JPS63192384A

JPS63192384A - ス−パ−オキシドデイスムタ−ゼの製造方法

Info

Publication number: JPS63192384A
Application number: JP2544787A
Authority: JP
Inventors: Hisashi Tsuji; 尚志辻; Masayo Yokoyama; 横山　昌代; Yuji Iwashita; 雄二岩下
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1987-02-05
Filing date: 1987-02-05
Publication date: 1988-08-09

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、医薬、例えば各種炎症、リウマチ性関接炎等
疾患の予防、治療剤として使用することが期待されてい
るチオール基を有する鋼、亜鉛スーＩ臂−オキシドディ
スムターゼの新規な製造方法に関するものである。

従来の技術スー／＃−オキシドディスムターゼ（以下ｒｓＯＤＪと
略記する。）は細菌から哨乳動物にいたるまで広く存在
が知られている酵素であシ、スーパーオキシドアニオン
０−の不均化反応２０□−＋　２Ｈ→０２＋　Ｈ２Ｏ２
１触媒する。スーパーオキシドアニオンは、生体内で酸
素毒性を示す活性酸素分子種の１つであｆｉ　５００は
生体の酸素毒性からの防御の役割を果しているものと考
えられている０例えば、０□−は各種炎症やりウマチ性
関節炎の発症に関与すると言われておシ、実際にこれら
の疾患に対する８００の治療効果も確認されている。従
って、従来よシ工業的規模でのＳＯＤの製造方法に関す
る研究が行なわれている。

８００　Ｆｉ、活性中心に金属を持つ金Ｍ４酵累であシ
、その金属の程類によってＦ・−８ＯＤ　、　Ｍｎ　−
ＳＯＤ及びＣｕ−Ｚｎ−８ＯＤ　（鋼、　亜鉛−ＳＯＤ
　）　Ｏ３ｆｌｌＫ大別ｆルことか出来る。このうち、
Ｃｕ−２ｎ−８ＯＤは赤血球中に著量存在することから
特に、その利用に関する研究が進められている。

Ｃｕ　−Ｚｎ−８ＯＤ　ｆ生体ａｌ織や面数から分離す
る方法としては、クロロホルム−エタノール処理法（Ｊ
。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２４４　、６０５１　）　、
イオン交換樹脂法（Ｊ、　Ｂｌｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２４
７　、７０４３　）　、加熱処理法（特開昭５３−３１
２０６号公報）などの方法が知られてお）、これらの方
法とクロマトグラフィーを組み合わせることにより、Ｃ
ｕ　−Ｚｎ−８ＯＤ　Ｆｉｎ製されている。このように
して精製されたＣｕ−Ｚｎ−８ＯＤは蛋白質として均一
ではなく、チャージアイソマーと称されるｖｉ数の成分
からなることが知られている。このＳＯＤに特有の分子
多様性は、８００分子が生体内において伺らかの２次的
修飾を受けた結果であると考えられているが、詳細につ
いては明らかではない。

Ｃｕ−Ｚｎ−８ＯＤのうち最も研究されているものけ牛
歩血球由来のＳＯＤであシ、全アミノ酸配列の他。

Ｘ線結晶構造解析による立体構造声明らかにされている
。即ち、分子量は約３２，０００であジアミノ酸敗１５
１個よシなる同等なサブユニットで二量体を形成してい
る。それぞれのサブユニットには、銅及び亜鉛が１つず
つ結合しておシ、活性発現に重要な役割を果している。

ヒ）　Ｃｕ−Ｚｎ−８ＯＤに２いても全アミノ酸配列が
明らかにされており、アミノ酸敗１５３個の均等なサブ
ユニットで二量体を形成している。そのアミノ酸配列は
、ウシＣｕ　−Ｚｎ−ＳＯＤのそれとよく類似しておシ
、分子量や等電点もよく似かよっ゛ている。従って′８
表方法も、ウシＣｕ−Ｚｎ−８ＯＤに用いられている方
法に準じた方法がとられている。

ヒトＣｕ−Ｚｎ−８ＯＤについても、他のＳＯＤと同様
に等電点の異なるチャージアイソマーの存在が知られて
お夛、赤血球からＣｕ　−Ｚｎ−８ＯＤ　ｆ　ｉｌｆ製
してゆく過程でイオン交換クロマトグラフィーにより、
２成分に分離されることが報告されている（例えば、Ｍ
＠ｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　Ｍｏｌ
　１０５　、　ｐ８８　（１９８４））。

コ１７）　多ｔ−１ｅ性についてはヒ）　Ｃｕ−Ｚ’ｎ
−８ＯＤが反応性に富む一８Ｈ基を持ち、この−８Ｈ基
の修飾が原因であることが指摘されてｋ　ｊ）　（Ｅｕ
ｒ、Ｊ、　Ｂｌｏｃｈ＠ｍ　５６３０５（１９７５）’
）　、その修飾は低分子チオール化合物とのポリスルフ
ィド形成であろうと言われている（　Ｂｌｏｃｈｉｍ、
　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｅｔａ　、　５３７　、１００
（１９７８））。実際に明らかにされたヒトＣｕ−Ｚｎ
−８ＯＤの１次構造を他のＣｕ−Ｚｎ−８ＯＤと比較す
ると１１１番目にＣｙｓ残基金持つことが特徴的であシ
。

他の牛、烏、カジキ、ハエ、酵母、ホウレン草から単離
されたＣｕ−Ｚｎ−８ＯＤでは、この位置はすべてＳｅ
ｒになっている（　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　、　１２０
　、５３（１９８０））。このＣｙｓ残基が、以前に指
摘された反応性に富む一８Ｈ基の原因であろうと考える
ことは、Ｃｕ−Ｚｎ−８ＯＤが極めて１次構造上のホモ
ロジーが高く、他のＣｙｓ　ｌｌ！７ｃ基は良く保存さ
れておシ、又、この反応性−８１１基の存在がヒトＣｕ
　−Ｚｎ−８ＯＤに特徴的なことを考えると、極めて妥
当である。又、最近では、非酵素的グリコジル化が多様
性の原因であるとする指摘もあｔ）　（Ｊ、　Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ９１．１３９（１９８６））
、又ヒト以外のＣｕ　−Ｚｎ　−８ＯＤにも分子多様性
が見られることから、ヒト−Ｃｕ・Ｚｎ　−ＳＯＤの多
様性の原因についてはいまだに充分解明されていないの
が現状である。

発明が解決しようとする間１点ＳＯＤの臨床応用を考えた場合、抗亦性の点から用いら
れるＳＯＤはヒト由来のものであることが望ましい。し
かし、以上に述べた分子多様性はヒト−Ｃｕ−Ｚｎ−８
ＯＤの作用の研究や医薬品としての利用に際しては１）
多様な分子種が作用、性質の面で異なる可能性がある、
２）医薬品としての品質管理の面かつ、３）　ＳＯＤと
他ｆ４Ｉ蛋白質の分離が困離になる。

４）　８０Ｄの純度検定が難しい、などの理由で不都合
の原因となる。従りて、均一なヒト−Ｃｕ　−Ｚｎ−８
ＯＤしかもネイティブな構造を持つものが得られること
が最も望ましい。このことは高分解能の精製手段により
多様なＳＯＤ分子種の中からネイティブと思われるもの
を選び分けることにより可能となるが、容易に想像され
るように良い回収率は期待出来ない。

を確立することを目的とし、Ｃｕ−Ｚｎ−８０Ｄの多様
性の原因について詳細な検ｆｆｔを加え、修飾されたＳ
ＯＤをネイティブ型に変換する方法について鋭意研究を
行ない本発明を完成させた。

即ち、本発明はチオール基が酸化された銅・亜鉛−８Ｏ
Ｄ　ｔ−含む水溶液を緩かな還元剤で処理しチオール基
を生成せしめた後、イオン交換クロマトグラフィーによ
り精製することを特徴とする銅・亜鉛−８ＯＤの製造方
法である。

ζこで使用するＣｕ−Ｚｎ−８ＯＤは反応性のＳＲ，ｉ
ｌｉ’を有するものであれば、その起源を問わないが、
例えばヒ）　Ｃｕ−Ｚｎ−８ＯＤではヒト赤血球、胎盤
などその由来を問わない。又、遺伝子組み替え手法によ
り。

微生物や動物細胞によって生産されたものも含む。

Ｃｕ−Ｚｎ−８ＯＤはこれらの材料よシ既知の方法を組
み合わせることにより粗精製される。例えば、赤血球由
来のヒ）　Ｃｕ−Ｚｎ−８００の場合得られた粗精製Ｓ
ＯＤは等電点電気泳動法、高速陰イオン交換クロマドグ
２フイー等の手段により分析すると、ＳＯＤ活性を示す
蛋白質として３種以上の蛋白質を含んでいるがこのうち
主な３成分は、ネイティブなＳＯＤ及び、そのサブユニ
ットの片方がグルタチオンとの混合ジスルフィドを形成
したもの、そのサブユニットの双方がグルタチオンとの
混合ジスルフィドを形成し九ものであることが明らかに
なった。更にこうした混合ジスルフィド体は還元剤で緩
かに処理することによ）、効果的にネイティブなＳＯＤ
へと変換出来ることを見い出した。すなわち粗精製され
たＳＯＤを蛋白濃度１〜２００号似、望ましくは５〜１
００−１−６〜１０、望ましくは７〜８．５の水溶液と
し、過剰の還元剤を加える。ここで、用いられる還元剤
の量、反応温度、反応時間は還元剤の種類に依存する。

　ＳＯＤは分子中にジスルフィド架橋を持つ為このジス
ルフィド架橋に影響を与えず、グルタチオンとの混合ジ
スルフィド結合のみを選択的に開裂させることが重要で
ある０例えば、メルカグトエタールやジチオスレイトー
ル（ＤＴＴ　）等の低分子チオール化合物を用いる場合
には、ＳＯＤに対して２倍〜１００倍、好ましくは５倍
から４０倍モル当量用い、室温で３０分から２４時間程
度、望ましくは１〜５時間反応させる。反応時間が長い
場合は、メルカグトエタノール等を用いた際には、空気
酸化によジメルカプトエタノールと８０Ｄの混合ジスル
フィドが形成されるので反応時間は２時間以下が望まし
い。

具体的には高速イオン交換クロマトグラフィーなどによ
り反応の進行をモニターし、反応が完了した時点で過剰
の試薬をすみやかに除去するのがよい。この点で分子内
の環状ジスルフィド形成へ平衡が片寄ったＤＴＴやジチ
オスレイトール（ＤＴＥ）の使用がよシ望ましい。

反応終了後は、反応液を直接陰イオン交換クロマドグ２
フイーに負荷し溶離することによりて、還元剤等の除去
と、ＳＯＤの精製が同時に達成される。用いられる樹脂
としては通常の蛋白質の分離に用いられるものであれば
いずれでもよいが高分離能を持つものが望ましい。還元
剤処理されたＳＯＤは一旦樹脂に吸着させた後にイオン
強度を増加させるあるいは、ｐｌ（ｔ−低下させること
により浴出、回収される。

このようにして得られたＳＯＤはサブユニット当）銅・
亜鉛を１原子づつ、反応性の一６Ｈ基を１ヶ含みネイテ
ィブ型のＣｕ−Ｚｎ−８ＯＤと考えられる。又、比活性
はマツコードらの方法（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

２４４．６０４９（１９６９））によって測定したとこ
ろ、３５００　Ｕｎｔｔ／ｑ以上の値を示し、ドデシル
硫酸ナトリウム存在下の電気泳動法により分子量１６．
０００の単一バンドを与え、等電点電気泳動法４．９によりても１等を点＃エキの単一バンドを示した。

実施例以下、実施例により本発明の詳細な説明する。

実施例１洗浄ヒト赤血球５１Ｋ同量の蒸留水を加えて溶血させ、
マツコードらの方法（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｂｓ＋ｍ、
　＋２４４．６０４９〜６０５５　、（１９６９））に
より１）エタノール−クロロホルム処理によるヘモグロ
ビンの沈澱除去、２）リン酸ｌ水累カリウムの添加によ
るエタノール層と水層の分離、３）アセトン沈澱による
エタノール層からのＣｕ−Ｚｎ−８ＯＤの回収、を行な
った。得られた沈＃ｆ：２５０Ｌ／の０．０２Ｍ）リス
ヒドロキシメチルアミノメタン−塩酸緩衝液（以下「ト
リス塩酸緩衝液」と略す。）　ｐＨ７，５に溶解させ、
不溶物を遠心分離により除去した後、同じ緩衝液に対し
て透析した。透析内ｆＬを同じ緩＠液で平衡化したＤＥ
ＡＥ−８＠ｐｈａｃｅｌ　ｔ−充填したカラム−３２躇
Ｘ１００ｍに通液し、１５０１Ｒ１の同じ緩衝液で洗浄
した。その後、０．０２Ｍ）！ｊス塩酸緩衝ｇ（ｐＨ７
，５）（緩衝液Ａ）と、０．５Ｍ塩化ナトリワムを含む
０．０２Ｍ）リス塩酸緩衝液（ＦＪ（７，５）（緩衝液
Ｂ）を用いてグラジェント溶出を行なった。８００活性
を示す画分を集め、限外濾過によ）蛋白濃度１０１とな
る様に濃縮し、引き続き緩衝ｅ、Ａに対して透析を行な
った。得られた浴液を「粗ＳＯＤ溶液」と呼ぶ。

粗ＳＯＤｍ液９ｄに１００ｍＭジチオスレイトール水浴
液０．９−を加えて攪拌後、室温下で静置し九。

図１ｍ）にジチオスレイトール添加前の、ｂ）に酢加後
２時間経過後のイオン交換高速液体クロマトグラフィー
による分析クロマトグラムを示した。これから明らかな
ように３本のピーク（ピークＡ。

ａ、Ｃ）がジチオスレイトール処理により１本のピーク
（ピークＡ）に変化している。２時間後、全量を緩衝液
Ａで平衡化したＴＳＫ−Ｇｅｌ　ＤＩＡＥ　５ＲＶ（φ
５１１Ｉａｘ２０ｃｍ）に負荷し、流速３０叫４で緩衝
液ＡとＢを用いて１２０分間でＡ−１００チから７０チ
まで変化させる直線濃度勾配により溶出を行なった。得
られたクロマトグラムを図２に示した。図中に示した画
分を分取したところ、活性の回収はｉツコードらの方法
（Ｊ、　Ｂｉｏｌ　Ｃｈのｍ。

２４４．６０４９〜６０５５（１９６９））による活性
測定の結果、ジチオスレイトール処理及びクロマトグラ
フィー精製を通して約４０チであった。

””　　−０，４９８ト１．テ得られた精製ＳＯＤは、Ｅ２８０ｎｍ算出すると、比活性４．２００　ＵＡを示し、等電点電
気泳動及び還元条件下での８ＤＳポリアクリルアミドｒ
ルを気泳動でいずれも単一バンドを示した（図−３ｍ）
　、　ｂ）　）。又、原子吸光法による銅及び亜鉛の定
量の結果ＳＯＤ　１分子当勺それぞれ約２ｙ−原子づつ
含むことが判った０実施例２実施例ＩＫ記した粗ＳＯＤ溶液０．５ｄにメルカプトエ
タノールを濃度１０−となるように加え、授拌後室温で
静置した。１時間後、全量をＴＳＫ−Ｇ＠ＩＤＥＡＥ　
５　ＰＷ　（φ７．５　ｍ　ｘ　７．５　ｃｒｌＬ）で
実施例１に示した方、法に準じて精製を行なった。主ピ
ーク画分を分取したところ、活性回収率は４５％であり
、得られたＳＯＤは電気泳動的に均一であった。又、イ
オン交換１（ＰＬＯで分析を行なり九ところ１図４に示
したように単一のピークを示した。又、比活性は４）ｏ
ｏＵ／ｑで返った。

実施例３市販のヒト８００　（Ｓｉｇｍａ社製）１０ｖｔｌ−の
トリス−塩酸緩衝液（声７．２）に溶解し、１００ｄの
ＤＴ？水浴液０６２ｄを加え、攪拌後室温下２時間装置
した。その後、実施例２に記したものと同一の方法で、
イオン交換クロマトグラフィーにより精裂した。実施例
１で示したピークムに相当する両分を分取したところ、
活性回収率は７５％であり、ＳＯＤ蛋白質として５．４
）１１Ｆが得られた。得られたＳＯＤは電気泳動的に単
一のノ４ンドを示し、３９５０明この比活性を示した。

発明の効果以上から明らかな如く、本発明の方法に依れば分子多様
性を有するものから均一なＣｕ　−Ｚｎ−８ＯＤを収率
よく裏道することができるので、本発明は医薬産業上極
めて有利である。

【図面の簡単な説明】

図１は実施例１におけるイオン交換高速液体クロマトグ
ラフィーによる分析クロマトグラムを示す。ａ）はジチ
オスレイトール添加前、ｂ）はジチオスレイトール添加
２時間後のものであシ、秩軸は２８０ｎｍにおける吸光
度を、横軸は保持時間を示す。ＴＳＫ−Ｇ＠　Ｉ　ＤＥ
ＡＥ５ＰＷ　（φ）、　５　ｍ　Ｘ　７．５　ｒｘ　）
を用い、緩衝液Ａ、Ｂｔ−用いて直線グラジェント溶出
を行なった。図２は実施例１における分取スケールでのクロマトグラ
ムを示す。図中の縦線にはさまれたピ−り両分を分取し
た。図３　ｍ）は実施例１における等電点電気泳動の結
果を示す。−範囲４．５−６のダルを用い１．３は精製
されたＳＯＤ、２．４は粗８００溶液の泳動パターンを
示した。図３　ｂ）は実施例ＩＫおけるＳＯ８−／リア
クリルアミドグル電気泳動の結果を示す。アクリルアミ
ド濃度８−２５−の濃度勾配グルを用いた。１，５は分
子基標品で上から９４，０００　、６７．０００　、４
３，０００，３０，０００゜２０、Ｚｏｏ　、１４，４
００の分子量のものであシ、２゜６は精製ＳＯＤ、３，
４．７，８は粗ＳＯＤ溶液の泳動パターンを示した。図
４は実施例２におけるイオン交換高速液体クロマトグラ
フィーによる分析クロマトグラムを示す。条件等は図１
と同様である。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）チオール基が酸化された銅、亜鉛スーパーオキシ
ドディスムターゼを含む水溶液を緩かな還元剤で処理し
チオール基を生成せしめた後、イオン交換クロマトグラ
フィーにより精製することを特徴とするチオール基を有
する銅、亜鉛スーパーオキシドディスムターゼの製造方
法。
（２）還元剤が低分子チオール化合物である特許請求の
範囲第１項記載の方法。
（３）還元剤がジチオスレイトール又はジチオエリスロ
トールである特許請求の範囲第１項記載の方法。
（４）特許請求の範囲第１項記載の方法により製造され
たチオール基を有する銅、亜鉛スーパーオキシドディス
ムターゼ。