JPS63226291A - 酵素によるポリエステルの製造方法,光学活性カルボン酸およびエステルの製造方法,およびポリエステルを含む製品 - Google Patents
酵素によるポリエステルの製造方法,光学活性カルボン酸およびエステルの製造方法,およびポリエステルを含む製品Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/62—Carboxylic acid esters
- C12P7/625—Polyesters of hydroxy carboxylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
- C08G63/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carboxylic ester link in the main chain of the macromolecule
- C08G63/02—Polyesters derived from hydroxycarboxylic acids or from polycarboxylic acids and polyhydroxy compounds
- C08G63/06—Polyesters derived from hydroxycarboxylic acids or from polycarboxylic acids and polyhydroxy compounds derived from hydroxycarboxylic acids
-
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
本発明は、栄養源制限下における微生物の好気的培養に
よるポリエステルの製造方法に関する。
よるポリエステルの製造方法に関する。
(従来の技術)
このタイプの方法はヨーロッパ特許公開公報第0015
669号に開示されている。そこでは、P貼と呼ばれる
ポリ(3−ヒドロキシ醋酸)の調製が述べられている。
669号に開示されている。そこでは、P貼と呼ばれる
ポリ(3−ヒドロキシ醋酸)の調製が述べられている。
この調製は、あるメチロバクテリウムオルカノフィラム
(助ぷ犯■徂は町力担 肛計吠−画旦堕し株の栄養源制
限、特に窒素および/またはリンの制限下における好気
培養による。使用し得る炭素源は、安価なメタノールで
ある。他の微生物もまたPHBの製造を目的として提案
されている。それには例えば、ヨーロッパ特許公開公報
第0046344号に開示されているアルカリゲネス(
^1cali−=脛匝s )種および八pp1. Mi
crobiol、 Biotechnol、 23(1
986) 322−329に記述のあるシュードモナス
μ迫里Ldomonas)株がある。
(助ぷ犯■徂は町力担 肛計吠−画旦堕し株の栄養源制
限、特に窒素および/またはリンの制限下における好気
培養による。使用し得る炭素源は、安価なメタノールで
ある。他の微生物もまたPHBの製造を目的として提案
されている。それには例えば、ヨーロッパ特許公開公報
第0046344号に開示されているアルカリゲネス(
^1cali−=脛匝s )種および八pp1. Mi
crobiol、 Biotechnol、 23(1
986) 322−329に記述のあるシュードモナス
μ迫里Ldomonas)株がある。
微生物学的手段により生産されるP貼は、生分解性であ
り2式−CO−CHg−Cll(C113)−0−を有
する単位から構成される光学活性のポリエステルである
。
り2式−CO−CHg−Cll(C113)−0−を有
する単位から構成される光学活性のポリエステルである
。
このバイオポリマーは非常に興味深い性質を有しており
、そして、多くの用途に用いられ得る。このポリマーは
他の熱可塑性プラスチングと同様に型に入れ成型でき、
無機充填剤で補強でき、繊維に紡ぐことができ、そして
良好な気体遮断特性を有するフィルムの調製に使用でき
る。この生分解性のPIIBは、非生分解性のポリマー
とともに混合ポリマー形に変換できる。具体的な利用に
は、 PIIBによる外科用糸および人工皮膚または人
工骨の調製がある。また、光学活性PIIBは、光学活
性モノマーに変換され得(それは化学的手段によっては
光学的に純粋な形には容易に製造することができない)
、有機化学的変換2例えば薬剤の合成、の適当な出発材
料となる。
、そして、多くの用途に用いられ得る。このポリマーは
他の熱可塑性プラスチングと同様に型に入れ成型でき、
無機充填剤で補強でき、繊維に紡ぐことができ、そして
良好な気体遮断特性を有するフィルムの調製に使用でき
る。この生分解性のPIIBは、非生分解性のポリマー
とともに混合ポリマー形に変換できる。具体的な利用に
は、 PIIBによる外科用糸および人工皮膚または人
工骨の調製がある。また、光学活性PIIBは、光学活
性モノマーに変換され得(それは化学的手段によっては
光学的に純粋な形には容易に製造することができない)
、有機化学的変換2例えば薬剤の合成、の適当な出発材
料となる。
しかし、 P貼の欠点は、このポリマーの化学構造の変
更が容易ではないということである。この欠点は、米国
特許第4,477.654号によれば、アルカリゲネス
種の好気培養を、少なくとも一部においては、カルボン
酸(例えばプロピオン酸)、またはアルカリ金属塩また
はその低級アルキルエステルの存在下で1行うことによ
り回避できる。このようにして形成されたバイオポリマ
ーは、構造式−Co−CI□−CIl (Cll:+)
−0−を有する3−ヒドロキシ醋酸エステル残基と、構
造式−GO−CIlg−(Jl(Czlls)−0−を
有する残基のような他のヒドロキシ酸残基(50モル%
を下回る)から形成される。しかし、この既知の方法に
おいても、変更の可能性は極めて制限されている。
更が容易ではないということである。この欠点は、米国
特許第4,477.654号によれば、アルカリゲネス
種の好気培養を、少なくとも一部においては、カルボン
酸(例えばプロピオン酸)、またはアルカリ金属塩また
はその低級アルキルエステルの存在下で1行うことによ
り回避できる。このようにして形成されたバイオポリマ
ーは、構造式−Co−CI□−CIl (Cll:+)
−0−を有する3−ヒドロキシ醋酸エステル残基と、構
造式−GO−CIlg−(Jl(Czlls)−0−を
有する残基のような他のヒドロキシ酸残基(50モル%
を下回る)から形成される。しかし、この既知の方法に
おいても、変更の可能性は極めて制限されている。
(発明の構成)
本発明者が属している研究グループは、シュードモナス
オレオボランス(Pseudo印几特o1eovor
ans)種の微生物の研究を行っている。種々のシュー
ドモナス種は炭素源として直鎖または芳香族炭化水素を
用いることにより生育でき、資化は酸素付加で始まる。
オレオボランス(Pseudo印几特o1eovor
ans)種の微生物の研究を行っている。種々のシュー
ドモナス種は炭素源として直鎖または芳香族炭化水素を
用いることにより生育でき、資化は酸素付加で始まる。
この酸素付加はオキシゲナーゼにより触媒され、その遺
伝情報は大部分プラスミドに関係している。そのプラス
ミドとは、既知のOCT、 CAM。
伝情報は大部分プラスミドに関係している。そのプラス
ミドとは、既知のOCT、 CAM。
TOL、 XYIl、 S’AL、およびN^1■プラ
スミドであり、それぞれ6〜12個の炭素原子を含むn
−アルカン;カンファー;トルエン、m−キシレンおよ
びp−キシレン;サリチル酸塩;およびナフタレンの分
解の第1段階を行うことができる。モノオキシゲナーゼ
ω−ヒドロキシラーゼをコードするOCTプラスミドを
含むシュードモナス オレオボランス株は、6〜12個
の炭素原子を含むn−アルカンで生育し得る。なぜなら
、末端のメチル基はヒドロキシメチル基に変換され、そ
の後、そのアルデヒドおよびそのカルボン酸を経て変換
され、正常な代謝に適合する産物を生じる。これらの株
はまた。
スミドであり、それぞれ6〜12個の炭素原子を含むn
−アルカン;カンファー;トルエン、m−キシレンおよ
びp−キシレン;サリチル酸塩;およびナフタレンの分
解の第1段階を行うことができる。モノオキシゲナーゼ
ω−ヒドロキシラーゼをコードするOCTプラスミドを
含むシュードモナス オレオボランス株は、6〜12個
の炭素原子を含むn−アルカンで生育し得る。なぜなら
、末端のメチル基はヒドロキシメチル基に変換され、そ
の後、そのアルデヒドおよびそのカルボン酸を経て変換
され、正常な代謝に適合する産物を生じる。これらの株
はまた。
■−オクテンおよび1.7−オクタジエンのような種々
の不飽和炭化水素に生育できることが見出されており、
その第1の段階は、しばしば1.2−エポキサイドの形
成である。
の不飽和炭化水素に生育できることが見出されており、
その第1の段階は、しばしば1.2−エポキサイドの形
成である。
De Smet らがJ、Bacteriol、 15
4 (1983) 870−878で述べているように
、シュードモナス オレオボラyスTF4−IL(AT
CC29347)(7)、 20〜50%(V/V)
(7)n−オクタンを含む栄養培地での培養において。
4 (1983) 870−878で述べているように
、シュードモナス オレオボラyスTF4−IL(AT
CC29347)(7)、 20〜50%(V/V)
(7)n−オクタンを含む栄養培地での培養において。
細胞中には封入体が存在した。この封入体は1例えばバ
チルス セレウス(B a c i I l u s
印匹叩) (7)既知のポリ−β−ヒドロキシ醋酸エ
ステル封入体に似た封入体である。さらに、これらの封
入体は少なくとも一部は構造式−Co−CH2−CIl
(C5II+ +)−0−を有するβ−ヒドロキシオク
タン酸エステルの単位から構成されるポリマー物質を含
んでいることが示された。
チルス セレウス(B a c i I l u s
印匹叩) (7)既知のポリ−β−ヒドロキシ醋酸エ
ステル封入体に似た封入体である。さらに、これらの封
入体は少なくとも一部は構造式−Co−CH2−CIl
(C5II+ +)−0−を有するβ−ヒドロキシオク
タン酸エステルの単位から構成されるポリマー物質を含
んでいることが示された。
広範囲のポリエステル型のバイオポリマーがシュードモ
ナス オレオボランス細菌の好気培養で製造され得るこ
とが、現在では見出されている。
ナス オレオボランス細菌の好気培養で製造され得るこ
とが、現在では見出されている。
そして、これが本発明の本質である。この方法において
は、このバイオポリマーの化学構造または組成が基質を
選ぶことにより容易に制御され得る。
は、このバイオポリマーの化学構造または組成が基質を
選ぶことにより容易に制御され得る。
本発明においては、側鎖の長さが調節され得、そして、
所望の位置に末端二重結合を有するポリエステル型バイ
オポリマーの生産が可能となる。
所望の位置に末端二重結合を有するポリエステル型バイ
オポリマーの生産が可能となる。
本発明方法は、シュードモナス オレオボランス細菌を
、過剰の炭素源と生育に必須の他の栄養源の少なくとも
1種の制限量とを含有する栄養培地で、好気条件下にて
培養することを特徴とする。
、過剰の炭素源と生育に必須の他の栄養源の少なくとも
1種の制限量とを含有する栄養培地で、好気条件下にて
培養することを特徴とする。
上記炭素源は、少なくとも1種の資化可能な非環式脂肪
族炭化水素化合物を含み、そして必要に応じて形成され
たバイオポリマーを細胞から回収する。
族炭化水素化合物を含み、そして必要に応じて形成され
たバイオポリマーを細胞から回収する。
飽和側鎖を含むバイオポリマーのみを生ずる本発明の方
法は、構造式(1)を有する単位から構成されるポリエ
ステルの生産によって特徴づけられる。
法は、構造式(1)を有する単位から構成されるポリエ
ステルの生産によって特徴づけられる。
0 (CIlz) −Ctl+
−CC1(z Cll O,(1)(ここで1mは
2〜8の整数である。)この生産は、6〜12個の炭素
原子を含む1種またはそれ以上のパラフィン、またはパ
ラフィン酸化物を含む炭素源を用いて行われる。ここで
使用される“パラフィン酸化物°゛という用語は5アル
カノール、アルカナール、およびアルカン酸を意味し、
それらはパラフィン分解の中間体として生じる。これら
他の基質は、シュードモナス オレオボランス株をOC
Tプラスミドが存在しない状態で。
2〜8の整数である。)この生産は、6〜12個の炭素
原子を含む1種またはそれ以上のパラフィン、またはパ
ラフィン酸化物を含む炭素源を用いて行われる。ここで
使用される“パラフィン酸化物°゛という用語は5アル
カノール、アルカナール、およびアルカン酸を意味し、
それらはパラフィン分解の中間体として生じる。これら
他の基質は、シュードモナス オレオボランス株をOC
Tプラスミドが存在しない状態で。
そして少なくとも活性パラフィンヒドロキシラーゼが存
在しない状態で用いられる場合に、特に好適である。パ
ラフィン酸化物の炭素原子数は、あるいは、6〜12個
の範囲を外れる範囲(例えば4個または14個の炭素原
子)であり得る。なぜなら。
在しない状態で用いられる場合に、特に好適である。パ
ラフィン酸化物の炭素原子数は、あるいは、6〜12個
の範囲を外れる範囲(例えば4個または14個の炭素原
子)であり得る。なぜなら。
パラフィンの6〜12個という炭素原子の制限は。
パラフィン−ヒドロキシラーゼ系の制限に関係するため
である。
である。
パラフィン(またはパラフィン酸化物)は、好ましくは
、側鎖のない化合物であるが、側鎖のある化合物も同様
に用いられ得、ポリマーになり得る。
、側鎖のない化合物であるが、側鎖のある化合物も同様
に用いられ得、ポリマーになり得る。
飽和および不飽和側鎖の両方を含むポリマーを生産する
本発明の方法は、構造式(1)を有する単位と構造式(
2)を有する単位とで構成されるポリエステルの生産に
よって特徴づけられる。
本発明の方法は、構造式(1)を有する単位と構造式(
2)を有する単位とで構成されるポリエステルの生産に
よって特徴づけられる。
(Cll2)lIC113
+1 1
−C−C1lz Cll O(1)0 (C
112)−−ICII=CH2−C−CH2CHO(2
) (ここで1mは2〜8の整数である。)この生産は、6
〜12個の炭素原子を含み1側鎖を持たない1種または
それ以上の1−アルケン、および必要に応じて6〜12
個の炭素原子を含み、側鎖を持たない1種またはそれ以
上のパラフィンまたはパラフィン酸化物を含む炭素源を
用いて行われる。1−アルケンを唯一の炭素源として用
いる場合においても、生成するバイオポリマーの側鎖の
一部は飽和している。しかし、飽和および不飽和側鎖の
比率は、基質の混合物(例えばオクタンおよびオクテン
)を用いることにより変化させ得る。
112)−−ICII=CH2−C−CH2CHO(2
) (ここで1mは2〜8の整数である。)この生産は、6
〜12個の炭素原子を含み1側鎖を持たない1種または
それ以上の1−アルケン、および必要に応じて6〜12
個の炭素原子を含み、側鎖を持たない1種またはそれ以
上のパラフィンまたはパラフィン酸化物を含む炭素源を
用いて行われる。1−アルケンを唯一の炭素源として用
いる場合においても、生成するバイオポリマーの側鎖の
一部は飽和している。しかし、飽和および不飽和側鎖の
比率は、基質の混合物(例えばオクタンおよびオクテン
)を用いることにより変化させ得る。
本発明のこの変法は、特に利点を有している。
末端の二重結合のために、得られるバイオポリマーは側
鎖の割合を制御して化学的に容易に修飾または他のポリ
マー鎖と架橋し得る。
鎖の割合を制御して化学的に容易に修飾または他のポリ
マー鎖と架橋し得る。
本発明の好適な実施態様は、6個の炭素原子を有する1
種またはそれ以上の基質を用いて、側鎖が3個の原子を
有する(m=2)ポリエステルを生産することにより特
徴づけられる。ヘキセン。
種またはそれ以上の基質を用いて、側鎖が3個の原子を
有する(m=2)ポリエステルを生産することにより特
徴づけられる。ヘキセン。
またはヘキセンおよびヘキサンを含む基質を用いる場合
には、バイオポリマーの側鎖の一部は末端二重結合を含
む。
には、バイオポリマーの側鎖の一部は末端二重結合を含
む。
本発明の他の好適な実施態様は、7個の炭素原子を有す
る1種またはそれ以上の基質を用い、側鎖が4個の炭素
原子を有する(m=3)ポリエステルを調製することに
より特徴づけられる。側鎖の一部に末端二重結合を有す
るポリエステルは。
る1種またはそれ以上の基質を用い、側鎖が4個の炭素
原子を有する(m=3)ポリエステルを調製することに
より特徴づけられる。側鎖の一部に末端二重結合を有す
るポリエステルは。
用いられる基質がヘプテン、またはヘプテンおよびヘプ
タンである場合に得られる。
タンである場合に得られる。
上記の好適な実施態様は両者とも2本質的に。
全ての側鎖が同数の炭素原子を有するポリエステ ・ル
の生産である。以下に述べる好適な実施態様は。
の生産である。以下に述べる好適な実施態様は。
そのような例ではない。
本発明のそのような好適な実施態様は、6個の炭素原子
を有する1種またはそれ以上の基質と7個の炭素原子を
有する1種またはそれ以上の基質を用い、側鎖が3個お
よび4個の炭素原子を有する(m−2および3)共重合
ポリエステルの生産により特徴づけられる。これらおよ
び全ての他の実施態様において、基質の選択およびその
お互いの比率の両者において多くの変更が可能であり。
を有する1種またはそれ以上の基質と7個の炭素原子を
有する1種またはそれ以上の基質を用い、側鎖が3個お
よび4個の炭素原子を有する(m−2および3)共重合
ポリエステルの生産により特徴づけられる。これらおよ
び全ての他の実施態様において、基質の選択およびその
お互いの比率の両者において多くの変更が可能であり。
そして、これらの変更は、バイオポリマーにおける種々
の側鎖の比率を事実上無限に変えることができる。従っ
てこの実施態様においては1次の組合せが用いられ得る
:ヘキサンおよびヘプタン;ヘキセンおよびヘフ゛テン
;へ4−サンおよびヘプタン;ヘキセンおよびヘプタン
;ヘキサン、ヘキセンおよびヘプタン;ヘキサン、ヘキ
センおよびヘプテン;ヘキサン、ヘプタンおよびヘプテ
ン;ヘキセン、ヘプタンおよびヘプテン;そしてヘキサ
ン、ヘキセン、ヘプタンおよびヘプテン。そして。
の側鎖の比率を事実上無限に変えることができる。従っ
てこの実施態様においては1次の組合せが用いられ得る
:ヘキサンおよびヘプタン;ヘキセンおよびヘフ゛テン
;へ4−サンおよびヘプタン;ヘキセンおよびヘプタン
;ヘキサン、ヘキセンおよびヘプタン;ヘキサン、ヘキ
センおよびヘプテン;ヘキサン、ヘプタンおよびヘプテ
ン;ヘキセン、ヘプタンおよびヘプテン;そしてヘキサ
ン、ヘキセン、ヘプタンおよびヘプテン。そして。
これらの組合せのそれぞれにおいて、数種の基質間の比
率は所望の値に選択することができる。
率は所望の値に選択することができる。
他の実施態様は、8個の炭素原子を有する1種またはそ
れ以上の基質、そして、必要に応じて6個の炭素原子を
有する1種またはそれ以上の基質と組合せて用いて、側
鎖が3個および5個の炭素原子を有する(m−2および
4)共重合ポリエステルを生産することにより特徴づけ
られる。好適な基質は1−オクテンであり、必要に応じ
てオクタン、ヘキサンおよび/またはヘキセンが組合せ
て用いられる。
れ以上の基質、そして、必要に応じて6個の炭素原子を
有する1種またはそれ以上の基質と組合せて用いて、側
鎖が3個および5個の炭素原子を有する(m−2および
4)共重合ポリエステルを生産することにより特徴づけ
られる。好適な基質は1−オクテンであり、必要に応じ
てオクタン、ヘキサンおよび/またはヘキセンが組合せ
て用いられる。
次に、好適な実施態様は、7個の炭素原子を有する1種
またはそれ以上の基質と8個の炭素原子を有する1種ま
たはそれ以上の基質を、必要に応じて6個の炭素原子を
有する1種またはそれ以上の基質と組合せて用い、側鎖
が3個、4個および5個の炭素原子を有する(m=2.
3.および4)共重合ポリエステルを生産することによ
り特徴づけられる。
またはそれ以上の基質と8個の炭素原子を有する1種ま
たはそれ以上の基質を、必要に応じて6個の炭素原子を
有する1種またはそれ以上の基質と組合せて用い、側鎖
が3個、4個および5個の炭素原子を有する(m=2.
3.および4)共重合ポリエステルを生産することによ
り特徴づけられる。
さらに好適な実施態様は、9個の炭素原子を有する1種
またはそれ以」−の基質を、必要に応じて7個の炭素原
子を有する1種またはそれ以上の基質と組合せて用い、
側鎖が4個および6個の炭素原子を有する(m−3およ
び5)共重合ポリエステルを生産することにより特徴づ
けられる。
またはそれ以」−の基質を、必要に応じて7個の炭素原
子を有する1種またはそれ以上の基質と組合せて用い、
側鎖が4個および6個の炭素原子を有する(m−3およ
び5)共重合ポリエステルを生産することにより特徴づ
けられる。
さらに他の好適な実施態様は、8個の炭素原子を有する
1種またはそれ以上の基質と9個の炭素原子を有する1
種またはそれ以上の基質とを、必要に応じて、6個およ
び/または7個の炭素原子を有する1種またはそれ以上
の基質と組合せて用い、側鎖が3個、4個、5個および
6個の炭素原子を有する(m=2.3.4および5)共
重合ポリエステルを生産することにより特徴づけられる
。
1種またはそれ以上の基質と9個の炭素原子を有する1
種またはそれ以上の基質とを、必要に応じて、6個およ
び/または7個の炭素原子を有する1種またはそれ以上
の基質と組合せて用い、側鎖が3個、4個、5個および
6個の炭素原子を有する(m=2.3.4および5)共
重合ポリエステルを生産することにより特徴づけられる
。
次の好適な実施態様は、 10個の炭素原子を有する1
種またはそれ以上の基質を、必要に応じて6個および/
または8個の炭素原子を有する1種またはそれ以上の基
質と組合せて用い、側鎖が3個。
種またはそれ以上の基質を、必要に応じて6個および/
または8個の炭素原子を有する1種またはそれ以上の基
質と組合せて用い、側鎖が3個。
5個および7個の炭素原子を有する(m=2.4および
6)共重合ポリエステルを生産することにより特徴づけ
られる。
6)共重合ポリエステルを生産することにより特徴づけ
られる。
さらに好適な実施態様は、9個の炭素原子を有する1種
またはそれ以上の基質と、 10個の炭素原子を有する
1種またはそれ以上の基質とを、必要に応じて、6個、
7個および/または8個の炭素原子を有する1種または
それ以上の基質と組合せて用い、側鎖が3個、4個、5
個、6個および7個の炭素原子を有する(m=2.3,
4.5および6)共重合ポリエステルを生産することに
より特徴づけられる。
またはそれ以上の基質と、 10個の炭素原子を有する
1種またはそれ以上の基質とを、必要に応じて、6個、
7個および/または8個の炭素原子を有する1種または
それ以上の基質と組合せて用い、側鎖が3個、4個、5
個、6個および7個の炭素原子を有する(m=2.3,
4.5および6)共重合ポリエステルを生産することに
より特徴づけられる。
さらに他の好適な実施態様は、11個の炭素原子を有す
る1種またはそれ以上の基質を、必要に応じて7個およ
び/または9個の炭素原子を有する1種またはそれ以上
の基質と組合せて、側鎖が4個、6個および8個の炭素
原子を有する(m=3゜5および7)共重合ポリエステ
ルを生産することにより特徴づけられる。しかし、他の
好適な実施態様は、 10個の炭素原子を有する1種ま
たはそれ以上の基質を、必要に応じて6個、7個、8個
。
る1種またはそれ以上の基質を、必要に応じて7個およ
び/または9個の炭素原子を有する1種またはそれ以上
の基質と組合せて、側鎖が4個、6個および8個の炭素
原子を有する(m=3゜5および7)共重合ポリエステ
ルを生産することにより特徴づけられる。しかし、他の
好適な実施態様は、 10個の炭素原子を有する1種ま
たはそれ以上の基質を、必要に応じて6個、7個、8個
。
および/または9個の炭素原子を有する1種またはそれ
以上の基質と組合せて用い、側鎖が3個。
以上の基質と組合せて用い、側鎖が3個。
4個、5個、6個、7個および8個の炭素原子を有する
(m=2.3,4,5.6および7)共重合ポリエステ
ルを生産することにより特徴づけられる。
(m=2.3,4,5.6および7)共重合ポリエステ
ルを生産することにより特徴づけられる。
次の好適な実施態様は、12個の炭素原子を有する1種
またはそれ以上の基質を、必要に応じて6個、8個およ
び/または10個の炭素原子を有する1種またはそれ以
上の基質と組合せて用い、側鎖が3個、5個、7個およ
び9個の炭素原子を有する(m=2.4.6および8)
共重合ポリエステルを生産することにより特徴づけられ
る。さらに好適な実施態様は、11個の炭素原子を有す
る1種またはそれ以上の基質と、12個の炭素原子を有
する1種またはそれ以上の基質とを、必要に応じて6個
、7個、8個、9個および/または10個の炭素原子を
有する1種またはそれ以上の基質と組合せて用い、側鎖
が3個、4個、5個、6個、7個。
またはそれ以上の基質を、必要に応じて6個、8個およ
び/または10個の炭素原子を有する1種またはそれ以
上の基質と組合せて用い、側鎖が3個、5個、7個およ
び9個の炭素原子を有する(m=2.4.6および8)
共重合ポリエステルを生産することにより特徴づけられ
る。さらに好適な実施態様は、11個の炭素原子を有す
る1種またはそれ以上の基質と、12個の炭素原子を有
する1種またはそれ以上の基質とを、必要に応じて6個
、7個、8個、9個および/または10個の炭素原子を
有する1種またはそれ以上の基質と組合せて用い、側鎖
が3個、4個、5個、6個、7個。
8個および9個の炭素原子を有する(m=2.3゜4.
5,6.7および8)共重合ポリエステルを生産するこ
とにより特徴づけられる。
5,6.7および8)共重合ポリエステルを生産するこ
とにより特徴づけられる。
本発明によれば、好ましくは7〜11個の炭素原子を有
する1種またはそれ以上の基質、最も好ましくは8〜1
0個の炭素原子を有する1種またはそれ以上の基質が用
いられる。このようにして、最大量のポリマーが細胞内
に得られる。
する1種またはそれ以上の基質、最も好ましくは8〜1
0個の炭素原子を有する1種またはそれ以上の基質が用
いられる。このようにして、最大量のポリマーが細胞内
に得られる。
シュードモナス オレオポランス細菌の好気培養が達成
される様式および条件は当業者には既知である。培養は
3回分法または連続法が有効であり得る。この好気培養
は、pH5〜9.好ましくは約7において37℃以下の
温度、好ましくは約30℃において行われ、そしてこの
好気培養は、溶存酸素圧が好ましくは空気飽和の約50
%を越える値であり、十分な撹拌を行うことにより行わ
れることが推奨される。
される様式および条件は当業者には既知である。培養は
3回分法または連続法が有効であり得る。この好気培養
は、pH5〜9.好ましくは約7において37℃以下の
温度、好ましくは約30℃において行われ、そしてこの
好気培養は、溶存酸素圧が好ましくは空気飽和の約50
%を越える値であり、十分な撹拌を行うことにより行わ
れることが推奨される。
この好気培養は2液系で行うことができ、そして、それ
が望ましい。2液系の相のうちのひとつは、水溶性栄養
源および上記細菌を含む水相であり、そして他方は基質
の炭化水素を含む非極性相である。
が望ましい。2液系の相のうちのひとつは、水溶性栄養
源および上記細菌を含む水相であり、そして他方は基質
の炭化水素を含む非極性相である。
上に述べたPIIB生産微生物の場合のように、このシ
ュードモナス オレオボランスは生育に必須の栄養源の
1つが枯渇するまでは、有意な量のポリマーを生産しな
い。適当な栄養源の制限は1例えば、窒素、リン酸、イ
オウおよびマグネシウムの制限であるが、これらのうち
、Nの制限およびPの制限が高ポリマー収量という観点
からは好ましい。これらのうち、Nの制限が実際に容易
に行われ、その理由から最も好適である。
ュードモナス オレオボランスは生育に必須の栄養源の
1つが枯渇するまでは、有意な量のポリマーを生産しな
い。適当な栄養源の制限は1例えば、窒素、リン酸、イ
オウおよびマグネシウムの制限であるが、これらのうち
、Nの制限およびPの制限が高ポリマー収量という観点
からは好ましい。これらのうち、Nの制限が実際に容易
に行われ、その理由から最も好適である。
実際にはこの方法は2通常、細胞密度が少なくとも2
g/ 1に達するまで栄養源制限なしで対数増殖を行い
1次に栄養源を制限した好気培養を行うような方法であ
る。
g/ 1に達するまで栄養源制限なしで対数増殖を行い
1次に栄養源を制限した好気培養を行うような方法であ
る。
バイオポリマー中に封入体が形成される定常期はあまり
長く続けてはならない。なぜならば最大値に達した後、
このポリマーの濃度は再び減少するからである。従って
、好ましくは、栄養源制限で定常期に形成されたバイオ
ポリマー含有細胞は。
長く続けてはならない。なぜならば最大値に達した後、
このポリマーの濃度は再び減少するからである。従って
、好ましくは、栄養源制限で定常期に形成されたバイオ
ポリマー含有細胞は。
細胞中のバイオポリマー含量の有意な低下が起こる前に
、集菌される。
、集菌される。
細胞に含まれているバイオポリマーは必ずしも単離する
必要がない。なぜならば、バイオポリマー封入体を有す
る細菌細胞を5例えば米国特許第3、107.172号
に開示されているように、直接用いることができるため
である。しかし、大部分の用途には、このポリマーの単
離精製することが望ましいか、もしくは必要である。こ
の目的のために。
必要がない。なぜならば、バイオポリマー封入体を有す
る細菌細胞を5例えば米国特許第3、107.172号
に開示されているように、直接用いることができるため
である。しかし、大部分の用途には、このポリマーの単
離精製することが望ましいか、もしくは必要である。こ
の目的のために。
多くの既知方法が採用され得る。この細菌細胞は。
当業者に既知の多くの方法で破砕され得る。例えば、剪
断力を用いること(ホモジナイザー、グラインダー、い
わゆる゛フレンチプレス゛°など)、浸透圧ショック処
理を用いること、音波または超音波振動を用いること、
酵素的細胞壁分解を行うこと、または細胞懸濁液をスプ
レードライすることが採用され得る。ついで、ポリマー
は、多くの既知方法により他の成分から分離され得る。
断力を用いること(ホモジナイザー、グラインダー、い
わゆる゛フレンチプレス゛°など)、浸透圧ショック処
理を用いること、音波または超音波振動を用いること、
酵素的細胞壁分解を行うこと、または細胞懸濁液をスプ
レードライすることが採用され得る。ついで、ポリマー
は、多くの既知方法により他の成分から分離され得る。
それには3例えば、溶剤抽出および遠心分離による方法
がある。適当な分離方法の1つは上述のDe Smet
らの報告に述べられており、それによれば等密度遠心分
離が用いられる。大規模スケールでバイオポリマーを単
離するには9次の方法が好適である。
がある。適当な分離方法の1つは上述のDe Smet
らの報告に述べられており、それによれば等密度遠心分
離が用いられる。大規模スケールでバイオポリマーを単
離するには9次の方法が好適である。
まず、集菌した細胞をスフェロプラストにし、音波振動
処理で破砕し、そして遠心後上層を分離し3さらに必要
に応じて洗浄と乾燥を行う。好ましくは、スフェロプラ
ストへの変換は、蔗糖の存在下において行うことが有効
である。遠心分離は、 10,000gで約30分間行
えば充分である。ポリマーはそこで上清に白い最上層を
形成し、容易に分離できる。
処理で破砕し、そして遠心後上層を分離し3さらに必要
に応じて洗浄と乾燥を行う。好ましくは、スフェロプラ
ストへの変換は、蔗糖の存在下において行うことが有効
である。遠心分離は、 10,000gで約30分間行
えば充分である。ポリマーはそこで上清に白い最上層を
形成し、容易に分離できる。
混入物は洗浄により除去でき、そして1洗浄されたポリ
マーを適当な方法で乾燥、好ましくは凍結乾燥にイ」ず
。
マーを適当な方法で乾燥、好ましくは凍結乾燥にイ」ず
。
非常に好適な他の単離法は次のとおりである。
まず、細胞を連結遠心分離により集菌し、つぎに凍結乾
燥する。乾燥細胞を1例えばクロロホルムに懸濁し1次
に還流条件下で1例えば4時間にわたり抽出を行う。冷
却後、懸濁液を浄過し1例えば50から100 mlの
容量までエバボレートする。得られたポリマー溶液は、
このポリエステル以外に大量の脂質および脂肪酸を含有
する。これらを。
燥する。乾燥細胞を1例えばクロロホルムに懸濁し1次
に還流条件下で1例えば4時間にわたり抽出を行う。冷
却後、懸濁液を浄過し1例えば50から100 mlの
容量までエバボレートする。得られたポリマー溶液は、
このポリエステル以外に大量の脂質および脂肪酸を含有
する。これらを。
例えば110倍量のエタノール中でポリマーを沈澱させ
ることにより除去する。ポリマーが沈澱後。
ることにより除去する。ポリマーが沈澱後。
上澄をデカンテーションで除き、ポリマーの沈澱を圧縮
空気を上に流すことにより乾燥させる。ポリマーを次に
、好ましくは、できるだけ少量のクロロホルムに溶解さ
せ、ついで濾過後、10倍量のエタノールで再沈澱させ
る。得られた沈澱を再び最小容量のクロロホルムに熔解
させ、その後、上記溶液を鋳型に注ぎ、蒸発させること
により1合成プラスチック材が得られる。蒸発はこの材
料を真空下でしばらくの間50゛Cに保持することによ
り促進され得る。
空気を上に流すことにより乾燥させる。ポリマーを次に
、好ましくは、できるだけ少量のクロロホルムに溶解さ
せ、ついで濾過後、10倍量のエタノールで再沈澱させ
る。得られた沈澱を再び最小容量のクロロホルムに熔解
させ、その後、上記溶液を鋳型に注ぎ、蒸発させること
により1合成プラスチック材が得られる。蒸発はこの材
料を真空下でしばらくの間50゛Cに保持することによ
り促進され得る。
このようにして得られるポリエステルは、該ポリエステ
ルから、その全体または一部が構成される。縫糸3フイ
ルム、皮膚、または骨移植材などの製品に利用され得る
。
ルから、その全体または一部が構成される。縫糸3フイ
ルム、皮膚、または骨移植材などの製品に利用され得る
。
上記PIIBについて記載した利用はまた1本発明によ
り生産されたポリエステルにも適用される。
り生産されたポリエステルにも適用される。
特に注目されるのは、得られたバイオポリマーを化学的
に修飾する可能性であり、この可能性はこのポリエステ
ルが末端に二重結合を有する側鎖を含む場合に、特にう
まく実現される。他のポリマー鎖との架橋もまた可能で
ある。
に修飾する可能性であり、この可能性はこのポリエステ
ルが末端に二重結合を有する側鎖を含む場合に、特にう
まく実現される。他のポリマー鎖との架橋もまた可能で
ある。
本発明はまた。光学的に活性なカルボン酸またはエステ
ルを生産する方法を提供し、それは2本発明により生産
されたポリエステルの加水分解。
ルを生産する方法を提供し、それは2本発明により生産
されたポリエステルの加水分解。
および必要に応じて行われる生じたモノマーのエステル
化により特徴づけられる。上述のように。
化により特徴づけられる。上述のように。
そのような光学的活性化合物は、化学的手段を用いた場
合には、光学的に純粋な形では容易に得られない。本発
明は従って、そのような光学的に純粋な化合物の製造を
容易に達成する方法を提供する。それには例えば、薬剤
の製造における中間体。
合には、光学的に純粋な形では容易に得られない。本発
明は従って、そのような光学的に純粋な化合物の製造を
容易に達成する方法を提供する。それには例えば、薬剤
の製造における中間体。
または純粋に科学的なおよび/または応用を指向した研
究への利用性があり得る。使用した基質の相異により、
このプロセスにより異なったモノマーが生じた場合には
、必要に応じてこれらは既知方法(モノマーの鎖長およ
び/または飽和度の違いを利用した方法)により分離さ
れ得る。
究への利用性があり得る。使用した基質の相異により、
このプロセスにより異なったモノマーが生じた場合には
、必要に応じてこれらは既知方法(モノマーの鎖長およ
び/または飽和度の違いを利用した方法)により分離さ
れ得る。
本発明は1次の実験により詳述される。
(以下余白)
1、バイオポリマーの 1
オクタンによる生育の間のシュードモナス オレオボラ
ンスによる重合物質の生合成は、 1983年にDe
Smetらにより初めて示された。このポリマーは、メ
タツリシスされた千ツマ−の元素分析。
ンスによる重合物質の生合成は、 1983年にDe
Smetらにより初めて示された。このポリマーは、メ
タツリシスされた千ツマ−の元素分析。
赤外吸収スペクトル、およびガスクロマトグラフィーに
より、ポリ−3−ヒドロキシブチレート様(PH八)ポ
リエステル、おそらくポリ−3−ヒドロキシオクタノエ
ートと同定された。その後、3つの同定化合物が、有機
化学的な経路で合成され(Ketelaarら、 Te
trahedron Letters 26(1985
L 4665−4668) 、その後このポリマーの絶
対構造の決定が可能となった。
より、ポリ−3−ヒドロキシブチレート様(PH八)ポ
リエステル、おそらくポリ−3−ヒドロキシオクタノエ
ートと同定された。その後、3つの同定化合物が、有機
化学的な経路で合成され(Ketelaarら、 Te
trahedron Letters 26(1985
L 4665−4668) 、その後このポリマーの絶
対構造の決定が可能となった。
メタツリシスされたモノマーと2合成された(S)−3
−ヒドロキシヘキサノエート メチルエステル。
−ヒドロキシヘキサノエート メチルエステル。
(S) −3−ヒドロキシオクタノエート メチルエ
′ステル、および(S)−3−ヒドロキシブチレ−
ト メチルエステルとを比較することによって。
′ステル、および(S)−3−ヒドロキシブチレ−
ト メチルエステルとを比較することによって。
シュードモナス オレオボランスによりオクタンで生育
後に形成されるポリマーは、(R)−3−ヒドロキシヘ
キサノエートおよび(R) −3−ヒドロキシオクタノ
エートから成ることが確立された。
後に形成されるポリマーは、(R)−3−ヒドロキシヘ
キサノエートおよび(R) −3−ヒドロキシオクタノ
エートから成ることが確立された。
オクタンでの生育後に形成されるポリマーの一般的な構
造式を第1図に示す。第1図において、Rはアルキル基
−(CI+□)、CH3,またはアルケニル基−(CI
+2)lI−I Cl−Cl12.を示し、ここでm
は2〜8の整数である。基質としてオクタンを用いる場
合には、バイオポリマーは、モノマー(R) −3−ヒ
ドロキシヘキサン酸エステル(R=C311,)と、(
R)−3−ヒドロキシオクタン酸エステル(R=C5旧
、)との共重合体である。
造式を第1図に示す。第1図において、Rはアルキル基
−(CI+□)、CH3,またはアルケニル基−(CI
+2)lI−I Cl−Cl12.を示し、ここでm
は2〜8の整数である。基質としてオクタンを用いる場
合には、バイオポリマーは、モノマー(R) −3−ヒ
ドロキシヘキサン酸エステル(R=C311,)と、(
R)−3−ヒドロキシオクタン酸エステル(R=C5旧
、)との共重合体である。
形成される他のポリマーにおけるモノマーの同定(以下
参照)は、そのポリマーの酸メタツリシスが有効であり
、その後生成したモノマーのメチルエステルを、ガスク
ロマトグラフィーと連結したマススペクトロメトリーで
分析した。
参照)は、そのポリマーの酸メタツリシスが有効であり
、その後生成したモノマーのメチルエステルを、ガスク
ロマトグラフィーと連結したマススペクトロメトリーで
分析した。
2、分析
細胞内に貯蔵されるポリマーの形成に関する反応動力学
を分析するために、ポリマーの量を短時間で少量の培養
試料(バイオマス)で測定し得る手段を用いて、再現性
のある方法を開発した。この方法は、微生物バイオマス
中のポリ−3−ヒドロキシブチレートの測定に対するB
rauneggら(Eur。
を分析するために、ポリマーの量を短時間で少量の培養
試料(バイオマス)で測定し得る手段を用いて、再現性
のある方法を開発した。この方法は、微生物バイオマス
中のポリ−3−ヒドロキシブチレートの測定に対するB
rauneggら(Eur。
J、Mic、robiol、Biotechnol、
6(197B)29−37)の方法に基づいて開発した
。
6(197B)29−37)の方法に基づいて開発した
。
その方法によると、細胞培養の全試料を同時に加水分解
とメタツリシスを行い、その後ポリマーから形成された
七ツマ−のメチルエステルを、ガスクロマトグラフィー
で分析する。2つのピークの典型的なガスクロマトグラ
ムとマススペクトルを第2図に示す。第2図Aはオクタ
ンで培養した細胞の分析後のGLCパターンを示す。矢
印で示すピークは重合物質に由来する。t=5分のピー
クは内部標準(安息香酸メチルエステル)である。
とメタツリシスを行い、その後ポリマーから形成された
七ツマ−のメチルエステルを、ガスクロマトグラフィー
で分析する。2つのピークの典型的なガスクロマトグラ
ムとマススペクトルを第2図に示す。第2図Aはオクタ
ンで培養した細胞の分析後のGLCパターンを示す。矢
印で示すピークは重合物質に由来する。t=5分のピー
クは内部標準(安息香酸メチルエステル)である。
第2図Bは最も重要なGLCピークのMSパターンを示
す。175におけるピークは3−ヒドロキシオクタン酸
メチルエステルモノマーのプロトン化型であり、192
におけるピークはN)14−3−ヒドロキシオクタン酸
メチルエステルを示す。第2図Cは。
す。175におけるピークは3−ヒドロキシオクタン酸
メチルエステルモノマーのプロトン化型であり、192
におけるピークはN)14−3−ヒドロキシオクタン酸
メチルエステルを示す。第2図Cは。
より小さいGLCピークのMSパターンを示す。 14
7および164におけるピークはそれぞれ3−ヒドロキ
シヘキサン酸メチルエステルのプロトン化誘導体および
アンモニウム誘導体を示す。
7および164におけるピークはそれぞれ3−ヒドロキ
シヘキサン酸メチルエステルのプロトン化誘導体および
アンモニウム誘導体を示す。
この方法をシュードモナスのポリマーに対して開発する
ために、n−オクタンによるシュードモナス オレオボ
ランスの定常期培養の同一細胞試料を、100℃にて様
々な時間により、そしてメタノール中における種々の濃
度の硫酸で加水分解を行った(第3図)。第3図は、オ
クタンで生産されたバイオポリマーの加水分解時および
メタツリシス時におけるインキュベーションの時間およ
び硫酸濃度の、バイオポリマー量に対する効果を示すグ
ラフである。測定には同一の細胞ペレットが用いられた
。抽出時間をさらに最適化し、 Gl、C試料の乾燥
操作を導入した後9分析を以下のようにプログラムした
: 0.1〜4 、0 ml容量の細胞試料をエッペンドル
フ遠心管で3分間遠心分離し2次いで上清を除去し。
ために、n−オクタンによるシュードモナス オレオボ
ランスの定常期培養の同一細胞試料を、100℃にて様
々な時間により、そしてメタノール中における種々の濃
度の硫酸で加水分解を行った(第3図)。第3図は、オ
クタンで生産されたバイオポリマーの加水分解時および
メタツリシス時におけるインキュベーションの時間およ
び硫酸濃度の、バイオポリマー量に対する効果を示すグ
ラフである。測定には同一の細胞ペレットが用いられた
。抽出時間をさらに最適化し、 Gl、C試料の乾燥
操作を導入した後9分析を以下のようにプログラムした
: 0.1〜4 、0 ml容量の細胞試料をエッペンドル
フ遠心管で3分間遠心分離し2次いで上清を除去し。
ペレットを凍結乾燥する。つい、で、この凍結乾燥ペレ
ットを15%(V/V)の硫酸を含むメタノール溶液2
成に再懸濁し、2mlのクロロホルムを加える。
ットを15%(V/V)の硫酸を含むメタノール溶液2
成に再懸濁し、2mlのクロロホルムを加える。
ネジ蓋のある試験管で、これら試料を100℃で140
分間、マグ不ティクスターラーで撹拌しながら。
分間、マグ不ティクスターラーで撹拌しながら。
インキュベートする。試料を氷上で冷却後、1.0ml
の水を加え、モノマー化したメチルエステルを。
の水を加え、モノマー化したメチルエステルを。
試験管の内容物を20秒間ポルテックスミキサーにかけ
て抽出する。遠心分N1(5分間、4000Xg)で層
分離を促進させた後、水層を除き、有機層を無水Na2
5o4上で乾燥する。次いて、これら試料を。
て抽出する。遠心分N1(5分間、4000Xg)で層
分離を促進させた後、水層を除き、有機層を無水Na2
5o4上で乾燥する。次いて、これら試料を。
内部標準として安息香酸メチルエステルを用いてガスク
ロマトグラフィーにかける。
ロマトグラフィーにかける。
この分析の直線性を第4図に示す。この分析によると、
試料あたり9mgのバイオポリマーまで、この反応は一
次反応である。
試料あたり9mgのバイオポリマーまで、この反応は一
次反応である。
第9項を除く全ての実験は、シュードモナスオレオボラ
ンスTF4−IL(ATCC29347)を用いて行っ
た。
ンスTF4−IL(ATCC29347)を用いて行っ
た。
醗酵には、シュードモナス オレオボランスを。
250mβのエーレンマイヤーフラスコ中で、2%オク
タンを含む50m(lのE培地により、 30″Cにて
振盪プレート(20Orpm)上で16時間(−晩)前
培養した。
タンを含む50m(lのE培地により、 30″Cにて
振盪プレート(20Orpm)上で16時間(−晩)前
培養した。
E培地は、以下の組成である:
FIgSO,・7)120 0.2g/
j2クエン酸三ナトリウム 2.0g/ I
I!NaN114・HP(h ・41120
3.5g/I。
j2クエン酸三ナトリウム 2.0g/ I
I!NaN114・HP(h ・41120
3.5g/I。
K211PO410,Og/ 1
3000” MT 1mR/1
1000” MTは、 IN IIcI中の胞子成分の
溶液であり。
1000” MTは、 IN IIcI中の胞子成分の
溶液であり。
他の成分を殺菌した後に加える。1000” MTは、
以下の組成である: FeSO4・ 7H202,188)1MnCIz ・
4820 1.98g/ I。
以下の組成である: FeSO4・ 7H202,188)1MnCIz ・
4820 1.98g/ I。
C05O,、711202,81g#2CaC1z ・
21120 1.47g/ρCuC12
・2H200,17g/ lZn5Oa ・7Hz0
0.29g/ j2をIN IC+に溶
解する。
21120 1.47g/ρCuC12
・2H200,17g/ lZn5Oa ・7Hz0
0.29g/ j2をIN IC+に溶
解する。
本培養は、1/2の醗酵槽(連結撹拌タンク反応容器、
C3T11)に500雌のE”培地を入れ2生育の最
適値であるpH6,9に維持して、コンピューター制御
で5%NI+3とIN 112sO4を加えて行った。
C3T11)に500雌のE”培地を入れ2生育の最
適値であるpH6,9に維持して、コンピューター制御
で5%NI+3とIN 112sO4を加えて行った。
醗酵の間、酵素分圧(溶存酵素分圧[1,O,T、)を
60%空気飽和に、空気流入管のコンピューター制御バ
ルブを用いて維持した。培地は、 600rpmの速度
で撹拌した。
60%空気飽和に、空気流入管のコンピューター制御バ
ルブを用いて維持した。培地は、 600rpmの速度
で撹拌した。
E“培地は、以下の組成を有する:
に211P04・31120 7.5g
/ lNaNH411PO4・41120
3.58/ j2KII2PO43,7g/ l1 1000” MT 1mQ/l
。
/ lNaNH411PO4・41120
3.58/ j2KII2PO43,7g/ l1 1000” MT 1mQ/l
。
100 mM MgSO4’ 10m1N。
1000“MTと殺菌MgSO4溶液のみを、他の成分
を殺菌した後に加えた。単一炭素源およびエネルギー源
として、10〜20%(V/V)のオクタンを加えた。
を殺菌した後に加えた。単一炭素源およびエネルギー源
として、10〜20%(V/V)のオクタンを加えた。
この培地をアンモニアによるpl+滴定と組合せて用い
ると、6.5■/ mflの細胞密度を得るのが可能で
あった。
ると、6.5■/ mflの細胞密度を得るのが可能で
あった。
全醗酵を通して、細胞密度’(Witholt、J、B
acteriol。
acteriol。
109 (1972) 350−364 )とポリマー
形成量(第2項による)を、試料を取ることによってモ
ニターした。
形成量(第2項による)を、試料を取ることによってモ
ニターした。
第5図Aは、対数増殖期(μmax =0.48)の間
に、事実上バイオポリマーの生産がないことを示す。し
かし、生育速度が、栄養源の1つ(この場合は窒素)の
制限により低下すると、ポリマー形成が始まる(最大で
細胞乾燥重量の15%)。
に、事実上バイオポリマーの生産がないことを示す。し
かし、生育速度が、栄養源の1つ(この場合は窒素)の
制限により低下すると、ポリマー形成が始まる(最大で
細胞乾燥重量の15%)。
この窒素制限は、以下のように行った:l旧限、Eii
培地は、 2N KOJIおよびINII。SOaを添
加することによって、培養pHを調整して用いた。
培地は、 2N KOJIおよびINII。SOaを添
加することによって、培養pHを調整して用いた。
このようにすると、 2 mg / mflの細胞密
度が達成され得る。
度が達成され得る。
4、也の によるバイオポリマー−塵詐戊シュードモ
ナス オレオボランスを第3項に記載のように前培養し
た。本培養には、制限する栄養源に依存して、改変E″
培地を用いた:を皿扱: E”培地を40倍に希釈し、
窒素をNll、CIの形で17mMまで加えて、用いた
。培養pl+は、 2N KOJIおよび2N H2S
O,で一定に維持した。この培地に存在するリン酸は、
2mg / 7まで、細胞増殖を可能にする。
ナス オレオボランスを第3項に記載のように前培養し
た。本培養には、制限する栄養源に依存して、改変E″
培地を用いた:を皿扱: E”培地を40倍に希釈し、
窒素をNll、CIの形で17mMまで加えて、用いた
。培養pl+は、 2N KOJIおよび2N H2S
O,で一定に維持した。この培地に存在するリン酸は、
2mg / 7まで、細胞増殖を可能にする。
M:E”培地に、 100mM Mg5o4に代えて、
ある量のMg5O,を加えて最終濃度を0.4mMとし
、そしである量のMgC1,を加えて最終濃度を0.6
mMとした。poは、5%アンモニアを用いて調整した
。この培地では。
ある量のMg5O,を加えて最終濃度を0.4mMとし
、そしである量のMgC1,を加えて最終濃度を0.6
mMとした。poは、5%アンモニアを用いて調整した
。この培地では。
2 mg / mlの細胞密度が可能である。
、h[!IL : E ”培地に、 100mM Mg
SO4に代えて、ある量のMgSO4を加えて最終濃度
を0.1mMとし、そしである量のNa2SO4を加え
て最終濃度を0.9+nMとした。pHは、5%アンモ
ニアを用いて調整した。この培地で。
SO4に代えて、ある量のMgSO4を加えて最終濃度
を0.1mMとし、そしである量のNa2SO4を加え
て最終濃度を0.9+nMとした。pHは、5%アンモ
ニアを用いて調整した。この培地で。
は、 1 mg / mlの細胞密度を達成し得る。
全醗酵の間、培養の細胞密度および生成ポリマーの量を
、上の第3項に示したように測定した。
、上の第3項に示したように測定した。
これらの培地を用いることにより、ポリマーの生成が主
に定常期に起こることが再び見られる。
に定常期に起こることが再び見られる。
上記の制限に依存して、細胞乾燥重量当りのバイオポリ
マーの百分率は、第5図に示すように変動する。第5図
Aは窒素の制限、第5図Bはマグネシウムの制限、第5
図Cはリン酸塩の制限、そして第5図りはイオウの制限
を行った場合のものである。黒丸は細胞密度、そして白
丸はバイオポリマーの量を示す。以下の表1は、これら
栄養源制限の生成ポリマー量に対する効果を示し、細胞
乾燥重量の百分率で示した。
マーの百分率は、第5図に示すように変動する。第5図
Aは窒素の制限、第5図Bはマグネシウムの制限、第5
図Cはリン酸塩の制限、そして第5図りはイオウの制限
を行った場合のものである。黒丸は細胞密度、そして白
丸はバイオポリマーの量を示す。以下の表1は、これら
栄養源制限の生成ポリマー量に対する効果を示し、細胞
乾燥重量の百分率で示した。
表土:ポリマー生成に対する制限の効果一般に、ポリマ
ーの生成は、窒素とリン酸制限下で最良であると結論し
得る。
ーの生成は、窒素とリン酸制限下で最良であると結論し
得る。
5.4jj3のパラフィンによるポリマーのり”上の第
4項で述べたように決定した。ポリ−3−ヒドロキシ−
アルカノエート生成の最適条件を用いて、他のパラフィ
ンを、ポリマー形成のための基質としての可能性を調べ
た。シュードモナスオレオボランスが06〜CI2のn
−パラフィンで生育し得ることを示す文献があるので、
これらの化合物をます調べた。
4項で述べたように決定した。ポリ−3−ヒドロキシ−
アルカノエート生成の最適条件を用いて、他のパラフィ
ンを、ポリマー形成のための基質としての可能性を調べ
た。シュードモナスオレオボランスが06〜CI2のn
−パラフィンで生育し得ることを示す文献があるので、
これらの化合物をます調べた。
前培養を上の第3項のように行い、そして本培養を上の
第4項の窒素制限条件で行った。細胞密度およびポリマ
ーの百分率は、上の第3項に示すように測定した。
第4項の窒素制限条件で行った。細胞密度およびポリマ
ーの百分率は、上の第3項に示すように測定した。
増殖およびポリマー形成の結果を第6図に要約する。第
6図において、使用されたパラフィンは。
6図において、使用されたパラフィンは。
n−ヘキサン(第6図A)、n−ヘプタン(第6図B)
、n〜ノナン(第6図C)、、n−デカン(第6図D)
、n−ウンデカン(第6図E)、およびn〜ドデカン(
第6図F)である。黒丸は細胞密度を、そして白丸はバ
イオポリマーの量を示す表2は、ポリマーの最大生成量
、この最大値に達する時間、および生成ポリマーのモノ
マー組成を示す。
、n〜ノナン(第6図C)、、n−デカン(第6図D)
、n−ウンデカン(第6図E)、およびn〜ドデカン(
第6図F)である。黒丸は細胞密度を、そして白丸はバ
イオポリマーの量を示す表2は、ポリマーの最大生成量
、この最大値に達する時間、および生成ポリマーのモノ
マー組成を示す。
シュードモナス オレオボランスが全てのこれらパラフ
ィンに対してポリマーを生成し得ることがわかる。最良
の増殖基質であることが知られている基質、すなわちオ
クタンおよびノナンは、ポリマー形成に最良の基質でも
ある。ポリマーの組成は、用いた基質に依有する。炭素
数が偶数のパラフィンで生育後、炭素数が偶数のモノマ
ーが金側で形成され、そして炭素数が奇数のパラフィン
は、常に炭素数が奇数のモノマーとなる。これらモノマ
ーは、常に3−ヒドロキシ−アルカノエートであり、鎖
長が基質の長さから06に変動する。
ィンに対してポリマーを生成し得ることがわかる。最良
の増殖基質であることが知られている基質、すなわちオ
クタンおよびノナンは、ポリマー形成に最良の基質でも
ある。ポリマーの組成は、用いた基質に依有する。炭素
数が偶数のパラフィンで生育後、炭素数が偶数のモノマ
ーが金側で形成され、そして炭素数が奇数のパラフィン
は、常に炭素数が奇数のモノマーとなる。これらモノマ
ーは、常に3−ヒドロキシ−アルカノエートであり、鎖
長が基質の長さから06に変動する。
CBおよびC,モノマーに対して、ポリマー生成酵素は
最大の特異性を有するようである。
最大の特異性を有するようである。
6、オレフィンによるバイオポリマーのターシュードモ
ナス オレオボランスは、またn −オレフィンを唯一
の炭素源およびエネルギー源として利用できるので、バ
イオポリマーがこれらの基質でもまた形成されるかどう
かを検討した。この研究のための醗酵は、上の第5項に
従って行った。細胞密度およびポリマーの百分率は、第
3項に示すように定量した。
ナス オレオボランスは、またn −オレフィンを唯一
の炭素源およびエネルギー源として利用できるので、バ
イオポリマーがこれらの基質でもまた形成されるかどう
かを検討した。この研究のための醗酵は、上の第5項に
従って行った。細胞密度およびポリマーの百分率は、第
3項に示すように定量した。
これら不飽和パラフィンによって生育した後に生成した
ポリマーは、パラフィンポリマーとは異なった組成を有
するようになる。該生成ポリマーは、モノマーの一部が
末端二重結合を含むという点において異なる。
ポリマーは、パラフィンポリマーとは異なった組成を有
するようになる。該生成ポリマーは、モノマーの一部が
末端二重結合を含むという点において異なる。
n−オクテンによって生成するポリマーの場合。
このような二重結合を有するモノマーの量は、全体の5
5%であった。オクテンによって生成したポリマーの加
水分解物の典型的なGCスペクトルを第7図に示す。ピ
ークの最初の集団は、3−ヒドロキシヘキセン酸エステ
ルと3−ヒドロキシヘキサン酸エステルとの存在を示す
。第2のピーク対は3−ヒドロキシオクテン酸エステル
と3−ヒドロキシオクタン酸エステルとの存在を示す。
5%であった。オクテンによって生成したポリマーの加
水分解物の典型的なGCスペクトルを第7図に示す。ピ
ークの最初の集団は、3−ヒドロキシヘキセン酸エステ
ルと3−ヒドロキシヘキサン酸エステルとの存在を示す
。第2のピーク対は3−ヒドロキシオクテン酸エステル
と3−ヒドロキシオクタン酸エステルとの存在を示す。
不飽和化合物は、それぞれの場合において、 GLC/
MSで分析されるように、より短い保持時間を有する。
MSで分析されるように、より短い保持時間を有する。
対応するピークを矢印で示す。オクタンおよびオクテン
によって生成したポリマーのIRスペクトルを第8図に
示す。二重結合によるピーク(矢印で示す)が明瞭に見
られる。
によって生成したポリマーのIRスペクトルを第8図に
示す。二重結合によるピーク(矢印で示す)が明瞭に見
られる。
表3は1種々のオレフィンによって生育した後に生成し
たポリマーの最大量、この最大値に達するのに必要な時
間、およびポリマーを構成するモノマーを示す。
たポリマーの最大量、この最大値に達するのに必要な時
間、およびポリマーを構成するモノマーを示す。
(以下余白)
シュードモナス オレオボランスは、■−オクテン、1
−ノネン、および1−デセンによってバイオポリマーを
生成する能力があることが示される。しかし3ヘキセン
によって生育させた場合は。
−ノネン、および1−デセンによってバイオポリマーを
生成する能力があることが示される。しかし3ヘキセン
によって生育させた場合は。
ポリマー形成が見られなかった。ポリマーがこれらのモ
ノマーから構成される様式は、n−パラフィンによって
生成するポリマーの場合と類似している。しかし、1−
デセンによる生育の間に形成されるバイオポリマーが、
検出し得る量の06モノマーを含んでいないことは驚き
である。
ノマーから構成される様式は、n−パラフィンによって
生成するポリマーの場合と類似している。しかし、1−
デセンによる生育の間に形成されるバイオポリマーが、
検出し得る量の06モノマーを含んでいないことは驚き
である。
試験した1−オレフィンによって得られた結果によれば
、バイオポリマー形成が1−ヘプテン、 、■−ウン
デセン、および1−ドデセンによっても起こることが期
待され得る。
、バイオポリマー形成が1−ヘプテン、 、■−ウン
デセン、および1−ドデセンによっても起こることが期
待され得る。
1−オクテンによる生育の間、形成されたポリマーは5
飽和モノマーおよび不飽和モノマーの両方を含むことが
見出された。不飽和モノマーの量が、0(オクタンによ
る生育)と55%(オクテンによる生育;第6項参照)
の間のポリマーを生産するために、シュードモナス オ
レオボランスをこれら2つの基質の混合物で培養した。
飽和モノマーおよび不飽和モノマーの両方を含むことが
見出された。不飽和モノマーの量が、0(オクタンによ
る生育)と55%(オクテンによる生育;第6項参照)
の間のポリマーを生産するために、シュードモナス オ
レオボランスをこれら2つの基質の混合物で培養した。
醗酵は、lff1の撹拌タンク反応容器で、第3項のよ
うに行った。すべての場合に、全量20%の有機層を加
えた。細胞密度およびポリマーの百分率は、第3項に示
したように定量した。
うに行った。すべての場合に、全量20%の有機層を加
えた。細胞密度およびポリマーの百分率は、第3項に示
したように定量した。
表4は、二重結合を有するモノマーの割合が。
用いた基質の組成に依存してどのように変化するかを、
モノマー組成と共に示す。示した値は、細胞のポリマー
含量が最大の時に測定した値である。
モノマー組成と共に示す。示した値は、細胞のポリマー
含量が最大の時に測定した値である。
(以下余白)
パラフィンおよびオレフィンの混合物から出発すると、
ポリマーにおける二重結合の百分率を変化させ得ると結
論される。従って、生育基質の組成がポリマーのモノマ
ー組成を決定する(部分的に)。
ポリマーにおける二重結合の百分率を変化させ得ると結
論される。従って、生育基質の組成がポリマーのモノマ
ー組成を決定する(部分的に)。
8、−他のtpヒノ 、によるボーリ□ア二二Φ」4成
n−パラフィン(第5項参照)および1−オレフィン(
第6項参照)によるポリマー生成に加えて、他の置換炭
化水素または不飽和炭化水素を炭素源とした場合にも、
ポリマー生成が起こり得るか否かを検討した。シュード
モナス オレオボランスは、全てのこれら基質に抵抗性
を有さないかも知れないので、これら基質はn−オクタ
ンとの1:1混合物で加えた。
n−パラフィン(第5項参照)および1−オレフィン(
第6項参照)によるポリマー生成に加えて、他の置換炭
化水素または不飽和炭化水素を炭素源とした場合にも、
ポリマー生成が起こり得るか否かを検討した。シュード
モナス オレオボランスは、全てのこれら基質に抵抗性
を有さないかも知れないので、これら基質はn−オクタ
ンとの1:1混合物で加えた。
醗酵は、第3項のように、1!の撹拌タンク反応容器で
、10〜15%の有機層を用いて行った。
、10〜15%の有機層を用いて行った。
表5は、このようにして試験した基質、およびこの場合
に1種々のモノマーを有するポリマーが実際生成するか
否かを示す。また、オクタン分解の第1中間体である1
−オクタツールが、生育およびポリマーの基質として用
い得るかどうかも調べた。これは、1−オクタツールを
唯一の炭素源およびエネルギー源として、シュードモナ
ス オレオボランスを培養した場合に見出された。
に1種々のモノマーを有するポリマーが実際生成するか
否かを示す。また、オクタン分解の第1中間体である1
−オクタツールが、生育およびポリマーの基質として用
い得るかどうかも調べた。これは、1−オクタツールを
唯一の炭素源およびエネルギー源として、シュードモナ
ス オレオボランスを培養した場合に見出された。
ポリマー生成が、またさらに酸化されたパラフィン(オ
クタツール、オクタン酸)による生育の間にも起こるこ
とが期待される。
クタツール、オクタン酸)による生育の間にも起こるこ
とが期待される。
(以下余白)
表五二他の炭化水素による生育の間のシュードモナス
オレオボランスによるバイオポリマーの形成 1“生育“で示した欄における記号は2次の意味である
ニ ー 生育しない。
オレオボランスによるバイオポリマーの形成 1“生育“で示した欄における記号は2次の意味である
ニ ー 生育しない。
十 最終OD値が1と5の間である中程度の生育。
+十 最終OD値が5と10の間である適度の生育。
十+十 最終OD値が10を越えるオクタンによる生育
に匹敵する良好な生育。
に匹敵する良好な生育。
9、thの菌朱によるポリマーのンハ
上に述べたすべての実験は、シュードモナスオレオボラ
ンスTF4−IL (ATCC29347)を用いて行
った。この菌株は9時々GPo−1と呼ばれる。この野
性型に加えて、数多くの関連菌株を、オクタンまたは1
−オクタツールによる生育後のポリマー形成について調
べた: GPo−12: OCTプラスミドを保持しない」ハ」
。
ンスTF4−IL (ATCC29347)を用いて行
った。この菌株は9時々GPo−1と呼ばれる。この野
性型に加えて、数多くの関連菌株を、オクタンまたは1
−オクタツールによる生育後のポリマー形成について調
べた: GPo−12: OCTプラスミドを保持しない」ハ」
。
並財し=シュードモナス プチダ、 Chakraba
rむyにより単離されたものでプラスミドを含まない。
rむyにより単離されたものでプラスミドを含まない。
血飢L: OCTプラスミドを保持する」匹」。
hΣ−−124: CAM10CT融合プラスミドを保
持する」飢」。
持する」飢」。
これらの菌株は、 250mβのエーレンマイヤーフ
ラスコ中の50m1E”培地(第3項参照)で、4%オ
クタン、またはOCTプラスミドがない場合には。
ラスコ中の50m1E”培地(第3項参照)で、4%オ
クタン、またはOCTプラスミドがない場合には。
4%1−オクタツールを、唯一の炭素源およびエネルギ
ー源として用いて試験した。
ー源として用いて試験した。
表6は、オクタンまたは1−オクタツールによる生育の
後にポリマーを生成する菌株を示す。
後にポリマーを生成する菌株を示す。
(以下余白)
プラスミドを保持しない株、すなわち−4汚」−が。
細胞内にポリ−3−ヒドロキシアルカノエートを蓄積す
る事実から、ポリマー合成に関与する酵素がプラスミド
ではなく、染色体にコードされていると結論し得る。
る事実から、ポリマー合成に関与する酵素がプラスミド
ではなく、染色体にコードされていると結論し得る。
得られた結果は、またアルカノール、アルデヒド、カル
ボン酸、ジアルカノール、ジアルデヒドおよびジカルボ
ン酸を単一炭素源として用いる場合にも、ポリマー生成
が起こることを証明するか。
ボン酸、ジアルカノール、ジアルデヒドおよびジカルボ
ン酸を単一炭素源として用いる場合にも、ポリマー生成
が起こることを証明するか。
あるいは示唆する。
精製ポリ−3−ヒドロキシオクタノエート−3−ヒドロ
キシヘキサノニー) (PIIOH)および精製ポリ−
3−ヒドロキシオクタノエート−3−ヒドロキシオクタ
ノエート−3−ヒドロキシヘキサノエート−3−ヒドロ
キシヘキサノニー) (PHOIILI)の分子量(M
W) 、融点(Tm)およびガラス転移温度(Tg)を
決定した。得られた値を表7に示す。比較のために、ポ
リ−3−ヒドロキシブチレート(PH8)の値も示す。
キシヘキサノニー) (PIIOH)および精製ポリ−
3−ヒドロキシオクタノエート−3−ヒドロキシオクタ
ノエート−3−ヒドロキシヘキサノエート−3−ヒドロ
キシヘキサノニー) (PHOIILI)の分子量(M
W) 、融点(Tm)およびガラス転移温度(Tg)を
決定した。得られた値を表7に示す。比較のために、ポ
リ−3−ヒドロキシブチレート(PH8)の値も示す。
表1:ボリマーの特性
9−は、この場合、ポリマー物質が完全に非結晶性なの
で、融点が存在しないことを意味する。
で、融点が存在しないことを意味する。
(発明の要約)
本発明は、シュードモナス オレオポランス細菌を、あ
る栄養源を含む基質で培養することによってポリエステ
ルバイオポリマーを生産する方法に関する。該ポリエス
テルの性質は、用いる炭素源の性質を変化させることに
より変化させ得る。
る栄養源を含む基質で培養することによってポリエステ
ルバイオポリマーを生産する方法に関する。該ポリエス
テルの性質は、用いる炭素源の性質を変化させることに
より変化させ得る。
このようにして、不飽和二重結合を有するポリエステル
をも生産し得る。該ポリエステルから光学活性なカルボ
ン酸またはエステルが生産される。
をも生産し得る。該ポリエステルから光学活性なカルボ
ン酸またはエステルが生産される。
該ポリマーは、縫糸、フィルム、皮膚および骨移植材な
どの製品を製造するのに利用し得る。
どの製品を製造するのに利用し得る。
4 パ の なj゛明−
第1図は本発明方法により生産されるバイオポリマーの
構造単位の一般式を示す。
構造単位の一般式を示す。
第2図Aは、オクタンで生産されたバイオポリマーのガ
スクロマトグラフィー(GLC) 、 そして第2図B
およびCは、マススペクトル(MS)の結果を示す。
スクロマトグラフィー(GLC) 、 そして第2図B
およびCは、マススペクトル(MS)の結果を示す。
第3図はシュードモナス オレオボランス培養物の試料
中におけるバイオポリマーの定量分析の結果を表すグラ
フである。
中におけるバイオポリマーの定量分析の結果を表すグラ
フである。
第4図はポリ−3−ヒドロキシアルカン酸エステルの分
析において、用いた細胞量に対する相対GLC応答のプ
ロットである。
析において、用いた細胞量に対する相対GLC応答のプ
ロットである。
第5図A−Dは、培地中の栄養源制限と、 n −オ
クタンを用いたときのバイオポリマー生産との関係を示
す。
クタンを用いたときのバイオポリマー生産との関係を示
す。
第6図は、窒素制限下で種々のn−パラフィンにおいて
増殖したシュードモナス オレオポランスによるポリ−
3−ヒドロキシアルカン酸エステルの生産を示す。
増殖したシュードモナス オレオポランスによるポリ−
3−ヒドロキシアルカン酸エステルの生産を示す。
第7図は1−オクテンで増殖したシュードモナス オレ
オポランスにより生成したバイオポリマーのGLC分析
の結果を示す。
オポランスにより生成したバイオポリマーのGLC分析
の結果を示す。
第8図はオクタン(第8図A)とオクテン(第8図B)
とで生成するバイオポリマーの赤夕←スペクトルを示す
。
とで生成するバイオポリマーの赤夕←スペクトルを示す
。
以上
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、微生物を栄養源制限下で好気的に培養することによ
って、ポリエステルを製造する方法であって、 シュードモナス オレオボランス細菌を好気条件下で、
少なくとも1種の資化可能な非環状脂肪族炭化水素化合
物を含有する炭素源の過剰量と、生育に必須の他の栄養
源の少なくとも1種の制限量とを含有する栄養培地で培
養すること;および必要に応じて、形成されたバイオポ
リマーを該細胞から回収すること、 を包含する方法。 2、次の構造式(1)を有する単位から構成されるポリ
エステルを、6〜12個の炭素原子を有するパラフィン
またはパラフィン酸化物を1種またはそれ以上含有する
炭素源を用いることによって、生産することを特徴とす
る特許請求の範囲第1項に記載の方法: ▲数式、化学式、表等があります▼(1) ここで、mは2〜8の整数である。 3、次の構造式(1)を有する単位と次の構造式(2)
を有する単位とから構成されるポリエステルを、6〜1
2個の炭素原子を有する非分岐1−オレフィンの1種ま
たはそれ以上と、必要に応じて、6〜12個の炭素原子
を有する非分岐パラフィンまたはパラフィン酸化物の1
種またはそれ以上とを含有する炭素源を用いることによ
って、生産することを特徴とする特許請求の範囲第1項
に記載の方法:▲数式、化学式、表等があります▼(1
) ▲数式、化学式、表等があります▼(2) ここで、mは2〜8の整数である。 4、6個の炭素原子を有する1種またはそれ以上の基質
を用いることによって、側鎖が3個の炭素原子を有する
(m=2)ポリエステルを生産することを特徴とする特
許請求の範囲第2項または第3項に記載の方法。 5、7個の炭素原子を有する1種またはそれ以上の基質
を用いることによって、側鎖が4個の炭素原子を有する
(m=3)ポリエステルを生産することを特徴とする特
許請求の範囲第2項または第3項に記載の方法。 6、6個の炭素原子を有する1種またはそれ以上の基質
と、7個の炭素原子を有する1種またはそれ以上の基質
とを用いることによって、側鎖が3個および4個の炭素
原子を有する(m=2および3)共重合ポリエステルを
生産することを特徴とする特許請求の範囲第2項または
第3項に記載の方法。 7、8個の炭素原子を有する1種またはそれ以上の基質
を、必要に応じて、6個の炭素原子を有する1種または
それ以上の基質と組み合わせて用いることによって、側
鎖が3個および5個の炭素原子を有する(m=2および
4)共重合ポリエステルを生産することを特徴とする特
許請求の範囲第2項または第3項に記載の方法。 8、7個の炭素原子を有する1種またはそれ以上の基質
と、8個の炭素原子を有する1種またはそれ以上の基質
とを、必要に応じて、6個の炭素原子を有する1種また
はそれ以上の基質と組み合わせて用いることによって、
側鎖が3個、4個および5個の炭素原子を有する(m=
2、3および4)共重合ポリエステルを生産することを
特徴とする特許請求の範囲第2項または第3項に記載の
方法。 9、9個の炭素原子を有する1種またはそれ以上の基質
を、必要に応じて、7個の炭素原子を有する1種または
それ以上の基質と組み合わせて用いることによって、側
鎖が4個および6個の炭素原子を有する(m=3および
5)共重合ポリエステルを生産することを特徴とする特
許請求の範囲第2項または第3項に記載の方法。 10、8個の炭素原子を有する1種またはそれ以上の基
質と、9個の炭素原子を有する1種またはそれ以上の基
質とを、必要に応じて、6個および/または7個の炭素
原子を有する1種またはそれ以上の基質と組み合わせて
用いることによって、側鎖が3個、4個、5個および6
個の炭素原子を有する(m=2、3、4および5)共重
合ポリエステルを生産することを特徴とする特許請求の
範囲第2項または第3項に記載の方法。 11、10個の炭素原子を有する1種またはそれ以上の
基質を、必要に応じて、6個および/または8個の炭素
原子を有する1種またはそれ以上の基質と組み合わせて
用いることによって、側鎖が3個、5個および7個の炭
素原子を有する(m=2、4および6)共重合ポリエス
テルを生産することを特徴とする特許請求の範囲第2項
または第3項に記載の方法。 12、9個の炭素原子を有する1種またはそれ以上の基
質と、10個の炭素原子を有する1種またはそれ以上の
基質とを、必要に応じて、6個、7個および/または8
個の炭素原子を有する1種またはそれ以上の基質と組み
合わせて用いることによって、側鎖が3個、4個、5個
、6個および7個の炭素原子を有する(m=2、3、4
、5および6)共重合ポリエステルを生産することを特
徴とする特許請求の範囲第2項または第3項に記載の方
法。 13、11個の炭素原子を有する1種またはそれ以上の
基質を、必要に応じて、7個および/または9個の炭素
原子を有する1種またはそれ以上の基質と組み合わせて
用いることによって、側鎖が4個、6個および8個の炭
素原子を有する(m=3、5および7)共重合ポリエス
テルを生産することを特徴とする特許請求の範囲第2項
または第3項に記載の方法。 14、10個の炭素原子を有する1種またはそれ以上の
基質と、11個の炭素原子を有する1種またはそれ以上
の基質とを、必要に応じて、6個、7個、8個および/
または9個の炭素原子を有する1種またはそれ以上の基
質と組み合わせて用いることによって、側鎖が3個、4
個、5個、6個、7個および8個の炭素原子を有する(
m=2、3、4、5、6および7)共重合ポリエステル
を生産することを特徴とする特許請求の範囲第2項また
は第3項に記載の方法。 15、12個の炭素原子を有する1種またはそれ以上の
基質を、必要に応じて、6個、8個および/または10
個の炭素原子を有する基質と組み合わせて用いることに
よって、側鎖が3個、5個、7個および/または9個の
炭素原子を有する(m=2、4、6および8)共重合ポ
リエステルを生産することを特徴とする特許請求の範囲
第2項または第3項に記載の方法。 16、11個の炭素原子を有する1種またはそれ以上の
基質と、12個の炭素原子を有する1種またはそれ以上
の基質とを、必要に応じて、6個、7個、8個、9個お
よび/または10個の炭素原子を有する1種またはそれ
以上の基質と組み合わせて用いることによって、側鎖が
3個、4個、5個、6個、7個、8個および/または9
個の炭素原子を有する(m=2、3、4、5、6、7お
よび8)共重合ポリエステルを生産することを特徴とす
る特許請求の範囲第2項または第3項に記載の方法。 17、7〜11個の炭素原子を有する1種またはそれ以
上の基質を用いることを特徴とする特許請求の範囲第2
項または第3項に記載の方法。 18、8〜10個の炭素原子を有する1種またはそれ以
上の基質を用いることを特徴とする特許請求の範囲第2
項または第3項に記載の方法。 19、窒素またはリン制限で前記好気培養を行うことを
特徴とする特許請求の範囲第1項から第18項のいずれ
か1つに記載の方法。 20、窒素制限で前記好気培養を行うことを特徴とする
特許請求の範囲第1項から第19項のいずれか1つに記
載の方法。 21、前記好気培養が、pH5〜9、好ましくは約7に
て、および37℃を下まわる温度、好ましくは約30℃
で行われることを特徴とする特許請求の範囲第1項から
第20項のいずれか1つに記載の方法。 22、前記好気培養が、好ましくは空気による飽和の約
50%の溶存酸素分圧で、十分に撹拌して行われること
を特徴とする特許請求の範囲第1項から第21項のいず
れか1つに記載の方法。 23、前記好気培養が、二液相系で行われることを特徴
とする特許請求の範囲第1項から第22項のいずれか1
つに記載の方法。 24、栄養源制限による前記好気培養が、細胞密度が少
なくとも2g/lに達する、栄養源制限なしの対数増殖
期後に、行われることを特徴とする特許請求の範囲第1
項から第23項のいずれか1つに記載の方法。 25、栄養源制限による定常期に形成される前記バイオ
ポリマー含有細胞が、該細胞のバイオポリマー含量の顕
著な低下が起こる前に、採取されることを特徴とする特
許請求の範囲第1項から第24項のいずれか1つに記載
の方法。 26、前記バイオポリマーが、前記採取細胞をスフェロ
プラストへ変換し、音波振動処理によってこれらを破砕
し;そして遠心分離した後に形成される最上層を分離し
;さらに必要に応じて、洗浄と乾燥を行うこと、によっ
て単離されることを特徴とする特許請求の範囲第1項か
ら第25項のいずれか1つに記載の方法。 27、前記バイオポリマーが、化学的に修飾されること
を特徴とする特許請求の範囲第1項から第26項のいず
れか1つに記載の方法。 28、光学的に活性なカルボン酸またはエステルを製造
する方法であって、 特許請求の範囲第1項から第27項のいずれか1つに記
載の方法により生産されるポリエステルを加水分解する
こと;および、 必要に応じて、得られたモノマーをエステル化すること
を特徴とする方法。 29、特許請求の範囲第1項から第27項のいずれかに
記載の方法によって製造されるポリエステルから、その
全体または一部が構成される、縫糸、フィルム、皮膚、
または骨移植材などの製品。
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