JPS6320518B2

JPS6320518B2 -

Info

Publication number: JPS6320518B2
Application number: JP59022394A
Authority: JP
Inventors: Osamu Suzuki; Toshihiro Yokochi
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1984-02-09
Filing date: 1984-02-09
Publication date: 1988-04-27
Also published as: JPS60168391A

Description

【発明の詳細な説明】本発明はモルテイエレラ層の糸状菌を炭水化物
を炭素源とする培地に培養することにより、γ−
リノレン酸含有脂質〔中性脂質（油脂など）、極
性脂質（リン脂質、糖脂質）〕の高含量菌体を生
産し、培養菌体よりγ−リノレン酸含有脂質を採
取し、これからγ−リノレン酸濃縮物を得る方法
に関するものである。現在、γ−リノレン酸あるいはその含有脂質は
つきみ草（Oenotbera biennisL.）の種子から採
取されているが、極めて生産性が低く、これに代
る植物種子油の探索など〔R.B.Wolt，R.
kleiman，R.E.England，J.Amer.OilChem.Soc.，
60 1858（1983）〕が試みられている。γ−リノレ
ン酸含有脂質を生産する植物はいずれも特殊なも
のであり、種子の集収も含めて生産性を高めるこ
とは困難である。これに対して微生物による生産
は太陽エネルギーが不必要であり、天候に左右さ
れないこと、大きな土地を必要とせず工場規模で
生産が行えること、生産性が高いこと及び生産量
を自由に制御できることなどの利点を有すること
が知られている。現在までにγ−リノレン酸を脂
質中に含む微生物としてはムコール・グロボサ
ス、ムコール・プシルス〔R.O.Mumma etal.，
Lipids，６，584（1971）〕、ユアネホラ・ククルビ
タルム〔H.B.White，Jr.，S.S.Rowell，
Biochim.Biophys.Acta.，116，388（1966）〕、ビ
チウム・テバリアナム、サブロレグニア・リトラ
リス、リゾパス・ストロニフア、リゾパス・アル
ヒザス、ピユミセス・ブラチエスレアヌス、ムコ
ール・ジヤバニカス、ヘリユステイルム・ピルホ
ルメ〔R.Shaw，Biochim.Biophys.Acta，98，
230（1965）〕、エントモフトラ・コロナタ〔R.O.
Mumma.T.E.Brus−zewski，Lipids，５，915
（1970）〕などが報告されているが、いずれの菌も
フラスコスケールあるいは小型培養槽による菌体
の増殖に際しては原料炭素源の炭水化物濃度は20
〜60ｇ／にとどまつており、増殖菌体量も少
く、又生成脂質の含量も３〜30％であり、γ−リ
ノレン酸含有脂質の生産性としては極めて低いも
のであつた。本発明者らは、モルテイエレラ属に属するイサ
ベリナ、ビナセア、ラマニアナ、ラマニアナ・ア
ングリスポラ及びナナの糸状菌菌株を炭水化物を
炭素源とする培地に培養して得られる菌体は、γ
−リノレン酸を全脂質脂肪酸中の2.0〜12％含む
脂質を乾燥菌体に対して30〜60％含有することを
見出した。しかも、この場合、細菌や酵母と異な
り菌糸で増殖する糸状菌は一般に通気撹拌培養に
おける菌体の高密度培養は困難とされていたのに
対して、モルテイエレラ属に属する前記糸状菌の
高密度培養が可能であることを見出した。すなわ
ち、モルテイエレラ属に属する特定の糸状菌が高
濃度の炭水化物を炭素源とする培地を用いての通
気撹拌培養において撹拌速度を早くすることによ
り、菌糸を伸ばさずに小単位で増殖し、γ−リノ
レン酸を含む脂質の含量が高い状態で菌体の高密
度培養が可能であること、たとえば原料炭水化物
（グルコース270ｇ／培地）が30℃、72時間の菌
体培養により完全に消費され、増殖菌体量（乾燥
重量）100ｇ／培地以上、γ−リノレン酸を４
％以上含む脂質生成量約50ｇ／培地、脂質含量
約50％が得られ、その結果、γ−リノレン酸の培
地当りの生成量約2.0ｇ、乾燥菌体に対するγ
−リノレン酸の生産性2.0％以上の値が得られる。本発明は、モルテイエレラ属に属するイサベリ
ナ、ビナセア、ラマニアナ、ラマニアナ・アング
リスポラ及びナナの菌株を炭水化物を炭素源とす
る培地に培養することにより、γ−リノレン酸含
有脂質〔中性脂質（油脂など）、極性脂質（リン
脂質、糖脂質）〕を含有する菌体を生産し、培養
菌体よりγ−リノレン酸含有脂質を採取し、この
脂質からγ−リノレン酸濃縮物を得ることを特徴
とするγ−リノレン酸濃縮物の製造方法である。本発明の使用菌はモルテイエレラ
（Mortierella）属のイサベリナ（isabellina）
〔IFO7824，7884，8183，8308，8309〕、ビナセア
（vinacea）〔IFO6738〕、ラマニアナ
（ramaniana）〔IFO8287〕ラマニアナ・アングリ
スポラ（ramanianavar.anglispora）〔IFO6744，
8187〕、ナナ（nana）〔IFO8794〕の各種菌株で
ある。なお、上記した菌はいずれも財団法人発酵研究
所に保存され、IFOカタログ（菌株目録）に記載
されている糸状菌である。上記の糸状菌を培養する培地の炭素源である炭
水化物としては、たとえばグルコース、フラクト
ース、サツカロース、糖蜜、デン粉、木材糖化液
などが用いられる。炭水化物は培地１中に60〜
400ｇ用いられるのが好ましい。また窒素源とし
ては、例えば硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウムなど
の様な無機窒素源、または尿素、ペプトン、酵母
エキス、コーン・スチーブ・リカーなど有機窒素
源が用いられる。無機塩としては、例えば
KH₂PO₄，K₂HPO₄，NaCl，FeSO₄・7H₂O，
MgSO₄・7H₂O，ZnSO₄・7H₂Oなどが用いられ
る。その他必要に応じて微量要素、その他の栄養
源を添加する。上記の糸状菌の培養は通常液体培地で通気撹拌
培養などにより行われる。培地のpHは4.0〜6.0が
良く、撹拌速度300〜800rpm通気量0.5〜2vvmで
２日〜15日培養が行われる。かくして、γ−リノ
レン酸を含む脂質の高含量菌体が培地中に高密度
に生産されるので、培養物より菌体を分離し、γ
−リノレン酸含有脂質が糸状菌の菌体中に含まれ
るので、この菌体よりγ−リノレン酸含有脂質及
びγ−リノレン酸を採取するのが好適である。培
養物より菌体の分離に当つては菌体があまりのび
ず極めて小単位（１〜10細胞）で培養されてお
り、従つて、例えば遠心脱水器などにより極めて
容易に分離され、乾燥度の高い菌体（含水率約60
％）になる利点を有することも明らかになつた。 γ−リノレン酸含有脂質の採取は常法によつて
溶媒抽出などによつて行われる。γ−リノレン酸
含有脂質からのγ−リノレン酸濃縮物の回収は、
混合脂肪酸あるいは脂肪酸エステルの状態で常法
のたとえば尿素付加法、冷却分離法などにより濃
縮採取される。かくして、本発明によれば、高濃度の炭水化物
を炭素源としてγ−リノレン酸含有脂質の高含量
菌体を生産し、生産された菌体よりγ−リノレン
酸含有脂質並びにγ−リノレン酸濃縮物を採取す
ることができ、本発明は生産性の高いγ−リノレ
ン酸含有脂質あるいはγ−リノレン酸の製造法と
してすぐれたものである。このことは特に現在植
物種子から採取されているγ−リノレン酸含有脂
質あるいはγ−リノレン酸の微生物からより生産
性の優れた製造方法を与えるものである。なお、γ−リノレン酸〔18：３（６，９，12）〕
はリノール酸と共に哺乳動物では体内で合成する
ことのできない、食飼として要求される脂肪酸
（必須脂肪酸）である。これはγ−リノレン酸が
体内でビスホモ−γ−リノレン酸となり、さらに
はアラキドン酸となる前駆体であること、ビスホ
モーγ−リノレン酸、アラキドン酸はそれぞれブ
ロスタグランジン、E₁，F_1d及びE₂，F_2dとなり生
体中で極めて重要な生理的な役割をはたしている
からである。従つて、γ−リノレン酸含有脂質は
医薬品などとして利用できるものであることは明
らかである。次に本発明の実施例を示すが、本発明はこれに
より制限を受けるものではない。実施例１グルコース60ｇ、KH₂PO₄2ｇ、
MgSO₄7H₂O0.3ｇ、NaCl0.1ｇ、マルト・エキス
0.2ｇ、イースト・エキス0.2ｇ，ペプトン0.1ｇ、
FeSO₄・7H₂O10mg、CaCl₂・2H₂O10mg、
CuSO₄・5H₂O0.2mg，MnSO₄・4H₂O1.0mgと窒素
源として（NH₄）₂SO₄3ｇ，〔Ｃ／Ｎ比（炭素源中
の炭素原子重量／窒素原子中の窒素原子重量）は
約40〕を脱イオン水1000mlに混合した培地を基準
として炭素源である炭水化物（グリコース、糖な
ど）の濃度を増加させた場合、その濃度に応じて
培地成分を増加して、又窒素源を尿素などに変え
た場合は同じＣ／Ｎ比になるように培地を調整し
た。この培地を10の培養槽で培養する場合には６
、30の培養槽では20仕込み、それぞれ菌株
を接種し、30℃の培養温度で所定の時間、通気量
0.5〜2.0vvmで300〜700rpmで撹拌して培養を行
つた。培養後遠心分離法で菌体を集めた。又、菌
体の増殖量、脂質生成量及び培地中の炭水化物濃
度の測定を行うため、培養の中間段階において所
定の時間毎に100mlずつ試料の採取を行い、口過
法により菌体と培地の分離を行つた。分離された
菌体はその一部を含水率の定量のため、精秤し恒
温槽中120℃で一昼夜乾燥し、含水率を求め、残
りの菌体について脂質の抽出を行つた。菌体から
の脂質の抽出は、残りの湿菌体にクロロホルム−
メタノール（２：1V／Ｖ）混液を加え、ガラス
ビーズ存在下にホモジナイズすることにより菌体
の破砕と脂質の抽出を同時に行つた。なお、抽出
を完全に行うため、これを５回繰返し、全抽出液
を集めた。上記抽出液をFolchの分配洗浄法によ
り精製した後、溶媒を減圧留去し、重量法で全脂
質量を測定した。菌体を除いた培地については高
速液体クロマトグラフイー（HPLC）により炭水
化物（グルコース、フラクトース、サツカロー
ス）の濃度を測定し、濃度が０になつた時点で培
養を終了した。菌体から抽出し、精秤した生成脂質は一部を取
りメチルエステル化の後、ガスクロマトグラフイ
ーにより脂肪酸組成を分析した。残りの脂質につ
いて、ユニシルを充填剤とし、クロロホルム及び
メタノールを展開溶剤とするカラムクロマトグラ
フイーにより中性脂質と極性脂質に分離し、それ
ぞれの存在量を求めると共に、それぞれの脂質に
ついてもガスクロマトグラフイーを行い、脂肪酸
組成を求めた。各種モルテイエレラ属糸状菌菌株について、グ
ルコールあるいは糖蜜を炭素源として各種の初期
炭素源濃度における窒素源及び窒素源濃度を変え
て10及び30培養槽により培養して得られた菌
体増殖量（乾燥重量ｇ／）、脂質生成量（ｇ／
）、脂質含量（％）、中性及び極性脂質含量
（％）、全脂質、中性及び極性脂質中に占めるγ−
リノレン酸含量並びにγ−リノレン酸の生産性と
して培地当りの生成量（ｇ／）及び乾燥菌体
中のγ−リノレン酸含量の得られた結果を表−１
にまとめて示した。なお、培養時間として示した
時間は炭素源であるグリコースあるいは糖蜜が完
全に消費され、培地中になくなつた時間であり、
その時間で培養を停止した。表−１では炭素源として用いたグリコースある
いは糖密が濃度100ｇ／以上、平均200ｇ／と
高くても菌体の増殖は早く、菌体濃度として40〜
156ｇ／、γ−リノレン酸を含む脂質生成量と
しては13〜83ｇ／、脂質含量としては32〜58％
の生産性が示された。また、生成脂質の脂肪酸中
のγ−リノレン酸は3.5〜11.2％とつきみ草種子
などの植物種子油中のγ−リノレン酸含量に匹敵
するものであることがわかる。中性脂質のγ−リ
ノレン酸含量は3.3〜11.0％であり、極性脂質で
は12.1〜23.7％とかなり高い含量であることが認
められた。γ−リノレン酸の生産性として培地１
当りの生産量を求めた結果では0.9〜3.4ｇと高
い生産性を持つことがわかる。乾燥菌体中に占めるγ−リノレン酸含量として
も1.3〜4.1％の値が得られ、これも植物種子中に
占める値とほぼ同程度であることが認められた。実施例２実施例１で示された菌株モルテイエレラ・ラマ
ニアナ・アングリスポラIFO8187の培養温度30℃
で66時間培養して得られた湿菌体900ｇ（乾燥重
量270ｇ）より100ｇの脂質を実施例１に従つて抽
出した。得られた脂質100ｇを常法によりメチル
エステル化を行つた結果、92ｇの脂肪酸メチルを
得た。この脂肪酸メチルの組成はガスクロマトグ
ラフ分析でパルミチン酸31.3％、パルミトオレイ
ン酸1.4％、ステアリン酸5.6％、オレイン酸44.7
％、リノール酸9.2％、γ−リノレン酸6.4％であ
ることが認められた。この混合脂肪酸メチルにつ
いて常法による尿素付加法を３回繰返した結果、
γ−リノレン酸メチルが48.2％まで濃縮された混
合脂肪酸7.2ｇを得た。なお、γ−リノレン酸濃
縮混合脂肪酸の組成はリノール酸45.9％、オレイ
ン酸4.1％、その他1.8％であつた。【表】

Claims

【特許請求の範囲】

１モルテイエレラ属に属するイサベリナ、ビナ
セア、ラマニアナ、ラマニアナ・アングリスポラ
及びナナの菌株を炭水化物を炭素源とする培地に
培養された菌体より採取されたγ−リノレン酸含
有脂質からγ−リノレン酸濃縮物を得ることを特
徴とするγ−リノレン酸濃縮物の製造方法。