JPS63192384A - ス−パ−オキシドデイスムタ−ゼの製造方法 - Google Patents
ス−パ−オキシドデイスムタ−ゼの製造方法Info
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- JPS63192384A JPS63192384A JP2544787A JP2544787A JPS63192384A JP S63192384 A JPS63192384 A JP S63192384A JP 2544787 A JP2544787 A JP 2544787A JP 2544787 A JP2544787 A JP 2544787A JP S63192384 A JPS63192384 A JP S63192384A
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Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、医薬、例えば各種炎症、リウマチ性関接炎等
疾患の予防、治療剤として使用することが期待されてい
るチオール基を有する鋼、亜鉛スーI臂−オキシドディ
スムターゼの新規な製造方法に関するものである。
疾患の予防、治療剤として使用することが期待されてい
るチオール基を有する鋼、亜鉛スーI臂−オキシドディ
スムターゼの新規な製造方法に関するものである。
従来の技術
スー/#−オキシドディスムターゼ(以下rsODJと
略記する。)は細菌から哨乳動物にいたるまで広く存在
が知られている酵素であシ、スーパーオキシドアニオン
0−の不均化反応20□−+ 2H→02+ H2O2
1触媒する。スーパーオキシドアニオンは、生体内で酸
素毒性を示す活性酸素分子種の1つであfi 500は
生体の酸素毒性からの防御の役割を果しているものと考
えられている0例えば、0□−は各種炎症やりウマチ性
関節炎の発症に関与すると言われておシ、実際にこれら
の疾患に対する800の治療効果も確認されている。従
って、従来よシ工業的規模でのSODの製造方法に関す
る研究が行なわれている。
略記する。)は細菌から哨乳動物にいたるまで広く存在
が知られている酵素であシ、スーパーオキシドアニオン
0−の不均化反応20□−+ 2H→02+ H2O2
1触媒する。スーパーオキシドアニオンは、生体内で酸
素毒性を示す活性酸素分子種の1つであfi 500は
生体の酸素毒性からの防御の役割を果しているものと考
えられている0例えば、0□−は各種炎症やりウマチ性
関節炎の発症に関与すると言われておシ、実際にこれら
の疾患に対する800の治療効果も確認されている。従
って、従来よシ工業的規模でのSODの製造方法に関す
る研究が行なわれている。
800 Fi、活性中心に金属を持つ金M4酵累であシ
、その金属の程類によってF・−8OD 、 Mn −
SOD及びCu−Zn−8OD (鋼、 亜鉛−SOD
) O3fllK大別fルことか出来る。このうち、
Cu−2n−8ODは赤血球中に著量存在することから
特に、その利用に関する研究が進められている。
、その金属の程類によってF・−8OD 、 Mn −
SOD及びCu−Zn−8OD (鋼、 亜鉛−SOD
) O3fllK大別fルことか出来る。このうち、
Cu−2n−8ODは赤血球中に著量存在することから
特に、その利用に関する研究が進められている。
Cu −Zn−8OD f生体al織や面数から分離す
る方法としては、クロロホルム−エタノール処理法(J
。
る方法としては、クロロホルム−エタノール処理法(J
。
Biol、 Chem、 244 、6051 ) 、
イオン交換樹脂法(J、 Blol、Chem、 24
7 、7043 ) 、加熱処理法(特開昭53−31
206号公報)などの方法が知られてお)、これらの方
法とクロマトグラフィーを組み合わせることにより、C
u −Zn−8OD Fin製されている。このように
して精製されたCu−Zn−8ODは蛋白質として均一
ではなく、チャージアイソマーと称されるvi数の成分
からなることが知られている。このSODに特有の分子
多様性は、800分子が生体内において伺らかの2次的
修飾を受けた結果であると考えられているが、詳細につ
いては明らかではない。
イオン交換樹脂法(J、 Blol、Chem、 24
7 、7043 ) 、加熱処理法(特開昭53−31
206号公報)などの方法が知られてお)、これらの方
法とクロマトグラフィーを組み合わせることにより、C
u −Zn−8OD Fin製されている。このように
して精製されたCu−Zn−8ODは蛋白質として均一
ではなく、チャージアイソマーと称されるvi数の成分
からなることが知られている。このSODに特有の分子
多様性は、800分子が生体内において伺らかの2次的
修飾を受けた結果であると考えられているが、詳細につ
いては明らかではない。
Cu−Zn−8ODのうち最も研究されているものけ牛
歩血球由来のSODであシ、全アミノ酸配列の他。
歩血球由来のSODであシ、全アミノ酸配列の他。
X線結晶構造解析による立体構造声明らかにされている
。即ち、分子量は約32,000であジアミノ酸敗15
1個よシなる同等なサブユニットで二量体を形成してい
る。それぞれのサブユニットには、銅及び亜鉛が1つず
つ結合しておシ、活性発現に重要な役割を果している。
。即ち、分子量は約32,000であジアミノ酸敗15
1個よシなる同等なサブユニットで二量体を形成してい
る。それぞれのサブユニットには、銅及び亜鉛が1つず
つ結合しておシ、活性発現に重要な役割を果している。
ヒ) Cu−Zn−8ODに2いても全アミノ酸配列が
明らかにされており、アミノ酸敗153個の均等なサブ
ユニットで二量体を形成している。そのアミノ酸配列は
、ウシCu −Zn−SODのそれとよく類似しておシ
、分子量や等電点もよく似かよっ゛ている。従って′8
表方法も、ウシCu−Zn−8ODに用いられている方
法に準じた方法がとられている。
明らかにされており、アミノ酸敗153個の均等なサブ
ユニットで二量体を形成している。そのアミノ酸配列は
、ウシCu −Zn−SODのそれとよく類似しておシ
、分子量や等電点もよく似かよっ゛ている。従って′8
表方法も、ウシCu−Zn−8ODに用いられている方
法に準じた方法がとられている。
ヒトCu−Zn−8ODについても、他のSODと同様
に等電点の異なるチャージアイソマーの存在が知られて
お夛、赤血球からCu −Zn−8OD f ilf製
してゆく過程でイオン交換クロマトグラフィーにより、
2成分に分離されることが報告されている(例えば、M
@thods of Enzymology、 Mol
105 、 p88 (1984))。
に等電点の異なるチャージアイソマーの存在が知られて
お夛、赤血球からCu −Zn−8OD f ilf製
してゆく過程でイオン交換クロマトグラフィーにより、
2成分に分離されることが報告されている(例えば、M
@thods of Enzymology、 Mol
105 、 p88 (1984))。
コ17) 多t−1e性についてはヒ) Cu−Z’n
−8ODが反応性に富む一8H基を持ち、この−8H基
の修飾が原因であることが指摘されてk j) (Eu
r、J、 Bloch@m 56305(1975)’
) 、その修飾は低分子チオール化合物とのポリスルフ
ィド形成であろうと言われている( Blochim、
Biophys、 Aeta 、 537 、100
(1978))。実際に明らかにされたヒトCu−Zn
−8ODの1次構造を他のCu−Zn−8ODと比較す
ると111番目にCys残基金持つことが特徴的であシ
。
−8ODが反応性に富む一8H基を持ち、この−8H基
の修飾が原因であることが指摘されてk j) (Eu
r、J、 Bloch@m 56305(1975)’
) 、その修飾は低分子チオール化合物とのポリスルフ
ィド形成であろうと言われている( Blochim、
Biophys、 Aeta 、 537 、100
(1978))。実際に明らかにされたヒトCu−Zn
−8ODの1次構造を他のCu−Zn−8ODと比較す
ると111番目にCys残基金持つことが特徴的であシ
。
他の牛、烏、カジキ、ハエ、酵母、ホウレン草から単離
されたCu−Zn−8ODでは、この位置はすべてSe
rになっている( FEBS Lett、 、 120
、53(1980))。このCys残基が、以前に指
摘された反応性に富む一8H基の原因であろうと考える
ことは、Cu−Zn−8ODが極めて1次構造上のホモ
ロジーが高く、他のCys ll!7c基は良く保存さ
れておシ、又、この反応性−811基の存在がヒトCu
−Zn−8ODに特徴的なことを考えると、極めて妥
当である。又、最近では、非酵素的グリコジル化が多様
性の原因であるとする指摘もあt) (J、 Immu
nol、 Methods91.139(1986))
、又ヒト以外のCu −Zn −8ODにも分子多様性
が見られることから、ヒト−Cu・Zn −SODの多
様性の原因についてはいまだに充分解明されていないの
が現状である。
されたCu−Zn−8ODでは、この位置はすべてSe
rになっている( FEBS Lett、 、 120
、53(1980))。このCys残基が、以前に指
摘された反応性に富む一8H基の原因であろうと考える
ことは、Cu−Zn−8ODが極めて1次構造上のホモ
ロジーが高く、他のCys ll!7c基は良く保存さ
れておシ、又、この反応性−811基の存在がヒトCu
−Zn−8ODに特徴的なことを考えると、極めて妥
当である。又、最近では、非酵素的グリコジル化が多様
性の原因であるとする指摘もあt) (J、 Immu
nol、 Methods91.139(1986))
、又ヒト以外のCu −Zn −8ODにも分子多様性
が見られることから、ヒト−Cu・Zn −SODの多
様性の原因についてはいまだに充分解明されていないの
が現状である。
発明が解決しようとする間1点
SODの臨床応用を考えた場合、抗亦性の点から用いら
れるSODはヒト由来のものであることが望ましい。し
かし、以上に述べた分子多様性はヒト−Cu−Zn−8
ODの作用の研究や医薬品としての利用に際しては1)
多様な分子種が作用、性質の面で異なる可能性がある、
2)医薬品としての品質管理の面かつ、3) SODと
他f4I蛋白質の分離が困離になる。
れるSODはヒト由来のものであることが望ましい。し
かし、以上に述べた分子多様性はヒト−Cu−Zn−8
ODの作用の研究や医薬品としての利用に際しては1)
多様な分子種が作用、性質の面で異なる可能性がある、
2)医薬品としての品質管理の面かつ、3) SODと
他f4I蛋白質の分離が困離になる。
4) 80Dの純度検定が難しい、などの理由で不都合
の原因となる。従りて、均一なヒト−Cu −Zn−8
ODしかもネイティブな構造を持つものが得られること
が最も望ましい。このことは高分解能の精製手段により
多様なSOD分子種の中からネイティブと思われるもの
を選び分けることにより可能となるが、容易に想像され
るように良い回収率は期待出来ない。
の原因となる。従りて、均一なヒト−Cu −Zn−8
ODしかもネイティブな構造を持つものが得られること
が最も望ましい。このことは高分解能の精製手段により
多様なSOD分子種の中からネイティブと思われるもの
を選び分けることにより可能となるが、容易に想像され
るように良い回収率は期待出来ない。
を確立することを目的とし、Cu−Zn−80Dの多様
性の原因について詳細な検fftを加え、修飾されたS
ODをネイティブ型に変換する方法について鋭意研究を
行ない本発明を完成させた。
性の原因について詳細な検fftを加え、修飾されたS
ODをネイティブ型に変換する方法について鋭意研究を
行ない本発明を完成させた。
即ち、本発明はチオール基が酸化された銅・亜鉛−8O
D t−含む水溶液を緩かな還元剤で処理しチオール基
を生成せしめた後、イオン交換クロマトグラフィーによ
り精製することを特徴とする銅・亜鉛−8ODの製造方
法である。
D t−含む水溶液を緩かな還元剤で処理しチオール基
を生成せしめた後、イオン交換クロマトグラフィーによ
り精製することを特徴とする銅・亜鉛−8ODの製造方
法である。
ζこで使用するCu−Zn−8ODは反応性のSR,i
li’を有するものであれば、その起源を問わないが、
例えばヒ) Cu−Zn−8ODではヒト赤血球、胎盤
などその由来を問わない。又、遺伝子組み替え手法によ
り。
li’を有するものであれば、その起源を問わないが、
例えばヒ) Cu−Zn−8ODではヒト赤血球、胎盤
などその由来を問わない。又、遺伝子組み替え手法によ
り。
微生物や動物細胞によって生産されたものも含む。
Cu−Zn−8ODはこれらの材料よシ既知の方法を組
み合わせることにより粗精製される。例えば、赤血球由
来のヒ) Cu−Zn−800の場合得られた粗精製S
ODは等電点電気泳動法、高速陰イオン交換クロマドグ
2フイー等の手段により分析すると、SOD活性を示す
蛋白質として3種以上の蛋白質を含んでいるがこのうち
主な3成分は、ネイティブなSOD及び、そのサブユニ
ットの片方がグルタチオンとの混合ジスルフィドを形成
したもの、そのサブユニットの双方がグルタチオンとの
混合ジスルフィドを形成し九ものであることが明らかに
なった。更にこうした混合ジスルフィド体は還元剤で緩
かに処理することによ)、効果的にネイティブなSOD
へと変換出来ることを見い出した。すなわち粗精製され
たSODを蛋白濃度1〜200号似、望ましくは5〜1
00−1−6〜10、望ましくは7〜8.5の水溶液と
し、過剰の還元剤を加える。ここで、用いられる還元剤
の量、反応温度、反応時間は還元剤の種類に依存する。
み合わせることにより粗精製される。例えば、赤血球由
来のヒ) Cu−Zn−800の場合得られた粗精製S
ODは等電点電気泳動法、高速陰イオン交換クロマドグ
2フイー等の手段により分析すると、SOD活性を示す
蛋白質として3種以上の蛋白質を含んでいるがこのうち
主な3成分は、ネイティブなSOD及び、そのサブユニ
ットの片方がグルタチオンとの混合ジスルフィドを形成
したもの、そのサブユニットの双方がグルタチオンとの
混合ジスルフィドを形成し九ものであることが明らかに
なった。更にこうした混合ジスルフィド体は還元剤で緩
かに処理することによ)、効果的にネイティブなSOD
へと変換出来ることを見い出した。すなわち粗精製され
たSODを蛋白濃度1〜200号似、望ましくは5〜1
00−1−6〜10、望ましくは7〜8.5の水溶液と
し、過剰の還元剤を加える。ここで、用いられる還元剤
の量、反応温度、反応時間は還元剤の種類に依存する。
SODは分子中にジスルフィド架橋を持つ為このジス
ルフィド架橋に影響を与えず、グルタチオンとの混合ジ
スルフィド結合のみを選択的に開裂させることが重要で
ある0例えば、メルカグトエタールやジチオスレイトー
ル(DTT )等の低分子チオール化合物を用いる場合
には、SODに対して2倍〜100倍、好ましくは5倍
から40倍モル当量用い、室温で30分から24時間程
度、望ましくは1〜5時間反応させる。反応時間が長い
場合は、メルカグトエタノール等を用いた際には、空気
酸化によジメルカプトエタノールと80Dの混合ジスル
フィドが形成されるので反応時間は2時間以下が望まし
い。
ルフィド架橋に影響を与えず、グルタチオンとの混合ジ
スルフィド結合のみを選択的に開裂させることが重要で
ある0例えば、メルカグトエタールやジチオスレイトー
ル(DTT )等の低分子チオール化合物を用いる場合
には、SODに対して2倍〜100倍、好ましくは5倍
から40倍モル当量用い、室温で30分から24時間程
度、望ましくは1〜5時間反応させる。反応時間が長い
場合は、メルカグトエタノール等を用いた際には、空気
酸化によジメルカプトエタノールと80Dの混合ジスル
フィドが形成されるので反応時間は2時間以下が望まし
い。
具体的には高速イオン交換クロマトグラフィーなどによ
り反応の進行をモニターし、反応が完了した時点で過剰
の試薬をすみやかに除去するのがよい。この点で分子内
の環状ジスルフィド形成へ平衡が片寄ったDTTやジチ
オスレイトール(DTE)の使用がよシ望ましい。
り反応の進行をモニターし、反応が完了した時点で過剰
の試薬をすみやかに除去するのがよい。この点で分子内
の環状ジスルフィド形成へ平衡が片寄ったDTTやジチ
オスレイトール(DTE)の使用がよシ望ましい。
反応終了後は、反応液を直接陰イオン交換クロマドグ2
フイーに負荷し溶離することによりて、還元剤等の除去
と、SODの精製が同時に達成される。用いられる樹脂
としては通常の蛋白質の分離に用いられるものであれば
いずれでもよいが高分離能を持つものが望ましい。還元
剤処理されたSODは一旦樹脂に吸着させた後にイオン
強度を増加させるあるいは、pl(t−低下させること
により浴出、回収される。
フイーに負荷し溶離することによりて、還元剤等の除去
と、SODの精製が同時に達成される。用いられる樹脂
としては通常の蛋白質の分離に用いられるものであれば
いずれでもよいが高分離能を持つものが望ましい。還元
剤処理されたSODは一旦樹脂に吸着させた後にイオン
強度を増加させるあるいは、pl(t−低下させること
により浴出、回収される。
このようにして得られたSODはサブユニット当)銅・
亜鉛を1原子づつ、反応性の一6H基を1ヶ含みネイテ
ィブ型のCu−Zn−8ODと考えられる。又、比活性
はマツコードらの方法(J、 Biol、Chem。
亜鉛を1原子づつ、反応性の一6H基を1ヶ含みネイテ
ィブ型のCu−Zn−8ODと考えられる。又、比活性
はマツコードらの方法(J、 Biol、Chem。
244.6049(1969))によって測定したとこ
ろ、3500 Untt/q以上の値を示し、ドデシル
硫酸ナトリウム存在下の電気泳動法により分子量16.
000の単一バンドを与え、等電点電気泳動法4.9 によりても1等を点#エキの単一バンドを示した。
ろ、3500 Untt/q以上の値を示し、ドデシル
硫酸ナトリウム存在下の電気泳動法により分子量16.
000の単一バンドを与え、等電点電気泳動法4.9 によりても1等を点#エキの単一バンドを示した。
実施例
以下、実施例により本発明の詳細な説明する。
実施例1
洗浄ヒト赤血球51K同量の蒸留水を加えて溶血させ、
マツコードらの方法(J、 Biol、 Cbs+m、
+244.6049〜6055 、(1969))に
より1)エタノール−クロロホルム処理によるヘモグロ
ビンの沈澱除去、2)リン酸l水累カリウムの添加によ
るエタノール層と水層の分離、3)アセトン沈澱による
エタノール層からのCu−Zn−8ODの回収、を行な
った。得られた沈#f:250L/の0.02M)リス
ヒドロキシメチルアミノメタン−塩酸緩衝液(以下「ト
リス塩酸緩衝液」と略す。) pH7,5に溶解させ、
不溶物を遠心分離により除去した後、同じ緩衝液に対し
て透析した。透析内fLを同じ緩@液で平衡化したDE
AE−8@phacel t−充填したカラム−32躇
X100mに通液し、1501R1の同じ緩衝液で洗浄
した。その後、0.02M)!jス塩酸緩衝g(pH7
,5)(緩衝液A)と、0.5M塩化ナトリワムを含む
0.02M)リス塩酸緩衝液(FJ(7,5)(緩衝液
B)を用いてグラジェント溶出を行なった。800活性
を示す画分を集め、限外濾過によ)蛋白濃度101とな
る様に濃縮し、引き続き緩衝e、Aに対して透析を行な
った。得られた浴液を「粗SOD溶液」と呼ぶ。
マツコードらの方法(J、 Biol、 Cbs+m、
+244.6049〜6055 、(1969))に
より1)エタノール−クロロホルム処理によるヘモグロ
ビンの沈澱除去、2)リン酸l水累カリウムの添加によ
るエタノール層と水層の分離、3)アセトン沈澱による
エタノール層からのCu−Zn−8ODの回収、を行な
った。得られた沈#f:250L/の0.02M)リス
ヒドロキシメチルアミノメタン−塩酸緩衝液(以下「ト
リス塩酸緩衝液」と略す。) pH7,5に溶解させ、
不溶物を遠心分離により除去した後、同じ緩衝液に対し
て透析した。透析内fLを同じ緩@液で平衡化したDE
AE−8@phacel t−充填したカラム−32躇
X100mに通液し、1501R1の同じ緩衝液で洗浄
した。その後、0.02M)!jス塩酸緩衝g(pH7
,5)(緩衝液A)と、0.5M塩化ナトリワムを含む
0.02M)リス塩酸緩衝液(FJ(7,5)(緩衝液
B)を用いてグラジェント溶出を行なった。800活性
を示す画分を集め、限外濾過によ)蛋白濃度101とな
る様に濃縮し、引き続き緩衝e、Aに対して透析を行な
った。得られた浴液を「粗SOD溶液」と呼ぶ。
粗SODm液9dに100mMジチオスレイトール水浴
液0.9−を加えて攪拌後、室温下で静置し九。
液0.9−を加えて攪拌後、室温下で静置し九。
図1m)にジチオスレイトール添加前の、b)に酢加後
2時間経過後のイオン交換高速液体クロマトグラフィー
による分析クロマトグラムを示した。これから明らかな
ように3本のピーク(ピークA。
2時間経過後のイオン交換高速液体クロマトグラフィー
による分析クロマトグラムを示した。これから明らかな
ように3本のピーク(ピークA。
a、C)がジチオスレイトール処理により1本のピーク
(ピークA)に変化している。2時間後、全量を緩衝液
Aで平衡化したTSK−Gel DIAE 5RV(φ
511Iax20cm)に負荷し、流速30叫4で緩衝
液AとBを用いて120分間でA−100チから70チ
まで変化させる直線濃度勾配により溶出を行なった。得
られたクロマトグラムを図2に示した。図中に示した画
分を分取したところ、活性の回収はiツコードらの方法
(J、 Biol Chのm。
(ピークA)に変化している。2時間後、全量を緩衝液
Aで平衡化したTSK−Gel DIAE 5RV(φ
511Iax20cm)に負荷し、流速30叫4で緩衝
液AとBを用いて120分間でA−100チから70チ
まで変化させる直線濃度勾配により溶出を行なった。得
られたクロマトグラムを図2に示した。図中に示した画
分を分取したところ、活性の回収はiツコードらの方法
(J、 Biol Chのm。
244.6049〜6055(1969))による活性
測定の結果、ジチオスレイトール処理及びクロマトグラ
フィー精製を通して約40チであった。
測定の結果、ジチオスレイトール処理及びクロマトグラ
フィー精製を通して約40チであった。
”” −0,498ト1.テ
得られた精製SODは、E280nm
算出すると、比活性4.200 UAを示し、等電点電
気泳動及び還元条件下での8DSポリアクリルアミドr
ルを気泳動でいずれも単一バンドを示した(図−3m)
、 b) )。又、原子吸光法による銅及び亜鉛の定
量の結果SOD 1分子当勺それぞれ約2y−原子づつ
含むことが判った0 実施例2 実施例IK記した粗SOD溶液0.5dにメルカプトエ
タノールを濃度10−となるように加え、授拌後室温で
静置した。1時間後、全量をTSK−G@IDEAE
5 PW (φ7.5 m x 7.5 crlL)で
実施例1に示した方、法に準じて精製を行なった。主ピ
ーク画分を分取したところ、活性回収率は45%であり
、得られたSODは電気泳動的に均一であった。又、イ
オン交換1(PLOで分析を行なり九ところ1図4に示
したように単一のピークを示した。又、比活性は4)o
oU/qで返った。
気泳動及び還元条件下での8DSポリアクリルアミドr
ルを気泳動でいずれも単一バンドを示した(図−3m)
、 b) )。又、原子吸光法による銅及び亜鉛の定
量の結果SOD 1分子当勺それぞれ約2y−原子づつ
含むことが判った0 実施例2 実施例IK記した粗SOD溶液0.5dにメルカプトエ
タノールを濃度10−となるように加え、授拌後室温で
静置した。1時間後、全量をTSK−G@IDEAE
5 PW (φ7.5 m x 7.5 crlL)で
実施例1に示した方、法に準じて精製を行なった。主ピ
ーク画分を分取したところ、活性回収率は45%であり
、得られたSODは電気泳動的に均一であった。又、イ
オン交換1(PLOで分析を行なり九ところ1図4に示
したように単一のピークを示した。又、比活性は4)o
oU/qで返った。
実施例3
市販のヒト800 (Sigma社製)10vtl−の
トリス−塩酸緩衝液(声7.2)に溶解し、100dの
DT?水浴液062dを加え、攪拌後室温下2時間装置
した。その後、実施例2に記したものと同一の方法で、
イオン交換クロマトグラフィーにより精裂した。実施例
1で示したピークムに相当する両分を分取したところ、
活性回収率は75%であり、SOD蛋白質として5.4
)11Fが得られた。得られたSODは電気泳動的に単
一のノ4ンドを示し、3950明この比活性を示した。
トリス−塩酸緩衝液(声7.2)に溶解し、100dの
DT?水浴液062dを加え、攪拌後室温下2時間装置
した。その後、実施例2に記したものと同一の方法で、
イオン交換クロマトグラフィーにより精裂した。実施例
1で示したピークムに相当する両分を分取したところ、
活性回収率は75%であり、SOD蛋白質として5.4
)11Fが得られた。得られたSODは電気泳動的に単
一のノ4ンドを示し、3950明この比活性を示した。
発明の効果
以上から明らかな如く、本発明の方法に依れば分子多様
性を有するものから均一なCu −Zn−8ODを収率
よく裏道することができるので、本発明は医薬産業上極
めて有利である。
性を有するものから均一なCu −Zn−8ODを収率
よく裏道することができるので、本発明は医薬産業上極
めて有利である。
図1は実施例1におけるイオン交換高速液体クロマトグ
ラフィーによる分析クロマトグラムを示す。a)はジチ
オスレイトール添加前、b)はジチオスレイトール添加
2時間後のものであシ、秩軸は280nmにおける吸光
度を、横軸は保持時間を示す。TSK−G@ I DE
AE5PW (φ)、 5 m X 7.5 rx )
を用い、緩衝液A、Bt−用いて直線グラジェント溶出
を行なった。 図2は実施例1における分取スケールでのクロマトグラ
ムを示す。図中の縦線にはさまれたピ−り両分を分取し
た。図3 m)は実施例1における等電点電気泳動の結
果を示す。−範囲4.5−6のダルを用い1.3は精製
されたSOD、2.4は粗800溶液の泳動パターンを
示した。図3 b)は実施例IKおけるSO8−/リア
クリルアミドグル電気泳動の結果を示す。アクリルアミ
ド濃度8−25−の濃度勾配グルを用いた。1,5は分
子基標品で上から94,000 、67.000 、4
3,000,30,000゜20、Zoo 、14,4
00の分子量のものであシ、2゜6は精製SOD、3,
4.7,8は粗SOD溶液の泳動パターンを示した。図
4は実施例2におけるイオン交換高速液体クロマトグラ
フィーによる分析クロマトグラムを示す。条件等は図1
と同様である。
ラフィーによる分析クロマトグラムを示す。a)はジチ
オスレイトール添加前、b)はジチオスレイトール添加
2時間後のものであシ、秩軸は280nmにおける吸光
度を、横軸は保持時間を示す。TSK−G@ I DE
AE5PW (φ)、 5 m X 7.5 rx )
を用い、緩衝液A、Bt−用いて直線グラジェント溶出
を行なった。 図2は実施例1における分取スケールでのクロマトグラ
ムを示す。図中の縦線にはさまれたピ−り両分を分取し
た。図3 m)は実施例1における等電点電気泳動の結
果を示す。−範囲4.5−6のダルを用い1.3は精製
されたSOD、2.4は粗800溶液の泳動パターンを
示した。図3 b)は実施例IKおけるSO8−/リア
クリルアミドグル電気泳動の結果を示す。アクリルアミ
ド濃度8−25−の濃度勾配グルを用いた。1,5は分
子基標品で上から94,000 、67.000 、4
3,000,30,000゜20、Zoo 、14,4
00の分子量のものであシ、2゜6は精製SOD、3,
4.7,8は粗SOD溶液の泳動パターンを示した。図
4は実施例2におけるイオン交換高速液体クロマトグラ
フィーによる分析クロマトグラムを示す。条件等は図1
と同様である。
Claims (4)
- (1)チオール基が酸化された銅、亜鉛スーパーオキシ
ドディスムターゼを含む水溶液を緩かな還元剤で処理し
チオール基を生成せしめた後、イオン交換クロマトグラ
フィーにより精製することを特徴とするチオール基を有
する銅、亜鉛スーパーオキシドディスムターゼの製造方
法。 - (2)還元剤が低分子チオール化合物である特許請求の
範囲第1項記載の方法。 - (3)還元剤がジチオスレイトール又はジチオエリスロ
トールである特許請求の範囲第1項記載の方法。 - (4)特許請求の範囲第1項記載の方法により製造され
たチオール基を有する銅、亜鉛スーパーオキシドディス
ムターゼ。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2544787A JPS63192384A (ja) | 1987-02-05 | 1987-02-05 | ス−パ−オキシドデイスムタ−ゼの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2544787A JPS63192384A (ja) | 1987-02-05 | 1987-02-05 | ス−パ−オキシドデイスムタ−ゼの製造方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS63192384A true JPS63192384A (ja) | 1988-08-09 |
Family
ID=12166266
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2544787A Pending JPS63192384A (ja) | 1987-02-05 | 1987-02-05 | ス−パ−オキシドデイスムタ−ゼの製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS63192384A (ja) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5635984A (en) * | 1979-05-17 | 1981-04-08 | Forenede Bryggerier As | Isolation of enzyme from aqueous solution containing cu*znnsureroxide deisumutase and accompanying protein |
JPS5729287A (en) * | 1980-07-30 | 1982-02-17 | Technicon Instr | Stabilized creatinekinase and use thereof as standard sample |
-
1987
- 1987-02-05 JP JP2544787A patent/JPS63192384A/ja active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5635984A (en) * | 1979-05-17 | 1981-04-08 | Forenede Bryggerier As | Isolation of enzyme from aqueous solution containing cu*znnsureroxide deisumutase and accompanying protein |
JPS5729287A (en) * | 1980-07-30 | 1982-02-17 | Technicon Instr | Stabilized creatinekinase and use thereof as standard sample |
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