリル基、ｌ−ベンゾトリアゾリルオキシ基または当業
者に周知である同様のその他の活性基である）。Ｑは、
本化合物が免疫原として用いられる場合は、ポリ（アミ
ノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体または他の免疫原性キ
ャリアである１゜ 本発明は、第二に、新規なハブテンから免疫原を製造す
る方法に関する。

その目的は、第２図で表わされる化合物を化学的な結合
することによって、免疫原を作る方法により行なわれる
。なお、第２図の式中の符号は下記の通りである。

ＸはＣＨ，Ｎ、まタハＣ−ハＣ７ゲン、Ｒ１は−Ｈ，−
ＣＨ，または−Ｒ−Ｚ−Ｑ。

Ｒ２は−Ｈまたは−ＯＨ。

Ｒ３は一〇または非結合性電子対、 Ｒ４は、Ｒ１が−Ｈまたは−ＣＩ（３の場合、−Ｒ−Ｚ
−Ｑ、またはＲ１が−Ｒ−Ｚ−Ｑ（７）場合、ハロゲン
、−Ｎｏ□、−ＮＨ２または−ＮＨＣＯＣＨ３であり、 Ｒは０〜２０個の炭素原子およびヘテロ原子からなる連
結基であり、それは１２個以下のへテロ原子を含む直鎖
または分枝鎖からなり、２個までの環状構造を含んでい
る。ただし、ヘテロ原子は４個を超えて連続して結合せ
ず、２個以上のイオウ原子または窒素原子および１個の
酸素原子が連続して結合してはいない、 Ｚｌ：ｔＣ＝Ｏ，Ｃ＝ＮＨ，Ｓｏ、、ＮＨ，ＮＣＨ。

まｔ；はＣＨ，であり、 Ｑは水素、ヒドロキシまたは除去しうる基Ｃｆ−だし、
ＺがＣＨ２である場合、Ｑは水素ではない）である。

また、該化合物はポリ（アミノ酸）、ポリ（アミノ酸）
誘導体または他の巨大分子のキャリアまｔ；はその表面
上に反応性官能基を持った合成重合体ビーズの様な巨大
分子状または微粒子のキャリア物質を有している。

本発明は、第三には、新規な免疫原による抗体の生成に
関する。本発明によれば、公知の方法によりイン・ビポ
またはイン・ビトロの技術を用いて、前記の合成化合物
または物質に反応して抗体を生成させる。

本発明は、第四には、新規な構造を有する特異なトレー
サー、および該トレーサーの合成前駆体として用いられ
る化合物に関する。

これらのトレーサーおよびトレーサー前駆体は第２図で
表わされ、式中、 ＸはＣＨｌＮまたはＣ−ハロゲン、 Ｒ１は−）（、−ＣＨ，または−Ｒ−Ｚ−Ｑ。

Ｒ２は、Ｒ１およびＲ１のいずれも−Ｒ−Ｚ−Ｑでない
場合、−Ｒ−Ｚ−Ｑ、またはＲ２は−Ｈまには　−ＯＨ
。

Ｒ３は一〇または非結合性電子対、 Ｒ４は、Ｒ１およびＲ２のいずれも−Ｒ−Ｚ−Ｑでない
場合、−Ｒ−Ｚ−Ｑ、またはＲ４は一ハロゲン、−Ｎｏ
２、−ＮＨ２または−ＮＨＣＯＣＨ，、Ｒは０〜２０個
の炭素原子およびヘテロ原子からなる連結基であり、そ
れは１２個以下のへテロ原子を含む直鎖まｔ；は分枝鎖
からなり、２個までの環状構造を含んでいる。ｔ；だし
、ヘテロ原子は４個を超えて連続して結合せず、２個以
上のイ才ウ原子または窒素原子および１個の酸素原子が
連続して結合してはいない、 ＺはＮＨ１ＣＯ１ｓｏ２まｔ；はＣ＝ＮＨであり、Ｑは
−Ｈ，−ＯＨ，除去しうる基またはフルオレセイ〉′マ
たはフルオレセイン誘導体である。

Ｑがフルオレセインまたはフルオレセイン誘導体である
場合、本化合物はトレーサーとして用いることができ、
Ｑが−Ｈ，−ＯＨまたは除去しうる基である場合には、
本化合物はトレーサー前駆体として用い得る。

本発明は、第五には、新規トレーサーの製造方法に関す
る。本発明によれば、該トレーサーは第２図で表わされ
る化合物をフルオレセインまたはフルオレセイン誘導体
と化学的にカップリングすることによって製造される。

該第２図の式中、ＸはＣＨ％ＮまたはＣ−ハロゲン、 Ｒ１は−Ｈ，−ＣＨ，または−Ｒ−Ｚ−Ｑ。

Ｒ２は、Ｒ１およびＲ４のいずれも−Ｒ−Ｚ−Ｑでない
場合、−Ｒ−Ｚ−Ｑ、またはＲ２は−Ｈまたは−ＯＨ。

Ｒ３は一〇または非結合性電子対、 Ｒ４は、Ｒ１およびＲ２のいずれも−Ｒ−Ｚ−Ｑでない
場合、−Ｒ−Ｚ−Ｑ、またはＲ′は−ハロゲン、−Ｎ０
２、−ＮＨ２または−ＮＨＣＯＣＨ３、Ｒは０〜２０個
の炭素原子およびヘテロ原子からなる連結基であり、そ
れは１２個以下のへテロ原子を含む直鎖または分枝鎖か
らなり、２個までの環状構造を含んでいる。ｔ；だし、
ヘテロ原子は４個を超えて連続して結合せず、２個以上
のイオウ原子または窒素原子および１個の酸素原子が連
続して結合してはいない、 ＺはＮ　Ｈ，ＣＯ，Ｓ　Ｏ！またはＣ−ＮＨであり、Ｑ
は−Ｈ，−ＯＨ，または除去しうる基である。

本発明は、第六には、分析方法、すなわち、前述のトレ
ーサーおよびベンゾジアゼピン類およびベンゾジアゼピ
ン代謝物に対する抗血清を試薬として用いる検査方法に
関する。その目的は、改良されたフルオレセイン偏光イ
ムノアッセイを提供することであり、ベンゾジアゼピン
（類）またはその代謝物（群）を含むまたは含むと考え
られる液体を、均質溶液中で、ベンゾジアゼピン（類）
に対する抗血清および抗血清の存在に対して検出可能な
蛍光偏光反応を生じさせることのできるフルオレセイン
でラベルしたベンゾジアゼピン誘導体に接触させ、その
均質溶液に平面偏光を通し、それからの蛍光偏光反応を
測定することによって行なうことができる。

本発明は、第七には、リボフラビンまたは他の蛍光発色
団による潜在的な蛍光の干渉を消去ることに関する。ヨ
ウ化ナトリウムを各々のサンプルに直接加えるかまたは
、検査に用いられる１つまたはそれ以上の試薬に加え、
存在している蛍光を消光することにより、蛍光の干渉を
消去する。

本発明の目的およびそれらの利点は実施例と共に、以下
の詳細な説明から明らかである。

発明の構成および効果 本発明ではフルオレセインおよびフルオレセイン誘導体
を使用する。

本発明のトレーサー化合物の利用に必要なフルオレセイ
ンおよびその誘導体の特質はフルオレセインの蛍光であ
る。フルオレセインは第３図で示されるように、周囲の
酸濃度（ｐＨ）により２つの互変体の形態で存在してい
る。開環（酸性）型においては、多くの共役二重結合が
あり、これによりフルオレセイン（およびフルオレセイ
ン分子を含む化合物）の開環型が青い光を吸収し、約４
ナノセカンドの励起状態ライフタイム後に緑色の蛍光を
放出し得る。開環型および閉環型が共存する場合、開環
型および閉環型の分子の濃度比はｐＨレベルを調節する
ことによって容易に変化させうる。

一般に、本発明に係るトレーサー化合物は例えばナトリ
ウム、カリウム、アンモニウムなどの様な生理学的に許
容し得る塩として溶液中に存在し、このことにより本発
明の分析方法において用いる際に、トレーサー化合物は
開環蛍光型で存在することができる。存在する塩の特定
は、ｐＨレベルを調節するために用いた緩衝液に依存す
ることになる。例えば、ナトリウムリン酸緩衝液の存在
下では本発明化合物は普通はナトリウム塩として開環型
で存在することになる。

本明細書中で用いられる場合には、「フルオレセイン」
という用語は独立した化合物としても、より大きな化合
物の一成分としても、特定の分子として存在している場
合には、蛍光性は別として、開環型および閉環型の両者
を含んでいることを意味している。開環型は蛍光が生じ
るために必要である。

フルオレセイン分子の炭素原子番号は分子が開環型であ
るか閉環型であるかによって変わる。従って、フルオレ
セインおよびその化合物に関する記載は炭素原子番号に
関しては統一されていない。

閉環型ではフェニル環上のラクトンのカルボニルに対し
てパラ位の炭素は「６」と番号が付けつられている。開
環型ではフェニル環上のカルボン酸基に対してパラ位の
炭素は「５」と番号が付けられている（第３図参照）。

合成に用いる原料は閉環型で番号付けを行なうのが最も
一般的であるので、本明細書でも閉環型による番号付け
を採用している。

従って、本明細書の記載では、フルオレセインおよびそ
の化合物のカルボキシル基と反対方向にある炭素原子は
「６」と番号付けする。

抗体と複合体を形成していない溶液中のトレーサーは蛍
光の吸収および再放出に必要な時間以内で自由に施米す
る。その結果、再放出光はがなりランダムに向くため、
抗体と複合体を形成していないトレーサーの蛍光偏光は
低く、０に近い。特定の抗体と複合体を形成すると、そ
のトレーサー−抗体複合体では、抗体分子の施米は比較
的小さなトレーサー分子のものよりも遅いと考えられ、
そのため観察される偏光は増大する。従って、リガンド
が抗体の部位についてトレーサーと競合する場合、フリ
ーのトレーサーとトレーサー−抗体複合体の混合物の観
察される蛍光偏光は、トレーサーの偏光とトレーサー−
抗体複合体の偏光との中間の値をとるものと考えられる
。サンプルがリガンドを高濃度に含んでいる場合は、観
察された偏光値はフリーのリガンドの偏光値に近似し、
すなわち、低い。テストサンプルがリガンドを低濃度含
んでいる場合は、偏光値は結合したりガントの偏光値に
近似し、すなわち高い。イムノアッセイの反応混合物を
垂直偏光ついで水平偏光を用いて類火励起させ、この放
出光の垂直成分のみを分析することによって、反応混合
物中の蛍光偏光を正確に決定しうる。決定されるべき偏
光およびリガンド濃度間の正確な関係は既知濃度を用い
て偏光値を測定することにより確立することができる。

リガンド濃度はこの方法で用意された標準曲線から算出
し得る。

本発明に係る方法で形成された特定の抗体およびトレー
サーは、以下に述べるように、非常に良く検査に使用し
得る。

１、試薬 本発明における免疫原およびトレーサーはともに第２図
に示される構造式で表わすことができる。

対象物は、抗体の認識部位について、ベンゾジアゼピン
類およびベンゾジアゼピン代謝物群とトレーサーとの間
で競合性を有するものでなければならない。ハプテンお
よびトレーサーの構造はかなり違いがあり、それによっ
てその目的を達成し得る。本発明の目的においては、「
ハプテン」は免疫原の前駆物質であり、一般には免疫学
的に活性なキャリアと結合するのに適した基を有する置
換ベンゾジアゼピン誘導体からなる。

（ａ）免疫原の構造 使用し得る抗体は種々のベンゾジアゼピン誘導体から製
造され得る。環上の１位または７位のいずれかに官能基
を有する化合物から作られる免疫原は動物内にて抗体を
生成し得る。このような抗体を適当なトレーサーと結合
させて、本発明のベンゾジアゼピン類およびベンゾジア
ゼピン代謝物の検査に用いられる。

本発明の免疫原は第２図に示す構造式を有し、本発明の
好ましい態様では、該免疫原は第４図で示される化合物
から誘導される。該免疫原は、後記合成法および実施例
に記載されるように、第２図の化合物をポリ（アミノ酸
）、ポリ（アミノ酸）の誘導体または他の免疫学的に活
性なキャリアとカップリングさせることにより製造され
る。

構造の観点からは、１位または７位のいずれを置換して
も同様に好ましいが、７位誘導体の方が出発物質がより
容易に入手しやすく、製造が非常に簡潔である。しかし
、特定の動物から有用な抗血清を得る可能性は１位誘導
体の方が大きいと考えられる。従って、第４図（式中、
Ｒ，Ｒ２およびＲ３は前記と同じ、ＺはＣ＝Ｏ１Ｃ＝Ｎ
Ｈ，ＳＯ２、ＮＨ，ＮＣＨ３またはＣＨ，、およびＱは
免疫原性キャリアである）で示される１位誘導体が本発
明の目的において好ましい具体例である。本発明の最も
好ましい態様においては、免疫原は第５図で示されるも
のである。このものは、他の薬物および内因性物質は除
外して、広範囲のベンゾジアゼピン類およびベンゾジア
ゼピン代謝物に対して感受性のある抗血清を提供するの
で好ましい。この最も好ましい態様においては、牛血清
アルブミンはポリ（アミノ酸）であるが、アルブミン、
血清たん白質ｗ１（例えば、グロブリン、眼レンズたん
白質、リポたん白質など）を含む種々のたん白質キャリ
アが用い得る。代表的なたん白質キャリアには牛血清ア
ルブミン、鍵穴カサ貝（ｋ６ｙｈｏｌｅ１ｉｍｐｅｔ）
ヘモシアニン、卵オバルプミン、牛γ−グロプリン、チ
ロキシン結合グロブリンなどがある。また、リジンまた
はオルニチン残基などのような有効なアミノ基を十分有
する合成ポリ（アミノ酸）も使用でき、さらに、反応性
官能基を有する他の多くの合成または天然の重合物質が
使用できる。さらに、炭水化物、酵母、多糖類、または
他の免疫学的キャリアとして用いられる物質をハプテン
と結合させて免疫原を製造し得る。

（ｂ）トレーサーの構造 本発明にトレーサーの構造の可変性はハプテンの構造の
可変性よりもさらに大である。トレーサーは第２図の構
造式を有する。本発明の好ましい態様では、トレーサー
は第６図（式中、Ｒは前記と同じ、ＺはＣ＝Ｏ１Ｎｌ（
、、Ｓ０２またはＣ＝ＮＨである）で示される構造を有
している。

本発明に係るトレーサーは、例えば第７−１図〜第７−
１０図で示されるような、アミド、アミジノ、トリアジ
ニルアミノ、カルバミド、チオカルバミド、カルバモイ
ル、チオカルバモイルまたはスルホニルカルバモイル基
などによって、フルオレセイン誘導体と結合しているベ
ンゾジアゼピン誘導体である。本発明のトレーサーは、
後記合成法および実施例で示すように、アミノ、カルボ
ン酸、スルホン酸、メルカプト、ヒドロキシ、イミデー
ト、ヒドラジド、インシアネート、チオイソシアネート
、クロロホルメート、クロロチオホルメート、クロロス
ルホニルカルバモイルまたは同様の基を含むベンゾジア
ゼピン誘導体を適当なフルオレセイン誘導体と結合させ
ることによって製造される。

例えば、以下のフルオレセイン誘導体のいずれも反応剤
として用い得る。

ＦＱ−ＮＨ，フルオレセインアミノ Ｆ１２−Ｇｏ２ＨカルボキシフルオレセインＦＱ−ＮＨ
ＣＯＣＨ，Ｉ　　−ヨードアセトアミドフルオレセイン Ｆ　Ｑ　　Ｎ　ＨＣＯＣＨ２Ｂ　ｒ−ブロモアセトアミ
ドフルオレセイン ２．４−ジクロロ−１，３，５−ト リアジン−２−イルｒミノーフルオ レセイン（ＤＴＡＦ） ４−クロロ−６−メドキシー１．３゜ ５−トリアジン−２−イルアミノ− フルオレセイン ＦＱ−ＮＣ５フルオレセインチオイソシアネート ＦＱ−ＣＨｔＮＨｔ　　ｌ　ｌ−アミノメチルフルオレ
セイン ２、抗体 本発明の抗体は、前述の免疫原に対して羊またはウサギ
内において反応を誘導することにより製造する。免疫原
は本技術分野において知られている方法で動物に投与す
るがまたは免疫成分細胞の試験管培養物に接種する。

３、製造方法 本発明の免疫原およびトレーサーはともに第２図の構造
を有する前駆体から製造しうる。

（ａ）免疫原の製造 本発明の免疫原は第２図で示す構造を有するハプテンと
ポリ（アミノ酸）とをカップリングすることにより製造
される。このポリ（アミノ酸）部分はハプテンと、アミ
ド、アミジン、アルキル、尿素、チオ尿素、カルバメー
ト、またはチオカルバメート結合によって結合し得る。

好ましい具体例においては、該ポリ（アミノ酸）は牛血
清アルブミン（ＢＳＡ）であり、該ハプテンは筆社式第
８図で示される。ハプテンは公知のアミド結合の形成に
用いられる通常の条件下でカップリングするのが好まし
い。免疫原は−ＮＨ２、−ＣＯ２Ｈ，−ＣＯＮＨＮＨ，
、−ＣＮＯＲ，−ＣＨｏ、−Ｂｒ１−１、−ＮＣＯ，−
ＮＣ５，−０ＣＯＣ（２，−３ｏ□ＣＱまたは−○ｃｓ
ｃａ基を含むハプテンをポリ（アミノ酸）とカップリン
グして製造する。Ｎｌ２基を含むハプテンは、−Ｎｌ２
基の存在下ポリ（アミノ酸）上のカルボン酸基を活性化
することによりカップリングし得る。芳香族アミン類に
対しては、ジアゾニウム塩法が用いられ得る。酸性溶液
中、アミンと硝酸ナトリウムを混合して製造したジアゾ
ニウム塩をポリ（アミノｒａ）に加える。ポリ（アミノ
酸）上のカルボン酸基の活性化はハプテンおよびポリ（
アミノ酸）を１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ。

Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド１−シクロヘキ
シル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド、
メトキシ−ｐ−トルエンスルホネートなどと混合するこ
とにより行なわれる。

カルボン酸を含むハプテンも、後記トレーサー製造の項
で述べるように、そのまま活性化する方法（ＥＤＣ）ま
たは活性エステル法によってカップリングする。−ＣＯ
ＮＨＮＨ，に対しては、カップリングは非芳香族アミノ
基の場合と同様に行う。

対応するシアノ化合物から製造した一ＣＮＯＲ化合物は
直接、ポリ（アミノ酸）とカップリングする。

−ＣＨＯ化合物は還元アミノ化により、ポリ（アミノ酸
）とカップリングする。ポリ（アミノ酸）を−ＣＨＯハ
プテンと混合し、生じたイミンを水素化シアノホウ素ナ
トリウムなどのような水素化ホウ素還元試薬を用いて還
元して、ポリ（アミノ酸）上にアルキル化したアミンを
生成する。対応するアミン化合物から製造されたインシ
アネート（−ＮＣＯ）およびイソチオシアネート（−Ｎ
ＳＣ）化合物、および対応するアルコール化合物から製
造されたクロロホルメート（−ｏｃｏｃＱ）およびクロ
ロチオホルメート（−０ＣＳＣＱ）化合物は各々、尿素
、チオ尿素、カルバメートおよびチオカルバメート結合
を生成する。このことは、ハプテンをポリ（アミノ酸）
に直接カップリングすることにより達成される。

上述のハプテン（免疫原前駆物質）の製造は互いにきわ
めて類似した方法で達成される。第４図の化合物は本発
明の好ましい具体例による免疫原前駆物質を示す。

一般に１位置換ハプテンは、ツルジアゼパムまたはその
誘導体のアミド窒素を、オメガ−ハロカルボン酸、オメ
ガ−ハロアジドのエステルまたはオメガ−アジド第一級
アルコールのスルホネートエステルを用いてアルキル化
することにより製造する。潜在性または保護された官能
基を顕在化し、その化合物をポリ（アミノ酸）または他
のキャリアとカップリングする、例えば、側鎖が保護さ
れた１−ブチルエステル（例えば第２１図の化合物）の
場合、保護基はトリフルオロ酢酸で処理することにより
除去され、一方、アジド末端鎖の場合は潜在性官能基は
プロパンジオールまたはトリフェニルホスフィンを用い
て選択的に還元することによって顕在化される。ノルジ
アゼピンまたはその誘導体を、ブロモアセトニトリル、
ブロモアセトアルデヒド、ジメチルアセタールなどの様
な他のジ官能性アルキル化剤を用いてアルキル化するこ
とができる。

アルデヒド類またはケトン類はウイテッヒ（Ｗｉｔｔｉ
ｇ）反応、ヒドラジン化合物との縮合、アミン化合物と
の還元アミノ化などのような既知の方法により、キャリ
アたん白質とカップリングするのに有用な適切な基を含
む種々の化合物へ誘導しうる。

アルデヒド類およびケトン類は、また、ＮＨ。

ＯＣＨ２ＣＯ□Ｈなどのような（アミノヒドロキン）ア
ルキルカルボン酸と縮合して置換したオキシム誘導体を
生成しうる。このオキシムアルキルカルポン酸誘導体は
部分的に還元して、対応する（アミノヒドロキン）アル
キルカルボン酸誘導体にすることができる。同じ型の縮
合および還元はヒドラジンおよびヒドラジン誘導体を用
いても達成しうる。

ニトリル誘導体はニトリルを無水アルコールおよび塩化
水素ガスを用いて処理することにより、アルコキシイミ
デートに転換しうる。ヒドラジン誘導体は対応するカル
ボン酸誘導体から、ヒドラジンとカップリングしている
活性エステルによっテマタハヒドラジンを対応するカル
ボン酸エステル誘導体と反応させることによって製造し
うる。

アミンまたはアルコールをホスゲンまたはチオホスゲン
と反応させることによって、アミン類はイソシアネート
またはチオイソシアネート誘導体へ転換でき、アルコー
ルはクロロホルメートおよびクロロチオホルメート誘導
体へ転換しうる。

（ｂ）トレーサーの合成 本発明に係るトレーサーはフルオレセイン分子またはフ
ルオレセイン誘導体とカップリングすることにより製造
され、第２図で示される構造を有する。フルオレセイン
分子は第７−１−第７−１０図に示すようにアミド、ア
ミジン、尿素、チオ尿素、カルバメート、チオカルバメ
ート、トリアジニルアミノまたはスルホニルカルバメー
ト結合によってアミノ、カルボニル、イミデートまたは
アルコキシ官能基と結合しうる。本発明に係る好ましい
具体例では、フルオレセイン誘導体は６−（４，６−ジ
クロロ−１，３，５−トリアジン−２−イルアミノ）フ
ルオレセインであり、これは第９図および第１０図に示
される前駆体とカッブリジグされる。

例えばアミノ、ヒドラジニル、ヒドラジドなどのような
末端アミノ基を有するすべてのベンゾジアゼピン誘導体
は活性エステル法または混合酸無水物法によってカルボ
キシフルオレセインにカップリングされ、溶液中で２つ
の物質を単に混合することによって、フルオレセインイ
ソチオシアネート、ＤＴＡＦ、またはアルコキシＤＴＡ
Ｆとカップリングされる。このアミノ基はホスゲンおよ
びチオホスゲンと反応させることによって、各々、イソ
シアネートおよびチオイソシアネート基へ転換しうる。

次にこれらをアミノフルオレセインと縮合してトレーサ
ーを生成する。

例えばカルボン酸、（アミノヒドロキシ）アルキルカル
ボン酸などのような末端カルボン酸基を有するすべての
ベンゾジアゼピン誘導体は活性エステル法によってアミ
ノフルオレセインおよびアミノメチルフルオレセインと
カップリングする。

末端水酸基を有するベンゾジアゼピン誘導体はＤＴＡＦ
、−ブロモアセトアミドフルオレセインまたはフルオレ
セインイソチオシアネートと溶液中で反応させることに
より、フルオレセインとカップリングしうる。この水酸
基はクロロスルホニルイソシアネート、ホスゲン、また
はチオホスゲンと反応させることにより、各々、クロロ
スルホニルカルバモイル、クロロホルメートまたはクロ
ロチオホルメート基に転換しうる。次にこれらの誘導体
を溶液中、アミドフルオレセインとカップリングしてト
レーサーを得る。

末端メルカプト基を有するベンゾジアゼピン誘導体は前
記アジド類の場合と同様にハロゲン化物またはスルホネ
ートエステル類およびアルカリ金属スルフィド類から製
造される。これらは溶液中、−ブロモアセトアミドフル
オレセインまたは−ブロモアセ］・アミドフルオレセイ
ンとカップリングする。

末端ニトリル基を有するベンゾジアゼピン誘導体は前記
アジド類の場合と同様に、ハロゲン化物またはスルホネ
ートエステル類から製造される。

これらは塩化水素ガスの存在下、無水アルコール中でイ
ミデート類に転換される。このイミデートは次に、溶液
中でフルオレセインアミンとカップリングしてトレーサ
ーを得る。

ベンゾジアゼピン誘導体の種々のアミン、ヒドロキシ、
およびメルカプト誘導体の製造法は前記免疫原製造法の
項で説明したとおりである。

３、検査法 本発明に係る特別なトレーサーおよび抗体は本発明に従
って定性的にまＩ；は定量的に決定され得るベンゾジア
ゼピン類およびベンゾジアゼピン代謝物のフルオレセイ
ン偏光分析において非常に良好な結果を与え得る。本発
明に係る分析は分析前に標本処理を行う必要がないので
、従来方法よりもより迅速なベンゾジアゼピン類および
ベンゾジアゼピン代謝物分析方法を提供する。本発明に
係る分析システムは正確にサンプル中のベンゾジアゼピ
ン類およびベンゾジアゼピン代謝物の存在を検出する。

本発明に係る分析方法によって、すなわち、本発明に係
るトレーサー化合、勿および免疫原を用いる蛍光偏光イ
ムノアッセイ法にてベンゾジアゼピン類およびベンゾジ
アゼピン代謝物を決定する方法によって、ベンゾジアゼ
ピン類また゛はベンゾジアゼピン代謝物を含んでいるか
または含むと考えられるサンプルを、トレーサーの生物
学的に許容される塩およびベンゾジアゼピン類およびペ
イゾジアゼピン代謝物およびトレーサーに対して特異的
な抗体と混合する。抗体は上述の免疫原を用いて製造す
る。ベンゾジアゼピン類およびベンゾジアゼピン代謝物
およびトレーサーは競合して限られた抗体の部位と反応
し、複合体を形成する。トレーサーおよび抗体の濃度を
一定に保つことによって、形成するベンゾジアゼピン類
−抗体複合体およびベンゾジアゼピン代謝物−抗体複合
体のトレーサー−抗体複合体に対する比はサンプル中の
ベンゾジアゼピン類およびベンゾジアゼピン代謝物の総
量に直接比例する。従って、直線偏光を用いて混合物を
励起し、トレーサーおよびトレーサー−抗体複合体によ
って放出される蛍光偏光を測定することにより、サンプ
ル中にベンゾジアゼピン類およびベンゾジアゼピン代謝
物が存在しているか否かを定性的に決定しうる。

この結果は正味の偏光単位および幅（ミリ偏光単位で）
によって定量し得る。ミリ偏光単位を測定すると、ベン
ゾジアゼピン類およびベンゾジアゼピン代謝物がなく最
大量のトレーサーが抗体と結合する場合には最大の偏光
を示す。正味のミリ偏光単位が高いほど、トレーサー（
群）はより良く抗体に結合する。この偏光幅はサンプル
にベンゾジアゼピン類およびベンゾジアゼピン代謝物が
含まれていると決定される最小濃度においての正味のミ
リ偏光と抗体と結合しているトレーサーの総量との間の
差を示している。より大きな幅はより良い多数のデータ
ー分析を提供する。好ましい抗体−トレーサー結合物は
少なくとも３０ミリ偏光単位の広がりを有しているが、
この検出可能な最小濃度においては少なくとも５ミリ偏
光幅は許容されうる。

第１表は本発明に係る種々の具体例において得られた結
果を偏光幅および正味のミリ偏光単位を用いて表わす。

すべての場合において、牛血清アルブミンをたん白質キ
ャリアとして用いた。第１表のデーターから明らかなよ
うに、第１７図および第１９図に示されるトレーサーを
組み合わせて用いた第５図で示されるハプテンから得ら
れた免疫原を用いて行なった検査では優れた結果が得ら
れた。従って、この組み合わせは本発明において最も好
ましいものである。また、第１５図／１６図、第１５図
／第１７図、および第１５図／第１９図の組合せからな
るハプテン／トレーサーの組合せも許容しうる結果を導
き、これらは他の好ましい組み合わせである。

第　　　１　　　表 第５図　　　第１５図　　１８７　　　３５／／　　　
　　第１６図　　１９５　　８０混合物　　　　２１１
　　　３５ 〃　　　　第１７図　　２０３　　　７１／／　　　　
　第１８図　　１５７　　　６３混合物　　　　２１４
　　　４３ ／ｌ　　　　第１９図　　２５１　　１２２混合物　　
　　２３４　　　４０ 第１３図　　　第２０図　　１７１　　７＊　ミリ偏光
単位 ＊＊ノルジアゼピン（２００ｎｇ／ｍＱ）のベンゾジア
ゼピン濃度およびサンプル量（５μのにおけるミリ偏光
単位 ヨウ化ナトリウム（Ｎａ　Ｉ　）をサンプルに加えても
よく、またはトレーサー以外の１つまたはそれ以上の検
査試薬を加えてサンプル中に本来存在している蛍光を消
し、検査における潜在性蛍光の干渉を消去する。サンプ
ル中の約５０％までの蛍光を消去するために十分な量を
用いるならば、用いるＮａｌの量は重要ではない。

また、前処理用溶液、希釈用緩衝液、ベンゾジアゼピン
検定液およびベンゾジアゼピン対照物などの一般に入手
し得る溶液を所望により用〜いてもよい。

これらの典型的な試薬溶液は、後述するように、検査用
「キット」としてアボット・ラボラトリーズ（イリノイ
州、アボット・パーク）から市販されている。

特記しない限り、本明細書において表わされる百分率は
すべて重量／容量の単位である。本発明において好まし
いトレーサーの組成は、リン酸緩衝液［ｐＨ７，５，０
，１モル、ポリソルベート８０（０，２％）、ナトリウ
ムアジド（０，１％）および牛ガンマーーグロブリン（
０，０１％）］中にトレーサーが１２０〜２４０ナノモ
ル含まれている。抗血清の組成はトリス緩衝液（ｐＨ７
，５，０，１モル）、ナトリウムアジド（０，１％）、
牛ガンマーーグロブリン（０，０１％）およびエチレン
グリコール（２゜０％）（容量／容量））を用いて希釈
した羊血清からなる。希釈緩衝液はリン酸ナトリウム（
ｐＨ７、５，０，１モル）、ナトリウムアジド（０，１
％）、および牛ガンマーーグロブリン（０，０１％）か
らなる。

前処理用溶液はヨウ化ナトリウム（５０％）、塩化ナト
リウム（０，９％）および蒸留水からなる。正常ヒト尿
中にノルジアゼピンを０．０．２００．０．４００．０
．８００．０．１２００．０、および２４００．０ナノ
グラム／ミリリツトルの濃度で含み、保存剤としてナト
リウムアジド（０，１％）を共に含んでなるベンゾジア
ゼピン検定液が有用である。正常ヒト尿中にノルジアゼ
ピンを３００゜０および１０００．０ナノグラム／ミリ
リツトルの濃度で含み、保存剤としてナトリウムアジド
（０，１％）を共に含でなるベンゾジアゼピン対照液も
有用である。

各々の検定液、対照液またはサンプルの蛍光偏光値を決
定し、アボットＴＤｘ”の偏光分析器のような機械の打
ち出しテープ上にプリントする。非線形回帰分析を用い
、各検定液の偏光とその濃度を相関させることによって
標準曲線を作成する。

所有する検量線と打ち出されたテープ上のデータから各
対照液およびサンプルの濃度を読み取る。

前述の好ましい方法においては、トレーサー、抗体、前
処理用溶液、検定液および対照液は約り℃〜約８°Ｃに
て保管しなければならず、一方、希釈溶液は常温で保管
しなければならない。標準曲線および対照液は２週間毎
に調製し、各検定液および対照液は２つずつ調製する。

所望により、対照液は毎日調製し、すべてのサンプルは
２つずつ調製する。

以下に述べる説明および以下の実施例は例示であり、本
発明の目的に関して何ら限定的なものではない。当業者
に自明の種々の変更を含み、特許請求の範囲で定義され
るものおよびそれと法律上均等物は本発明の範囲に含ま
れる。

衷鳳興 実施例１から実施例２７は本発明による実施例である。

実施例１および２は抗体を生成するだめの免疫原の製造
法に関し、実施例３から実施例１４は免疫原およびトレ
ーサーの前駆体の製造法に関し、実施例１５から実施例
２７はトレーサーの製造法に関する。

実施例１ 第５図に示される免疫原の製造法二 ■−力ルポキシメチル−７−クロロ−１，３−ジヒドロ
−５−７エニルー２Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２
−オン（５６ｍｇ）をジシクロヘキシルカルボジイミド サクシンイミド（３２ｍｇ）およびピリジン（　１　ｍ
ｆｆ）と混合する。この混合物を３時間攪拌し、得られ
た混合物にジメチルホルムアルデヒド（２５％）中の牛
血清アルブミン（１０ｍｇ／ｍのからなる溶液（ｌＯｍ
Ｑ）を滴下する。次にこの溶液を室温にて１８時間攪拌
した後、ガラスウールを通して濾過し、反応物から沈殿
物を除去する。この混合物をセルロース透析管（スペク
トラ／プロ３、Ｍ．Ｗ．カソトフ３　５　０　０）中で
ジメチルホルムアミド（２５％）に対して２日間透析し
、続いて、蒸留水に対して３日間透析する。透析管から
得た溶液はビウレットたん白質濃度決定法により測定し
て８　、　６　ｍｙ／ｍＱのたん白質を含んでいた。

実施例２ 第１３図で示される免疫原の製造法： ｌ−メチル−７−アミノ−１．３−ジヒドロ−５−フェ
ニル−２Ｈ−１．４−ベンゾジアゼピン、　−２−オン
（５０ｍＯ．、０．１９ミリモル）をＮ−ジメチルホル
ムアミド（ＤＭＦＸ５．０ｍ（２）、水（１。

５　ｍ＋２）および塩酸（ＩＭ，０．５ｍＱ）中に溶解
し、この混合物を４°Ｃまで冷却し、硝酸ナトリウム（
１Ｍ，０．１５ミリモル、０．１５ｍＱ）を加える。こ
の反応溶液を４°Ｃにて３０分間攪拌し、これに、１Ｍ
尿素水溶液（１２５μＱ）を加えて反応を停止させる。

得られた溶液にホウ酸ナトリウム緩衝液（０．１ＭＳｐ
Ｈ９．０、１２．５ｍの中の牛血清アルブミン（５００
ｍｇ）溶液を滴下し、４°Ｃにて１時間攪拌する（Ｎａ
ＯＨ（ＩＮ）を用いてｐＨ９．０に維持）・この反応混
合物を４°Ｃにおいて１６時間混合する。得られた溶液
をまず重炭酸ナトリウム（０、０５Ｍ，４１２）にて、
３回緩衝液を交替して、透析し、続いて脱イオン化水Ｃ
４Ｑ，４回交替）にて透析する。得られた溶液が実験動
物に注射する免疫原である。

実施例３ １　−　［ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル１−７
−クロロ−１．３−ジヒドロ−５−７エニルー２Ｈ−１
，４−ベンゾジアゼピン−２−オン（第２１図）の製造
法： 無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（Ｄ　Ｍ　Ｆ　Ｘ　
２０　ｍ（２）中の７−クロロ−１．３−ジヒドロ−５
−フェニル−２Ｈ−１．４−ベンゾジアゼピン−２−オ
ン（２６４＋＋＋９、９．７ミリモル）の溶液に窒素雰
囲気下にてナトリウムメトキシド（６　５　９ｍｇ、１
　２。

８ミリモル）を加える。この混合物を攪拌しながら油浴
中８５°Ｃにて３０分間加熱した後、ＤＭＦ（　ｌ　ｍ
１２）中のｔｅｒｔ−ブチルブロモアセテート（１．９
ｇ，９．７ミリモル）の溶液を１０分間かけて加える。

同温度にて４時間攪拌を続けた後、この混合物を減圧濃
縮し、塩化メチレン（９０ｍ１２）と水（１８０ｍ＋２
）間に分配する。この水相を塩化メチレン２倍以上の部
分を用いて抽出し、合わせた有機層を食塩水（４５ｎ＋
１２）で洗浄し、乾燥する（Ｍｇ　Ｓ　Ｏ　４）。

回転蒸留を行った後、粗生成物を減圧下でさらに乾燥し
、ヘキサン／酢酸エチル（１：ｌ）から再結晶して精製
し、白色粉体を得る（１．９９ｇ，５３％）。

実施例４ ■−カルボキシメチル−７−クロロ−１．３−ジヒドロ
−５−７エニルー２Ｈ−１．４−ベンゾジアゼピン−２
−オン（第８図）の製造法：塩化メチレン（５ｍＱ）中
のｌ　−　［ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル］−
７−クロロ−１．３−、’ヒＦロー５ーフェニルー２Ｈ
−１．４−ベンゾジアゼピン−２−オン（２７５ｍｇ、
０．７１ミリモル）の溶液にトリフルオロ酢酸（２　ｍ
＋２）を加える。室温にて１１時間攪拌後、揮発性物質
を減圧下除去し、残渣をノリ力ゲル（ＥＭ９３８５）フ
ラッシュ−クロマトグラフィーにかける。ヘキサン／酢
酸エチル（１：５）を用いて溶出すると淡黄色ガラス（
２４０ｍｇ）を得る。

実施例５ １−［（２−アミノエチルアミン）カルボニル］メチル
−７−クロロ−１，３−ジヒドロ−５−フェニル−２Ｈ
−１，４−ベンゾジアゼピン−２−オン（第１０図）の
製造法： ｌ−（カルボキシメチル）−７−クロロ−１，３−ジヒ
ドロ−５−フェニル−２Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン
−２−オン（３５ｍｇミリモル）、ジシクロへキシルカ
ルボジイミド（４，１ｍｇ、０．２ミリモル）、Ｎ−ヒ
ドロキシサクシンイミド（１３ｍｇ、０．１１ミリモル
）、およびピリジン（０，２５ミリモル）の混合物を室
温にて１時間攪拌する。エチレンジアミン（３０ｍｇ、
０．５ミリモル）を加えた後、この混合物をさらに５時
間攪拌する。その後、水を加え、水性混合物を酢酸エチ
ルを用いて抽出する（３回）。合わせた抽出物を食塩水
で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥する。この溶液を回
転蒸留すると粗生成分が得られ、これを酢酸エチルから
再結晶して、ＮＭＲスペクトルにおいて芳香族プロトン
を有しない無色の粉体（２４ｍｇ）を得る。

母液をプレパラティブＴＬＣ板（２０ｃｍＸ　２３０ｃ
ｍＸ０．５ｍｍ）に適用し、メタノール−水酸化アンモ
ニウム（９９：１）を用いて展開し、正確なＮＭＲスペ
クＩ・ルを与えるニンヒドリン陽性（またＵＶ活性）物
質（６、４ｍｇ）を得る。

ＤＴＡＦ　トレーサーの一般的製造法（Ｇｌ）アミン（
０，０１ミリモル）、ＤＴＡＦ（Ｉまたは■ＸＯ，Ｏｌ
ミリモル）、トリエチルアミン（２滴）およびメタノー
ル（０、１ｍ１２）の混合物を室温にて１６時間攪拌す
る。この混合物をプレパラティブシリカゲルＴＬＣ板上
に適用する。ＣＨＣＱｓ／ＭｅＯＨ（３：ｌ又は４：ｌ
）を用いて展開し、蛍光の帯を得、これを削り取り、メ
タノールで別々に溶出する。特定のケースでは、相対的
に純粋なトレーサーをアセトニトリル／リン酸緩衝溶液
（０゜０１Ｍ、ｐＨ５，３Ｘｌ：１％Ｖ／Ｖ）を展開液
として用いて逆相プレパラティブＴＬＣ板（ホワットマ
ン４８０３−−８００、ＫＣ−１８Ｆ２５４）上でさら
に精製する。

カルボキンフルオレセイントレーサー 製造法（Ｇ２） アミン（０．０１ミリモル）、フルオレセインカルボン
酸（ＶまたはＶｌ）−　０−サクシンイミドエステル（
０．０　１ミリモル）およびピリジン（０．１ｍ１２）
の混合物を室温にて１６時間攪拌する。この混合物をプ
レパラティブＴＬＣ板に適用する。ＣＨＣ’（２，／Ｍ
ｅＯＨ（３：ｌ又は４：１）を用いて展開し、蛍光の帯
を得て、板から削り得り、メタノールを用いて別々に溶
出する。

フルオレセインアミントレーサーの一般的製造方法（Ｇ
３） 乾燥ピリジン（０．１ｍＱ）中のカルボン酸（０．Ｏｌ
ミリモル）、ジンクロヘキンル力ルポジイミド（０．０
２ミリモル）およびＮ−ヒドロキシサクシンイミド（０
．０１２モル）の混合物を室温にて１時間攪拌する。生
成した活性エステルを次にフルオレセインアミン（異性
体ｌまたは２）を用いて同温にて１６時間処理する。こ
の反応混合物をプレパラティブンリ力ゲルＴＬＣ板（２
　０ｃｍＸ　２　０ｃｍＸＱ．５ｍｍ）に適用する。Ｃ
　Ｈ　Ｃ　Ｑｓ／　ＭｅＯ　Ｈ　（基質の極性に応じて
３：ｌまたは４：ｌ）を用いて展開し、蛍光の帯を得て
、板から削り取る。個々の帯をメタノールを用いて溶出
し、溶出液を集める。

実施例６ １−（２−アジドエチル）−７−クロロ−１．３−ジヒ
ドロ−５−フェニル−２Ｈ−１．４−ベンゾジアゼピン
−２−オン（第２２図）の製造法：無水Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルホルムアミド（ＤＭＦＸ３ｍｆ２）中の７−クロロ−
１．３−ジヒドロ−５−フェニル−２Ｈ−１．４−ベン
ゾジアゼピン−２−オン（２７０ｓｇ、１ミリモル）の
溶液に窒素雰囲気下、ナトリウムメトキシド（ナトリウ
ム（３０ｍｇ）およびメタノール（３−）から新しく調
製）を加える。　　　　　−二の混合物を油浴中、８５
°Ｃにおいて攪拌しなから１５分間加熱した後、ＤＭＦ
（２６０ｍｇ）中の２−アジドエチルメシレートの溶液
を加える。８時間攪拌後、この混合物を濃縮し、水およ
び塩化メチレン間に分配する（３回）。有機層を合せ、
水および食塩水で洗浄する（各１回）。硫酸マグネシウ
ムで乾燥し、この溶液を回転蒸留して粗生成物（３３５
ｍｇ）を得る。

実施例７ １−アミノエチル−７−クロロ−１，３−ジヒドロ−５
−フェニル−２Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−オ
ン（第９図）の製造法：実施例６で製造した粗アジド（
３１０ｍｇ）、プロパンジチオール（１−１ｍＩ２）、
およびトリエチルアミン（０、９ｍ１２）のメタノール
（３０ｍ（２）中の混合物を室温にて一晩攪拌する。こ
の混合物を水で希釈し、酢酸エチルで抽出する（３回）
。抽出物を合わせ、食塩水で洗浄し、乾燥する（硫酸マ
グネシウム）。この溶液を回転蒸留して粗残渣を得、こ
れをシリカゲル（１２０ｍ１２）フラッシュ−カラムク
ロマトグラフィーにかけ、メタノール−ＮＨ４０Ｈ（７
００：１）を用いて溶出して、高領域（３６０ＭＨ２）
プロトンＮＭＲスペクトルにより特定されたニンヒドリ
ン陽性およびＵＶ活性物質（１０９ｍｇ）を得る。

実施例８ ｌ−（３−アジドプロピル）−７−クロロ−５−フェニ
ル−２Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−オンの製造
法： エタノール中のカリウムエトキンド（１，０Ｍ。

０．３７５ｎ＋１２）から溶媒を除去した。ジメチルホ
ルムアミド（１、０ｍｆｆ）および７−クロロ−１，３
−ジヒドロ−５−フェニル−２Ｈ−１，４−ベンゾジア
ゼピン−２−オン（８１＋＋＋９）を加え、この混合物
を油浴中で１５分間８０°Ｃにて加熱する。室温にまで
冷却した後、ジメチルホルムアミド（０，１５ｍＱ）中
の３−アジドプロピルメタンスルホネート（８１ｍｇ）
を加え、この混合物を８０°Ｃの油浴中で１時間、再び
加熱すると、固化してゲルとなる。

ジクロロメタンおよび水の間に分配し、食塩水で洗浄し
、硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、溶媒を除去して
粗生成物を得、これをヘキサン−酢酸エチルを用いて展
開する薄層シリカゲル板上のクロマトグラフィーによっ
て精製して、標題の化合物を得る。

実施例９ ｌ−（３−アミノプロピル）−７−クロロ−１゜３−ジ
ヒドロ−５−フェニル−２Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピ
ン−２−オンの製造法： １−（３−アジドプロピル）−７−クロロ−１゜３−ジ
ヒドロ−５−フェニル−２Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピ
ン−２−オン（４０ｍｇ）およびトリフェニルホスフィ
ン（３５ｍｇ）の無水Ｔ　ＨＦ　（２’／ｚ　ｍ１２）
中の溶液を室温にて２４時間攪拌する。水（０，００２
６ｍ１２）を加え、攪拌を３時間以上続ける。揮発性物
質を除去し、標題の化合物およびトリフェニルホスフィ
ンオキシトの混合物を得、これをさらに精製することな
くトレーサーの製造に用いる。

実施例１０ ７−クロロ−１−（フルオレセイン−１１１ルメチルア
ミノ力ルポニルメチル）−５−フェニル−１，３−ジヒ
ドロ−２Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−オン（第
１９図）の製造法：実施例９に記載の如く調製した酸（
４０ミリグラム）をＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（２
ｍ１２）中に入れ、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（１
５ｍｇ）を加え、次に１．３−ジシクロへキシルカルボ
ジイミド（２８＋＋＋ｇ）を加える。室温にて１６時間
攪拌し続ける。これを濾過してアミノメチルフルオレセ
イン（４８ｍｇ）およびトリエチルアミン（２４ｍｇ）
のＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（３ｍ（２）中の溶液
に加える。この混合物を室温にて２４時間攪拌する。

朋 第１番目−ホワットマンＣ１８，２０Ｘ２０ｃｍ、／ｍ
ｍプレパラティブＴＣＬ板、溶媒系ニア０／３０１５メ
タノール、水、酢酸、Ｒｆ＝０．２第２番目　シリカゲ
ル、２０　Ｘ　２０ｃｍ、　／ｍｍプレパラティブＴＣ
Ｌ板、溶媒系：９０／ｌ　Ｏ塩化メチレン−メタノール
、Ｒｆ＝０．６５実施例１１ ３−　［（ｔ−ブトキシカルボニル）メチル］−７−ク
ロロ−Ｘ、３−ジヒドロ−１−メチル−５−フェニル−
２Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−オン（第２３図
）の製造法： 実施例３に記載の方法と同様の方法によりジアゼパムか
ら製造する。

実施例１２ ３−（カルボキシメチル）−７−クロロ−１，３−ジヒ
ドロ−１−メチル−５−フェニル−２Ｈ−１，４−ベン
ゾジアゼピン−２−オン（第１１図）の製造法： ｔｅｒｔ−ブトキン基を除去する方法は実施例４を参照
。

実施例１３ ７−クロロ−１，３−ジヒドロ−１−メチル−５−フェ
ニル−３−［（２−１リメチルシリルエトキシ）カルボ
ニルアミノメチル］−２Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン
−２−オン（第２４図）の製造法：カルポン酸（実施例
１２で製造、８５＋＋＋ｐ、０．２４８ミリモル）、ジ
フェニルホスホリルアジド（６８ｍｇ、０．２４８ミリ
モル）、トリエチルアミン（２５ｍｇ、０．２４８ミリ
モル）およびトルエン（１，５ｍｆ２）の混合物を窒素
雰囲気下８０°Ｃにて２時間攪拌する。２−（トリメチ
ルシリル）エタノール（５９ｍｇ、０．４９９ミリモル
）を加え、得られた混合物を同温度でさらに６時間攪拌
しながら、加熱する。

室温にまで冷却した後、混合物を水と酢酸エチルとの間
に分配する。合わせた有機相を食塩水で洗浄しく１回）
、硫酸マグネシウムで乾燥する。この溶液を回転蒸留し
て油（１７１ｍｇ）を得る。サンプルの３分の１をプレ
パラティブＴＬＣ板（シリカゲル、２０ｃｍＸ　２０ｃ
ｍＸ　２ｍｍ）に適用する。酢酸エチル／ヘキサン（５
：ｌ）で展開して主要な帯（Ｒｆ＝０．５２）を得、板
を削り取り、メタノールで溶出して油（２６ｍｇ）を得
る。

実施例１４ ３−アミノメチル−７−クロロ−１，３−ジヒドロ−１
−メチル−５−フェニル−２Ｈ−１，４−ベンゾジアゼ
ピン−２−オン（第１２図）の製造法： カルバメート（実施例１３により製造、２４ｍｇ、０．
０５２ミリモル）のＴ　ＨＦ　（ｌ　ｍｌｌり中の溶液
にＴＨＦ中の（ｎ−Ｂｕ）、ＮＦ（ＩＭ、０．２１ｍＱ
）を注射器を用いて加える。得られた溶液を５０℃にて
３０分間攪拌し、酢酸エチルを加え、希釈した混合物を
塩化アンモニウムおよび水で洗浄する（各１回）。硫酸
マグネシウムで乾燥後、この溶液を回転蒸留して油（２
５ｍｇ）を得る。

実施例ｌ５ １−　（２−［４−クロロ−２−（フルオレセイン−５
−イルアミノ）−１，３，５−トリアジン−６−イルア
ミノ］エチル）−７−クロロ−１，３−’；ヒドロー５
−フェニルー２Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２Ｈ−
オンの製造法ニ一 般的方法（Ｇｌ）により製造する実 施例１６ １−（２−［４−クロロ−２−［フルオレセイン−６−
イルアミノ）−１，３，５−トリアジン−６−イルアミ
ノ］エチル）−７−クロロ−１，３−ジヒドロ−５−フ
ェニル−２Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−オン（
第１５図）の製造法ニ一般的方法（Ｇｌ）により製造す
る。

実施例１７ １−［２−（フルオレセイン−５−イルカルボニル）ア
ミノエチル］−７−クロロ−１，３−ジヒドロ−５−フ
ェニル−２Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−オン（
第１４図）の製造法ニ一般的方法（Ｇ２）により製造す
る。

実施例１８ １−［２−（フルオレセイン−６−イルカルボニルアミ
ノ）エチル］−７−クロロー１．３−ジヒドロ−５−７
エニルー２Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−オンの
製造法ニ 一般的方法（Ｇ２）で製造する。

実施例１９ １−［（フルオレセイン−５−イルアミノ）カルボニル
メチル］−７−クロロ−１，３−ジヒドロ−５−フェニ
ル−２Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−オンの製造
法ニ 一般的方法（Ｇ３）で製造する。

実施例２０ ■−（フルオレセイン−６−イルアミツカルポニルメチ
ル）−７−クロロ−１，３−’；ヒドロー５−７エニル
ー２Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−オンの製造法
ニ 一般的方法（Ｇ３）により製造する。

実施例２１ １−（（２−［４−クロロ−２−（フルオレセイン−５
−イルアミノ）−１，３，５−）リアジン−６−イルア
ミノコエチル）アミノカルボニルメチル】−７−クロロ
−１，３−ジヒドロ−５−７エニルー２Ｈ−１，４−ベ
ンゾジアゼピン−２−オンの製造法ニ 一般的方法（Ｇｌ）により製造する。

実施例２２ ■−（（２−［４−クロロ−２−（フルオレセイン−６
−イルアミノ）−１，３，，５−トリアジン−６−イル
アミノコエチル）アミノカルボニルメチル】−７−クロ
ロ−１，３−ジヒドロ−５−７エニルー２Ｈ−１，４−
ベンゾジアゼピン−２−オン（第１６図）の製造法ニ 一般的方法（Ｇ１）により製造する。

実施例２３ １−１［２−（フルオレセイン−５−イルカルボニルア
ミノ）エチル１アミノカルボニルメチル）−７−りｏａ
〜１．３−’、；ヒドロー５−フェニルー２Ｈ−１，４
−ベンゾジアゼピン−２−オンの製造法ニ 一般的方法（Ｇ３）により製造する。

実施例２４ １−　ｆ［２−（フルオレセイン−６−イルカルボニル
アミノ）エチル１アミノカルボニルメチル）−７−クロ
ロ−１，３−ジヒドロ−５−７エニルー２Ｈ−１，４−
ベンゾジアゼピン−２−オンの製造法ニ 一般的方法（Ｇ２）により製造する。

実施例２５ １−　＋３−（２−［フルオレセイン−６−イルアミノ
］−４−クロロ−１，３，５−トリアジン−２＝イルア
ミノ）プロピル］　−７−クロロ−１，３−ジヒドロ−
５−フェニル−２Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−
オン（第１７図）の製造法：メタノール（０，２ｍｆｆ
）中の１−（３−アミノプロピル）−７−クロロ−１，
３−ジヒドロ−５−フェニル−２Ｈ−１，４−ベンゾジ
アゼピン−２−オン（１１ミクロモル）および２−（フ
ルオレセイン−６−イルアミノ）−４，６−ジクロロ−
１，３，５−トリアジン（５，８ｍｇ）の溶液を室温に
て１５分間攪拌する。トリエチルアミン（ｌ当量、０．
００１５ｍｆ２）を加え、２７時間攪拌し続ける。粗生
成物をクロロホルム−メタノールを用いて１回、ベンゼ
ン−酢酸エチル−アセトンを用いて１回、シリカゲル薄
層クロマトグラフィーに２回かけて純粋な共役物を得る
。

実施例２６ １−（３−［フルオレセイン−６−イルカルボニルアミ
ノコプロピル）−７−クロロ−１，３−ジヒドロ−５−
７エニルー２Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−２−オン
（第１８図）の製造法ニジメチルホルムアミド（０，１
５ｍ１２）中の１−（３−アミノブロピル）−７−クロ
ロ−１，３−ジヒドロ−５−フェニル−２Ｈ−１，４−
ベンゾジアゼピン−２−オン（１１ミクロモル）および
６−（Ｎ−サクシンイミジルオキシカルポニル）フルオ
レセインＣ５，２ｍｇ）の溶液を室温にて４　ｌ／２時
間攪拌する。減圧下、溶媒を除去し、粗生成物をクロロ
ホルム−メタノールを用いて１回およびベンゼン−酢酸
エチル−アセトンを用いて１回、シリカゲル薄膜クロマ
トグラフィーに２回かけて精製し、純粋な共役物を得る
。

実施例２７ ■−メチル−７−［２−（フルオレセイン−５−イルア
ミノ）−４−クロロ−１，３，５−トリアジン−６−イ
ルアミノ］−１−メチル−７−アミノ−１，３−ジヒド
ロ−５−フェニル−２Ｈ−１，４−ベンゾジアゼピン−
２−オン（第２０図）の製造法ニ アーアミノー１−メチルー１．３−ジヒドロ−５−フェ
ニル−２Ｈ−１，４−ペンツジアゼピン−２−オン（１
３，３ｍｇ）、トリエチルアミン（０、０２１ｍＱ）お
よび２−（フルオレセイン−５−イルアミノ）−４，６
−ジクロロ−１，３，５−トリアジン（２６，５７１ｇ
）の混合物をメタノール（０、５ｍｆｆ）中、周囲の温
度にて１晩攪拌する。粗反応混合物を、クロロホルム−
メタノールを用いてシリカゲル薄層クロマトグラフィー
にかけ、純粋な共役物を得る。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に従って定量的にまたは定性的に検出さ
れるべきベンゾジアゼピン類の基本的溝道を示し、これ
らの化合物に用いられる位置番号の付は方も示す。 第２図は本発明におけるハプテン、免疫原、トレーサー
およびトレーサー前駆体の−ａ％造式第３図は本発明の
トレーサーに含まれるフルオレセイン部分の互変構造式
を示し、その名前および位置番号付けも合せて示す。 第４図は本発明におけるより好ましい免疫原の一般的構
造式を示す。 第５図は本発明の好ましいトレーサーの一般的構造式を
示す。 第６図は本発明の好ましいトレーサブ一般的構造式を示
す。 第７−１図〜第７−１Ｏ図はフルオレセイン部分を第２
図のトレーサー前駆体にカップリングする種々の結合を
示す。 第８図から第１２図は本発明に係る免疫原およびトレー
サーを形成するために用いられるハプテン反応剤の種々
の具体例を示す。 第１３図は本発明により製造された免疫原の１具体例を
示す。 第１４図〜第２０図は本発明のトレーサーの種々の具体
例の構造を示す。 第２１図〜第２４図は本発明のハプテンおよびトレーサ
ー前駆体の合成に用いられる合成中間体の種々の具体例
を示す。 図面中、記号「ＦＱ」はフルオレセインまたはフルオレ
セイン誘導体を意味する。 Ｆｉｇ、ｌ Ｆｉｇ、　　２ Ｌａｃｔｏｎｅ　　　　　　　　　　ＡｃＨｄＦｉｇ、
　　３ Ｆ工ｑ、　４　　　　　　　　　　　　　　　　Ｆ　Ｌ
ｑ　、５Ｆｉｇ、１５ −ＮＨ−Ｃｏ−ＦＩ Ｆｉｇ、　　７７− ４−ＮＨ−Ｃｏ−ＮＨ−Ｆ ＩＦｉ、　　７７− ７−６−Ｃｏ−ＮＨ−Ｆ ＩＦｉ、７−９ −Ｃｏ−Ｎ）ｌ−Ｆｌ　　　　　　　　　　　　　　−
ＣＮＨ−ＮＨ−ＦＩＦｉｇ、　７−５　　　　　　　　
　　　　　Ｆｉｇ、　７−６−ドコＨ−Ｃ３−ＮＨ−Ｆ
Ｉ Ｆ’ｉｇ、　　７−８ −Ｏ−ＣＳ−ミｉコＨ−ＦＩ Ｆｉｇ、　　７−１０ Ｆ１９．１６ Ｆ１９．１８ Ｆｘｑ−２１ Ｆｉｇ、２３ Ｆｉｇ、２２ Ｆｉｇ、２４ 手続補正書坊式） ２、発明の名称 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　　アメリカ合衆国イリノイ　６００６４．４、代
理人

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. （１）式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ＸはＣＨ、Ｎ、またはＣ−ハロゲン、Ｒ＾１は
   −Ｈ、−ＣＨ＿３または−Ｒ−Ｚ−Ｑ、Ｒ＾２は−Ｈま
   たは−ＯＨ、 Ｒ＾３は−Ｏ、または非結合性電子対、 Ｒ＾４は、Ｒ＾１が−Ｈまたは−ＣＨ＿３の場合には、
   −Ｒ−Ｚ−Ｑ、またはＲ＾１が−Ｒ−Ｚ−Ｑの場合には
   、ハロゲン、−ＮＯ＿２、−ＮＨ＿２または−ＮＨＣＯ
   ＣＨ＿３であり、 Ｒは０〜２０個の炭素原子およびヘテロ原子からなる連
   結基であり、それは１２個以下のヘテロ原子を含む直鎖
   または分枝鎖からなり、２個までの環状構造を含んでい
   る。ただし、ヘテロ原子は４個を超えて連続して結合せ
   ず、２個以上のイオウ原子または窒素原子および１個の
   酸素原子が連続して結合してはいない、 ＺはＣ＝Ｏ、Ｃ＝ＮＨ、ＮＨ、ＮＣＨ＿３、−Ｎ＝Ｎ−
   、ＳＯ＿２またはＣＨ＿２であり、 Ｑは水素、ヒドロキシ、ハロゲン、アシルオキシ、Ｎ−
   サクシンイミジルオキシ、Ｎ−フタルイミジルオキシ基
   、アルコキシ、フェノキシ、置換フェノキシ、Ｎ−イミ
   ダゾリル、１−ベンゾトリアゾリルオキシまたはポリ（
   アミノ酸）、ポリ（アミノ酸）誘導体または他の免疫原
   性キャリア物質、またはフルオレセインのアミノ、アミ
   ド、アミジン、尿素、チオ尿素、カルバメート、チオカ
   ルバメート、トリアジニルアミノまたは（カルボキシア
   ミノ）−スルホンアミド誘導体である］ で示される化合物。
2. （２）Ｑが牛血清アルブミンである第１項に記載の化合
   物。
3. （３）Ｑがフルオレセインのトリアジニルアミノ誘導体
   である第１項に記載の化合物。
4. （４）Ｑが４−クロロ−６−（フルオレセイン−６−イ
   ルアミノ）−１，３，５−トリアジン−２−イル、フル
   オレセイン−５−イルカルボニル、またはフルオレセイ
   ン−６−イルカルボニルである第１項に記載の化合物。
5. （５）Ｑが（フルオレセイン−５−イルアミノ）カルボ
   ニルまたは（フルオレセイン−６−イルアミノ）カルボ
   ニルである第１項に記載の化合物。
6. （６）Ｑが（フルオレセイン−５−イル）アミノまたは
   （フルオレセイン−６−イル）アミノである第１項に記
   載の化合物。
7. （７）Ｑが非酵素的ポリ（アミノ酸）または非酵素的ポ
   リ（アミノ酸）誘導体または他の免疫学的に活性なキャ
   リアである第１項に記載の化合物に対する抗体。
8. （８）式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ＸはＣＨ、Ｎ、またはＣ−ハロゲン、Ｒ＾１は
   −Ｈ、−ＣＨ＿３または−Ｒ−Ｚ−Ｑ、Ｒ＾２は−Ｈま
   たは−ＯＨ、 Ｒ＾３は−Ｏ、または非結合性電子対、 Ｒ＾４は、Ｒ＾１が−Ｈまたは−ＣＨ＿３の場合には、
   −Ｒ−Ｚ−Ｑ、またはＲ＾１が−Ｒ−Ｚ−Ｑの場合には
   、ハロゲン、−ＮＯ＿２、−ＮＨ＿２または−ＮＨＣＯ
   ＣＨ＿３であり、 Ｒは０〜２０個の炭素原子およびヘテロ原子からなる連
   結基であり、それは１２個以下のヘテロ原子を含む直鎖
   または分枝鎖からなり、２個までの環状構造を含んでい
   る。ただし、ヘテロ原子は４個を超えて連続して結合せ
   ず、２個以上のイオウ原子または窒素原子および１個の
   酸素原子が連続して結合してはいない、 ＺはＣ＝Ｏ、Ｃ＝ＮＨ、ＳＯ＿２、ＮＨ、ＮＣＨ＿３ま
   たはＣＨ＿２、および Ｑは水素、ヒドロキシル、またはポリ（アミノ酸）、ポ
   リ（アミノ酸）誘導体または他の免疫原性キャリアを有
   する除去しうる基（ただし、ＺがＣＨ＿２である場合、
   Ｑは水素ではない）である］で示される前駆体をカップ
   リングする工程からなることを特徴とする抗原の製造方
   法。
9. （９）ＺＱがＮＨ＿２またはＣＯ＿２Ｈであり、前駆体
   をＮ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−エ
   チル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイ
   ミドまたは１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノ
   エチル）−カルボジイミド・メソ−ｐ−トルエンスルホ
   ネートを加えてポリ（アミノ酸）と反応させてカップリ
   ングする第８項に記載の方法。
10. （１０）ＺＱがＮＣＨ＿３またはＮＨ＿２であり、前駆
    体を１−エチル−２−（３−ジメチルアミノプロピル）
    カルボジイミドを加えることによりポリ（アミノ酸）と
    反応させてカップリングする第８項に記載の方法。
11. （１１）ＺＱがＮＨＣＨ＿３、ＮＨ＿２またはＣＨ＿２
    ＯＨであり、ＸがＮであり、前駆体を、 （ａ）ホスゲンまたはチオホスゲンと反応させる工程、 （ｂ）工程（ａ）の生成物をポリ（アミノ酸）と反応さ
    せる工程、 によりカップリングする第８項に記載の方法。
12. （１２）式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ＸはＣＨ、Ｎ、またはＣ−ハロゲン、Ｒ＾１は
    −Ｈ、−ＣＨ＿３または−Ｒ−Ｚ−Ｑ、Ｒ＾２は、Ｒ＾
    １およびＲ＾４がいずれも−Ｒ−Ｚ−Ｑではない場合は
    、−Ｒ−Ｚ−Ｑ、またはＲ＾２は−Ｈまたは−ＯＨ、 Ｒ＾３は−Ｏ、または非結合性電子対、 Ｒ＾４は、Ｒ＾１およびＲ＾２がいずれも−Ｒ−Ｚ−Ｑ
    でない場合は、−Ｒ−Ｚ−Ｑ、またはＲ＾４は−ハロゲ
    ン、−ＮＯ＿２、−ＮＨ＿２または−ＮＨＣＯＣＨ＿３
    、Ｒは０〜２０個の炭素原子およびヘテロ原子からなる
    連結基であり、それは１２個以下のヘテロ原子を含む直
    鎖または分枝鎖からなり、２個までの環状構造を含んで
    いる。ただし、ヘテロ原子は４個を超えて連続して結合
    せず、２個以上のイオウ原子または窒素原子および１個
    の酸素原子が連続して結合してはいない、 ＺはＮＨ、ＣＯ、ＳＯ＿２またはＣ＝ＮＨであり、Ｑは
    −Ｈ、−ＯＨ、または除去しうる基である］で示される
    前駆体をフルオレセンまたはフルオレセン誘導体とカッ
    プリングする工程からなることを特徴とするトレーサー
    の製造方法。
13. （１３）ＺＱがＮＨ＿２であり、前駆体を （ａ）カルボキシフルオレセインの活性エステルを製造
    する工程、 （ｂ）この活性エステルを前駆体と反応させる工程、 によりカップリングする第１２項に記載の方法。
14. （１４）ＺＱがＣＯ＿２Ｈであり、前駆体を、（ａ）前
    駆体の活性エステルを製造する工程、（ｂ）この活性エ
    ステルをアミノフルオレセインと反応させる工程、 によりカップリングする第１２項に記載の方法。
15. （１５）ＺＱがＮＨ＿２であり、前駆体を（４，６−ジ
    クロロ−１，３，５−トリアジン−２−イルアミノ）フ
    ルオレセインまたはフルオレセインイソチオシアネート
    と反応させる第１２項に記載の方法。
16. （１６）前駆体を （ａ）前駆体のイミデートエステルを製造する工程、 （ｂ）このイミデートをアミノフルオレセインと反応さ
    せる工程、 によりカップリングする第１２項に記載の方法。
17. （１７）ＱがＯＨであり、前駆体を（４，６−ジクロロ
    −１，３，５−トリアジン−２−イルアミノ）フルオレ
    セインと反応させることによりカップリングする第１２
    項に記載の方法。
18. （１８）（ａ）サンプルをベンゾジアゼピン誘導体の抗
    血清およびベンゾジアゼピン類誘導体抗血清の存在に対
    して検出可能な蛍光偏光反応を生じ得る第１項に記載の
    化合物と接触させる工程、（ｂ）工程（ａ）で得た溶液
    に平面偏光を通して蛍光偏光反応を生じさせる工程、お
    よび （ｃ）サンプル中のベンゾジアゼピン類およびベンゾジ
    アゼピン代謝物の存在を測定するために工程（ｂ）の溶
    液の蛍光偏光反応を検出する工程、からなるベンゾジア
    ゼピン類およびベンゾジアゼピン代謝物の存在を検出す
    る方法。
19. （１９）ベンゾジアゼピン誘導体抗血清を第７項に記載
    の抗体により生成させる第１８項に記載の方法。