JPS63185390A

JPS63185390A - 藻類によるエイコサペンタエン酸の製造方法

Info

Publication number: JPS63185390A
Application number: JP62015109A
Authority: JP
Inventors: Yoshiji Shinmen; 新免　芳史; Hideaki Yamada; 秀明山田; Akira Shimizu; 昌清水
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Ltd
Priority date: 1987-01-27
Filing date: 1987-01-27
Publication date: 1988-07-30
Also published as: EP0277747A3; EP0277747A2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、藻類を用いたエイコサペンタエン酸（以後、
ＥＰＡという場合がある）の新規な製造方法に関する。

さらに詳しくは、コラリナ（Ｃｏｒａｌｌｉｎａ）属に
属し、エイコサペンタエン酸生産能を有する藻類を利用
して高純度のＥＰＡを製造する方法に関する。

〔従来技術〕

従来からＥＰＡの製造方法としては、魚油又はある種の
藻類より抽出・精製する方法が用いられている。また、
酵素的製造方法に関しては、ボルフィラ（Ｐｏｒｐｈｙ
ｒａ）属等に属する藻類中のエイコサペンタエン酸合成
酵素を利用する方法が報告されている（特開昭６ｌ−３
１０９２）が、いずれの方法においても夾雑する他の不
飽和脂肪酸が多（、高純度のＥＰＡを得ることは困難で
ある。

また、コラリナ属に属する藻類を用いるＥＰＡの製造方
法は知られていない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明は、従来ＥＰＡを生産する能力を有することが知
られていなかったコラリナ属藻類を使用し、単純な工程
で高純度のＥＰＡを製造することができる方法を提供す
るものである。

〔問題点を解決するための手段〕

上記の目的は、コラリナ（Ｃｏｒａ　１１１ｎａ）属に
属する藻類の藻体からエイコサベンクエン酸を含有する
脂質を得、この脂質からエイコサペンタエン酸を採取す
ることを特徴とするエイコサペンタエン酸の製造方法；
及びコラリナ（Ｃｏｒａｌｌｉｎａ）属に属する藻類の
エイコサベンクエン酸合成酵素系を有する藻体又はその
処理物の存在下で前駆体をエイコサペンタエン酸に転換
せしめ、次にこのエイコサペンタエン酸を採取すること
を特徴とするエイコサペンタエン酸の製造方法により達
成される。

一般に、藻類中に含まれる脂質含量は、乾燥藻体巾約０
．２〜３．０％と少ないが、コラリナ属に属する紅藻類
の藻体中には、その全脂肪酸の４０〜６５％のＥＰＡが
含まれており、その他は、パルミチン酸、パルミトレイ
ン酸、オレイン酸等の飽和脂肪酸又はモノ不飽和脂肪酸
が大部分である。従って、コラリナ属藻類は他にドコサ
ヘキサエン酸等の高度不飽和脂肪酸を大量に含む魚油よ
りも、精製の点でＥＰＡ供給源として優れていると考え
られる。さらに、コラリナ属藻類の藻体中には、強力な
高度不飽和脂肪酸合成酵素系、特にＥＰＡ合成酵素系が
含まれており、この酸素系を利用して、オレイン酸、リ
ノール酸、リルン酸等の前駆体をＥＰＡへ容易に変換す
ることができることから、高純度のＥＰＡを製造する上
で、コラリナ属藻類を用いることは、非常に有効である
と考えられる。

〔具体的な説明〕

本発明においては、使用する藻類としては、コラリナ属
に属しＥＰＡ生産能を有する藻類であればすべて使用す
ることができる。このような藻類として、例えばコラリ
ナ・ビルリフエラ（Ｃｏｒａｌｌｉｎａｐｉｌｕｌｉｆ
ｅｒａ和名；ピリヒバ）やコラリナ・セシリス（Ｃｏｒ
ａｌｌｉｎａ　　５ｅｓｓｉｌｉｓ＋　和名；ミャヒバ
モドキ）等を挙げることができる。これらの藻類は、各
地内外海の低潮線に孟秋をなして群生しており、容易に
入手できる。また、藻類を培養するための常法に従って
前記の藻類を人工的に培養して藻体を得ることもできる
。藻体より直接ＥＰＡを採取する場合には、例えば次の
ようにして行なう。

藻体はそのままの状態でも、細胞を破砕した状態でも抽
出を行なうことができるが、好ましくは、水又はメタノ
ール、クロロホルム等の有機溶媒中でホモジナイザー等
により、破砕してから抽出を行なう。藻体又は藻体のホ
モジネートは好ましくは乾燥する。乾燥は凍結乾燥、風
乾等によって行うことができる。乾燥物は、好ましくは
窒素気流下で有機溶媒によって抽出処理する。有機溶媒
としてはエーテル、ヘキサン、メタノール、エタノール
、クロロホルム、ジクロロメタン、石油エーテル等を用
いることができ、またメタノールと石油エーテルの交互
抽出や、クロロホルム−メタノール−水の一層系の溶媒
を用いた抽出によっても良好な結果を得ることができる
。抽出物から減圧下で有機溶媒を留去することにより、
高濃度のＥＰＡを含有した脂質が得られる。

また、上記の方法に代えて湿藻体又は湿藻体ホモジネー
トを用いて抽出を行うことができる。この場合にはメタ
ノール、エタノール等の水に対しく５）て相溶性の溶媒、又はこれらと水及び／又は他の溶媒と
から成る水に対して相溶性の混合溶媒を使用する。その
他の手順は上記と同様である。

上記のようにして得られた脂質中には、ＥＰＡが脂質化
合物、例えば脂肪の構成成分として含まれている。これ
らを、直接分離することもできるが、低級アルコールと
のエステル、例えばエイコサベンクエン酸メチルとして
分離するのが好ましい。このようなエステルにすること
により、他の脂質成分から容易に分離することができ、
また、藻体中に生成する他の脂肪酸、例えばパルミチン
酸、オレイン酸、リノール酸等（これらも、ＥＰＡのエ
ステル化に際してエステル化される）から容易に分離す
ることができる。例えば、ＥＰＡのメチルエステルを得
るには、前記の抽出脂質を無水メタノール−塩酸５％〜
１０％、ＢＦ３−メタノール１０％〜５０％等により、
室温にて１〜２４時間処理するのが好ましい。

前記の処理液からエイコサベンクエン酸メチルエステル
を回収するにはヘキサン、エーテル、酢酸エチル等の有
機溶剤で抽出するのが好ましい。

次に、この抽出液を無水硫酸ナトリウム等により乾燥し
、有機溶媒を好ましくは減圧下で留去することにより主
として脂肪酸エステルから成る混合物が得られる。この
混合物中には、目的とするエイコサペンタエン酸メチル
エステルの他に、パルミチン酸メチルエステル、ステア
リン酸メチルエステル、オレイン酸メチルエステル等が
含まれている。これらの脂肪酸メチルエステル混合物か
らエイコサペンタエン酸メチルエステルを単離するには
、カラムクロマトグラフィー、低温結晶化法、尿素包接
体法等を、単独で、又は組み合わせて使用することがで
きる。

こうして単離されたエイコサペンタエン酸メチルからＥ
ＰＡを得るには、アルカリで加水分解した後、エーテル
、酢酸エチル等の有機溶媒で抽出すればよい。

また、ＥＰＡをそのメチルエステルを経ないで採取する
には、前記の抽出脂質をアルカリ分解（例えば５％水酸
化ナトリウムにより室温にて２〜３時間）した後、この
分解液から、脂肪酸の抽出・精製に常用されている方法
により抽出・精製することができる。

また、藻体中のＥＰＡ合成酵素系を利用して、ＥＰＡ前
駆体からの変換によりＥＰＡを製造する場合、藻体から
のＢＰＡ合成酵素系を含有する藻体処理物の調製は、例
えば次のようにして行なう。

藻体に０．０５Ｍリンリン酸緩衝液ｌ（７，０）を加え
、水冷下で乳鉢中による磨砕あるいはホモジナイザーに
よる組織破砕によりホモジネートを調製する。

このホモジネートをそのまま酵素溶液として用いること
ができる。また、藻体をハサミ等で細片に切ったものを
、そのまま反応溶液中に添加して使用することもできる
。さらに通常の固定化酵素法によって固定化して使用す
ることもできる。さらには、藻体をそのまま使用するこ
ともできる。

基質としては、酢酸、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、
カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイ
ン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸
、オレイン酸、リノール酸、リルン酸、オクタデカテト
ラエン酸、アラキシン酸、エイコセン酸、エイコサジエ
ン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸等、
炭素数２〜２０の脂肪酸を、そのままの形で、あるいは
ナトリウム、カリウム、もしくはアンモニウム等の塩の
形で、又はメチルエステル、エチルエステル等のエステ
ルの形で使用することができる。また、これらの脂肪酸
を含有する油脂類の形で使用することもできる。これら
の基質は、乾燥藻体ｌ■当り０．００１■〜１ｇの範囲
で添加するのが好ましい。

反応液中には、ツイーン、トリトン等の界面活性剤、胆
汁末等のエマルジョン促進剤を必要に応じて、ｏ、ｏｏ
ｉ％〜１％の濃度で添加することができる。

反応液のｐｎは３〜１０、好ましくは５〜８であり、反
応温度は、２〜４５℃、好ましくは５〜３０℃である。

反応時間は３０分〜５日間、好ましくは１０〜４８時間
である。

反応は水、海水又は緩衝液、例えば、リン酸緩衝液、ト
リス−塩酸緩衝液、中で行なうのが好ましく、静置状態
で、あるいは必要に応じて振盪機等で攪拌しながら反応
を行うことができる。

以上のようにして得られた反応物より、ＥＰＡの採取を
行なうためには、前記の藻体より直接採取する方法に従
えば良い。

次に、実施例により、この発明をさらに具体的に説明す
るが、本発明におけるＥＰＡの製造法は、決してこれら
の例に限られるものではない。

尖拒貫土福井県若狭湾沿岸で採集されたピリヒバ〔コラリナ・ビ
ルリフエラ（Ｃｏｒａｌｌｉｎａ　　且ハ旦ハｒａ）　
）５０ｇ（湿重）を十分水洗した後、凍結乾燥した。

これにより、１２．５　ｇの乾燥藻体を得た。この藻体
より、クロロホルム−メタノール−水の一層系の溶媒を
用いる。

Ｂｌｉｇｈ　＆　Ｄｙｅｒの抽出法によって総脂質を抽
出したところ、９５■の脂質が得られた。この脂質を無
水メタノール−塩酸（９５：５）を用いて、２０℃にて
３時間処理することによってメチルエステル化し、エー
テルで抽出して６２■の脂肪酸メチルを得た。この脂肪
酸メチルの組成はガスクロマトグラフィーによる分析で
、パルミチン酸メチル６％、パルミトレイン酸メチル３
２％、ステアリン酸メチル２％、オレイン酸メチル４％
、リノール酸メチル１％、アラキドン酸メチル１１％、
エイコサペンタエン酸メチル４０％、その他４％である
ことが認められた。この混合脂肪酸メチルをカラムクロ
マトグラフィーによって分離し、エイコサペンタエン酸
メチル画分を分取し、ロータリーエバポレーターによっ
て溶媒を留去した結果、１９■の精製されたエイコサペ
ンタエン酸メチルを得た。本標品と市販のエイコサペン
タエン酸メチル標準サンプルについて、ガスクロマトグ
ラフィー分析、高速液体クロマトグラフィー分析、質量
分析、及びＮＭＲ分析によって比較を行なったところ、
両者はいずれの分析においても一致した。

精製前及び精製後のエイコサペンタエン酸メチル量は乾
燥藻体当りそれぞれ２■／ｇ、１．５■／ｇであった。

これを常法に従って加水分解することによりエイコサペ
ンタエン酸を得ることができる。

尖施尉童実施例１で示した同じビリヒバ２０ｇ　（湿重）を−８
０℃で６ケ月間保存したものを室温で解凍し、これに５
０ｍ７！の０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）を添
加し、水冷下にホモジナイザーで１５〜２０分間にわた
り細胞破砕を行ない、得られたホモジネートを酵素溶液
として使用し、下記の反応液組成によって反応を行なっ
た。

酵素溶液　　　　　　　　　　　０．５ｍｌ１基質　　
　　　　２■ ０．６％Ｔｗｅｅｎ２０水溶液　　　　　０．４ｍｊ！
基質としては、ステアリン酸ナトリウム、オレイン酸ナ
トリウム、リノール酸ナトリウム及びりルン酸ナトリウ
ムを使用した。別に、基質を含まないブランク（１）と
、酵素溶液の代わりに、０．０５Ｍリン酸緩衝液Ｑ、　
５　ｍ　ｌを加えたブランク（２）をそれぞれ反応に供
した。反応は、試験管（１６，５φＸ　１６０ｍｍ）中
で、２８℃、３時間、２４Ｏｒｐｍで振盪して行なった
。３時間後、−２０℃下に移して反応を停止させ、即ち
に反応液の凍結乾燥を行ない、無水メタノール−塩酸（
９５：　５）を用いて２０℃にて５時間処理することに
よって、反応物中の脂肪酸をメチルエステル化し、エー
テルで抽出し、得られた脂肪酸メチルの組成をガスクロ
マトグラフィーで測定した。下記に示す計算式により、
各基質の減少量とＥＰＡ及び他の脂肪酸の生成量を求め
、表１に示した。

以下余白第ユ」−一表ステアリン酸　　　　１７０　　　　　１．６　　　０
．１　　　０．２　　　０．１　　　　痕跡オレイン　
酸　　　　１３６　　　　４５　　　　　４．５　　　
−　　０．９　　　　痕跡ジノ−１１酸　　１１１　　
６４　　５．８　０．１　　−　痕跡リルン　酸　　　
　　８１　　　　３４　　　　　０．５　　　０．１　
　　０．２　　　　−ム減少量一反応液中の各脂肪酸量−ブランク１−ブランク２実施
炎↓ 岩手系で採取したミャヒバモドキ〔コラリナ・セシリス
（Ｃｏｒａｌｌｉｎａ　　５ｅｓｓｉｌｉｓ）　）をハ
サミで細片に切り、下記の反応液組成によって反応を行
反応液組成０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）　　　０．５　
ｍ　（１藻類細片　　　　　　　　　　０．２ｇ（湿重
）基質　　　　　２■ ０．６％ツイーン２０水溶液　　　０．４ｍβ海水　　
　　　０．１ｍｊ！以下、実施例２と同様な操作を行ない、結果を表２に示
した。

第一１−表

Claims

【特許請求の範囲】１、コラリナ（Ｃｏｒａｌｌｉｎａ）属に属する藻類の
藻体からエイコサペンタエン酸を含有する脂質を得、こ
の脂質からエイコサペンタエン酸を採取することを特徴
とするエイコサペンタエン酸の製造方法。２、コラリナ（Ｃｏｒａｌｌｉｎａ）属に属する藻類の
エイコサペンタエン酸合成酵素系を有する藻体又はその
処理物の存在下で前駆体をエイコサペンタエン酸に転換
せしめ、次にこのエイコサペンタエン酸を採取すること
を特徴とするエイコサペンタエン酸の製造方法。