JPS63217271A - 後天性免疫不全症候群の検出のための方法及び組成物 - Google Patents
後天性免疫不全症候群の検出のための方法及び組成物Info
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- JPS63217271A JPS63217271A JP4741887A JP4741887A JPS63217271A JP S63217271 A JPS63217271 A JP S63217271A JP 4741887 A JP4741887 A JP 4741887A JP 4741887 A JP4741887 A JP 4741887A JP S63217271 A JPS63217271 A JP S63217271A
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- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は後天性免疫不全症候群(エイズ)検出のための
方法及び組成物に関する。更に詳しくは、本発明はヒト
エイズ組織と陽性反応する抗体に関する。
方法及び組成物に関する。更に詳しくは、本発明はヒト
エイズ組織と陽性反応する抗体に関する。
同性愛者関連免疫不全症又は同性愛者妥協症候群として
も知られる後天性免疫不全症候群(エイズ)は、198
1年以前には特異的疾患として認識されていなかった明
らかに新しい人間の疾患である。現在までに4000例
以上が報告されており、この流行病が急速に広がり、疾
患が非常に高い死亡率を示すことから、この疾患は多大
な関心を集めた。
も知られる後天性免疫不全症候群(エイズ)は、198
1年以前には特異的疾患として認識されていなかった明
らかに新しい人間の疾患である。現在までに4000例
以上が報告されており、この流行病が急速に広がり、疾
患が非常に高い死亡率を示すことから、この疾患は多大
な関心を集めた。
現在、この疾患は、特異的診断試験法が報告されていな
かったことから、その臨床的特徴によって定義されてい
る。幼児(28日未満)及び年長者(60オ以」二)は
、細胞性免疫不含の他の原因がこれらの年齢群に影響す
るため、定義から除外される。更に定義によれば、新生
物(特にエイズ関連のものを除<)、免疫抑制療法、副
腎皮質ステロイド療法及び腎障害のようなすべての他の
公知の免疫不全原因は除外される。エイズと診断するた
めには、患者は、カボジ肉腫、−次性中枢神経系リンパ
腫、進行性多病巣性白質脳障害、又は二二一モシスチス
・カリニイ(Pneuiocystlscarfnll
) 、トキソプラズマ・ゴンジイ(Toxoplas
ma gondll ) 、クリブトスボリジウム(C
ryptosporidiua+ ) 、サイドメガロ
ウイスを含む通常病原体としてみられない各種生物によ
る感染症、特にアスペルギルス(Asperglllu
s ) 、クリプトコツカス(Cryptococcu
s) 、カンシタ(Candlda ) 、ノカルジア
(Nocardla) 、伝染性ヘルペスウィルスによ
る伝染性真菌感染症、又は未制御のストロンギロイデス
・ステルコラリス(Strongyloides 5t
ercoralis )寄生病のような1細胞性免疫不
全を特に示す疾患を有していなければならない。典型的
には、これらのうちの2種以上の疾患が患者にみられ、
しかも研究所試験では証明可能であるがエイズに特異的
ではない免疫機能異常が併存する。カボジ肉腫及びニュ
ーモシスチス・カリニイ肺炎が最も特徴的な疾患であっ
た。
かったことから、その臨床的特徴によって定義されてい
る。幼児(28日未満)及び年長者(60オ以」二)は
、細胞性免疫不含の他の原因がこれらの年齢群に影響す
るため、定義から除外される。更に定義によれば、新生
物(特にエイズ関連のものを除<)、免疫抑制療法、副
腎皮質ステロイド療法及び腎障害のようなすべての他の
公知の免疫不全原因は除外される。エイズと診断するた
めには、患者は、カボジ肉腫、−次性中枢神経系リンパ
腫、進行性多病巣性白質脳障害、又は二二一モシスチス
・カリニイ(Pneuiocystlscarfnll
) 、トキソプラズマ・ゴンジイ(Toxoplas
ma gondll ) 、クリブトスボリジウム(C
ryptosporidiua+ ) 、サイドメガロ
ウイスを含む通常病原体としてみられない各種生物によ
る感染症、特にアスペルギルス(Asperglllu
s ) 、クリプトコツカス(Cryptococcu
s) 、カンシタ(Candlda ) 、ノカルジア
(Nocardla) 、伝染性ヘルペスウィルスによ
る伝染性真菌感染症、又は未制御のストロンギロイデス
・ステルコラリス(Strongyloides 5t
ercoralis )寄生病のような1細胞性免疫不
全を特に示す疾患を有していなければならない。典型的
には、これらのうちの2種以上の疾患が患者にみられ、
しかも研究所試験では証明可能であるがエイズに特異的
ではない免疫機能異常が併存する。カボジ肉腫及びニュ
ーモシスチス・カリニイ肺炎が最も特徴的な疾患であっ
た。
エイズの特徴的臨床像が一度患者に確立されると、免疫
機能は正常に回復しない。
機能は正常に回復しない。
エイズが進行するに先立ち、患者は発熱、体重減少及び
リンパ節肥大という特徴がある前駆症状を有する。これ
は数週間〜数年間にわたり続く。
リンパ節肥大という特徴がある前駆症状を有する。これ
は数週間〜数年間にわたり続く。
このリンパ節障害症候群はエイズに特異的であるという
わけではなく、類似のケースがエイズが認識されるかな
り以前から知られており、しかもかかる臨床症候群をも
つ患者のほんの一部だけが危険度の高い群であってもエ
イズに進行するにすぎなかった。
わけではなく、類似のケースがエイズが認識されるかな
り以前から知られており、しかもかかる臨床症候群をも
つ患者のほんの一部だけが危険度の高い群であってもエ
イズに進行するにすぎなかった。
エイズ疫学によればウィルスのような伝染性因子の介在
を強く示唆している。エイズは、同性的及び両性的***
男性、ハイチ人、経静脈薬乱用者、血友病者、並びにそ
の他の血液及び血液製剤の受領者に主として限定されて
いた。この疾患は非常に長い潜伏期間を有しているため
、伝染経路の追跡を困難ならしめている。疾患は伝染し
にくい性質があり、親密な接触、特に肛門***又は直接
的血液感染を要する。
を強く示唆している。エイズは、同性的及び両性的***
男性、ハイチ人、経静脈薬乱用者、血友病者、並びにそ
の他の血液及び血液製剤の受領者に主として限定されて
いた。この疾患は非常に長い潜伏期間を有しているため
、伝染経路の追跡を困難ならしめている。疾患は伝染し
にくい性質があり、親密な接触、特に肛門***又は直接
的血液感染を要する。
各種の因子が可能性のある原因として示唆されてきた。
サイトメガロウィルス、エプスタイン−バー(Epst
eln−Barr)ウィルス及びアデノウィルス等のウ
ィルス類がこの疾病の患者から一様に検出される。最も
可能性の高い因果関係掌上の因子としてはレトロウィル
スがあるが、これは国立癌研究所(NCI)及びパスツ
ール研究所の研究員によって大部分の患者から採取され
た。MCIで採取培養された作用因子は、HTLV−I
IIと命名されたヒトT細胞白血病ウィルスの変異体と
して特定されている。それは前駆症候群のある患者の大
部分から採取された。それに対する抗体はエイズ患者の
大部分で見出されているが、実際のエイズ患者の約1/
3からしか採取されなかった。フランス人労働者から採
取されたウィルスに関する比較データが現在人手されて
いる。現時点において、これらウィルスのいずれが実際
にエイズの原因であるかについて証拠は存在しないが、
いずれのグループもそれらウィルスが原因であると主張
している。
eln−Barr)ウィルス及びアデノウィルス等のウ
ィルス類がこの疾病の患者から一様に検出される。最も
可能性の高い因果関係掌上の因子としてはレトロウィル
スがあるが、これは国立癌研究所(NCI)及びパスツ
ール研究所の研究員によって大部分の患者から採取され
た。MCIで採取培養された作用因子は、HTLV−I
IIと命名されたヒトT細胞白血病ウィルスの変異体と
して特定されている。それは前駆症候群のある患者の大
部分から採取された。それに対する抗体はエイズ患者の
大部分で見出されているが、実際のエイズ患者の約1/
3からしか採取されなかった。フランス人労働者から採
取されたウィルスに関する比較データが現在人手されて
いる。現時点において、これらウィルスのいずれが実際
にエイズの原因であるかについて証拠は存在しないが、
いずれのグループもそれらウィルスが原因であると主張
している。
現在のところ、エイズに特異的な利用可能な試験法は見
出されていない。共通細胞性免疫リコール抗原の皮膚試
験での応答性に対する不完全性、変動した血中リンパ球
レベル、並びに変動したリンパ球のヘルパー及びサプレ
ッサーサブセット比率のようないくつかの免疫機能異常
は証明可能である。これら異常は免疫不全の単なる発現
にすぎず、多数の様々な原因によって生じ得る。α−チ
モシン、α−インターフェロン、ネオプテリン及びβ2
−ミクログロブリンの異常レベルも確認された。これら
は非特異的指標であって、免疫不全又は特異的疾患とは
無関係の炎症性刺激物質の存在を反映している。
出されていない。共通細胞性免疫リコール抗原の皮膚試
験での応答性に対する不完全性、変動した血中リンパ球
レベル、並びに変動したリンパ球のヘルパー及びサプレ
ッサーサブセット比率のようないくつかの免疫機能異常
は証明可能である。これら異常は免疫不全の単なる発現
にすぎず、多数の様々な原因によって生じ得る。α−チ
モシン、α−インターフェロン、ネオプテリン及びβ2
−ミクログロブリンの異常レベルも確認された。これら
は非特異的指標であって、免疫不全又は特異的疾患とは
無関係の炎症性刺激物質の存在を反映している。
エイズの特異的試験には、病因に特異的な抗体もしくは
免疫タンパク質又は該病因が関連組織で産生ずる何かを
必要とする。このような抗体として唯一候補となり得る
ものが、エイズ患者又は前エイズ症候群患者から得られ
た。エイズ組織中のウィルス成分を同定するために使用
することができるこれらの抗体は、複雑で長ったらしい
分析操作を要する。HLTV−Hに対する抗体が現在開
発中であるけれども、それらはエイズ検出のために複雑
な分析操作を要するであろう。しかも、HTLV−I[
[がエイズの原因であるという確たる証拠はない。
免疫タンパク質又は該病因が関連組織で産生ずる何かを
必要とする。このような抗体として唯一候補となり得る
ものが、エイズ患者又は前エイズ症候群患者から得られ
た。エイズ組織中のウィルス成分を同定するために使用
することができるこれらの抗体は、複雑で長ったらしい
分析操作を要する。HLTV−Hに対する抗体が現在開
発中であるけれども、それらはエイズ検出のために複雑
な分析操作を要するであろう。しかも、HTLV−I[
[がエイズの原因であるという確たる証拠はない。
数種の動物モデルは、アカゲザル及びマカークザルにお
けるエイズ様疾患をはじめとし、エイズに密接に関連し
ていることが示唆されていた。ウィルス類はこれらの動
物から検出されたが、これらウィルス類はHTLV−I
IIと関連がないようである。これらの動物は疾患を克
服できず、抗体源としては報告されなかった。ヒト疾患
をアカゲザル及びチンパンジーに移す試みも行なわれた
が、ウィルス及び抗体のいずれもこれらの動物からは報
告されなかった。現在、エイズの動物モデルと認識され
ているものはない。
けるエイズ様疾患をはじめとし、エイズに密接に関連し
ていることが示唆されていた。ウィルス類はこれらの動
物から検出されたが、これらウィルス類はHTLV−I
IIと関連がないようである。これらの動物は疾患を克
服できず、抗体源としては報告されなかった。ヒト疾患
をアカゲザル及びチンパンジーに移す試みも行なわれた
が、ウィルス及び抗体のいずれもこれらの動物からは報
告されなかった。現在、エイズの動物モデルと認識され
ているものはない。
したがって、彼疑保田者においてエイズを検出すること
ができる診断試験法又は操作法の必要性は高い。
ができる診断試験法又は操作法の必要性は高い。
本発明は、エイズ感染個体から得たリンパ球試料と選択
的に反応することができる抗体を含有した免疫試薬を提
供する。更に詳しくは、免疫試薬は、マー上セットウェ
イスティング病(a+armosetwasting
disease )にかかっているか又はそれから回復
しつつあるマーモセットザルの血清又は血清から単離さ
れた免疫グロブリンである。本発明の他面において、免
疫試薬はトレーサー標識抗体を含有している。
的に反応することができる抗体を含有した免疫試薬を提
供する。更に詳しくは、免疫試薬は、マー上セットウェ
イスティング病(a+armosetwasting
disease )にかかっているか又はそれから回復
しつつあるマーモセットザルの血清又は血清から単離さ
れた免疫グロブリンである。本発明の他面において、免
疫試薬はトレーサー標識抗体を含有している。
更に、本発明は、疾患に感染したか又はその疑いのある
ヒトのエイズ免疫学的診断方法を提供する。その方法で
は、リンパ系組織又は血液のような被疑保菌者のリンパ
球試料を、マー上セットウェイスティング病にかかって
いるか又はそれから回復したマーモセットザルから得た
トレーサー標識抗体含有免疫試薬と一緒にインキュベー
トすることを要する。ヒトがエイズであることを示す陽
性免疫反応は、リンパ球における細胞質液胞膜又は他の
細胞質膜関連構造体の染色によって発現される。
ヒトのエイズ免疫学的診断方法を提供する。その方法で
は、リンパ系組織又は血液のような被疑保菌者のリンパ
球試料を、マー上セットウェイスティング病にかかって
いるか又はそれから回復したマーモセットザルから得た
トレーサー標識抗体含有免疫試薬と一緒にインキュベー
トすることを要する。ヒトがエイズであることを示す陽
性免疫反応は、リンパ球における細胞質液胞膜又は他の
細胞質膜関連構造体の染色によって発現される。
通常の病原疾患状態の免疫学的診断では、疾患状態に関
連して生じた抗原に対して特異的な抗体を必要とする。
連して生じた抗原に対して特異的な抗体を必要とする。
ウィルス病の場合、ウィルス感染により生じた抗原は、
ウィルス抗原に対し選択的な抗体と免疫反応することに
よって検出することができる。しかしながら、このよう
な抗体の選択的産生のためには、一般に該ウィルス因子
に関する知識を要する。一般に、特異的抗体が開発され
る前に、原因性ウィルス因子を単離するか又は少なくと
も確認していたにちがいない。しかしながら、エイズの
場合では、ウィルス因子が原因物質として具体的に特定
されていない。
ウィルス抗原に対し選択的な抗体と免疫反応することに
よって検出することができる。しかしながら、このよう
な抗体の選択的産生のためには、一般に該ウィルス因子
に関する知識を要する。一般に、特異的抗体が開発され
る前に、原因性ウィルス因子を単離するか又は少なくと
も確認していたにちがいない。しかしながら、エイズの
場合では、ウィルス因子が原因物質として具体的に特定
されていない。
本発明は、マーモセットザルが、エイズ病因感染患者か
ら得たリンパ球細胞と選択的に反応し得る抗体又は抗体
群3育免疫グロブリンを産生ずるという事実を利用して
いる。本発明者らは、マーモセットウェイスティング症
候群と称される症状にかかっているか又はそれから回復
しつつあるマーモセットがエイズ選択的抗体を産生でき
ることを観察した。このマーモセットウェィスティング
症候群抗体はエイズ感染個体のリンパ球と選択的に反応
する。
ら得たリンパ球細胞と選択的に反応し得る抗体又は抗体
群3育免疫グロブリンを産生ずるという事実を利用して
いる。本発明者らは、マーモセットウェイスティング症
候群と称される症状にかかっているか又はそれから回復
しつつあるマーモセットがエイズ選択的抗体を産生でき
ることを観察した。このマーモセットウェィスティング
症候群抗体はエイズ感染個体のリンパ球と選択的に反応
する。
エイズ用マーモセットモデル
テキサスA&M大学の獣医学部には、研究源として管理
された通常のマーモセット〔カリスリックス・ジー1”
7クス(Calllthrlx jaccllus)
]居住区がある。数年前から、これらの動物のある種の
ものは慢性ウェイスティング病をもつことが知られてい
た。ある時期にはこれは研究に不適な病的動物を生じる
問題があると考えられていたが、特有の症状は体重減少
、抜毛及び日和見的感染症に特徴があると認識されてい
た。疾患パターンはヒトエイズと同一ではなく、特にこ
れらの動物では同一の感染スペクトルを有さないばかり
か、カボジ肉腫のような新生物を有していないが、その
差異は種差に関係していると思われる。
された通常のマーモセット〔カリスリックス・ジー1”
7クス(Calllthrlx jaccllus)
]居住区がある。数年前から、これらの動物のある種の
ものは慢性ウェイスティング病をもつことが知られてい
た。ある時期にはこれは研究に不適な病的動物を生じる
問題があると考えられていたが、特有の症状は体重減少
、抜毛及び日和見的感染症に特徴があると認識されてい
た。疾患パターンはヒトエイズと同一ではなく、特にこ
れらの動物では同一の感染スペクトルを有さないばかり
か、カボジ肉腫のような新生物を有していないが、その
差異は種差に関係していると思われる。
マーモセットウェィスティング症候群及びヒトエイズ間
の関係は明白である。これらの罹患動物では、ヘルパー
Tリンパ球すブセット対すプレッサーTリンパ球サブセ
ットの比率が減少し、幼若化分析においてリンパ球活性
が減少し、しかもヒトエイズで観察されるのと同様の抗
体産生障害が生じる。
の関係は明白である。これらの罹患動物では、ヘルパー
Tリンパ球すブセット対すプレッサーTリンパ球サブセ
ットの比率が減少し、幼若化分析においてリンパ球活性
が減少し、しかもヒトエイズで観察されるのと同様の抗
体産生障害が生じる。
マーモセットウェィスティング症候群はエイズと類似し
ているが、重大な差異、即ち感染マーモセットの大部分
が疾患から回復するという差異が存在する。
ているが、重大な差異、即ち感染マーモセットの大部分
が疾患から回復するという差異が存在する。
エイズ選択的抗体の産生
3匹のマーモセットを、ウェイスティング症候群から回
復したことが確認された研究群とした。
復したことが確認された研究群とした。
血液を大腿部穿刺によってこれらの動物から採取し、凝
固させ、血清を分離しプールした。等量のpH7,2の
0.05Mリン酸標準緩衝液(P B S)を血清に加
えた。冷室(温度約4℃)にて、pH7,6の飽和硫酸
アンモニウムを50%飽和となるまで攪拌しながら滴下
した。得たグロブリン混合物を30分間攪拌し、しかる
後振動パケットローター中4℃100ORCFで遠心分
離した。上澄画分を静かに傾けて廃棄し、沈降物をPB
Sに溶解した。飽和硫酸アンモニウムを再度50%飽和
になるまで滴下し、グロブリン混合物を攪拌し、以前と
同様に遠心分離した。沈降グロブリンをPBSに再溶解
し、−夜PBSに対して透析した。次いで、グロブリン
画分を室温で10分間1000RCFで遠心分離した。
固させ、血清を分離しプールした。等量のpH7,2の
0.05Mリン酸標準緩衝液(P B S)を血清に加
えた。冷室(温度約4℃)にて、pH7,6の飽和硫酸
アンモニウムを50%飽和となるまで攪拌しながら滴下
した。得たグロブリン混合物を30分間攪拌し、しかる
後振動パケットローター中4℃100ORCFで遠心分
離した。上澄画分を静かに傾けて廃棄し、沈降物をPB
Sに溶解した。飽和硫酸アンモニウムを再度50%飽和
になるまで滴下し、グロブリン混合物を攪拌し、以前と
同様に遠心分離した。沈降グロブリンをPBSに再溶解
し、−夜PBSに対して透析した。次いで、グロブリン
画分を室温で10分間1000RCFで遠心分離した。
0.25m1の上澄グロブリン画分を一70℃凍結保存
した。
した。
グロブリン画分を、プロティンA−アガロースカラムに
吸着させることにより、免疫グロブリンまで更に精製し
た。グロブリン画分を解凍し、1時間かけて該カラムに
吸着させた。カラムを次いで多量のPBSで少なくとも
1時間洗浄した。免疫グロブリン含有抗体を0.15M
NaC1中の0.5%酢酸で溶出させ、画分を集め
た。
吸着させることにより、免疫グロブリンまで更に精製し
た。グロブリン画分を解凍し、1時間かけて該カラムに
吸着させた。カラムを次いで多量のPBSで少なくとも
1時間洗浄した。免疫グロブリン含有抗体を0.15M
NaC1中の0.5%酢酸で溶出させ、画分を集め
た。
0D28oで確認されるタンパク質ピークをプールした
。プールされた免疫グロブリンタンパク質両分を一夜P
BSに対して2回取換えて透析した。
。プールされた免疫グロブリンタンパク質両分を一夜P
BSに対して2回取換えて透析した。
次の反応のために、免疫グロブリン画分を、pH9,0
の0 、1 M N a CO3−N a HCO3
に対して4時間透析することにより、ビオチニル化(b
iotinylated)させた。次いで、N−ヒドロ
キシスクシジミノビオチン1%溶液0.12m1を免疫
グロブリン画分1mlに加え、室温で3〜3.5時間イ
ンキュベートした。生成物を−皮PBSに対して透析し
た。免疫グロブリンの最初のバッチは不安定であり、し
かも過剰の非特異的反応を生じたため、次のロットでは
少量(未知量)のα1−アンチトリプシンを加えて安定
化させ、数時間アセトン乾燥扁桃又は肺臓に吸告させた
。
の0 、1 M N a CO3−N a HCO3
に対して4時間透析することにより、ビオチニル化(b
iotinylated)させた。次いで、N−ヒドロ
キシスクシジミノビオチン1%溶液0.12m1を免疫
グロブリン画分1mlに加え、室温で3〜3.5時間イ
ンキュベートした。生成物を−皮PBSに対して透析し
た。免疫グロブリンの最初のバッチは不安定であり、し
かも過剰の非特異的反応を生じたため、次のロットでは
少量(未知量)のα1−アンチトリプシンを加えて安定
化させ、数時間アセトン乾燥扁桃又は肺臓に吸告させた
。
吸着は、少量の組織画分を免疫グロブリン製剤に加え、
それらを4℃で3〜6時間インキュベートすることによ
り行なった。次いで、粗組織を除去し、免疫グロブリン
を0.2μ径膜フイルターに通してi濾過した。
それらを4℃で3〜6時間インキュベートすることによ
り行なった。次いで、粗組織を除去し、免疫グロブリン
を0.2μ径膜フイルターに通してi濾過した。
組織試料の免疫組織化学染色
エイズ組織に対して反応性の抗体を含有するこの免疫グ
ロブリン画分は、下記操作法によって免疫組織化学染色
に使用した。ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片を
キシレンで脱パラフイン処理し、等級別のエタノールに
次いでH2Oで再度水和した。又は、風乾された血液膜
をホルマリンで固定し、水洗した。内因性ペルオキシダ
ーゼ活性を3%H202−MeOH1:4で5分間阻害
した。スライドをPBS中で洗浄し、PBSで1:20
0に希釈されたビオチニル化免疫グロブリン画分と一緒
に30分間〜1時間インキュベートした。コントロール
のスライドをPBSと一緒にインキュベートした。スラ
イドをPBSで洗浄し、アビジンDH−ビオチンーペル
オキシダーゼ複合体〔ベクタシュティン、ベクター・ラ
ボラトリーズ、バーリンガム、カリフォルニア(Vec
ta−sLaln、 Vector LaboraLo
rales、 Burlingame。
ロブリン画分は、下記操作法によって免疫組織化学染色
に使用した。ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片を
キシレンで脱パラフイン処理し、等級別のエタノールに
次いでH2Oで再度水和した。又は、風乾された血液膜
をホルマリンで固定し、水洗した。内因性ペルオキシダ
ーゼ活性を3%H202−MeOH1:4で5分間阻害
した。スライドをPBS中で洗浄し、PBSで1:20
0に希釈されたビオチニル化免疫グロブリン画分と一緒
に30分間〜1時間インキュベートした。コントロール
のスライドをPBSと一緒にインキュベートした。スラ
イドをPBSで洗浄し、アビジンDH−ビオチンーペル
オキシダーゼ複合体〔ベクタシュティン、ベクター・ラ
ボラトリーズ、バーリンガム、カリフォルニア(Vec
ta−sLaln、 Vector LaboraLo
rales、 Burlingame。
CA) )中で45分間インキュベートした。ベクタシ
ュティン操作に続くすべての工程では、0.02%の濃
度におけるクロモゲンとしてジアミノベンジンを用いた
。スライドを80%エタノール中0.05%トルイジン
ブルーで10秒間対対比色し、水洗し、脱水し、顕微鏡
に固定した。
ュティン操作に続くすべての工程では、0.02%の濃
度におけるクロモゲンとしてジアミノベンジンを用いた
。スライドを80%エタノール中0.05%トルイジン
ブルーで10秒間対対比色し、水洗し、脱水し、顕微鏡
に固定した。
ビオチニル化免疫グロブリン画分は、ウェイスティング
病マーモセット及びヒトエイズ患者のリンパ系組織及び
血清中のリンパ球と特異的に反応した。
病マーモセット及びヒトエイズ患者のリンパ系組織及び
血清中のリンパ球と特異的に反応した。
抗体が反応している実際の組織成分(抗原)は未知であ
るけれども、ある種の細胞質膜構造と関係があるように
思われる。本発明者らは、組織中に固有に存在するすべ
てのペルオキシダーゼ活性をまず破壊してみる。組織又
は血液を次いで抗体と一緒にインキュベートする。その
活性部位は(抗体に典型的な)高親和性抗原と結合して
いるため、抗体は洗浄物中の抗原から除去されないが、
他のすべての部位からは洗浄除去される。この抗体はこ
の場合においてビオチンのようなトレーサーと既に結合
していたのである。抗体上のビオチン部分は、高親和性
のビオチンと結合する卵白タンパク質のアビジン上の遊
離部位と自由に反応することができる。アビジンもビオ
チニル化ペルオキシダーゼ分子と既に結合しているため
、架橋分子となる。ペルオキシダーゼは次いで多段階架
橋を経て抗原の存在を示す指示薬となる。ペルオキシダ
ーゼは、過酸化水素、及び有色酸化生成物を生じること
が可能な多数の化合物のうちの1種をそれと反応させる
ことによって視覚化される。本発明者らはジアミノベン
ジジンを使用していたが、それは他のほとんどの代替物
よりも良好な局在化を示すからであって、他に特別な価
値かあ、るためではない。酸化されたジアミノベンジジ
ンは容易に顕微鏡で目視される有色沈降物である。
るけれども、ある種の細胞質膜構造と関係があるように
思われる。本発明者らは、組織中に固有に存在するすべ
てのペルオキシダーゼ活性をまず破壊してみる。組織又
は血液を次いで抗体と一緒にインキュベートする。その
活性部位は(抗体に典型的な)高親和性抗原と結合して
いるため、抗体は洗浄物中の抗原から除去されないが、
他のすべての部位からは洗浄除去される。この抗体はこ
の場合においてビオチンのようなトレーサーと既に結合
していたのである。抗体上のビオチン部分は、高親和性
のビオチンと結合する卵白タンパク質のアビジン上の遊
離部位と自由に反応することができる。アビジンもビオ
チニル化ペルオキシダーゼ分子と既に結合しているため
、架橋分子となる。ペルオキシダーゼは次いで多段階架
橋を経て抗原の存在を示す指示薬となる。ペルオキシダ
ーゼは、過酸化水素、及び有色酸化生成物を生じること
が可能な多数の化合物のうちの1種をそれと反応させる
ことによって視覚化される。本発明者らはジアミノベン
ジジンを使用していたが、それは他のほとんどの代替物
よりも良好な局在化を示すからであって、他に特別な価
値かあ、るためではない。酸化されたジアミノベンジジ
ンは容易に顕微鏡で目視される有色沈降物である。
例1:ヒトエイズ組織の免疫組織化学染色8例のエイズ
オードブシー及び12例の非エイズオードブシーからの
各種組織、並びに5例の正常もしくは過形成非エイズ患
者からのリンパ節及び/又は肺臓、及び1例の非エイズ
患者からのプラズマ細胞腫の切片を染色した。
オードブシー及び12例の非エイズオードブシーからの
各種組織、並びに5例の正常もしくは過形成非エイズ患
者からのリンパ節及び/又は肺臓、及び1例の非エイズ
患者からのプラズマ細胞腫の切片を染色した。
エイズ患者の場合、細胞質における多数の模倣、又は液
胞膜を表わす、局在化した、特に現型の像のすべてのケ
ースのリンパ球及びマクロファージが特異的に染色され
ていた。1つの典型的な染色パターンは、細胞ゴルジ体
の全領域における現型像及び更に拡散した構造をなすも
のであった。核の染色は観察されなかったが、核膜は染
色されることもあった。
胞膜を表わす、局在化した、特に現型の像のすべてのケ
ースのリンパ球及びマクロファージが特異的に染色され
ていた。1つの典型的な染色パターンは、細胞ゴルジ体
の全領域における現型像及び更に拡散した構造をなすも
のであった。核の染色は観察されなかったが、核膜は染
色されることもあった。
非エイズリンパ系組織は染色されないか又は特異的には
染色されなかったが、唯一の例外としてプラズマ細胞腫
だけは特異的に染色された。染色強度及び非特異的染色
の有無は、組織固定の程度により左右されるようであり
、(通常の形態学的基準から判明するように)十分に固
定されていない組織は非特異的に又は弱く染色されたに
すぎない。
染色されなかったが、唯一の例外としてプラズマ細胞腫
だけは特異的に染色された。染色強度及び非特異的染色
の有無は、組織固定の程度により左右されるようであり
、(通常の形態学的基準から判明するように)十分に固
定されていない組織は非特異的に又は弱く染色されたに
すぎない。
例2:血液試料のスクリーニング
正常、非エイズ及びエイズの患者からの23例の血液塗
抹試料を免疫グロブリン免疫試薬で染色した。これらの
ヒト塗抹試料は、エイズ又は非エイズのブラインド分類
に成功し得るような変化を示した。
抹試料を免疫グロブリン免疫試薬で染色した。これらの
ヒト塗抹試料は、エイズ又は非エイズのブラインド分類
に成功し得るような変化を示した。
10例のエイズの場合では、細胞質、特に大きな異型リ
ンパ球が、しかしまたある程度はマクロファージも比較
的拡散して又はやや粒状に染色されていた。図1はエイ
ズ患者におけるリンパ球染色を表わす。好酸球の人工的
非特異的染色も観察されたが、容易に識別できた。
ンパ球が、しかしまたある程度はマクロファージも比較
的拡散して又はやや粒状に染色されていた。図1はエイ
ズ患者におけるリンパ球染色を表わす。好酸球の人工的
非特異的染色も観察されたが、容易に識別できた。
前駆症状段階の10例の患者の場合では、弱い陽性染色
が図2で示したように観察された。
が図2で示したように観察された。
非エイズの4例の塗抹試料のうち3例の場合には、染色
が観察されなかった。1例の感染性単球増加症の場合は
染色されたが、細胞パターンはエイズの場合とわずかに
異なっていた。
が観察されなかった。1例の感染性単球増加症の場合は
染色されたが、細胞パターンはエイズの場合とわずかに
異なっていた。
図3及び4は正常リンパ球染色を示す。
陽性対陰性又は非特異的染色を区別する基準陽性反応対
非特異的染色対陰性反応を認識するために適用された基
準は、以下のとおりである:1、 染色される細胞はリ
ンパ球でなければならない。他の細胞型の染色では、特
異的には示されなかった。
非特異的染色対陰性反応を認識するために適用された基
準は、以下のとおりである:1、 染色される細胞はリ
ンパ球でなければならない。他の細胞型の染色では、特
異的には示されなかった。
2、 染色は、集団から分離した個々の細胞のものでな
ければならない。すべての細胞の均一的な染色では非特
異的になる。
ければならない。すべての細胞の均一的な染色では非特
異的になる。
3、 不十分な固定組織の場合には、原形質膜、積換又
は細胞から拡散物が染色される傾向にある。
は細胞から拡散物が染色される傾向にある。
このことは試料のほとんどの細胞に該当する。これは人
為的問題であり、陽性と判断すべきではない。核の染色
も特異的であった。
為的問題であり、陽性と判断すべきではない。核の染色
も特異的であった。
4、 抗体が組織の様々な成分、特に高荷電基に非特異
的に結合するため、組織の弱い全体的な染色が常に生じ
る。この場合は陽性と判断すべきではない。
的に結合するため、組織の弱い全体的な染色が常に生じ
る。この場合は陽性と判断すべきではない。
5、 組織切片において、陽性染色は、個々の細胞、典
型的には大きな不規則のリンパ球たる原形質細胞の細胞
質部分に染色が局在化して観察される。2つの染色パタ
ーンが認識された。1つのパターンは、ゴルジ装置付近
、即ちほとんどの細胞質が集中する極部の核付近の領域
で生じる、小胞膜染色及び/又は更に拡散した染色であ
る。もう1つのパターンは、細胞質中のどこにも存在し
得しかも細胞質中の他のものより不規則な膜及び/又は
積換の染色と関連した、非常に小さな丸い小胞の個々の
膜の染色である。これらの小胞は大拡大したときのみ鮮
明に観察されるが、それらは非常に強度に染色され易い
。原形質膜の染色も観察されることがあるが、陽性染色
の基準とすることはできない。これらのパターンのうち
いずれが現在のデータのものよりも感受的又は特異的で
あるかについては明らかでないが、ゴルジ領域の染色は
より感受的であるとまでいえないものの、個々の小胞及
び膜の染色はより特異的である。
型的には大きな不規則のリンパ球たる原形質細胞の細胞
質部分に染色が局在化して観察される。2つの染色パタ
ーンが認識された。1つのパターンは、ゴルジ装置付近
、即ちほとんどの細胞質が集中する極部の核付近の領域
で生じる、小胞膜染色及び/又は更に拡散した染色であ
る。もう1つのパターンは、細胞質中のどこにも存在し
得しかも細胞質中の他のものより不規則な膜及び/又は
積換の染色と関連した、非常に小さな丸い小胞の個々の
膜の染色である。これらの小胞は大拡大したときのみ鮮
明に観察されるが、それらは非常に強度に染色され易い
。原形質膜の染色も観察されることがあるが、陽性染色
の基準とすることはできない。これらのパターンのうち
いずれが現在のデータのものよりも感受的又は特異的で
あるかについては明らかでないが、ゴルジ領域の染色は
より感受的であるとまでいえないものの、個々の小胞及
び膜の染色はより特異的である。
血岐塗沫試料の場合では、基準は若干異なる。
染色は個別的ではないようであり、再度細胞膜質の染色
のみが考慮される。陽性の血液塗抹試料では、個々のリ
ンパ球、特に大リンパ球の染色を示す。他の細胞型は考
慮されない。陽性染色は、特に原形質膜に隣接するおよ
びそれを含む細胞質中で観察され、やや塊状か又は粒状
のようである。
のみが考慮される。陽性の血液塗抹試料では、個々のリ
ンパ球、特に大リンパ球の染色を示す。他の細胞型は考
慮されない。陽性染色は、特に原形質膜に隣接するおよ
びそれを含む細胞質中で観察され、やや塊状か又は粒状
のようである。
細胞質の拡散染色は陽性と判断されない。
6、 反応生成物は、同一領域内に存在する対比染色剤
の量に応じて褐色から灰色に変化する。
の量に応じて褐色から灰色に変化する。
対比染色剤の青色は反応生成物と判断すべきではない。
特に、しばしば生じる灰色は観察しにくいため、良好な
色調が判断上必要とされる。顕微鏡素子はスライド中の
色の知覚に影響を及ぼし、したがって良質で慎重に選択
された素子を使用することが重要である。
色調が判断上必要とされる。顕微鏡素子はスライド中の
色の知覚に影響を及ぼし、したがって良質で慎重に選択
された素子を使用することが重要である。
上記記載は、実例及び説明の目的から、本発明の具体的
態様に関するものであった。当業者であれば、本発明の
範囲及び精神から逸脱することなく、−1−紀方法及び
組成物の修正及び変更を容品に認識するであろう。
態様に関するものであった。当業者であれば、本発明の
範囲及び精神から逸脱することなく、−1−紀方法及び
組成物の修正及び変更を容品に認識するであろう。
特に、本発明者らは、エイズ抗原又はエイズ感染リンパ
球と選択的に反応′するマーモセット抗体から開発され
るモノクローナル抗体組成物が本発明の免疫学的診断方
法を実施するために使用される他の特に好ましい免疫試
薬を提供し得ることを予期している。
球と選択的に反応′するマーモセット抗体から開発され
るモノクローナル抗体組成物が本発明の免疫学的診断方
法を実施するために使用される他の特に好ましい免疫試
薬を提供し得ることを予期している。
当然のことながら、マーモセット抗エイズ抗体は、他の
多数の診断試験方法のうちの1以上で使用することがで
きる。特に、抗体は、常法により、放射性同位体、蛍光
標識又は蛍光発生酵素のようなトレーサーで標識するこ
とができる。かかる標識抗体は診断試験において非常に
有用である。様々なアプローチが、直接的及び間接的両
方の免疫試験法を含めて利用し得る。一般的免疫試験法
のバリエーションには、放射免疫試験(ff!(接又は
間接)、蛍光抗体試験(直接又は間接)、酵素結合免疫
ソルベント試験(ELISA)、溶血阻害試験、凝集阻
害試験、凝集反応(抗体−リガント介在)及び/又は補
体消費試験がある。このような系における1以−りの抗
エイズ抗体の使用は、エイズ診断用の重要で新規かつを
用な試験法を構成するものであって、高感受性型免疫試
験に適用することができる。
多数の診断試験方法のうちの1以上で使用することがで
きる。特に、抗体は、常法により、放射性同位体、蛍光
標識又は蛍光発生酵素のようなトレーサーで標識するこ
とができる。かかる標識抗体は診断試験において非常に
有用である。様々なアプローチが、直接的及び間接的両
方の免疫試験法を含めて利用し得る。一般的免疫試験法
のバリエーションには、放射免疫試験(ff!(接又は
間接)、蛍光抗体試験(直接又は間接)、酵素結合免疫
ソルベント試験(ELISA)、溶血阻害試験、凝集阻
害試験、凝集反応(抗体−リガント介在)及び/又は補
体消費試験がある。このような系における1以−りの抗
エイズ抗体の使用は、エイズ診断用の重要で新規かつを
用な試験法を構成するものであって、高感受性型免疫試
験に適用することができる。
本発明者らの意図によれば、特許請求の範囲はすべての
−1−記のような修正及びバリエーションを゛包含する
ものと解釈されている。
−1−記のような修正及びバリエーションを゛包含する
ものと解釈されている。
図1は、エイズを示す陽性リンパ球染色の写真である。
図2は、エイズを示す陽性リンパ球染色の写真であり、
特にこの試料が採取された患者はエイズ前駆症であった
。 図3は、正常で健康な同性愛者から採取された血液塗抹
試料の陰性染色を示す写真である。 図4は陰性コントロール試料を示す写真である。 手続辛市正≠F(方式) 1.事件の表示 昭和62年 特許願 第47418号 2、発明の名称 後天性免疫不全症候群の検出のための方法及び組成物3
、補正をする者 事件との関係 特許出願人 ステイーブン、アール、ウエツチャー 4゜代 理 人(郵便番号100) Y盾 一、l::’− 二1・ 昭和62年5月5日 (発送日 昭和62年5月26日) づ 補正する。 図面の簡単な説明 図1は、エイズを示す陽性リンパ球染色の形態を示す写
真である。 図2は、エイズを示す陽性リンパ球染色の形態を示す写
真であり、特にこの試料が採取された患者はエイズ前駆
症であった。 図3は、正常で健康な同性愛者から採取された血岐塗沫
試料の陰性染色の形態を示す写真である。 図4は陰性コントロール試料の形態を示す写工°1であ
る。
特にこの試料が採取された患者はエイズ前駆症であった
。 図3は、正常で健康な同性愛者から採取された血液塗抹
試料の陰性染色を示す写真である。 図4は陰性コントロール試料を示す写真である。 手続辛市正≠F(方式) 1.事件の表示 昭和62年 特許願 第47418号 2、発明の名称 後天性免疫不全症候群の検出のための方法及び組成物3
、補正をする者 事件との関係 特許出願人 ステイーブン、アール、ウエツチャー 4゜代 理 人(郵便番号100) Y盾 一、l::’− 二1・ 昭和62年5月5日 (発送日 昭和62年5月26日) づ 補正する。 図面の簡単な説明 図1は、エイズを示す陽性リンパ球染色の形態を示す写
真である。 図2は、エイズを示す陽性リンパ球染色の形態を示す写
真であり、特にこの試料が採取された患者はエイズ前駆
症であった。 図3は、正常で健康な同性愛者から採取された血岐塗沫
試料の陰性染色の形態を示す写真である。 図4は陰性コントロール試料の形態を示す写工°1であ
る。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、被疑保菌者における後天性免疫不全症候群の免疫学
的診断方法であって、 (a)被疑保菌者から採取されたリンパ球試料を、エイ
ズ感染組織と選択的に反応するトレーサー標識抗体を含
有する免疫試薬と混合し(上記抗体はマーモセットザル
から得られたものであって、このマーモセットザルはマ
ーモセットウェィスティング症候群にかかっているか又
はそれから回復したものである); (b)免疫複合体形成条件下で混合物をインキュベート
し;次いで、 (c)後天性免疫不全症候群であることを示す陽性の免
疫反応を検出する; ことからなる免疫学的診断方法。 2、被疑保菌者がヒトである、特許請求の範囲第1項記
載の方法。 3、リンパ球試料が血液である、特許請求の範囲第1項
記載の方法。 4、リンパ球試料がリンパ系組織である、特許請求の範
囲第1項記載の方法。 5、リンパ球試料が脾臓組織である、特許請求の範囲第
1項記載の方法。 6、免疫試薬が血清である、特許請求の範囲第1項記載
の方法。 7、免疫試薬が実質的に免疫グロブリンからなる、特許
請求の範囲第1項記載の方法。 8、トレーサー標識抗体がビオチンと共有結合した抗体
からなる、特許請求の範囲第1項記載の方法。 9、トレーサー標識抗体が放射性同位体、蛍光発生酵素
又は蛍光標識と共有結合した抗体からなる、特許請求の
範囲第1項記載の方法。 10、エイズ感染組織と選択的に反応するトレーサー標
識抗体(上記抗体はマーモセットザルから得られたもの
であって、このマーモセットザルはマーモセットウェィ
スティング症候群にかかっているか又はそれから回復し
たものである)を含有した後天性免疫不全症候群診断用
免疫試薬。 11、免疫試薬が血清である、特許請求の範囲第10項
記載の免疫試薬。 12、実質的に免疫グロブリンからなる、特許請求の範
囲第10項記載の免疫試薬。 13、トレーサー標識抗体がビオチンと共有結合した抗
体からなる、特許請求の範囲第10項記載の免疫試薬。 14、トレーサー標識抗体が放射性同位体、蛍光発生酵
素又は蛍光標識と共有結合した抗体からなる、特許請求
の範囲第10項記載の免疫試薬。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP4741887A JPS63217271A (ja) | 1984-11-28 | 1987-03-02 | 後天性免疫不全症候群の検出のための方法及び組成物 |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US06/675,601 US4692403A (en) | 1984-11-28 | 1984-11-28 | Methods and compositions for the detection of acquired immune deficiency syndrome |
JP4741887A JPS63217271A (ja) | 1984-11-28 | 1987-03-02 | 後天性免疫不全症候群の検出のための方法及び組成物 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS63217271A true JPS63217271A (ja) | 1988-09-09 |
Family
ID=26387574
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP4741887A Pending JPS63217271A (ja) | 1984-11-28 | 1987-03-02 | 後天性免疫不全症候群の検出のための方法及び組成物 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS63217271A (ja) |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS63501295A (ja) * | 1985-11-14 | 1988-05-19 | プレジデント アンド フエロウズ オブ ハ−バ−ド カレツジ | T−リンパ趨行性ウイルス |
-
1987
- 1987-03-02 JP JP4741887A patent/JPS63217271A/ja active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS63501295A (ja) * | 1985-11-14 | 1988-05-19 | プレジデント アンド フエロウズ オブ ハ−バ−ド カレツジ | T−リンパ趨行性ウイルス |
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