JPS63179896A - Tumorous ergress factor and production thereof - Google Patents
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、ルースな（ｌｏｏｓｅ ）コロニー形態を有
するヒト転移性黒色腫由来のクローン（Ｍ３８２７）か
ら及びヒト単球性セルライン（Ｕ９３７）から単離され
た新規な細胞分散因子（ｃｅｌｌｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ
ｆａｃｔｏｒ） （以下［エグレシン（ｅｇｒｅｓ
ｓｉｎ） Ｊという）に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Field of Industrial Application The present invention is directed to the use of a clone isolated from a human metastatic melanoma (M3827) with loose colony morphology and from a human monocytic cell line (U937). A novel cell scattering factor
factor) (hereinafter referred to as [egres
sin) J).
エグレシンは、転移性病変（ｍｅｔａｓｔａｔｉｃＩｅ
ｓｉｏｎｓ）の検出及び治療用の免疫学的試薬の製造に
有用であり、薬剤を血液脳関門を通過して移動させるこ
との補助に有用であり、更に炎症性応答の制御の補助に
有用である。Eglesin is used in metastatic disease (metastatic disease).
ions), are useful in the production of immunological reagents for the detection and treatment of inflammatory diseases, are useful in assisting in the movement of drugs across the blood-brain barrier, and are useful in assisting in the control of inflammatory responses. .
発明の背景
細胞分散因子は、従来、ヒト胎芽肺線維芽細胞（ｅｍｂ
ｒｙｏ ｌｕｎｇ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ）の調整
培地から単離されていた。該因子のアッセイは、ヒトの
乳汁サンプルから得られたヒト***上皮細胞を用いて又
は犬の腎臓上皮細胞株（ＭＤＣＫ）を用いて行なわれる
。このアッセイは、単層で島状に増殖した上皮細胞間の
デスモソームの解離を測定するものである。該因子は、
約５５，０００ダルトンの分子量を有し、熱及び酸に不
安定な蛋白質である（ストーカ−、エム０、（Ｓｔｏｋ
ｅｒ 、 Ｍ、 ） Ｊ。BACKGROUND OF THE INVENTION Cell dispersion factors have traditionally been used in human embryonic lung fibroblasts (emb
ryo lung fibroblasts). Assays for the factors are performed using human mammary epithelial cells obtained from human milk samples or using a canine kidney epithelial cell line (MDCK). This assay measures the dissociation of desmosomes between epithelial cells grown in islands in a monolayer. The factor is
It is a heat- and acid-labile protein with a molecular weight of approximately 55,000 Daltons (Stoker, M0, (Stok)).
er, M, ) J.
Ｃｅ１ｌ 、 Ｐｈｙｓｌｏｌ、 、 １２１ ：１
７４−１８３（１９８４）、ストーカ−、エムら、Ｊ、
Ｃｅ１ｌＳｃｉ、ヱヱ： ２０９−２３３ （１９
８５）及びストーカ−、エムら、ネイチ’ｒ （Ｎａ
ｔｕｒｅ ）、３２７ ： ２３９−２４２ （１９８
７）参照コ。Ce1l, Physlol, 121:1
74-183 (1984), Stoker, M. et al., J.
Ce1lSci, E: 209-233 (19
85) and Stoker, M. et al., Na.
ture), 327: 239-242 (198
7) Reference.
また、細胞分散因子は、ヒト黒色腫セルライン（Ａ２０
５８）から単離されたこともある。この因子のアッセイ
は、該因子の存在を示すインディケータ−細胞としてヒ
ト黒色腫セルライン（Ａ２０５８）を用いることにより
行なわれる。このアセライは、該ヒト黒色腫セルライン
（Ａ２０５８）の走化性を測定するものである［（リオ
ッタ、エル、ニー、 （Ｌｉｏｔｔａ 、 Ｌ、Ａ
、 ）ら、プロシーデインダス オブ ザ ナショナル
アカデミーオブ サイエンス オブ ザ ニーニスニ
ー（Ｐｒｏｃ 、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 、
ＵＳＡ） ８３ ：３３０２−３３０６ （１９８６
）参照］。この細胞分散因子は、前記ストーカ−、エム
（Ｓ ｔｏｋｅｒＭ、 ） 、Ｊ、 Ｃｅ１１．Ｐｈ
ｙｓｉｏｌ、 １２１ ： １７４−１８３ （１９
８４） 、ストーカ−エムら、Ｊ。In addition, the cell dispersion factor is a human melanoma cell line (A20
It has also been isolated from 58). Assays for this factor are performed using a human melanoma cell line (A2058) as an indicator cell for the presence of the factor. This assay measures the chemotaxis of the human melanoma cell line (A2058) [Liotta, L, A.
, ) et al., Proc., Natl., Acad., Sci., Proc.
USA) 83:3302-3306 (1986
)reference]. This cell dispersion factor is described by Stoker M, J. Ce11. Ph
ysiol, 121: 174-183 (19
84), Stoker-M et al., J.
Ｃｅ１１．Ｓｃｉ、、７７ ： ２０９−２３３ （１
９８５）及びストーカ−エムら、ネイチャー（Ｎ ａｔ
ｕｒｅ）、３２７ ： ２３９−２４２ （１９８７）
に記載されたものと同一であると考えられている。Ce11. Sci., 77: 209-233 (1
985) and Stoker M et al., Nature (N at
ure), 327: 239-242 (1987)
It is believed to be the same as that described in .
形質転換された細胞はルースに集合した細胞の凝集体と
して増殖し、表皮増殖因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏ
ｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、以下ｒＥＧＦＪという）と腫瘍
増殖因子（ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ
ｓ以下ｒＴＧＦＪという）−βとの組合わせにより誘発
された正常ラットの腎臓（ｎｏｒｍａｌ ｒａｔ ｋｉ
ｄｎｅｙ 、 ＮＲＫ）のコロニーは密着結合した細胞
凝集体から成るとの観察結果からすると、ルースなコロ
ニー形態を与え得る、形質転換された細胞により遊離さ
れる他の変位因子（ｅｃｔｏｐｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ
）が存在し１このような因子が形質転換された細胞の転
移ポテンシャルを決定する役割を果たしているのではな
いか、と考えられた。Transformed cells proliferate as aggregates of loose cells and contain epidermal growth factor (epidermal growth factor).
wth factor (hereinafter referred to as rEGFJ) and tumor growth factor (rEGFJ)
normal rat kidney (hereinafter referred to as rTGFJ) induced in combination with -β
Given the observation that colonies of T. dney, NRK) are composed of tightly coupled cell aggregates, other ectopic factors released by transformed cells can give a loose colony morphology.
), and it was thought that such factors might play a role in determining the metastatic potential of transformed cells.
上記考え方、即ち腫瘍細胞により遊離された変位因子が
、それらの発現された表現型に寄与するとの考え方に基
き、ルースな形態学的特徴を有するコロニーは当該発現
された形態学的特徴に寄与する因子を産生じているので
はないかとの予測の下に、一つのヒト転移性腫瘍細胞系
統のクローンが、ルースなコロニー形態により、選択さ
れた。Based on the above idea, i.e. that displaced factors released by tumor cells contribute to their expressed phenotype, colonies with loose morphological characteristics contribute to the expressed morphological characteristics. A clone of one human metastatic tumor cell line was selected due to its loose colony morphology with the expectation that it might be producing the factor.
その結果、一つのクローン、即ちＭ３８２７クローン３
（ＡＴＣＣＮｏ、ＣＲＬ ９１９３）が、一つの正
常ラットの腎臓上皮細胞クローン（ＮＨＫ−４９Ｆ）（
ＡＴＣＣＮｏ、 ＣＲＬ １５７０）中で、ルース
なコロニー形態を誘発させることのできる因子を遊離し
ていることが見出された。この因子は、腫瘍ニゲレス因
子（ｔｕｍｏｒｅｇｒｅｓｓ ｆａｃｔｏｒ ）乃至エ
グレシンと命名され、１．０Ｍ酢酸中で２５，０００ダ
ルトンの見かけ分子量を有するＥＧＦ様活性を有する因
子（ＴＧＦ−α）と共に共溶比（ｃｏｅｌｕｔｅ ）す
ることが見出された［デラーコ、ジエイ、イー、 （
ＤｅＬａｒｃｏ、 Ｊ、 Ｅ、 ）ら、Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ 。As a result, one clone, namely M3827 clone 3
(ATCC No. CRL 9193), one normal rat kidney epithelial cell clone (NHK-49F) (
ATCC No., CRL 1570) was found to release factors capable of inducing loose colony morphology. This factor is named tumor regress factor or eglesin and coelutes with a factor having EGF-like activity (TGF-α) having an apparent molecular weight of 25,000 daltons in 1.0 M acetic acid. It was found that
DeLarco, J. E.) et al., Proc.
Natl, Acad.
Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８２ ： ５０１５−５０１９ （１
９８５）及びデラーコ、ジエイ、イー、ら、Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、 ５ ：
１０１−１０６ （１９８７）参照コ。Sci, USA, 82: 5015-5019 (1
985) and Delaco, J. E., et al., Molec.
ular Cell Biology, 5:
101-106 (1987).
例えば単球及び顆粒球の様な炎症性細胞も、細胞コンパ
ーメント間を移動し、細胞接合を崩壊し、増大した運動
性を示すものと考えられている。従って、マクロファー
ジ分化経路中へ活性化されたヒト単球セルライン（Ｕ９
３７）（ＡＴＣＣＮｏ。Inflammatory cells, such as monocytes and granulocytes, are also believed to migrate between cell compartments, disrupt cell junctions, and exhibit increased motility. Therefore, the activated human monocyte cell line (U9) into the macrophage differentiation pathway
37) (ATCC No.
ＣＲＬ １５９３）からの上清を、本発明においてエ
グレシン様活性について試験した。その結果、本発明に
おいて、このセルラインもエグレシンを産生ずることが
見出された。CRL 1593) was tested for eglesin-like activity in the present invention. As a result, in the present invention, it was discovered that this cell line also produces eglesin.
発明の開示
本発明は、Ｍ３８２７クローン３ （ＡＴＣＣＮｏ、
ＣＲＬ ９１９３ ）に関するエグレシンを精製し
てＥＧＦ様活性を有する因子及び他の不純物を含まない
ものとし、これにより、転移性病変の検出及び処置のた
めの免疫学的試薬の製造、薬剤の血液脳関門の通過移動
の補助及び炎症性の制御の補助に有用な形態のエグレシ
ンを提供する方法を得るべく開発されたものである。DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention relates to M3827 clone 3 (ATCC No.
Eglesin related to CRL 9193) has been purified to be free of factors with EGF-like activity and other impurities, thereby making it useful for the production of immunological reagents for the detection and treatment of metastatic lesions, for the blood-brain barrier of drugs. A method was developed to provide a form of eglesin useful for assisting in the transit of eglesin and for assisting in the control of inflammatory conditions.
また、本発明は、上記Ｕ９３７ （ＡＴＣＣＮｏ。Further, the present invention provides the above-mentioned U937 (ATCC No.
１５９３）ヒト単球セルラインからのエグレシンを精製
することにより、転移性病変の検出及び処置のための免
疫学的試薬の製造、薬剤の血液脳関門の通過移動の補助
及び炎症性応答の制御の補助に有用な形態のエグレシン
を提供する方法を得るべく開発されたものでもある。1593) Purification of eglesin from human monocyte cell lines can be used to produce immunological reagents for the detection and treatment of metastatic lesions, to aid in the movement of drugs across the blood-brain barrier, and to control inflammatory responses. It has also been developed to provide a method of providing a form of eglesin that is useful in supplementation.
従って、本発明の目的は、転移性病変の検出及び治療の
ための免疫学的試薬の製造に有用な新規細胞分散因子を
提供することにある。Accordingly, it is an object of the present invention to provide novel cell dispersion factors useful in the production of immunological reagents for the detection and treatment of metastatic lesions.
本発明の他の目的は、薬剤の血液脳関門の通過移動を補
助するのに有用な新規細胞分散因子を提供することにあ
る。Another object of the invention is to provide novel cell dispersion factors useful in aiding the movement of drugs across the blood-brain barrier.
本発明の更に他の目的は、炎症性応答の制御の補助に有
用な新規細胞分散因子を提供することにある。Yet another object of the present invention is to provide novel cell-dispersing factors useful in assisting in controlling inflammatory responses.
本発明の一実施態様においては、上記本発明の目的は、
下記性質を有する実質的に純粋なエグレシンにより達成
される。In one embodiment of the present invention, the above object of the present invention is to
This is achieved with substantially pure eglesin having the following properties.
（１） Ｓ Ｄ Ｓ −Ｐ Ａ Ｇ Ｅにより測定した
場合、約１０．０００ダルトンの見かけ分子量を有する
こと、
■塩基性蛋白であること、
０５６℃で３０分間加熱した場合安定であること、（４
） ｐ Ｈ約３．０〜約１０．０において安定であるこ
と、
■正常ラットの腎臓上皮細胞においてルースなコロニー
形態を誘発させる活性を有すること、０正常ラットの腎
臓上皮細胞及び線維芽細胞をその単層コロニーから遊走
させる活性を有すること、及び
（７）間接マイトジェンであること。(1) It must have an apparent molecular weight of about 10,000 daltons when measured by SDS-PAGE, ■ It must be a basic protein, and it must be stable when heated at 056°C for 30 minutes. 4
) It is stable at a pH of about 3.0 to about 10.0; It has the activity of inducing loose colony morphology in normal rat kidney epithelial cells, and it has the ability to induce normal rat kidney epithelial cells and fibroblasts. It has the activity of causing migration from the monolayer colony, and (7) it is an indirect mitogen.
本発明の他の一実施態様においては、前記本発明の目的
は、下記工程、即ち、
（１）ヒト転移性メラノーマＭ３８２７クローン３（Ａ
ＴＣＣＮｏ、ＣＲＬ ９１９３）を無血清培地中で培
養する工程、
■得られる無血清調整培地を採取する工程を包含し、
更に任意の順序で行うことのできる下記の工程、即ち、
＠１．０Ｍ酢酸の存在下に分子量による分離を行なって
エグレシン活性を有する約２５，０００の分子量分画を
単離する工程、
（４）カチオン交換分離を行なってエグレシン活性を有
する塩基性分画を単離する工程、
■ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを行なって
エグレシン活性を有する強く結合した塩基性分画を単離
する工程、及び
０疎水性分離を行なってエグレシン活性を有する疎水性
分画を単離する工程
を包含し、これにより少なくとも約１０，０００倍に精
製されたエグレシンを得る製造法により製造されたエグ
レシンにより達成される。In another embodiment of the present invention, the object of the present invention is to perform the following steps: (1) Human metastatic melanoma M3827 clone 3 (A
(TCC No., CRL 9193) in a serum-free medium; (2) collecting the resulting serum-free conditioned medium; (4) performing cation exchange separation to isolate a basic fraction having eglesin activity by performing molecular weight separation in the presence of a molecular weight fraction of about 25,000 having eglesin activity; , (2) performing hydroxyapatite chromatography to isolate a strongly bound basic fraction having eglesin activity; and performing zero-hydrophobic separation to isolate a hydrophobic fraction having eglesin activity. , which is achieved by eglesin produced by a manufacturing method that yields eglesin that is at least about 10,000 times more purified.
また、他の実施態様においては、前記本発明の目的は、
下記の工程、即ち、
（１）ヒト単球細胞ラインＵ９３７ （ＡＴＣＣＮｏ。In another embodiment, the object of the present invention is to
The following steps: (1) Human monocyte cell line U937 (ATCC No.
ＣＲＬ １５９３）を無血清培地中で分化誘発剤の存
在下に培養する工程、
■得られる無血清調整培地を採取する工程を包含、 し
、
更に、任意の順序で行なうことのできる下記工程、即ち
、
■カチオン交換分離を行なってエグレシン活性を有する
塩基性分画を単離する工程、
（４）１．０Ｍの酢酸の存在下に分子量分離を行なって
エグレシン活性を有する約２５０００の分子量分画を単
離する工程、
０力チオン交換分離を行なってエグレシン活性を有する
塩基性分画を単離する工程、及び０疎水性分離を行なっ
てエグレシン活性を有する疎水性分画を単離する工程
を包含し、それにより少なくとも約８０，０００倍に精
製されたエグレシンを得る製造法により得られたエグレ
シンにより達成される。CRL 1593) in a serum-free medium in the presence of a differentiation-inducing agent; (1) collecting the resulting serum-free conditioned medium; (4) Performing molecular weight separation in the presence of 1.0 M acetic acid to isolate a molecular weight fraction of approximately 25,000 having eglesin activity by performing cation exchange separation. a step of isolating, a step of performing zero-power thion exchange separation to isolate a basic fraction having eglesin activity, and a step of performing zero-hydrophobic separation to isolate a hydrophobic fraction having eglesin activity. and is achieved by eglesin obtained by a manufacturing method that yields eglesin that is at least about 80,000 times more purified.
以下、本発明の詳細な説明する。上述したように、本発
明の一実施態様においては、本発明の前記目的は、下記
性質を有する実質的に純粋なエグレシンにより達成され
る。The present invention will be explained in detail below. As mentioned above, in one embodiment of the invention, the above objects of the invention are achieved by a substantially pure eglesin having the following properties:
（１） Ｓ Ｄ Ｓ −Ｐ Ａ Ｇ Ｅにより測定した
場合、約１０．０００ダルトンの見かけ分子量を有する
こと、
■塩基性蛋白であること、
０５６℃で３０分間加熱しても安定であること、に）約
３．０〜約１０．０において安定であること、■正常ラ
ットの腎臓上皮細胞においてルースなコロニー形態を誘
発させる活性を有すること、０正常ラットの腎臓上皮細
胞及び線維芽細胞をその単層コロニーから遊走させる活
性を有すること、及び
（７）間接マイトジェンであること。(1) It has an apparent molecular weight of approximately 10,000 daltons when measured by SDS-PAGE, ■ It is a basic protein, and it is stable even when heated at 056°C for 30 minutes. 3.0 to about 10.0), 1) have activity to induce loose colony morphology in normal rat kidney epithelial cells, and 0 normal rat kidney epithelial cells and fibroblasts. It has the activity of causing migration from a monolayer colony, and (7) it is an indirect mitogen.
−２０一
本発明の他の一実施態様においては、前記本発明の目的
は、下記工程、即ち、
（１）ヒト転移性メラノーマＭ３８２７クローン３（Ａ
ＴＣＣＮｏ、 ＣＲＬ ９１３９）を無血清培地中
で培養する工程、
■得られる無血清調整培地を採取する工程を包含し、
更に任意の順序で行うことのできる下記の工程、即ち、
＠１．０Ｍの酢酸の存在下に分子量による分離を行なっ
てエグレシン活性を有する約２５． ０００の分子量分
画を単離する工程、
（４）カチオン交換分離を行なってエグレシン活性を有
する塩基性分画を単離する工程、
■ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを行なって
エグレシン活性を有する強く結合した塩基性分画を単離
する工程、及び
０疎水性分離を行なってエグレシン活性を有する疎水性
分画を単離する工程
を包含し、これにより少なくとも約１０，０００倍に精
製されたエグレシンを得る製造法により製造されたエグ
レシンにより達成される。-20 In another embodiment of the present invention, the object of the present invention is the following steps: (1) Human metastatic melanoma M3827 clone 3 (A
(TCC No., CRL 9139) in a serum-free medium; (2) collecting the obtained serum-free conditioned medium; Separation based on molecular weight in the presence of acetic acid revealed approximately 25% of eglecin activity. (4) performing cation exchange separation to isolate a basic fraction having eglesin activity; (2) performing hydroxyapatite chromatography to isolate a strongly bound base having eglesin activity; and performing zero-hydrophobic separation to isolate the hydrophobic fraction having eglesin activity, thereby obtaining eglesin purified at least about 10,000-fold. This is achieved by eglesin produced by the method.
また、他の実施態様においては、前記本発明の目的は、
下記の工程、即ち、
（１）ヒト単球細胞ラインＵ９３７ （ＡＴＣＣＮｏ。In another embodiment, the object of the present invention is to
The following steps: (1) Human monocyte cell line U937 (ATCC No.
ＣＲＬ １５９３）を無血清培地中で分化誘発剤の存
在下に培養する工程、
■得られる無血清調整培地を採取する工程を包含し、
更に、任意の順序で行なうことのできる下記工程、即ち
、
■カチオン交換分離を行なってエグレシン活性を有する
塩基性分画を単離する工程、
（４）１．０Ｍの酢酸の存在下に分子量分離を行なって
エグレシン活性を有する約２５，０００の分子量分画を
単離する工程、
■カチオン交換分離を行なってエグレシン活性を有する
塩基性分画を単離する工程、及び０疎水性分離を行なっ
てエグレシン活性を有する疎水性分画を単離する工程
を包含し、それにより少くとも約８０．０００倍に精製
されたエグレシンを得る製造法により得られたエグレシ
ンにより達成される。CRL 1593) in a serum-free medium in the presence of a differentiation-inducing agent; (2) collecting the resulting serum-free conditioned medium; (4) performing molecular weight separation in the presence of 1.0 M acetic acid to isolate a basic fraction having eglecin activity by performing cation exchange separation to obtain a molecular weight fraction of about 25,000 having eglecin activity; (2) A step of performing cation exchange separation to isolate a basic fraction having eglesin activity; and a step of performing zero hydrophobic separation to isolate a hydrophobic fraction having eglesin activity. and is achieved by eglesin obtained by a manufacturing method whereby eglesin is purified at least about 80,000 times.
発育（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ）中、神経堤からの細
胞は、生体中でこの部位（コンパートメント）から、他
の位置（コンパートメント）へと移動（ｍｉｇｒａｔｅ
）しなければならない。神経堤由来の細胞は、胃腸管
及び（皮膚において）メラニン細胞を生じる。During development, cells from the neural crest migrate from this site (compartment) to other locations (compartments) in the body.
)Must. Cells derived from the neural crest give rise to melanocytes in the gastrointestinal tract and (in the skin).
成人（ａｄｕｌｔ ）において、分化した機能性細胞の
ある分布（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）は、しばしば、異な
る組織乃至コンパートメントにおいて見出される一定量
の前駆細胞に由来する。例えば、表皮（最終コンパート
メント）のランゲルハンス
（Ｌ ａｎｇｅｒｈａｎｓ ）細胞は、骨髄（起源のコ
ンバートメント）中の間葉細胞のプール乃至前駆体に由
来する。エグレシンは、発育中、一つのコンパートメン
トから他のコンパートメントへの細胞の移動を容易にす
ると考えられる。In adults, a population of differentiated functional cells is often derived from a certain amount of progenitor cells found in different tissues or compartments. For example, Langerhans cells of the epidermis (final compartment) are derived from a pool or precursor of mesenchymal cells in the bone marrow (conversion of origin). Eglesins are thought to facilitate the movement of cells from one compartment to another during development.
しかも、エグレシンが変位ペプチドとして腫瘍細胞によ
り生産されるという事実から、腫瘍細胞が原発性腫瘍か
ら遠方の部位へと移動し、二次的転移部を確立するもの
と考えられる。Moreover, the fact that eglesin is produced by tumor cells as a displaced peptide suggests that tumor cells migrate to sites distant from the primary tumor and establish secondary metastases.
加えて、エグレシンはマクロファージ及び顆粒球の通常
の炎症性応答、遊走及び運動性において一定の役割を果
すものと考えられる。In addition, eglesins are thought to play a role in the normal inflammatory response, migration and motility of macrophages and granulocytes.
エグレシンは、ルースなコロニー形態を有するヒト転移
性メラノーマＭ３８２７クローン３ （ＡＴＣＣＮｏ、
ＣＲＬ ９１９３）の無血清調整培地から精製するこ
とができる。Eglesin is a human metastatic melanoma M3827 clone 3 with loose colony morphology (ATCC No.
CRL 9193) from serum-free conditioned medium.
ヒト単球性白血病セルラインＵ９３７ （ＡＴＣＣＮａ
ＣＲＬ １５９３）は、分化誘発剤で前処理する
と、ルースなコロニー形態を有する。処理細胞の無血清
調整培地もエグレシンの供給源であることが見出された
。Human monocytic leukemia cell line U937 (ATCCNa
CRL 1593) has a loose colony morphology when pretreated with differentiation-inducing agents. The serum-free conditioned medium of treated cells was also found to be a source of eglesin.
上記分化誘発剤としては、例えば、１２−０−テトラデ
カノイル−ホルボール １３−アセテート（以下ｒＴＰ
ＡＪという）及びフィトヘムアグルチニンを例示するこ
とができる。ＴＰＡは、１０〜２５０ｎｇ／ｍＱ程度、
好ましくは１１００ｎ／ＩＩＩＱ程度の量で使用するこ
とができる。フィトヘムアグルチニンは、１０〜２００
μｇ／或程度、好ましくは１００μｇ／ｍＱ程度の量で
使用することができる。As the differentiation-inducing agent, for example, 12-0-tetradecanoyl-phorbol 13-acetate (rTP
AJ) and phytohemagglutinin. TPA is about 10 to 250 ng/mQ,
Preferably, it can be used in an amount of about 1100n/IIIQ. Phytohemagglutinin is 10-200
It can be used in an amount of μg/mQ, preferably about 100 μg/mQ.
上記分化誘発剤によるＵ９３７セルラインの誘導（ｉｎ
ｄｕｃｔｉｏｎ ）から最初の２４時間の間には、エグ
レシン活性は分泌されず、４８時間において分泌は最大
となる。Ｕ９３７セルラインからのエグレシン活性の分
泌は、イノノマイシン（ｉｎｏｎｏｍｙｃｉｎ） 、リ
ポポリゴサッカライド（Ｉｉｐｏｐｏｌｌｇｏｓａｃｃ
ｈａｒｉｄｅ ）又はＩＬ−１では誘導できない。これ
ら化合物は、マクロファージ機能の部分的活性化を惹起
するものである。これから、Ｕ９３７セルラインによる
エグレシン産生は、特異的分化経路の一部であって、一
般的活性化事項ではないと考えられる。Induction of U937 cell line by the above differentiation-inducing agent (in
Eglesin activity is not secreted during the first 24 hours after duction, and secretion is maximal at 48 hours. Secretion of eglesin activity from the U937 cell line was induced by inonomycin, lipopolygosaccharide (Iipopollgosac).
haride) or IL-1. These compounds cause partial activation of macrophage function. This suggests that eglesin production by the U937 cell line is part of a specific differentiation pathway and not a general activation issue.
Ｍ３８２７クローン３からのエグレシンの精製は、一連
の特有の分離工程により行なわれる。１つの分離工程は
分子量に基づくものであり、他の分離工程はカチオン交
換に基づくものであり、更に他の分離工程はヒドロキシ
アパタイトクロマトグラフィーの未知のメカニズムに基
づくものであり、更に他の分離工程は疎水性に基づくも
のである。上記各分離工程は、任意の順序で行なうこと
ができるが、最大の分解能を得るためには、リストされ
た順で行なうのが好ましい。Purification of eglesin from M3827 clone 3 is carried out by a series of unique separation steps. One separation step is based on molecular weight, another is based on cation exchange, yet another is based on the unknown mechanism of hydroxyapatite chromatography, and yet another separation step is based on the unknown mechanism of hydroxyapatite chromatography. is based on hydrophobicity. Although each of the above separation steps can be performed in any order, it is preferred to perform them in the order listed to obtain maximum resolution.
Ｕ９３７からのエグレシンの精製も、一連の特有の分離
工程により行なわれる。２つの分離工程はカチオン交換
に基づくものであり、他の分離工程は疎水性に基づくも
のである。加えて、Ｕ９３７からのエグレシンの精製に
おいて、ヒドロキシアパタイト分離工程を採用するのが
好ましい。上記分離工程は、任意の順序で行なうことが
できる。Purification of eglesin from U937 is also carried out by a series of unique separation steps. Two separation steps are based on cation exchange and the other separation step is based on hydrophobicity. In addition, it is preferred to employ a hydroxyapatite separation step in the purification of eglecin from U937. The above separation steps can be performed in any order.
分子量による分離は、例えば、ゲル濾過クロマトグラフ
ィー、ショ糖密度勾配沈降、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動等を使用して行われる。ゲル濾過は、パイオーゲ
ル Ｐ−３０，バイオ−ゲル Ｐ−６０、セファデック
ス Ｇ−２５、セファデックス Ｇ−５０、セファデッ
クス Ｇ−７５、ＴＳＫ−ＨＰＬＣ等の周知のサイズ排
除カラム（ｓｉｚｉｎｇ ｃｏ’ｌｕｍｎ ）を使用し
て行うことができる。本発明においては、ゲル濾過クロ
マトグラフィーが好ましく、特にバイオ−ゲル Ｐ−６
０を使用するゲル濾過が好ましい。これは、穏やかであ
って、蛋白質を変性させないこと、エグレシンの分子量
範囲において極めて特異的で良好な分離能を示すこと、
比較的大量の蛋白質を精製するためのスケールアップが
可能であること等の理由による。Separation by molecular weight is performed using, for example, gel filtration chromatography, sucrose density gradient sedimentation, polyacrylamide gel electrophoresis, and the like. Gel filtration can be carried out using well-known size exclusion columns such as Pyogel P-30, Bio-Gel P-60, Sephadex G-25, Sephadex G-50, Sephadex G-75, and TSK-HPLC. This can be done using . In the present invention, gel filtration chromatography is preferred, especially bio-gel P-6
Gel filtration using 0 is preferred. It is gentle and does not denature the protein, is highly specific and exhibits good separation power in the molecular weight range of eglesins,
This is because it is possible to scale up to purify a relatively large amount of protein.
カチオン−交換分離は、例えば、ファルマシアモノーＳ
カチオン−交換樹脂、ワットマンＣＭ−５２セルロー
ス、ワットマン スルフオニチル セルロース、ゼータ
−８Ｐ 調製カートリッジ（Ｚｅｔａ ＳＰ ｐｒ
ｅｐａｒａｔ ｉ。Cation-exchange separations can be carried out, for example, by Pharmacia Mono S
Cation-Exchange Resin, Whatman CM-52 Cellulose, Whatman Sulfonithyl Cellulose, Zeta-8P Preparation Cartridge (Zeta SP pr
eparat i.
ｎ ｃａｒｔｒｉｄｇｅ）等を使用して行うことがで
きる。本発明においては、能力が大であることから、フ
ァルマシア モノ−８カチオン−交換樹脂又はゼータ−
８Ｐ 調製カートリッジを使用するカチオン−交換クロ
マトグラフィーがより好ましく、採用される。n cartridge), etc. In the present invention, Pharmacia mono-8 cation-exchange resin or zeta-exchange resin is used because of its large capacity.
Cation-exchange chromatography using a 8P preparation cartridge is more preferred and employed.
ヒドロキシアパタイト クロマトグラフ−は、例えば、
バイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）又はその他のヒドロキ
シアパタイト樹脂またはバイオ−ラド“高性能ヒドロキ
シアパタイト” （以下ＨＰＨＴという）を使用して行
われる。本発明においでは、急速な分離が可能となるの
で、バイオ−ラド ＨＰＨＴを使用することが好ましい
。Hydroxyapatite chromatography, for example,
This is done using Bio-Rad or other hydroxyapatite resins or Bio-Rad "High Performance Hydroxyapatite" (hereinafter referred to as HPHT). In the present invention, it is preferred to use Bio-Rad HPHT as it allows rapid separation.
疎水性相互作用クロマトグラフィーによる分離は、例え
ば、Ｃ２、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ４８等の多数の逆相樹
脂を使用して行われる。エグレシンがＭ３８２７ ク
ローン３から精製される本発明の実施態様においては、
Ｃ，Ｂ ＨＰＬＣクロマトグラフィーを採用することが
好ましい。これは、Ｍ３８２７ クローン３から放出
される他の活性物質、すなわち、ＴＧＦ−α及びＴＧＦ
−βからのエグレシンの分離に際して、優れた分離能を
発揮するからである。更に、この方法によれば、時間単
位ではなく、分単位での急速な分離が句能となる。更に
又、Ｕ９３７ セルラインからエグレシンを精製する本
発明実施態様においては、その大きな能力のゆえに、Ｃ
４ＨＰＬＣクロマトグラフィーによることが好ましい。Separations by hydrophobic interaction chromatography are performed using a number of reversed phase resins, such as C2, C4, C6, C8, C48, etc. In an embodiment of the invention in which eglesin is purified from M3827 clone 3,
Preferably, C,B HPLC chromatography is employed. This is due to the presence of other active substances released from M3827 clone 3, namely TGF-α and TGF-α.
This is because it exhibits excellent separation ability when separating eglesin from -β. Moreover, according to this method, rapid separation in minutes rather than hours becomes a performance. Furthermore, in the embodiment of the present invention for purifying eglesin from the U937 cell line, due to its great capacity, C.
Preference is given to using 4HPLC chromatography.
エグレシン活性は、正常ラットの腎臓線維芽細胞クロー
ン（ＮＨＫ−４９Ｆ）（ＡＴＴＣＮｏ、ＣＲＬ １５
７０）からの細胞の足場非依存性成長（ａｎｃｈｏｒａ
ｇｅ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｇｒｏｗｔｈ：以下“
ＡＩＧ”という）アッセイにおいてルーズなコロニー形
態を生じさせる能力により、測定可能である。エグレシ
ン活性は、形態的な変化、すなわち、ＮＨＫ−４９Ｆの
単層コロニーからの細胞の移行、又は組織培養皿上で単
層として培養された通常のラット腎臓上皮様細胞クロー
ン（ＮＨＫ−５２Ｅ）（ＡＴＣＣＮｏ。Eglesin activity was determined using a normal rat kidney fibroblast clone (NHK-49F) (ATTC No. CRL 15).
Anchorage-independent growth of cells from (70)
ge independent growth: “
Eglesin activity can be measured by its ability to generate loose colony morphology in the AIG assay. A normal rat kidney epithelial-like cell clone (NHK-52E) cultured as a monolayer in (ATCC No.
ＣＲＬ １５７１）における密着結合からの分散を生
じさせる能力によっても、測定され得る。It can also be measured by the ability to cause dispersion from tight junctions in CRL 1571).
ＡＩＧアッセイのために、子牛血清１０％（ｖ／ｖ ）
並びにＴＧＦ−ａ及びＴＧＦ−βを夫々１、 ０ｎｇ／
ＩＩＩＱを含有するダルベツコ（Ｄ ｕｌｂｅｃｃｏ
）の改良イーグル培地（以下“ＤＭＥＭ”という）に０
．３６％寒天（ｗ／ｖ ） １． ２５ｍ１を加えたも
のを収容した３５ｍｍの皿に、ＮＲＫ−４９Ｆ 細胞
（ＡＴＣＣＮｏ、ＣＲＬ １５７０）を約２．５Ｘ１
０３個の割合で接種する。For AIG assay, calf serum 10% (v/v)
and 1 and 0 ng/TGF-a and TGF-β, respectively.
Dulbecco containing IIIQ
) in modified Eagle medium (hereinafter referred to as “DMEM”).
．． 36% agar (w/v) 1. Approximately 2.5×1 NRK-49F cells (ATCC No. CRL 1570) were added to a 35 mm dish containing 25 ml of
Inoculate at a rate of 0.03.
エグレシンは、この様な条件下に形成される軟寒天コロ
ニー中でルーズなコロニー形態を発現させる。すなわち
、ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−βの組み合わせにより生じた
ＮＨＫ−４９Ｆ 細胞の密着結合コロニーは、エグレ
シンの添加により、ルーズに結合した（ＪｏｏｓｅＪｙ
ａｓｓｏｃｌａｔｅｄ）細胞へと変化する（デラーコ
、 Ｊ、 Ｅ、等、プロシーディンゲス オブ ナシ
ョナル アカデミ−オブ サイエンス オブ ザ ユナ
イテッド ステイツオブ アメリカ、８２．５０１５〜
５０１９（１９８５））。Eglesin develops a loose colony morphology in soft agar colonies formed under such conditions. That is, the tight junction colonies of NHK-49F cells generated by the combination of TGF-α and TGF-β were loosely bound by the addition of eglesin (JooseJy
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 82.5015~
5019 (1985)).
単層コロニーのアッセイのためには、子牛血清１０％（
ｖ／ｖ ）を含むＤＭＥＭを収容する３５關の培養皿に
、ＮＲＫ−５２Ｅ細胞（Ａ Ｔ ＣＣＮｏ。For monolayer colony assays, add 10% calf serum (
NRK-52E cells (AT CC No.
ＣＲＬ １５７１）またはＮＨＫ−４９Ｆ細胞（ＡＴ
ＣＣＮｏ、 ＣＲＬ １５７０）を約１×１０２個
の割合で接種する。５日後には培地中に小さな密着結合
（ｔｉｇｈｔｌｙ ａｓｓｏｃｉｔｅｄ ）コロニーが
形成される。エグレシンは、細胞−細胞間の相互作用を
乱して、これ等のコロニーからの細胞の移動を起こさせ
、細胞の形態を変化させる。すなわち、ＮＨＫ−４９Ｆ
細胞は、エグレシンの存在下に、伸びて長くなる。この
伸長は、エグレシンにより誘起されるアクチン フィラ
メントの再組織化によるものと考えられている。更に、
ＮＨＫ−５２Ｅ細胞は、エグレシンの存在下に、平滑さ
に欠ける凹凸（ｒｕｆｆｌｅｄ ｒｉｄｇｅｓ）及び長
い偽足形成を呈する。CRL 1571) or NHK-49F cells (AT
CC No., CRL 1570) is inoculated at a rate of approximately 1 x 102 cells. After 5 days, small tightly associated colonies are formed in the medium. Eglesins disrupt cell-cell interactions, causing migration of cells from these colonies and changing cell morphology. That is, NHK-49F
Cells elongate and become longer in the presence of eglesin. This elongation is thought to be due to eglesin-induced reorganization of actin filaments. Furthermore,
NHK-52E cells exhibit ruffled ridges and long pseudopodia formation in the presence of eglesin.
単層コロニー アッセイは、ＡＩＧ アッセイよりも感
度が高く且つより速やかに実施できる、すなわち、ＡＩ
Ｇ アッセイの場合の３〜４日に対して６〜２４時間の
オーダーで実施できるので、より有利である。Monolayer colony assays are more sensitive and faster to perform than AIG assays, i.e., AI
It is more advantageous because it can be carried out on the order of 6-24 hours as opposed to 3-4 days for the G assay.
本発明においては、全ての細胞は、湿潤培養器において
５％ＣＯ２／９５％空気中、３７℃で培養される。In the present invention, all cells are cultured at 37°C in 5% CO2/95% air in a humidified incubator.
本発明のエグレシンに関して、以下の事実が見出された
； （１）熱安定性に優れている、すなわち、５６℃で
３０分間の熱処理後にも、エグレシン活性を維持する（
但し、１００℃で１０分間の熱処理により、活性は失わ
れる）：、（２）酸安定性に優れている、すなわち、１
．０Ｍ酢酸（ｐＨ３，０）中４℃で数ケ月処理した後に
も、エグレシン活性を維持する（ただし、約３以下のｐ
Ｈでは、影響される）： （３）約１０までのｐＨに
おいて、エグレシン活性を維持する： （４）エグレシ
ンは、５０％（ｖ／ｖ ）アセトニトリル：０．１％（
Ｖ／Ｖ））リフルオロ酢酸（以下“ＴＦＡ”という）に
より、不活性化される。The following facts were discovered regarding the eglesin of the present invention: (1) It has excellent thermal stability, that is, it maintains eglesin activity even after heat treatment at 56°C for 30 minutes (
However, the activity is lost by heat treatment at 100°C for 10 minutes): (2) Excellent acid stability, i.e., 1
．． Eglesin activity is maintained even after several months of treatment at 4°C in 0M acetic acid (pH 3.0) (with the exception of p
(3) maintains eglesin activity at pH up to about 10: (4) eglesin is purified in 50% (v/v) acetonitrile: 0.1% (
V/V)) is inactivated by lifluoroacetic acid (hereinafter referred to as "TFA").
エグレシン活性は、プロテアーゼ阻害剤であるペプスタ
チン及びニトロフェニル グアニジン（ｇｕａｉｄｉｎ
ｅ）安息香酸−ＨＯ２により、阻害されない。事実、エ
グレシン活性は、プロテアーゼ阻害剤である大豆トリプ
シン阻害剤（シグマ ケミカル カンパニー）及びフェ
ニル−メチルスルフォニル フルオライドにより、増強
される。更に、エグレシン活性は、ウロキナーゼ又はス
トレプトキナーゼにより影響されない。これ等の全ての
結果は、エグレシン活性が、他のタイプのプロテアーゼ
による可能性を排除することは出来ないものの、セリン
プロテアーゼ活性によるものでも、プラスミノーゲンア
クチベーター活性によるものでもないことを示唆してい
る。Eglesin activity is influenced by the protease inhibitors pepstatin and nitrophenyl guanidine (guaidin).
e) Not inhibited by benzoic acid-HO2. In fact, eglesin activity is enhanced by the protease inhibitors soybean trypsin inhibitor (Sigma Chemical Company) and phenyl-methylsulfonyl fluoride. Furthermore, eglesin activity is not affected by urokinase or streptokinase. All these results suggest that eglesin activity is not due to serine protease activity or plasminogen activator activity, although we cannot exclude the possibility that it is due to other types of proteases. ing.
エグレシン活性は、ジチオスレイトール及びトリプシン
によっても、破壊される。これらの結果は、エグレシン
が、ジスルフィド結合により安定化された蛋白質である
ことを示唆している。Eglesin activity is also destroyed by dithiothreitol and trypsin. These results suggest that eglesin is a protein stabilized by disulfide bonds.
ストーカ−等（Ｓｔｏｋｅｒ、Ｍ、ｅｔ ａｌ。Stoker, M. et al.
ジャーナル オブ セルラー フルオライド。Journal of Cellular Fluoride.
（Ｊ、Ｃｅ１１．Ｐｈｙｓｉｏｌ、、）１２１：１７４
−１８３ （１９８４） ； Ｓ ｔ ｏｋｅ ｒ
、Ｍ。(J, Ce11. Physiol, ) 121:174
-183 (1984); Stoker
,M.
ｅｔ ａｔ、ジャーナル オブ セルラー サイエン
ス、７ （Ｊ、Ｃｅｌ １．Ｓｃｉ、）７７：２０９−
２３３ （１９８５）； Ｓｔ ｏｋｅ ｒ、Ｍ。et at, Journal of Cellular Science, 7 (J, Cel 1. Sci,) 77:209-
233 (1985); Stoker, M.
ｅｔ ａｌ、ネイチャー、３２７：２３９−２４２
（１９８７））により記述されている細胞分散因子は、
本発明のＡＩＧ アッセイ及び単層コロニーアッセイ
のいずれにおいても、活性を示さなかった。一方、エグ
レシンは、上記各文献においてストーカ−等により記述
された各種のアッセイにおいて活性を示さなかった。et al. Nature 327:239-242
(1987)), the cell dispersion factor described by
It showed no activity in either the AIG assay of the present invention or the monolayer colony assay. On the other hand, eglesin did not show any activity in the various assays described by Stoker et al. in the above-mentioned publications.
エグレシンと上記の各文献にストーカ−等により記述さ
れている細胞分散因子との相違点の若干を下記第１表に
示す。Table 1 below shows some of the differences between eglesin and the cell dispersion factors described by Stoker et al. in the above-mentioned publications.
一 ３６ −
エグレシンは、転移性病巣の検知及び治療用の免疫学的
試薬の製造に有用である。ここに、“免疫学的試薬”と
は、抗体を意味する。抗体は、エグレシンを抗原として
使用する常法により製造されるポリクローナル及びモノ
クローナル抗体を含む（“ハンドブック オブ エクス
ペリメンタルイムノロジー”、ワイアー デー、エム。-36-eglesin is useful in the production of immunological reagents for the detection and treatment of metastatic lesions. Here, "immunological reagent" means an antibody. Antibodies include polyclonal and monoclonal antibodies produced by conventional methods using eglesin as an antigen ("Handbook of Experimental Immunology", Wire Day, M.).
（Ｗｅ ｉ ｒ Ｄ、 Ｍ、 ）編、第３巻、ブラッ
クウェル サイエンティフィック パブリケイションズ
、（１９７８）、英国 オフスフオード を参照）。(Weir D, M., ed., Volume 3, Blackwell Scientific Publications, (1978), Offford, UK).
抗体は、以下の目的に使用される＝ （１）血清サンプ
ル中のエグレシンの存在を測定する、例えば、通常のコ
ンペティティブ酵素−結合イムノアッセイ又はラジオイ
ムノアッセイによる転移可能性のある病巣の検知（診断
）、又は（２）例えば、治療上有効量の抗体を静脈注射
により投与することによる既に存在する転移性病巣の治
療：この場合には、抗体は、血清中に存在するエグレシ
ンと結合し、その他の転移部位の形成を防止したり、現
存する腫瘍の退行を生じさせる。Antibodies are used for the following purposes: (1) Detection of potentially metastatic lesions (diagnosis) by measuring the presence of eglesin in serum samples, e.g. by conventional competitive enzyme-linked immunoassays or radioimmunoassays; or (2) treatment of pre-existing metastatic lesions, e.g. by administering therapeutically effective amounts of antibodies by intravenous injection; in this case, the antibodies bind to eglesins present in the serum and inhibit other metastatic lesions. prevent tumor formation or cause regression of existing tumors.
エグレシンは、単層 コロニーアッセイに際して、内皮
細胞を分散させるので、血管の内壁を覆う内皮細胞の細
胞−細胞結合部（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）にも作用する。こ
れ等結合部の解離は、血管の透過性を増大させ、血液−
脳関門の効果を低下させる。Since eglesin disperses endothelial cells during monolayer colony assays, it also acts on the cell-cell junctions of endothelial cells lining the inner walls of blood vessels. Dissociation of these connections increases blood vessel permeability and blood flow
Reduces the effectiveness of the brain barrier.
かくして、エグレシンのこの特性は、中枢神経系に影響
を及ぼすある種の状態の治療の為に、血液−脳関門を通
過して薬品を移行させる際に役立つものと考えられる。This property of eglesin is thus believed to be useful in translocating drugs across the blood-brain barrier for the treatment of certain conditions affecting the central nervous system.
この様な状態の例として、中枢神経系の感染或いは腫瘍
等が挙げられる。すなわち、エグレシンは、抗体及び免
疫系の細胞に加えて、中枢神経系への抗生物質の如き医
薬の進入量を増大させ、上記の状態の解消に役立つもの
と考えられる。この様な実施態様においては、内皮細胞
の細胞−細胞結合部の解離に有効な一定量のエグレシン
が、単独で（中枢神経系への抗体または免疫系細胞の導
入量増大の場合）又は所定の薬品の治療有効量とともに
（中枢神経系への薬品導入量増大の場合）静脈注射され
る。Examples of such conditions include central nervous system infections or tumors. That is, eglesin is thought to increase the amount of drugs such as antibiotics entering the central nervous system, in addition to antibodies and cells of the immune system, thereby helping to resolve the above-mentioned conditions. In such embodiments, an amount of eglesin effective to dissociate cell-cell junctions of endothelial cells may be present alone (in the case of increased introduction of antibodies or immune system cells into the central nervous system) or with a predetermined amount of eglesin. Injected intravenously with a therapeutically effective dose of the drug (in case of increased introduction of drug into the central nervous system).
エグレシンは、炎症性応答、すなわち、血管から病巣へ
の白血球の遊走をコントロールすることを助けるものと
しても、使用される。急性炎症応答においては、血液中
を循環する顆粒球及び単球が活性化されるか、又は分化
が誘発される。これ等の活性化された細胞は、内皮に付
着し、内皮細胞結合部の間及び血管外組織を通って、損
傷又は感染部位へと移動する。活性化された炎症細胞は
、エグレシンを生成及び分泌し、内皮細胞結合部及び組
織構造を破壊する。かくして、損傷部位にエグレシンを
治療的に付与することにより、血管から損傷部位への炎
症細胞の移動を促進するためにエグレシンを使用するこ
とができる。或いは、エグレシンに対する抗体を静脈投
与して、炎症細胞の移動をブロックし且つ炎症の悪影響
を減少させることもできる。Eglesins are also used to help control the inflammatory response, ie, the migration of leukocytes from blood vessels to lesions. In an acute inflammatory response, granulocytes and monocytes circulating in the blood are activated or induced to differentiate. These activated cells attach to the endothelium and migrate between endothelial cell junctions and through extravascular tissues to the site of injury or infection. Activated inflammatory cells produce and secrete eglesins and destroy endothelial cell junctions and tissue structures. Thus, by therapeutically applying eglesin to the site of injury, eglesin can be used to promote migration of inflammatory cells from blood vessels to the site of injury. Alternatively, antibodies against eglesin can be administered intravenously to block migration of inflammatory cells and reduce the negative effects of inflammation.
本発明により精製されたエグレシンは、１００００単位
／ｍ１以上、より好ましくは、１０００００単位／ｍ１
以上の比活性を有している。Eglesin purified according to the present invention has a concentration of 10,000 units/ml or more, more preferably 100,000 units/ml.
It has a specific activity of
“１単位”とは、半一最大応答（ｈａｌｆ−ｍａｘｉｍ
ａｌ ５ｅｓｐｏｎｓｅ）を与えるに必要なエグレシ
ンの量である。“One unit” means half-maximum response (half-maximum response).
This is the amount of eglesin required to give al 5 response).
実施例
以下に実施例を示し、本発明の特徴とするところをより
一層明らかにする。これ等の実施例は、本発明の代表的
なものを示すに過ぎず、本発明は、これ等の実施例によ
り同等限定されるものではない。EXAMPLES Examples will be shown below to further clarify the features of the present invention. These Examples merely show typical ones of the present invention, and the present invention is not limited to the same extent by these Examples.
実施例Ｉ
Ｍ３８２７ クローン３からのエグレシンの精製
（Ａ）Ｍ３８２７ クローン３の成育及び血清フリー
のコンディションドメディアの調製ヒトの転移性メラノ
ーマ Ｍ３８２７ クローン３によりコンディション
された血清フリーのメディアからエグレシンを精製した
。より詳細には、グルコース４．５ｇ／ｕと子牛血清１
０％（ｖ／ｖ）とを含むＤＭＥＭの存在下にローラーボ
トル中でメラノーマ細胞を高密度（２Ｘ １０８乃至１
×１０９）まで成育させた。血清フリーメディアを２回
代えて、血清成分を取り除き、次いで細胞を新たな血清
フリーメディアにより３７℃で４８時間培養した。得ら
れる血清フリーのコンディションド メディア（以下“
ＳＦ−ＣＭ”という）を低速遠心分離（５００Ｘｇ、１
０’Ｃで５分間）に供して細胞を除去し、次いで高速遠
心分離（３５０００Ｘｇ、１０℃で６０分間）により容
易に沈降する細胞以下の寸法の粒子を除去した。Example I Purification of Eglesin from M3827 Clone 3 (A) Growth of M3827 Clone 3 and Preparation of Serum-Free Conditioned Media Eglesin was purified from conditioned serum-free media with human metastatic melanoma M3827 Clone 3. More specifically, glucose 4.5 g/u and calf serum 1
Melanoma cells were grown to high density (2X 108-1
×109). The serum free media was changed twice to remove serum components, and then the cells were cultured in fresh serum free media at 37°C for 48 hours. The resulting serum-free conditioned media (hereinafter “
"SF-CM") was centrifuged at low speed (500Xg, 1
Cells were removed by subjecting the cells to 0'C for 5 minutes, followed by high speed centrifugation (35,000Xg, 60 minutes at 10C) to remove easily sedimented subcellular particles.
得られるＳＦ−ＣＭを１．０Ｍ５ｐＨ３の酢酸５容量を
それぞれ使用して、４回にわたり４℃で透折を行ない、
凍結乾燥した。凍結乾燥された材料を１．０Ｍ５ｐＨ３
の酢酸１／１００容量中に懸濁させ、３５０００Ｘｇ、
１０℃で９０分間遠心分離し、清澄させた。The resulting SF-CM was subjected to dialysis at 4°C four times using 5 volumes of 1.0 M 5 pH 3 acetic acid each time.
Lyophilized. Freeze-dried material to 1.0M 5pH3
suspended in 1/100 volume of acetic acid, 35000×g,
It was clarified by centrifugation at 10° C. for 90 minutes.
（Ｂ）分子量による分離
ゲル濾過クロマトグラフィーを使用して分子量による分
離を行った。ゲル濾過クロマトグラフィーは、１．０Ｍ
、ｐＨ３の酢酸により充填及び平衡化されたパイオーゲ
ル Ｐ−６０カラム（２，６ｃｍＸ９５ｃｍ）を使用し
て、上記で得られた上澄液について行った。バイオ−ゲ
ル Ｐ−６０は、高分離能ゲル濾適用の多孔性ポリアク
リルアミド ビーズである。該ゲルは、アクリルアミド
とＮ、Ｎ’ −メチレン−ビス−アクリルアミドとの
共重合により製造される。カラムは、使用に先立って、
分子量スタンダードによりキャリプレートしておいた。(B) Separation by Molecular Weight Separation by molecular weight was performed using gel filtration chromatography. Gel filtration chromatography: 1.0M
The supernatant obtained above was analyzed using a Pyogel P-60 column (2.6 cm x 95 cm) packed and equilibrated with acetic acid at pH 3. Bio-Gel P-60 is a porous polyacrylamide bead for high resolution gel filtration applications. The gel is produced by copolymerization of acrylamide and N,N'-methylene-bis-acrylamide. Prior to use, the column
It was calibrated with molecular weight standards.
より詳細には、上述の上澄液１０ｍ１をカラムにロード
し、１．０Ｍ、ｐＨ３，Ｏの酢酸中２５℃で１５ｍ１／
ｈｒの流速で展開してクロマトグラムを得た。７．５ｍ
ｌのフラクションを収得した。溶離液をＡ２□８での吸
光度によりモニターした。奇数のフラクションからのア
リコート７５μρを、キャリアーとしての牛血清アルブ
ミン（以下“ＢＳＡ”という）の存在下に凍結乾燥した
。次いで、０．５％（ｖ／ｖ ）子牛血清を含むＤＭＥ
Ｍ５００μρ中にこれらのアリコートを懸濁させ、前述
の如く成長因子を添加することなくＡＩＧアッセイを使
用して、エグレシン活性を測定した。More specifically, 10 ml of the above supernatant was loaded onto the column, and 15 ml/1.
A chromatogram was obtained by developing at a flow rate of hr. 7.5m
A fraction of 1 was obtained. The eluate was monitored by absorbance at A2□8. 75 μρ aliquots from the odd fractions were lyophilized in the presence of bovine serum albumin (hereinafter “BSA”) as a carrier. Then DME containing 0.5% (v/v) calf serum
These aliquots were suspended in M500 μρ and eglesin activity was measured using the AIG assay without the addition of growth factors as described above.
結果は、第１図に示す通りである。第１図において、“
−”は、応答なし、すなわち全ての細胞が単一細胞とし
てととどまっていることを示し、一方“＋＋＋＋”とあ
るのは、最大応答、すなわち緩やかに結合した細胞のコ
ロニーが形成されていることを示す。The results are shown in FIG. In Figure 1, “
-” indicates no response, i.e. all cells remain as single cells, while “++++” indicates maximal response, i.e. colonies of loosely connected cells are formed. shows.
第１図に示す結果が明らかにするように、エグレシン活
性成分は、フラクション２３〜２７中に溶離しており、
見掛は分子量は、約２５，０００ダルトンである。この
時点で、エグレシン活性は、当初のＳＦ−ＣＭで認めら
れるそれの約２４倍に精製されている。As the results shown in Figure 1 reveal, the eglesin active component was eluted in fractions 23-27;
The apparent molecular weight is approximately 25,000 Daltons. At this point, eglesin activity has been purified approximately 24 times that found in the original SF-CM.
（Ｃ）カチオン−交換による分離
約２５，０００ダルトンの見かけ分子量を有し且つエグ
レシン活性を備えた上記のフラクション２３〜２７を次
いでプールし、０．１５ＭのＮａｃｌを含有するｐＨ５
，０，０２５Ｍの酢酸ナトリウム バフア−に対し一夜
透析を行った。次に、ｐＨ５，０，０２５Ｍの酢酸ナト
リウム バファーにより平衡化されているファルマシア
モノ−８カラムに、プールされたフラクションをロー
ドした。ファルマシア モノ−８は、ビーズ化された疎
水性樹脂をベースとする強力なカチオン交換体である。(C) Separation by cation-exchange The above fractions 23-27 with an apparent molecular weight of about 25,000 Daltons and with eglesin activity were then pooled and purified at pH 5.0 with 0.15 M NaCl.
, 0,025M sodium acetate buffer overnight. The pooled fractions were then loaded onto a Pharmacia Mono-8 column equilibrated with pH 5,0,025M sodium acetate buffer. Pharmacia Mono-8 is a powerful cation exchanger based on beaded hydrophobic resins.
ビーズの粒子径は、約１０μである。樹脂上の荷電基は
、−ＣＨ−８ｏ３”″である。蛋白質の大半量は、これ
らの条件下には、カラムを流れ抜ける。結合した蛋白質
は、２２ｍＭＺ分の傾斜を有するリニアグラジェントの
０〜１、ＯＭＮａＣ＆により１． ０ｍｌ／分で溶離さ
れた。２．０ｍｌのフラクションが収得された。流出は
、Ａ２□８の吸光度でモニターされた。各フラクション
からのアリコート２０μρが、Ｂ５Ａ１００μｇの存在
下に凍結乾燥され、子牛血清０．５％（Ｖ／Ｖ）を含む
ＤＭＥＭ５００μＲ中に懸濁され、前述の通り成長因子
を添加することなくＡＩＧアッセイにより、エグレシン
活性が測定された。結果は、第２図に示す通りである。The particle size of the beads is approximately 10μ. The charged group on the resin is -CH-8o3"". Most of the protein flows through the column under these conditions. Bound protein was measured from 0 to 1 on a linear gradient with a slope of 22 mMZ, 1. Eluted at 0 ml/min. A 2.0 ml fraction was collected. Efflux was monitored by absorbance of A2□8. A 20 μρ aliquot from each fraction was lyophilized in the presence of 100 μg of B5A and suspended in 500 μR of DMEM containing 0.5% (V/V) calf serum and assayed for AIG without addition of growth factors as described above. Eglesin activity was measured. The results are shown in FIG.
第２図において、“−”は、応答なし、すなわち全ての
細胞が単一細胞としてととどまっていることを示し、一
方“＋＋＋＋”とあるのは、最大応答、すなわち緩やか
に結合した細胞のコロニーが形成されていることを示す
。In Figure 2, "-" indicates no response, i.e. all cells remain as single cells, while "++++" indicates maximal response, i.e. colonies of loosely connected cells. is formed.
第２図に示す結果が明らかにするように、エグレシン活
性成分は、フラクション２０〜２２中にすなわち０．６
〜０．７ＭＮａＣ１に溶離している。この時点で、エグ
レシン活性は、当初のＳＦ−ＣＭで認められるそれの約
４８０倍に精製されている。As the results shown in FIG.
Elutes at ~0.7M NaCl. At this point, eglesin activity has been purified approximately 480 times that found in the original SF-CM.
（Ｄ）ヒドロキシアパタイトによる分離エグレシン活性
を備えた上記のフラクション２０〜２２をプールし、１
０ｍＭリン酸ナトリウムバファー（ｐＨ６，８）で平衡
化したバイオ−ラド ＨＰＨＴ カラムにロードした
。バイオ−ラド ＨＰＨＴは、ビーズ化された樹脂で、
その機構及び分離については、未知である。蛋白質の大
部分は、１００ｍＭリン酸ナトリウムバファー（ｐＨ６
，８）で洗浄することにより、カラムから溶離された。(D) Separation by hydroxyapatite The above fractions 20 to 22 with eglesin activity were pooled and 1
Loaded onto a Bio-Rad HPHT column equilibrated with 0mM sodium phosphate buffer (pH 6,8). Bio-Rad HPHT is a beaded resin.
The mechanism and separation are unknown. Most of the protein was stored in 100mM sodium phosphate buffer (pH 6).
, 8).
強く結合した蛋白質は、リニアグラジェントの１００〜
３００ｍＭリン酸ナトリウムバファー（ｐＨ６，８）に
より６０分間かけて１．５ｍｌ／分の流速で溶離された
。２．０ｍｌのフラクションが収得された。流出は、Ａ
２．５の吸光度でモニターされた。各フラクションから
のアリコート１００μｇが、Ｂ５Ａ１００μｇの存在下
に凍結乾燥され、子牛血清０．５％（ｖ／ｖ ）を含む
ＤＭＥＭ５００μΩ中に懸濁され、前述の通り単層アッ
セイにより、エグレシン活性が測定された。結果は、第
３図に示す通りである。第３図において、“−”は、応
答なし、すなわち全ての細胞が接合部が不変で密着結合
コロニーを維持していることを示し、一方“＋＋＋＋”
とあるのは、最大応答、すなわち単一細胞のみが存在す
る、或いは換言すれば細胞が互いに接触していないこと
を示す。Strongly bound proteins have a linear gradient of 100 to
It was eluted with 300 mM sodium phosphate buffer (pH 6,8) over 60 minutes at a flow rate of 1.5 ml/min. A 2.0 ml fraction was collected. The leak is A
Absorbance was monitored at 2.5. A 100 μg aliquot from each fraction was lyophilized in the presence of 100 μg B5A and suspended in 500 μΩ DMEM containing 0.5% (v/v) calf serum, and eglesin activity was determined by monolayer assay as described above. It was done. The results are shown in FIG. In Figure 3, "-" indicates no response, i.e. all cells maintain tight junction colonies with unchanged junctions, while "++++"
indicates a maximum response, ie only a single cell is present, or in other words the cells are not in contact with each other.
第３図に示す結果が明らかにするように、エグレシン活
性成分の大部分は、フラクション２７〜２９中に、すな
わち２５０〜３００ｍＭリン酸ナトリウムバファー（ｐ
Ｈ６，８）に溶離している。As the results shown in FIG.
H6,8).
この時点で、エグレシン活性は、当初のＳＦ−ＣＭで認
められるそれの約２０００倍に精製されている。At this point, eglesin activity has been purified approximately 2000 times that found in the original SF-CM.
（Ｅ）疎水性分離
上記したエグレシン活性を有するＨＰＨＴカラムからの
２７〜２９両分をプールし、０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ
を含有するＨＰＬＣグレードの蒸留水で１＝３に希釈し
、１．０Ｍ Ｈ（ｌでｐＨ２，５に調整した。次いで
、希釈した画分をバイダックＣ，８ＨＰＬＣカラム（Ｖ
ｙｄａｃ Ｃ１，ＨＰＬＣｃｏｌｕｍｎ）に入れた。(E) Hydrophobic separation 27 to 29 volumes from the HPHT columns with egressin activity described above were pooled and 0.1% (v/v) TFA was added.
was diluted 1=3 with HPLC grade distilled water containing
ydac C1, HPLC column).
バイダックＣ，８ＨＰＬＣは、３００人ポアサイズ、１
０μ球状シリカビーズ上のＣ＋ａ （（ＣＨ２）＋ｙ
ＣＨ３）疎水結合相（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｂｏ
ｎｄｅｄ ｐｈａｓｅ）からなる。このカラムを０．１
％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ：Ｈ２Ｏで平衡化し、１． ０ｍＱ
／分で操作した。１．０諺画分を収集した。ゆるく結合
したタンパク質は、３０％（ｖ／ｖ ）アセトニトリル
：０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ：Ｈ２Ｏへのステップで溶
離された。より強く結合したタンパク質は、０．５％（
Ｖ／Ｖ ） ／分で展開されたリニアグラジェントの３
０〜６０％（ｖ／ｖ ）アセトニトリル：０．１％（ｖ
／ｖ）ＴＦＡ：Ｈ２Ｏで溶離され、カラムは、１００％
（ｖ／ｖ ）アセトニトリル：０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦ
Ａで洗浄された。溶離は、Ａ２ｏ６での吸光度でモニタ
ーされた。各両分からの５０μΩアリコートをＢ５Ａ１
００μｇの存在下で凍結乾燥し、０．５％（ｖ／ｖ ）
子ウシ血清を含有するＤＭＥＭ５００μｇ中に再懸濁さ
せ、次いで上記した単層アッセイを用いてエグレシン活
性を検定した。結果を第４図に示す。第４図において“
−”は、応答なし、即ち、すべての細胞がインタクトな
接合を有するタイトなコロニーであることを示す。一方
、“＋＋＋＋”は、最大の応答、即ち、単一の細胞のみ
が存在すること、即ち、細胞が接触していないことを示
す。Vydac C, 8 HPLC has a pore size of 300, 1
C+a ((CH2)+y on 0μ spherical silica beads
CH3) hydrophobic bonded phase
nded phase). This column is 0.1
% (v/v) TFA:H2O, 1. 0mQ
/min. A 1.0 proverb fraction was collected. Loosely bound proteins were eluted with a step to 30% (v/v) acetonitrile:0.1% (v/v) TFA:H2O. The more tightly bound proteins are 0.5% (
3 of the linear gradient developed in V/V)/min.
0-60% (v/v) Acetonitrile: 0.1% (v
/v) TFA:H2O, the column was eluted with 100%
(v/v) Acetonitrile: 0.1% (v/v) TF
Washed with A. Elution was monitored by absorbance at A2o6. A 50μΩ aliquot from each half was added to B5A1.
Lyophilized in the presence of 00 μg, 0.5% (v/v)
They were resuspended in 500 μg of DMEM containing calf serum and then assayed for eglesin activity using the monolayer assay described above. The results are shown in Figure 4. In Figure 4 “
-” indicates no response, i.e. a tight colony with all cells with intact junctions; whereas “++++” indicates maximum response, i.e. only a single cell is present; That is, it shows that the cells are not in contact.
第４図から、エグレシン活性成分の大部分は、３３〜３
５画分、即ち、３２〜３４％（ｖ／ｖ ）アセトニトリ
ルの間で溶離されることが判った。この時点で、エグレ
シン活性は、初期のＳＦ−ＣＭのほぼ１０，０００倍に
精製された。From Figure 4, the majority of eglesin active ingredients are 33-3
It was found to elute between 5 fractions, 32-34% (v/v) acetonitrile. At this point, eglesin activity was approximately 10,000 times more purified than the initial SF-CM.
実施例２
Ｕ９３７からのエグレシンの精製（Ａ）（Ａ）Ｕ９３７
の増殖及び無血清調整培地の調製１２−０−テトラデカ
ノイル−ホルボール１３−アセテートで３７９Ｃ４８時
間前処理したヒト単球細胞ラインＵ９３７により調整さ
れた無血清培地からエグレシンを精製した。Example 2 Purification of eglesin from U937 (A) (A) U937
Growth and Preparation of Serum-Free Conditioned Medium 12-Eglesin was purified from serum-free medium conditioned by the human monocyte cell line U937 pretreated with 379C for 48 hours with 0-tetradecanoyl-phorbol 13-acetate.
より、詳しくは、１０％（Ｖ／Ｖ ）子ウシ血清（ｃａ
ｌｆ ｓｅｒｕｍ）含有ＲＰＭＩ培地の存在下に、ロー
ラーボトル中で上記ヒト単球細胞を、約１×１０６セル
／１１ＩＱの濃度に増殖させた。血清成分は、細胞を遠
心分離（５００Ｘｇ、５分間、２５℃）することによっ
て除去した。More specifically, 10% (V/V) calf serum (ca
The human monocyte cells were grown in roller bottles to a concentration of approximately 1 x 10 cells/11 IQ in the presence of RPMI medium containing lf serum). Serum components were removed by centrifuging the cells (500×g, 5 min, 25° C.).
次いで細胞を、約１１００ｎ／ＩＩＱのＴＰＡの存在下
で３７℃で９４時間新鮮な無血清ＲＰＭＩ培地中で培養
した。次いで細胞を上記と同様にして遠心分離し、約１
１００ｎ／ｍＱのＴＰＡの存在下に、３７℃で２４時間
無血清ＲＰＭＩ培地中に再懸濁させた。得られたＳＦ−
ＣＭを低速遠心分離しく５００Ｘｇ、５分間、２５°Ｃ
）、細胞を除去した。得られたＳＦ−ＣＭは、６．０Ｎ
ＨＣρでｐＨ５，５に酸性化した後、遠心分離（３５，
０００Ｘｇ、９０分間、１０℃）により清澄化した。Cells were then cultured in fresh serum-free RPMI medium for 94 hours at 37° C. in the presence of TPA at approximately 1100 n/IIQ. Cells were then centrifuged as above, with approximately 1
Resuspended in serum-free RPMI medium for 24 hours at 37° C. in the presence of 100 n/mQ TPA. Obtained SF-
Centrifuge the CM at low speed at 500Xg for 5 minutes at 25°C.
), the cells were removed. The obtained SF-CM was 6.0N
After acidification to pH 5.5 with HCρ, centrifugation (35,
000×g, 90 minutes, 10° C.).
（Ｂ）カチオン交換分離
ｐＨ５，５の０．０２５Ｍ酢酸ナトリウムバッファーで
平衡化したゼーター−８Ｐプレバレージヨンカートリツ
ジ（Ｚ ｅｔａ −Ｓ Ｐ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ
ｃａｒｔｒｉｄｇｅ ）を使用して、上記ＳＦ−ＣＭに
ついてプレパラテイブカチオン交換クロマトグラフィー
を行なった。はぼ２０ΩのＳＦ−ＣＭが、はぼ５、
Ｏ１ｍ／分の流速でゼーター−８Ｐプレバレージヨンカ
ートリツジを通過した。溶離液は、Ａ２７８での吸光度
でモニターされた。吸光度がバックグランドレベルに戻
るまでｐＨ５，５の０，０２５Ｍ酢酸ナトリウムバッフ
ァーでカートリッジを洗浄した。次いでカラムを１．０
ＭＮａ（ｌを含有するｐＨ５，５の０．０２５Ｍ酢酸ナ
トリウムバッファーで洗浄し、吸光度が再びバックグラ
ンドレベルに戻るまで溶離液を収集した。(B) Cation exchange separation Zeta-8P preparation cartridge equilibrated with 0.025M sodium acetate buffer pH 5.5
Preparative cation exchange chromatography was performed on the SF-CM using a preparative cation exchange chromatography. Habo 20Ω SF-CM is Habo 5,
It was passed through a Zeter-8P pre-vaporation cartridge at a flow rate of 01 m/min. The eluent was monitored by absorbance at A278. The cartridge was washed with 0,025 M sodium acetate buffer, pH 5.5, until the absorbance returned to background levels. Then the column was 1.0
The eluate was washed with 0.025 M sodium acetate buffer, pH 5.5, containing MNa(l) and the eluate was collected until the absorbance was back to background level.
はぼ４００齢が収集された。最後に、２． ０ＭＮａＣ
ｆ２を含有するｐＨ５，５の０．０２５Ｍ酢酸ナトリウ
ムバッファーで、バックグラウンドが０になるまでカー
トリッジを洗浄した。流出物、１．０ＭＮａＣ１プール
、及び２ＭＮａ（１１！のアリコートをｐＨ３，０の１
．０Ｍ酢酸で透析し、凍結乾燥し、０．５％（Ｖ／Ｖ
）子ウシ血清を含むＤＭＥＭ５００μΩに再懸濁させ、
上記した単層アッセイにより、エグレシン活性をテスト
した。400 instars were collected. Finally, 2. 0MNaC
The cartridge was washed with 0.025M sodium acetate buffer, pH 5.5, containing f2 until the background was zero. The effluent, 1.0M NaCl pool, and 2MNa (11!) aliquots were collected at pH 3.0.
．． Dialyzed against 0M acetic acid, lyophilized, 0.5% (V/V
) resuspended in DMEM 500 μΩ containing calf serum;
Eglesin activity was tested using the monolayer assay described above.
エグレシン活性は、１．０ＭＮａ（１！プール中に見出
された。この時点で、エグレシン活性は、初期のＳＦ−
ＣＭに対して約５０倍に精製された。Eglesin activity was found in the 1.0M Na (1!) pool. At this point, eglesin activity was
It was purified approximately 50 times compared to CM.
（Ｃ）分子量分離
上記した１、ＯＭＮａ（１！プールは、ｐＨ３，０の１
．０Ｍ酢酸５容量のそれぞれを４回交換して４℃で透析
され、凍結乾燥された。得られた物質をｐＨ３，０の、
１．０Ｍ酢酸１０１＋１Ｑ中に再懸濁させ、高速遠心分
離（３５，０００Ｘｇ。(C) Molecular weight separation The above-mentioned 1, OMNa (1! Pool is 1 at pH 3.0
．． Dialyzed at 4° C. with four changes of 5 volumes each of 0 M acetic acid and lyophilized. The obtained substance was adjusted to pH 3.0,
Resuspend in 1.0M acetic acid 101+1Q and high speed centrifugation (35,000Xg.
１０℃４５分）を行ない微粒物を除去した。清澄な上澄
み液を、ｐＨ３，０の１．０Ｍ酢酸で平衡化したバイオ
−ゲルＰ−６０カラム（２，６ｃｍｘ９５ｃｍ）に入れ
た。ｐａ：３．０の１．０Ｍ酢酸で流速１５講／時、２
５℃で展開してクロマトグラムを得た。７．５齢の画分
を収集した。溶離液は、Ａ２７８での吸光度によりモニ
ターされた。両分の１００μρアリコートをＢ５Ａ１０
０μρの存在下で凍結乾燥し、次いで、０６５％（Ｖ／
Ｖ ）子ウシ血清を含むＤＭＥＭ５００μΩ中に再懸濁
させ、上記したように、単層アッセイを用いてエグレシ
ン活性を検定した。エグレシン活性は、約２５．０００
ダルトンの見掛は分子量の両分中に見出された。この時
点で、エグレシン活性は初期のＳＦ−ＣＭの約２０００
倍に精製された。10° C. for 45 minutes) to remove fine particles. The clear supernatant was loaded onto a Bio-Gel P-60 column (2.6 cm x 95 cm) equilibrated with 1.0 M acetic acid at pH 3.0. Pa: 3.0 1.0M acetic acid, flow rate 15 l/hr, 2
A chromatogram was obtained by developing at 5°C. The 7.5 age fraction was collected. The eluent was monitored by absorbance at A278. 100 μρ aliquots for both B5A10
Lyophilized in the presence of 0 μρ and then 065% (V/
V) Resuspended in DMEM 500 μΩ containing calf serum and assayed for eglesin activity using a monolayer assay as described above. Eglesin activity is approximately 25,000
Dalton's appearance was found in both molecular weight fractions. At this point, eglesin activity is approximately 2000% that of the initial SF-CM.
Refined twice.
（Ｄ）カチオン交換分離
バイオ−ゲルＰ−６０カラム中のエグレシン活性を含む
見掛は分子量２５０００の両分がプールされ、凍結乾燥
され、０．１５ＭＮａＣρを含むｐＨ５，０の０．０２
５Ｍ酢酸ナトリウムバッファー１０１ＴＩＱ中に再懸濁
された。この試料を上記した方法で遠心分離して微粒物
を除去し、ｐＨ５，０の０．０２５Ｍ酢酸ナトリウムバ
ッファーで平衡化したファーマシアセノーＳカラム（Ｐ
ｈａｒｍａｃｆａ Ｍｏｎｏ−８ｃｏｌｕｍｎ）に入
れた。このカラムを０．３ＭＮａＣ＆を含むｐＨ５，０
の０．０２５Ｍ酢酸ナトリウムバッファーでＡ２７８で
の溶離液の吸光度がバックグラウンドレベルに戻るまで
洗浄した。残留する強く結合したタンパク質は、２２ｍ
ＭＮａＣ！２分の傾斜を有するリニアグラジェント０．
３〜１．ＯＭＮａＣρで１、 ０ｍ１２／分で溶離され
た。それぞれの画分がらの５０μｇアリコートが、Ｂ５
Ａ１００μｇの存在下で凍結乾燥され、０．５％（ｖ／
ｖ）子ウシ血清を含む５００μｐＤＭＥＭ中に再懸濁さ
れ、上記単層アッセイにより、エグレシン活性が検定さ
れた。エグレシン活性は、０．６Ｍと０．７ＭＮａＣ＆
の間の画分中で最初に見出された。この時点でエグレシ
ン活性は初期のＳＦ−０Ｍ中の約１２．０００倍に精製
された。(D) Both fractions of apparent molecular weight 25,000 containing eglesin activity in a cation exchange separation bio-gel P-60 column were pooled and lyophilized to 0.02% at pH 5.0 containing 0.15M NaCρ.
Resuspended in 5M sodium acetate buffer 101TIQ. This sample was centrifuged using the method described above to remove particulates, and a Pharmaciaseno S column (P
harmacfa Mono-8 column). This column was prepared at pH 5,0 containing 0.3M NaC&
of 0.025 M sodium acetate buffer until the absorbance of the eluent at A278 returned to background levels. The remaining tightly bound protein is 22m
MNaC! Linear gradient 0.0 with a slope of 2 minutes.
3-1. It was eluted with OMNaCρ at 1.0 ml/min. A 50 μg aliquot of each fraction was added to B5
Freeze-dried in the presence of 100 μg of A, 0.5% (v/
v) Resuspended in 500 μp DMEM containing calf serum and assayed for eglesin activity by the monolayer assay described above. Eglesin activity was 0.6M and 0.7M NaC&
It was first found in the fractions between At this point, eglesin activity was purified approximately 12,000 times that in the initial SF-0M.
（Ｅ）ヒトキロキシアパタイト分離
上記したエグレシン活性を含む画分をプールし、ｐＨ６
，８の１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーで平衡化し
たバイオ−ラドＨＰＨＴカラムに入れた。タンパク質の
大部分は、ｐＨ６，８の１゜０ｍＭリン酸ナトリウムバ
ッファーで洗浄することによってカラムから溶離した。(E) Human chiroxyapatite separation The fractions containing the above eglesin activity were pooled, and the pH 6
, 8 on a Bio-Rad HPHT column equilibrated with 10 mM sodium phosphate buffer. Most of the protein was eluted from the column by washing with 1°0mM sodium phosphate buffer, pH 6.8.
強く結合したタンパク質は、１００〜３００ｍＭのリニ
アグラジェントのｐＨ６，８のリン酸ナトリウムバッフ
ァ一により６０分間で、流速０． ５ｍＱ／分で溶離し
た。２．０前画分を収集した。溶離は、Ａ２．５での吸
光度によりモニターした。１００μρアリコートを１０
０μｇＢｓＡの存在下で凍結乾燥し、０．５％（ｖ／ｖ
）子ウシ血清を含むＤＭＥＭ５００μΩ中に懸濁させ
、次いで上記した単層アッセイでエグレシン活性を検定
した。エグレシン活性は、ｐＨ６，８のリン酸ナトリウ
ムバッファーの２５０ｍＭと３００ｍＭの間で見出され
た。Tightly bound proteins were washed with a linear gradient of 100-300mM in pH 6.8 sodium phosphate buffer for 60 minutes at a flow rate of 0. Eluted at 5 mQ/min. The pre-2.0 fraction was collected. Elution was monitored by absorbance at A2.5. 10 100μρ aliquots
Lyophilized in the presence of 0 μg BsA, 0.5% (v/v
) were suspended in 500 μΩ of DMEM containing calf serum and then assayed for eglesin activity in the monolayer assay described above. Eglesin activity was found between 250 and 300 mM in sodium phosphate buffer at pH 6.8.
この時点で、エグレシン活性は、初期のＳＦ−ＣＭの約
８０，０００倍に精製された。At this point, eglesin activity was approximately 80,000 times more purified than the initial SF-CM.
（Ｆ）疎水性分離
得られたエグレシンを含むＨＰＨＴカラムからの画分を
プールし、ｐＨを１．０ＭＨＣρで２．５に調整した。(F) Hydrophobic separation The fractions from the HPHT column containing the resulting eglecin were pooled and the pH was adjusted to 2.5 with 1.0 MHCρ.
この物質を０．０１％（ｖ／ｖ ）ＴＦＡ：Ｈ２Ｏで平
衡化したバイダックＣ４セミプレパラテイブカラム（Ｖ
ｙｄａｃ Ｃ４ｓｅｍｉ −ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ
ｃｏｌｕｍｎ）に入れた。溶離液は、Ａ２ｏ６での吸
光度によりモニターされた。カラムは、０．０１％（ｖ
／ｖ ） ＴＦＡ ： Ｈ２０で吸光度がバラフグラド
に戻るまで洗浄された。より強く結合されたタンパク質
は、１００分間展開された２５〜３５％（Ｖ／Ｖ ）の
リニアグラジェントのアセトニトリル：０．１％（ｖ／
ｖ ） ＴＦＡ ： Ｈ２０で溶離された。１． ０ｍ
１２画分が収集され、１． ０Ｍ酢酸アンモニウム１０
０或が各両分に加えられた。得られた両分からの１００
μρアリコートをＢ５Ａ１００μｇの存在下で凍結乾燥
し、０．５％（ｖ／ｖ ）子ウシ血清含有ＤＭＥＭ５０
０μρ中に再懸濁させ、次いで上記した単層アッセイで
エグレシン活性を検定した。エグレシン活性は、約２９
％（Ｖ／Ｖ ）アセトニトリル中に見出された。This material was applied to a Vydac C4 semi-preparative column (V
ydac C4semi-preparative
column). The eluate was monitored by absorbance at A2o6. The column was 0.01% (v
/v) TFA: Washed with H20 until absorbance returned to Barafgrad. More tightly bound proteins were observed in acetonitrile:0.1% (v/v) linear gradient of 25-35% (v/v) developed for 100 min.
v) TFA: eluted with H20. 1. 0m
Twelve fractions were collected, 1. 0M ammonium acetate 10
0 or was added to each half. 100 from both obtained
μρ aliquots were lyophilized in the presence of 100 μg of B5A and DMEM50 containing 0.5% (v/v) calf serum.
resuspended in 0 μρ and then assayed for eglesin activity in the monolayer assay described above. Eglesin activity is approximately 29
% (V/V) was found in acetonitrile.
この時点で、エグレシン活性は、初期のＳＦ−ＣＭの約
１００，０００倍に精製された。At this point, eglesin activity was approximately 100,000 times more purified than the initial SF-CM.
実施例３
（Ａ）Ｕ９３７の成長及び無血清調整培地の調製エグレ
シンを、ＴＰＡで前処理したヒト単球細胞ラインＵ９３
７により調整された無血清培地から精製した。Example 3 (A) Growth of U937 and preparation of serum-free conditioned medium Human monocyte cell line U93 in which eglesin was pretreated with TPA
Purified from serum-free medium prepared by 7.
より詳しくは、７．０％（ｖ／ｖ ）牛胎児血清（ｆｅ
ｔａｌ ｃｏｌｆ ｓｅｒｕｍ）を含有するＲＰＭＩ培
地の存在下に、７５ｇの発酵容器中で、ヒト単球細胞を
約Ｉ Ｘ １０６セル／ｍｌの濃度に成長させた。誘導
に先立ち、プロストークメレンプラン濾過システム（Ｐ
ｒｏ−ｓｔａｌｋ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｉｌｔｒａｔ
ｉｏｎｓｙｓｔｅｍ）を用いて、細胞を含有する培地を
ほぼ１０Ωに濃縮し、この細胞を低速遠心分離（５００
×ｇ１５分、１０°Ｃ）することによって血清成分を除
去した。細胞ペレットを約１００ ｎ ｇ／ｍＱＴＰＡ
の存在下で新鮮な無血清ＲＰＭＩ培地中に再懸濁させ４
０Ω発酵層中に接種した。３７℃で３６時間培養した後
、この培地を、連続流α−ラベル遠心分離システム（ｃ
ｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｆｌｏｗ ａ −Ｌａｖｅｌｌ
ｃｅｔｒｉｆｕｇａｔｌｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）を通過さ
せて、細胞を取り除いた。得られたＳＦ−ＣＭを１０゜
０００ダルトンカツトオフフイルター（１０，０００ｄ
ａｌｔｏｎｓ ｃｕｔ ｏｆｆ ｆｉｌｔｅｒ）を用い
るペリコン濃縮装置（Ｐ ｅｌｉｃｏｎ ｃｏｎｃｅ
ｎｔｒａｔｉｏｎ ｄｅｖｉｃｅ ）を使用して濃縮し
た。ＳＦ−ＣＭは最終量１． ０Ωまで、はぼ４０倍に
濃縮された。この物質は、６．０ＮＨＣΩを用いて、ｐ
Ｈ５，５まで酸性化された。More specifically, 7.0% (v/v) fetal bovine serum (fe
Human monocyte cells were grown to a concentration of approximately I x 10 cells/ml in a 75 g fermentation vessel in the presence of RPMI medium containing tal colf serum). Prior to induction, the Prostoke Melenplan filtration system (P
ro-stalk membrane filtrat
The medium containing cells was concentrated to approximately 10 Ω using a ion system) and the cells were centrifuged at low speed (500 Ω).
Serum components were removed by xg 15 min, 10°C). Cell pellet at approximately 100 ng/mQTPA
Resuspend in fresh serum-free RPMI medium in the presence of 4
Inoculated into the 0Ω fermentation layer. After 36 hours of incubation at 37°C, the medium was transferred to a continuous flow α-labeled centrifugation system (c
continuous flow a -Labell
cells were removed by passage through a cetrifugatlon system). The obtained SF-CM was passed through a 10°,000 Dalton cut-off filter (10,000 d
Pellicon concentrator (Pelicone concentrator) using altons cut off filter
concentration device). SF-CM has a final amount of 1. Down to 0Ω, it was almost 40 times more concentrated. This material has p
Acidified to H5.5.
（Ｂ）カチオン交換分離
ｐＨ５，５の０．０２５Ｍ酢酸ナトリウムバッファーで
平衡化されたゼータ−８Ｐプレバレージヨンカートリツ
ジを用いて、上記したＳＦ−ＣＭのプレパラテイブカチ
オン交換クロマトグラフィーを行なった。ＳＦ−ＣＭの
導電率は、ｐＨ５，５の０．０２５Ｍ酢酸ナトリウムバ
ッファーにより、ｐＨ５，５の０．０２５Ｍ酢酸ナトリ
ウムバッファー０．１５ＭＮａＣρ溶液の導電率と−５
９＝
同じか、それ以下に調整した。得られた物質は、はぼ５
．０ＩＩＩＱ／分の流速でゼータ−８Ｐプレバレージヨ
ンカートリツジを通過させた。カートリッジは、実施例
２と同様にして洗浄され、タンパク質は、溶離された。(B) Cation Exchange Separation Preparative cation exchange chromatography of the SF-CM described above was performed using a Zeta-8P pre-vaporation cartridge equilibrated with 0.025M sodium acetate buffer at pH 5.5. The conductivity of SF-CM was determined by 0.025M sodium acetate buffer at pH 5.5, and the conductivity of 0.15M NaCρ solution in 0.025M sodium acetate buffer at pH 5.5 by −5
9 = Adjusted to the same or lower. The obtained substance is Habo 5
．． A flow rate of 0 IIIQ/min was passed through a Zeta-8P preva- ration cartridge. The cartridge was washed and the proteins eluted as in Example 2.
（Ｃ）カチオン交換分離
上記した１、０ＭＮａＣｎは、０．１５ＭＮａＣρ溶液
とほぼ同じ導電率となるように、ｐＨ５，５の０．０２
５Ｍ酢酸ナトリウムで調整した。(C) Cation Exchange Separation The 1,0M NaCn described above was prepared with 0.02M NaCn at pH 5,5 so as to have approximately the same conductivity as the 0.15M NaCρ solution.
Adjustment was made with 5M sodium acetate.
次いで、０．３ＭＮａＣｆｆを含有するｐＨ５，５の０
．０２５Ｍ酢酸ソーダバッファーで平衡化したファーマ
シア モノ−８１０／１０セミープレパラテイブカチオ
ン交換カラムに、この物質をいれた。Then, 0 at pH 5.5 containing 0.3 M NaCff
．． This material was loaded onto a Pharmacia Mono-810/10 semi-preparative cation exchange column equilibrated with 025M sodium acetate buffer.
溶離液は、Ａ２□８で吸光度をモニターされた。The eluent was monitored for absorbance on an A2□8.
カラムは４．０誦／分で運転し、４．０或両分が収集さ
れた。吸光度がバックグランドレベルに戻るまでこのカ
ラムを洗浄した。次いで、タンパク質は、０．３Ｍから
１．０ＭのリニアグラジエントのＮａ（１！で３５分間
溶離された。奇数番のサンプルの１００μΩアリコート
を、０．５％（ｖ／ｖ ）子ウシ血清含有ＤＭＥＭ９０
μρで希釈し、上記した単層アッセイを用いてエグレシ
ン活性を検定した。エグレシン活性は、はぼ０．６〜０
．７ＭＮａＣΩに対応する２８〜３１両分中で見出され
た。The column was run at 4.0 readings/min and 4.0 readings/min were collected. The column was washed until the absorbance returned to background levels. Proteins were then eluted with a linear gradient of 0.3 M to 1.0 M Na (1!) for 35 min. 100 μΩ aliquots of odd numbered samples were added to DMEM90 containing 0.5% (v/v) calf serum.
Eglesin activity was assayed using the monolayer assay described above. Eglesin activity is approximately 0.6-0
．． It was found in 28-31 volumes corresponding to 7M NaCΩ.
（Ｄ）分子量分離
エグレシン活性を有するモノ−Ｓカラムからの画分をプ
ールし、ｐＨ３，０の１．０Ｍ酢酸で透析した。透析さ
れた両分を凍結乾燥し、ｐＨ３，０の１．０Ｍ酢酸１０
或中に再懸濁させ、次いで上記した高速遠心分離によっ
て微粒物を除去した。クロマトグラムは、実施例２と同
様にバイオゲルＰ−６０カラムを用いた展開により得た
。(D) Molecular weight separation Fractions from mono-S columns with eglecin activity were pooled and dialyzed against 1.0 M acetic acid, pH 3.0. Both dialyzed aliquots were lyophilized and diluted with 1.0 M acetic acid (pH 3.0).
particulate matter was then removed by high speed centrifugation as described above. The chromatogram was obtained by development using a Biogel P-60 column in the same manner as in Example 2.
エグレシン活性成分は、上記した単層アッセイにより検
定し、はぼ２５．０００ダルトンの見掛は分子量で溶離
することか見出された。Eglesin active components were assayed by the monolayer assay described above and were found to elute at an apparent molecular weight of approximately 25,000 Daltons.
（Ｅ）疎水性分離
上記したバイオゲルＰ−６０カラムから得られたエグレ
シン活性を有する両分をバイダックｃｐｓカラム（Ｖ
ｙｄａｃ Ｃ１Ｂ ｃｏｌｕｍｎ）に直接入れ、実
施例２と同様にして展開した。エグレシン活性は、はぼ
３６％（Ｖ／Ｖ ）アセトニトリルでの３９画分中に見
出された。(E) Hydrophobic separation Both fractions with eglesin activity obtained from the above-mentioned Biogel P-60 column were separated using a Vydac CPS column (V
ydac C1B column) and developed in the same manner as in Example 2. Eglesin activity was found in 39 fractions at approximately 36% (V/V) acetonitrile.
この精製法では、工程（Ｄ）及び（Ｅ）は、交換可能で
ある。In this purification method, steps (D) and (E) are interchangeable.
実施例４
アミノ酸分析
実施例２で得られた精製エグレシンについて、Ｒｏｔｈ
、 Ｍ、 、 Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ 、 、 ４３
： ８８０−８８２ （１９７１）に記載されている
アミノ酸分析を行なった。結果を下記第２表に示す。Example 4 Amino acid analysis Regarding the purified eglesin obtained in Example 2, Roth
, M. , Anal Chem , , 43
: 880-882 (1971). The results are shown in Table 2 below.
第 ２ 表
上記した組成データは、一つの残基の数の仮定に基づく
ものであり、他の相対量が決定される。Table 2 The compositional data presented above are based on the assumption of one residue number; the relative amounts of the other are determined.
この場合、リジンが（１０）にセットされ、他の残基に
ついては、全分子量が約１００００ダルトンであるとの
仮定により相対量が計算された。In this case, lysine was set to (10), and for the other residues the relative amounts were calculated assuming a total molecular weight of approximately 10,000 Daltons.
実施例５
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ドデシル−硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気
泳動（（Ｓｏｄｌｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ −ｓｕｌｆａ
ｔｅｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｔ ｅｌｅｃ
ｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ （Ｓ Ｄ Ｓ −ＰＡＧＥ）
）をレムリ、英国、ネイチャー ２２７ ： ６８０
（１９７０） （Ｌａｅｍｎｌｉ Ｕ、 Ｋ。Example 5 SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis ((Sodlum dodecyl-sulfa)
tepolyacrylamide get elec
trophoresis (SDS-PAGE)
) Laemmle, UK, Nature 227: 680
(1970) (Laemnli U, K.
Ｎａｔｕｒｅ ）に記載された方法で行なった。得られ
たゲルは、１５％（Ｗ／Ｖ ）ポリアクリルアミドであ
った。電気泳動後、ゲルは、クーマシーブルー（Ｃｏｏ
ｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ ） テ、次イテバイオーラ
トから得られた市販試薬を用いて銀でタンパク質につい
て染色された。分子量マーカーは、ゲルの標増化に用い
られた。The method described in Nature) was used. The resulting gel was 15% (w/v) polyacrylamide. After electrophoresis, the gel was coated with Coomassie blue (Coo
massie blue) and then stained for proteins with silver using a commercially available reagent obtained from Itebiolat. Molecular weight markers were used to standardize the gels.
実施例３の各工程からの両分のアリコートを凍結乾燥し
、１０ｍＭ ＤＴＴを含有するレムリ同上文献（Ｌａ
ｅｍｍｌｉ、 ５ｕｐｒａ ）に記載されたサンプルバ
ッファー中に再懸濁させゲル電気泳動を行なった。精製
の最終工程からのゲル及び物質は、はぼ１００００ダル
トンの分子量の単−帯を示した。Both aliquots from each step of Example 3 were lyophilized and treated with Laemmli, supra, containing 10mM DTT.
The cells were resuspended in the sample buffer described in Emmli, 5upra) and subjected to gel electrophoresis. The gel and material from the final step of purification showed a single band with a molecular weight of approximately 10,000 Daltons.
実施例６
成長活性（Ｇｒｏｗｔｈ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ）の検定
（Ａ）直接マイトジェンアッセイ
成長活性は、トリクロロ酢酸沈澱物中への３Ｈ−チミジ
ンの取り込みによりモニターされた。より詳しくは、第
３表中に示されたすべての細胞を２４ウエルプレートを
用いてＩ Ｘ １０４セル／ウエルで１０％（Ｖ／Ｖ
）子ウシ血清を含有するＤＭＥＭ中で培養した。３７℃
２４時間後培地を０．５％（ｖ／ｖ ）子ウシ血清を含
有するＤＭＥＭに代えた。培養物は、この低血清培地中
で７２時間培養し、次いで、下記第３表に示された因子
で処理された。Example 6 Growth Activity Assay (A) Direct Mitogen Assay Growth activity was monitored by incorporation of 3H-thymidine into the trichloroacetic acid precipitate. More specifically, all cells shown in Table 3 were grown at 10% (V/V
) Cultured in DMEM containing calf serum. 37℃
After 24 hours, the medium was replaced with DMEM containing 0.5% (v/v) calf serum. Cultures were grown in this low serum medium for 72 hours and then treated with the factors shown in Table 3 below.
ＥＧＦは、０．５％（ｖ／ｖ ）子ウシ血清含有ＤＭＥ
Ｍ中で５．０Ｈｇ／ｌｎＱ濃度で使用された。第２図に
示されたクロマトグラフからの２２画分の５０μΩを凍
結乾燥し、５．０Ｈｇ／ｍＱＥＧＦ溶液又は０．５％（
ｖ／ｖ ）子ウシ血清含有ＤＭＥＭ１００μρ中に懸濁
させた。EGF was DME containing 0.5% (v/v) calf serum.
It was used at a concentration of 5.0 Hg/lnQ in M. 22 fractions of 50 μΩ from the chromatograph shown in FIG. 2 were lyophilized and 5.0 Hg/mQEGF solution or
v/v) suspended in 100 μρ of DMEM containing calf serum.
１０％（ｖ／ｖ ）子ウシ血清ＥＧＦ溶液、エグレシン
溶液、又はＥＧＦ溶液含有エグレケシン１００μｇがウ
ェルに加えられた。100 μg of 10% (v/v) calf serum EGF solution, eglesin solution, or eglechesin in EGF solution was added to the wells.
３７℃で１８時間培養した後、０．０１μＣｉ／ｍＱの
３Ｈ−チミジン１００μρを各ウェルに加え、更に細胞
を８時間培養した。次いで培養物を、４°Ｃで冷却チミ
ジン１００μｇ／ｍＱを含有するワイマウス培地（Ｗａ
ｙｍｏｕｔｈ’ｓ ｍｅｄｉａ）で２回洗浄し、添加
物を含有しないウェイマウス培地で２回洗浄した。次い
で細胞を４℃で１０％（Ｖ／Ｖ ） ）リクロロ酢酸で
洗浄し、続いて、０．１％（Ｗ／Ｖ ）ＮａＯＨＯ，５
ＩＱで可溶化した。可溶化物をシンチラント水性液（セ
ーフティー−ソルブ（Ｓ ｕｆｅｔｙ ５ｏｌｖｅ ）
リサーチ プロダクツ インスティテユー）） ５．
０ＩＱに添加しシンチレーション計数計中で計数した
。添加された因子の存在下において取込まれたｃｐｍ
／因子の添加なしの培養物中に取込まれたｅｐｆｆｌ
、の比率で表わされるマイトジェン指数を下記第３表に
示す。すべての実験は２つのウェルで行なわれた。After culturing at 37° C. for 18 hours, 100 μρ of 3H-thymidine at 0.01 μCi/mQ was added to each well, and the cells were further cultured for 8 hours. The culture was then incubated at 4°C in cold Wymouth medium (Wa) containing 100 μg/mQ thymidine
ymouth's media) and twice with Waymouth's medium containing no additives. Cells were then washed with 10% (V/V) dichloroacetic acid at 4°C, followed by 0.1% (W/V) NaOHO, 5
Solubilized with IQ. The solubilized material was treated with a scintillant aqueous solution (Safety Solve).
Research Products Institute)) 5.
0IQ and counted in a scintillation counter. cpm taken up in the presence of added factors
/epffl incorporated into cultures without addition of factors.
The mitogen index expressed as the ratio of , is shown in Table 3 below. All experiments were performed in duplicate wells.
＝ ６７ −
第 ３ 表
直接的マイトジェンアッセイ
第３表の結果は、エグレシンは成長因子ではなく寧ろ細
胞運動性因子（ｃｅｌｌ ｍｏｔｌｌｌｔｙ ｆａｃｔ
ｏｒ）であることを示している。このことは試験された
細胞に対するマイトジェニックポテンシャルの欠落とＡ
ＩＧ及び単層アッセイでの細胞運動の増大から明らかで
ある。= 67 - Table 3 Direct mitogen assay The results of Table 3 show that eglesin is not a growth factor but rather a cell motility fact.
or). This indicates a lack of mitogenic potential for the cells tested and A
This is evident from increased cell motility in IG and monolayer assays.
エグレシンの細胞増殖活性について試験した。Eglesin was tested for cell proliferation activity.
詳しく説明すると前記の如くして得たエグレシンを上記
血清除去培地に添加し、５日後の細胞数を求めた。細胞
数は、ＥＧＦ５．ｏｎｇ、／ｍＱ又は１０％（Ｖ／Ｖ
）牛胎児血清中で培養した細胞では約４倍に増大したが
、エグレシン処理培地では細胞数の増大を認めなかった
。このことはまたエグレシンは成長因子でないことを示
している。To explain in detail, the eglesin obtained as described above was added to the above serum-depleted medium, and the number of cells was determined after 5 days. The cell number is EGF5. on, /mQ or 10% (V/V
) Cells cultured in fetal bovine serum increased approximately 4 times, but no increase in cell number was observed in eglecin-treated medium. This also indicates that eglesin is not a growth factor.
（Ｂ）間接マイトジェンアッセイ
エグレシンの間接マイトジェン効果につき試験した。即
ち、ＥＧＦ、ＴＧＦ−β又は修生血清の存在下に融合性
、密度阻害性ＮＨＫ−４９Ｆ及びウシ大動脈細胞中で３
Ｈ−チミジンのトリクロロ酢酸沈殿物への取込みを増大
する活性を試験した。(B) Indirect mitogen assay Eglesin was tested for indirect mitogen effect. 3 in fusogenic, density-inhibiting NHK-49F and bovine aortic cells in the presence of EGF, TGF-β or reformed serum.
The activity of increasing the incorporation of H-thymidine into trichloroacetic acid precipitates was tested.
詳しく説明すると、下記第４表に示した全ての細胞をＩ
Ｘ １０５細胞／ウエルで１０％（ｖ／ｖ ）仔牛血
清含有ＤＭＥＭ中で平板培養した。３７℃で５日後因子
を上記の如く添加した。ＴＧＦ−βは０．５％（ｖ／ｖ
）仔牛血清含有ＤＭＥＭ中１．０Ｈｇ／ｎ１２の濃度
で用いた。To explain in detail, all the cells shown in Table 4 below were
X 105 cells/well were plated in DMEM containing 10% (v/v) calf serum. After 5 days at 37°C factors were added as above. TGF-β was 0.5% (v/v
) was used at a concentration of 1.0 Hg/n12 in DMEM containing calf serum.
３７℃で１６〜１８時間培養後、０．０１μＣ１／ｌ１
１１２の３Ｈ−チミジン５０μρを各ウェルに添加し、
細胞を更に８時間培養した。培養物をＤＭＥＭで二度洗
浄した。次いで４℃で１０％（Ｗ／Ｖ ）トリクロロ酢
酸で２度洗浄し、１．０％（Ｗ／Ｖ ）ＮａＯＨ０，５
１ｎＱで可溶化した。可溶化物を水性液状シンチラント
（セーフティーーソルブ リサーチ プロダクツ イン
スティテユート）３．０或に添加し、シンチレーション
カウンターで計数した。添加因子存在下に取込まれたｃ
ｐｍ ／因子無添加培地に取込まれたｃｐｍの比として
マイトジェン指数を求め下記第４表に示す。全ての実験
は２ウエルで行なった。After culturing at 37°C for 16-18 hours, 0.01μC1/l1
Add 50 μρ of 112 H-thymidine to each well;
Cells were cultured for an additional 8 hours. Cultures were washed twice with DMEM. It was then washed twice with 10% (w/v) trichloroacetic acid at 4°C, and washed with 1.0% (w/v) NaOH0.5.
Solubilized with 1nQ. The solubilized material was added to aqueous liquid scintillant (Safety Solve Research Products Institute) 3.0 and counted using a scintillation counter. c incorporated in the presence of added factors
The mitogen index was determined as the ratio of pm/cpm incorporated into the factor-free medium and is shown in Table 4 below. All experiments were performed in duplicate wells.
第 ４ 表
間接マイトジェンアッセイ
上記第４表の結果はエグレシンが間接マイトジェンであ
ることを示している。即ちエグレシンは、１０％（ｖ／
ｖ ）修生血清の存在下に接触阻害されたＮＨＫ−４９
Ｆ細胞中のチミジン取込みを増大させ、この効果はＴＧ
Ｆ−β及びＥＧＦにより増強された。エグレシンはＴＧ
Ｆ−βの存在下及び不存在下でのウシ大動脈内皮細胞に
対するマイトジェン作用を有しておらず血清除去ＮＨＫ
−４９Ｆ細胞の成長を増強しなかった。Table 4 Indirect Mitogen Assay The results in Table 4 above demonstrate that eglesin is an indirect mitogen. That is, eglesin is 10% (v/
v) NHK-49 contact inhibited in the presence of corrective serum
TG increases thymidine uptake in F cells, and this effect
Enhanced by F-β and EGF. Eglesin is TG
Serum-free NHK that has no mitogenic effect on bovine aortic endothelial cells in the presence and absence of F-β
- did not enhance the growth of 49F cells.
本発明を詳細に且つ特定の実施例に関連して説明したが
、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく種々の変更
と改変をなし得ることとは当業者に明らかである。Although the invention has been described in detail and with reference to specific embodiments, it will be apparent to those skilled in the art that various changes and modifications can be made without departing from the spirit and scope of the invention.
第１図は、１．０Ｍ酢酸の存在下、パイオーゲル（Ｂｉ
ｏ−Ｇｅｌ） Ｐ−６０カラム上で行なわれた、ヒト転
移性メラノーマＭ３８２７クローン３の無血清調整培地
の分子量クロマトグラフィー、並びに得られたエグレシ
ンについての足場非依存性増殖アッセイにおいて検定さ
れたエグレシン活性を示す。
第２図は、第１図のバイオゲルＰ−６０カラムから得ら
れたエグレシン活性を有するフラクションのファルマシ
ア モノ−８（Ｐ ｈａｒｍａｃｉａＭｏｎｏ−８）カ
ラム上で行なわれたカチオン交換クロマトグラフィー、
並びに得られたエグレシンについての足場非依存性増殖
アッセイにおいて検定されたエグレシン活性を示す。
第３図は、第２図のファルマシア モノ−Ｓカラムから
得られたエグレシン活性を有するフラクションのパイオ
ーラド（Ｂｉｏ−Ｒｅｄ）ＨＰＨＴカラム上で行なわれ
たヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、並びに得
られたエグレシンについての単層コロニーアッセイにお
いて検定されたエグレシン活性を示す。
第４図は、第３図のバイオ−ラドＨＰＨＴカラムから得
られたエグレシン活性を有するフラクションのヴイダク
（Ｖ ｙｄａｃ） Ｃ＋ａ ＨＰ Ｌ Ｃカラム上で行
なわれたヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、並
びに得られたエグレシンについての単層コロニーアッセ
イにおいて検定されたエグレシン活性を示す。
（以 上）
手続補正書動式）
昭和６３年１月１８８
１ 事件の表示
昭和６２年特許願第２３５４６８号
２ 発明の名称
事件との関係 特許出願人
大塚製薬株式会社
４代理人
昭和６２年１２月２２日
６ 補正の対象
図面全図
７ 補正の内容FIG.
o-Gel) Molecular weight chromatography of serum-free conditioned medium of human metastatic melanoma M3827 clone 3 performed on a P-60 column and eglesin activity assayed in an anchorage-independent growth assay for the resulting eglesin. shows. FIG. 2 shows cation exchange chromatography performed on a Pharmacia Mono-8 column of the fraction with eglecin activity obtained from the Biogel P-60 column of FIG.
and the eglesin activity assayed in an anchorage-independent proliferation assay for the obtained eglesins. FIG. 3 shows the hydroxyapatite chromatography performed on a Bio-Red HPHT column of the fraction with eglesin activity obtained from the Pharmacia Mono-S column of FIG. Eglesin activity assayed in a layered colony assay is shown. FIG. 4 shows hydroxyapatite chromatography performed on a Vydac C+a HPLC column of the fraction with eglesin activity obtained from the Bio-Rad HPHT column of FIG. 3 and the eglesin obtained. Figure 1 shows eglesin activity assayed in a monolayer colony assay. (Above) Procedural amendment written form) January 1988 188 1 Indication of the case Patent Application No. 235468 of 1988 2 Name of the invention Relationship to the case Patent applicant Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. 4 Agents December 1988 Month 22nd 6 All drawings subject to amendment 7 Contents of amendment
Claims (1)
が約１０，０００ダルトンであること、 （２）塩基性蛋白であること、 （３）５６℃で３０分間加熱しても安定であること、 （４）約３．０〜約１０．０のｐＨ領域に於て安定であ
ること、 （５）正常ラットの腎臓線維芽細胞に於てルースなコロ
ニー形態誘発活性を有すること、（６）正常ラットの腎
臓上皮細胞及び線維芽細胞の単層コロニーからの移行性
活性を示すこと、及び （７）間接マイトジェンであること。 ［２］（１）ヒト転移性メラノーマＭ３８２７クローン
３（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ ９１９３）を無血清培地
中で培養する工程、 （２）得られる無血清調整培地を採取する工程、並びに 更に任意の順序で行われ得る下記（３）〜（６）の工程
を含み、それにより少くとも約１００００倍に精製され
たエグレシンを得る方法により生産されるエグレシン。 （３）１．０Ｍ酢酸の存在下に分子量による分離を行い
エグレシン活性を有する約２５０００の分子量分画を単
離する工程、 （４）カチオン***換分離を行いエグレシン活性を有す
る塩基性分画を単離する工程、 （５）ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを行な
いエグレシン活性を有する強く結合した分画を単離する
工程、及び （６）疎水性分離を行ないエグレシン活性を有する疎水
性分画を単離する工程。 ［３］（３）〜（６）の工程が、（３）、（４）、（５
）及び（６）の順序で行われる特許請求の範囲第２項記
載のエグレシン。 ［４］（１）ヒト単球性細胞ラインＵ９３７（ＡＴＣＣ
Ｎｏ．ＣＲＬ １５９３）を無血清培地中で分化誘発剤
の存在下に培養する工程、 （２）得られる無血清調整培地を採取する工程、並びに 更に任意の順序で行われ得る下記（３）〜（５）の工程
を含み、それにより少くとも約８００００倍に精製され
たエグレシンを得る方法によって生産されるエグレシン
。 （３）カチオン交換分離を行ないエグレシン活性を有す
る塩基性分画を単離する工程、 （４）１．０Ｍの酢酸の存在下に分子量による分離を行
ないエグレシン活性を有する約２５０００の分子量分画
を単離する工程、 （５）カチオン交換分離を行ないエグレシン活性を有す
る塩基性分画を単離する工程、及び （６）疎水性分離を行ないエグレシン活性を有する疎水
性分画を単離する工程。 ［５］上記分化誘発剤が、１２−Ｏ−テトラデカノイル
−ホルボール １３−アセテート及びフイトヘマグルチ
ニンから成る群から選ばれる特許請求の範囲第４項記載
のエグレシン。 ［６］下記（７）の工程を含み、少くとも約１００００
０倍に精製されたエグレシンを得る特許請求の範囲第４
項記載のエグレシン。 （７）ヒドロキシアパタイト分離を行ないエグレシン活
性を有する強く結合した分画を単離する工程。 ［７］（３）〜（６）の工程が、（３）、（５）、（４
）及び（６）又は（３）、（５）、（６）及び（４）の
順序で行われる特許請求の範囲第４項記載のエグレシン
。 ［８］（３）〜（７）の工程が、（３）、（４）、（５
）、（７）及び（６）の順序で行われる特許請求の範囲
第６項記載のエグレシン。 ［９］下記性質を有する特許請求の範囲第２項記載のエ
グレシン。 （１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって求められた見掛分子量
が約１０，０００ダルトンであること、 （２）塩基性蛋白であること、 （３）５６℃で３０分間加熱しても安定であること、 （４）約３．０〜約１０．０のｐＨ領域に於て安定であ
ること、 （５）正常ラットの腎臓線維芽細胞に於てルースなコロ
ニー形態誘発活性を有すること、（６）正常ラットの腎
臓上皮細胞及び線維芽細胞の単層コロニーからの移行性
活性を示すこと、及び （７）間接マイトジェンであること。 ［１０］下記性質を有する特許請求の範囲第４項記載の
エグレシン。 （１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって求められた見掛分子量
が約１０，０００ダルトンであること、 （２）塩基性蛋白であること、 （３）５６℃で３０分間加熱しても安定であること、 （４）約３．０〜約１０．０のｐＨ領域に於て安定であ
ること、 （５）正常ラットの腎臓線維芽細胞に於てルースなコロ
ニー形態誘発活性を有すること、（６）正常ラットの腎
臓上皮細胞及び線維芽細胞の単層コロニーからの移行性
活性を示すこと、及び （７）間接マイトジェンであること。 ［１１］（１）ヒト転移性メラノーマＭ３８２７クロー
ン３（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ ９１９３）を無血清培
地中で培養する工程、 （２）得られる無血清調整培地を採取する工程、並びに 更に任意の順序で行われ得る下記（３）〜（６）の工程
を含み、それにより少くとも約１００００倍に精製され
たエグレシンを得るエグレシンの製造方法。 （３）１．０Ｍ酢酸の存在下に分子量による分離を行い
エグレシン活性を有する約２５０００の分子量分画を単
離する工程、 （４）カチオン***換分離を行いエグレシン活性を有す
る塩基性分画を単離する工程、 （５）ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを行な
いエグレシン活性を有する強く結合した分画を単離する
工程、及び （６）疎水性分離を行ないエグレシン活性を有する疎水
性分画を単離する工程。 ［１２］（３）〜（５）の工程が、（３）、（４）、（
５）及び（６）の順序で行われる特許請求の範囲第１１
項記載の方法。 ［１３］（１）ヒト単球性細胞ラインＵ９３７（ＡＴＣ
ＣＮｏ．ＣＲＬ １５９３）を無血清培地中で分化誘発
剤の存在下に培養する工程、 （２）得られる無血清調整培地を採取する工程、並びに 更に任意の順序で行われ得る下記（３）〜（５）の工程
を含み、それにより少くとも約８００００倍に精製され
たエグレシンを得るエグレシンの製造方法。 （３）カチオン交換分離を行ないエグレシン活性を有す
る塩基性分画を単離する工程、 （４）１．０Ｍの酢酸の存在下に分子量による分離を行
ないエグレシン活性を有する約２５０００の分子量分画
を単離する工程、 （５）カチオン交換分離を行ないエグレシン活性を有す
る塩基性分画を単離する工程、及び （６）疎水性分離を行ないエグレシン活性を有する疎水
性分画を単離する工程。 ［１４］上記分化誘発剤が、１２−Ｏ−テトラデカノイ
ル−ホルボール １３−アセテート及びフイトヘマグル
チニンから成る群から選ばれる特許請求の範囲第１３項
記載の方法。 ［１５］下記（７）の工程を含み、少くとも約１０００
００倍に精製されたエグレシンを得る特許請求の範囲第
１３項記載の方法。 （７）ヒドロキシアパタイト分離を行ないエグレシン活
性を有する強く結合した分画を単離する工程。 ［１６］（３）〜（６）の工程が、（３）、（５）、（
４）及び（５）又は（３）、（５）、（６）及び（４）
の順序で行われる特許請求の範囲第１３項記載の方法。 ［１７］（３）〜（７）の工程が、（３）、（４）、（
５）、（７）及び（６）の順序で行われる特許請求の範
囲第１５項記載の方法。 ［１８］下記性質を有するエグレシンを得る特許請求の
範囲第１１項記載の方法。 （１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって求められた見掛分子量
が約１０，０００ダルトンであること、 （２）塩基性蛋白であること、 （３）５６℃で３０分間加熱しても安定であること、 （４）約３．０〜約１０．０のｐＨ領域に於て安定であ
ること、 （５）正常ラットの腎臓線維芽細胞に於てルースなコロ
ニー形態誘発活性を有すること、（６）正常ラットの腎
臓上皮細胞及び線維芽細胞の単層コロニーからの移行性
活性を示すこと、及び （７）間接マイトジェンであること。 ［１９］下記性質を有するエグレシンを得る特許請求の
範囲第１３項記載の方法。 （１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって求められた見掛分子量
が約１０，０００ダルトンであること、 （２）塩基性蛋白であること、 （３）５６℃で３０分間加熱しても安定であること、 （４）約３．０〜約１０．０のｐＨ領域に於て安定であ
ること、 （５）正常ラットの腎臓線維芽細胞に於てルースなコロ
ニー形態誘発活性を有すること、（６）正常ラットの腎
臓上皮細胞及び線維芽細胞の単層コロニーからの移行性
活性を示すこと、及び （７）間接マイトジェンであること。[Claims] [1] Substantially pure eglesin having the following properties. (1) The apparent molecular weight determined by SDS-PAGE is approximately 10,000 Daltons, (2) It is a basic protein, (3) It is stable even when heated at 56°C for 30 minutes, (4) be stable in the pH range of about 3.0 to about 10.0; (5) have loose colony morphology-inducing activity in normal rat kidney fibroblasts; (6) normal (7) exhibits migratory activity from monolayer colonies of rat kidney epithelial cells and fibroblasts; and (7) is an indirect mitogen. [2] (1) A step of culturing human metastatic melanoma M3827 clone 3 (ATCC No. CRL 9193) in a serum-free medium, (2) A step of collecting the obtained serum-free conditioned medium, and further in any order. Eglesin produced by a method of obtaining eglesin purified at least about 10,000 times, which may include the following steps (3) to (6). (3) Performing molecular weight separation in the presence of 1.0 M acetic acid to isolate a molecular weight fraction of approximately 25,000 that has eglesin activity; (4) Performing cationic exchange separation to isolate a basic fraction that has eglesin activity. (5) performing hydroxyapatite chromatography to isolate a strongly bound fraction having eglesin activity; and (6) performing hydrophobic separation to isolate a hydrophobic fraction having eglesin activity. Process. [3] Steps (3) to (6) are performed in steps (3), (4), and (5).
) and (6) in the order of claim 2. [4] (1) Human monocytic cell line U937 (ATCC
No. CRL 1593) in the presence of a differentiation-inducing agent in a serum-free medium, (2) collecting the resulting serum-free conditioned medium, and the following (3) to (5), which may be performed in any order. ), thereby obtaining eglesin that is at least about 80,000 times purified. (3) Performing cation exchange separation to isolate a basic fraction having eglesin activity; (4) Performing molecular weight separation in the presence of 1.0 M acetic acid to isolate a molecular weight fraction of about 25,000 having eglesin activity. (5) performing cation exchange separation to isolate a basic fraction having eglesin activity; and (6) performing hydrophobic separation to isolate a hydrophobic fraction having eglesin activity. [5] The eglesin according to claim 4, wherein the differentiation-inducing agent is selected from the group consisting of 12-O-tetradecanoyl-phorbol 13-acetate and phytohemagglutinin. [6] Including the step (7) below, at least about 10,000
Claim 4 to obtain 0 times purified eglesin
Eglesin as described in section. (7) A step of performing hydroxyapatite separation and isolating a strongly bound fraction having eglesin activity. [7] Steps (3) to (6) are performed in steps (3), (5), and (4).
) and (6) or (3), (5), (6) and (4) in the order of claim 4. [8] Steps (3) to (7) are performed in steps (3), (4), and (5).
), (7) and (6) in the order of claim 6. [9] Eglesin according to claim 2, which has the following properties. (1) The apparent molecular weight determined by SDS-PAGE is approximately 10,000 Daltons, (2) It is a basic protein, (3) It is stable even when heated at 56°C for 30 minutes, (4) be stable in the pH range of about 3.0 to about 10.0; (5) have loose colony morphology-inducing activity in normal rat kidney fibroblasts; (6) normal (7) exhibits migratory activity from monolayer colonies of rat kidney epithelial cells and fibroblasts; and (7) is an indirect mitogen. [10] Eglesin according to claim 4, which has the following properties. (1) The apparent molecular weight determined by SDS-PAGE is approximately 10,000 Daltons, (2) It is a basic protein, (3) It is stable even when heated at 56°C for 30 minutes, (4) be stable in the pH range of about 3.0 to about 10.0; (5) have loose colony morphology-inducing activity in normal rat kidney fibroblasts; (6) normal (7) exhibits migratory activity from monolayer colonies of rat kidney epithelial cells and fibroblasts; and (7) is an indirect mitogen. [11] (1) Cultivating human metastatic melanoma M3827 clone 3 (ATCC No. CRL 9193) in a serum-free medium, (2) collecting the obtained serum-free conditioned medium, and further in any order A method for producing eglesin, which comprises the steps (3) to (6) below, which may be performed, thereby obtaining eglesin purified at least about 10,000 times. (3) Performing molecular weight separation in the presence of 1.0 M acetic acid to isolate a molecular weight fraction of approximately 25,000 that has eglesin activity; (4) Performing cationic exchange separation to isolate a basic fraction that has eglesin activity. (5) performing hydroxyapatite chromatography to isolate a strongly bound fraction having eglesin activity; and (6) performing hydrophobic separation to isolate a hydrophobic fraction having eglesin activity. Process. [12] Steps (3) to (5) are (3), (4), (
Claim 11 carried out in the order of 5) and (6)
The method described in section. [13] (1) Human monocytic cell line U937 (ATC
CNo. CRL 1593) in the presence of a differentiation-inducing agent in a serum-free medium, (2) collecting the resulting serum-free conditioned medium, and the following (3) to (5), which may be performed in any order. ), thereby obtaining eglesin purified at least about 80,000 times. (3) Performing cation exchange separation to isolate a basic fraction having eglesin activity; (4) Performing molecular weight separation in the presence of 1.0 M acetic acid to isolate a molecular weight fraction of about 25,000 having eglesin activity. (5) performing cation exchange separation to isolate a basic fraction having eglesin activity; and (6) performing hydrophobic separation to isolate a hydrophobic fraction having eglesin activity. [14] The method according to claim 13, wherein the differentiation-inducing agent is selected from the group consisting of 12-O-tetradecanoyl-phorbol 13-acetate and phytohemagglutinin. [15] At least about 1000 steps, including the step (7) below.
14. The method according to claim 13, wherein eglesin purified 00 times is obtained. (7) A step of performing hydroxyapatite separation and isolating a strongly bound fraction having eglesin activity. [16] The steps (3) to (6) are (3), (5), (
4) and (5) or (3), (5), (6) and (4)
14. The method of claim 13, which is carried out in the order of: [17] The steps (3) to (7) are (3), (4), (
16. The method according to claim 15, which is carried out in the order of steps (5), (7) and (6). [18] The method according to claim 11 for obtaining eglesin having the following properties. (1) The apparent molecular weight determined by SDS-PAGE is approximately 10,000 Daltons, (2) It is a basic protein, (3) It is stable even when heated at 56°C for 30 minutes, (4) be stable in the pH range of about 3.0 to about 10.0; (5) have loose colony morphology-inducing activity in normal rat kidney fibroblasts; (6) normal (7) exhibits migratory activity from monolayer colonies of rat kidney epithelial cells and fibroblasts; and (7) is an indirect mitogen. [19] The method according to claim 13 for obtaining eglesin having the following properties. (1) The apparent molecular weight determined by SDS-PAGE is approximately 10,000 Daltons, (2) It is a basic protein, (3) It is stable even when heated at 56°C for 30 minutes, (4) be stable in the pH range of about 3.0 to about 10.0; (5) have loose colony morphology-inducing activity in normal rat kidney fibroblasts; (6) normal (7) exhibiting migratory activity from monolayer colonies of rat kidney epithelial cells and fibroblasts; and (7) being an indirect mitogen.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US90935686A | 1986-09-19 | 1986-09-19 | |
| US909,356 | 1986-09-19 | ||
| US096,576 | 1987-09-15 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63179896A true JPS63179896A (en) | 1988-07-23 |
Family
ID=25427096
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62235468A Pending JPS63179896A (en) | 1986-09-19 | 1987-09-18 | Tumorous ergress factor and production thereof |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS63179896A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007508816A (en) * | 2003-10-10 | 2007-04-12 | ゲ・ミン・ルイ | Compositions and methods for cell culture and tissue culture platforms |
-
1987
- 1987-09-18 JP JP62235468A patent/JPS63179896A/en active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007508816A (en) * | 2003-10-10 | 2007-04-12 | ゲ・ミン・ルイ | Compositions and methods for cell culture and tissue culture platforms |
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