JPS6317685A - 細胞培養器及び細胞培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、多孔質膜から成る細胞培養器及び該多孔質膜
を用いた細胞培養方法に関する。

（従来技術とその問題点） ＫＮＡＺＥＫらによる中空糸を用いた細胞培養法の報告
（Ｓｃｉｅｎｃｅ、１７８：６５，１９７２）以来、中
空糸を用いた細胞培養の試み（以下中空糸法と称す）は
数多く報告されている。

中空系法は、限られた容積中に物質交換に重要な透液性
の膜表面、これは付着細胞にとってはその生育に必要な
基質としての役割をもはたすのであるが、を多く確保で
き、よって栄養素や酸素の供給並びに生成物や老廃物の
除去を、極めて効果的に行なえるのである。その為、細
胞培養による有用物質生産の有力な手法として期待され
ている。

公知の中空糸法にはポリスルフォン、セルロースジアセ
テート等の中空糸の使用例が見られる。

この中でもポリスルフォン中空糸は、セルロース系中空
糸に比べて基質としての性能が優れており、広く用いら
れている。しかしながら本発明者等の研究によれば、該
ポリスルフォン中空糸は細胞の初期接着性は満足できる
ものではなく、又、細胞の増殖速度はポリスチレン製デ
ィツシュに比べてはるかに劣っていることがわかった。

これは本発明者等の知見によれば、■ポリスルフォン中
空糸は実質部と空洞部とから成るのであるが、この部分
的構造差が透液の不均一性を生んでいる。

（リボリスルフォン中空糸実質部の構造は、粒子状ポリ
スルフォンのつながったスポンジ様構造であり、空孔率
が低く、又その細孔は貫通孔では無く、よって透液性は
低い、ことより培養液の流れにバイパスが生じ、部分的
に培養液の供給不足の状態に陥り、細胞が局所的にしか
増殖しない、或いは細胞数が増加するに従い上記部分的
培養液の供給不足状態が促進され、よって結果的に細胞
の増殖速度が低くなってしまう。更に、一般に■多孔性
であってもその膜表面が比較的平坦な膜では、その膜表
面上で均一に細胞が増殖した場合、その膜表面の細孔を
ふさいでしまい、やはり同様の培養液の供給不足状態に
陥ってしまうのである。

以上１本発明者等は、膜及び孔壁構造が、細胞培養用中
空糸の性能にとって重要であるとの知見を得、これに基
づきポリスチレン製ディツシュレベルの増殖速度が得ら
れる中空糸が特定の膜壁構造を持つことを見い出した。

（問題点を解決するための手段） 木発明者等の研究によれば、高い増殖速度を得るために
必要な細胞培養用の中空糸の孔壁構造としては、■空孔
率の高い貫通孔であること、■その孔壁構造は膜壁中で
実質的に均質であって、その為に膜表面で透液性は均一
であることである。

これによって部分的な培養液の供給不足状態には陥らず
、細胞は均一に増殖するのである。更に、（３）その膜
表面は網状の微細な凹凸を持つこと、なぜならたとえそ
の膜表面上で均一に細胞が増殖しても、その膜表面の細
孔を完全にはふさいでしまわず、前記の様な培養液の供
給不足状態には陥ることは無いからであるとともに、■
膜表面の網状の微細な凹凸は細胞添加時の細胞の物理的
ひっかかりを助け、細胞の初期接着性を高めるからであ
る。

本発明者等は、この様な孔壁構造をもつ細胞培養用中空
糸を得るべく鋭意研究した結果、本発明をなしたもので
ある。即ち、本発明は、長手方向に延びるミクロフィブ
リルとスタックドラメラからなる結節部とに囲まれて形
成される櫛状長方形の櫛状均質な網目構造よりなる多孔
質膜を用いた細胞培養器及び該多孔質膜を用いた細胞培
養方法である。その結果、該多孔質膜上で被培養細胞は
、従来知られている細胞培養用中空糸に比べてはるかに
高い増殖性を示すのである。

（発明の構１＆） 長手方向に延びるミクロフィブリルとスタックドラメラ
からなる結節部とに囲まれ・て形成される櫛状長方形の
櫛状均質な網目構造よりなる多孔質膜とは、例えばポリ
オレフィン等の結晶性高分子によって得られる配向性の
ものであって、ポリスルフォンやポリアクリロニトリル
などで知られている沈澱の凝集体としての方向性の無い
ランダムなスポンジ様の構造とは異なる。該網目構造を
形成する結晶性高分子としてはポリオレフィン以外にテ
フロン、ポリアセタール、ポリフェニルサルファイド等
が知られている。

本多孔質膜は、膜厚ｌ〜１１０００１Ｌ、内径０．０１
〜１０ｍｍの中空糸であり、ポリオレフィンでは、結晶
性ポリエチレン、ポリプロピレンの重合体を溶融押出に
より中空線条を形成し、これを延伸することにより中空
壁にフィブリルの開裂を生成せしめる、いわゆる延伸開
孔法によって調製することができる。これらの製法は特
開昭５７−４２９１９あるいは特開昭５７−６６１１４
などで既に知られている。

本発明で用いる多孔質膜としては、その孔径は培養液の
十分な流れが得られる大きさであって細胞（凡そ数十μ
ｍ）が漏れなければ良く、具体的には０．０２〜４．０
終ｍ、更に好ましくは０゜１〜２．０４ｍである。多孔
質膜の空孔率は、結晶性のミクロフィブリルとスタック
ドラメラからなる結節部により囲まれて形成される櫛状
長方形の櫛状均質な網目構造が保たれておりかつ実用上
の１＝分な強度があれば良く、具体的には３０〜９０％
、更に好ましくは５０〜８０％であれば良い、多孔質膜
の膜厚や内径については培養液の十分な流れが得られ、
細胞がその表面に存在しうる大きさであれば特に制限は
不要であるが、しいて揚げれば膜厚、内径はそれぞれｌ
ｌ−１Ｏ００ＪＬ、０．０１〜１０ｍｍであれば使用可
能である。本発明者等の経験によれば膜厚、内径はそれ
ぞれ１０−１００４ｍ、０．１〜１．０ｍｍぐらいの中
空糸が実用上特に適していた。

本多孔質膜の網目構造は、走査型電子顕微鏡によって観
察する時、該像中における結節部のしめる面積の割合は
、５〜５０％、更に好ましくは１０〜３０％であること
が望ましい、これは、細胞が本多孔質膜に付着する際、
主に該結節部と強く結合すると考えられ、よって該結節
部のしめる面積の割合が５％よりも低すぎると細胞の本
多孔質膜への結合が弱り、細胞の増殖に影響する。又。

該割合が５０％よりも高すぎると、該多孔質膜の物質交
換能に影響する。同様に、透過型電子顕微鏡にて観察す
る時、孔径の大きさあるいは物質交換能の点より、ミク
ロフィブリルの長さ及び太さの平均はそれぞれ０．１〜
６．０μｍ、０．０２〜０．３μｍであることが望まし
い。

本発明の実施法について詳しく説明すると、細胞添加口
と、培養液の流出入口の少なくとも１つを細胞添加口と
該多孔質膜を隔して具えた容器内の、一方の空間に細胞
添加口より細胞を注入し。

被培養細胞の生育に必要な栄養素及び酸素の供給或いは
被培養細胞の産生じた生成物や老廃物の除去を膜壁を通
して拡散により、或いは強制的に行なうことによって細
胞を培養する細胞培養器及び方法である。より具体的に
例を上げると、該多孔質膜で隔された中空糸外側に細胞
を置き、中空糸内側を中空糸の一方の口より他方の口へ
培養液を循環することによって栄養素及び酸素の供給或
いは被培養細胞の産生じた生成物や老廃物を除去する細
胞培養器及び方法である。或いは上記において中空糸膜
厚方向に強制的に培養液の流れをつくり栄養素及び酸素
の供給或いは被培養細胞の産生じた生成物や老廃物を除
去する細胞培養器及び方法である。更に該多孔質膜が平
膜であっても該容器内を２つの空間に区切る様に該平膜
を固定することによって、中空糸と同様の機能をはたし
、よって上記と同様にして用いることが可能である。

次に実施例をあげてより具体的に説明する。

尚、諸物性の性質は以下の様にして求めた。

「空孔率（％）」 水銀ポロシメーターにより求めた。

「平均孔径（ルｍ）　Ｊ 水銀ポロシメーターにより求めた孔径−空孔容積積分曲
線上で、全空孔容積の１／２の空孔容積を示す孔径。

「引張破断強度（Ｋ　ｇ　ｆ　／　ｃｍ’）　、引張破
断伸度（％）」 インストロン型引張試験機にて、歪速度２００り５７分
で測定。

「結節部面積の割合（％）」 外表面（縦１６μｍ、横２４ｐｍ）の走査型電子ｗＪ微
鏡写真より結節部を切り抜き、元写真との重量比により
計算。

「ミクロフィブリルの平均長、平均太さ」走査型電子Ｗ
４微鏡像により、中空糸膜外表面部、内表面部、及び膜
厚のほぼ中央部の３箇所の切断面を１００００倍で写真
撮影し、その上で各部位の長さを５０ケ所ずつ測定し、
平均値を計算した。

（実施例１） 高密度ポリエチレン（密度０．９６８．ＭＩ値５．５、
商品名ハイゼックス２２０８Ｊ）を円形二重紡口を用い
て、紡口温度１５０℃で紡糸し、得られた中空糸を１２
０℃で２時間アニール処理した後、室温で３０％、つい
で１０５℃で３５０％熱延伸を施し中空糸状ポリエチレ
ン膜（ポリエチレン製多孔質膜）を得た。該ポリエチレ
ン製多孔質膜の内径は３２０ルｍ、膜厚は４５ｐｍ、乾
燥時の引張破断強度４８５　Ｋ　ｇ　ｆ　／　ｃゴ、引
張破断伸度３２％、結節部面積の割合２１．３％、ミク
ロフィブリルの平均長１．７ｐｍ、平均太さ０．０５１
Ｌｍであった０本ポリエチレン製多孔質欣の走査型電子
顕微鏡像を第１図に示す。第１図には、多孔質膜を形成
する結節部、ミクロフィブリル、細孔が明示されている
。

該ポリエチレン製多孔質膜をガラス製カバーグラス（２
４×３２ｍｍ）上に長辺方向に並べ、シリコン接着剤（
サイラスティック、ダウコーニング社製、米国）にて固
定した。固定したポリエチレン製多孔質膜はあらかじめ
７０％エタノール水に１時間浸して湿潤化と滅菌を行な
った後、滅菌２回蒸留水にて十分に洗浄した。該ポリエ
チレン製多孔質膜を細胞培養用ディツシュ（ファルコン
２００３、ベクトン・ディッキンソン社製、米国）内に
置き、付着性細胞であるＨｅＬａ細胞２×１０　個を添
加し、ペニシリン１００　Ｉ　Ｕ　／　ｍｌ、ストレプ
トマイシン５０体ｇ／ｍ１．カナマイシン５０　ｐ、　
ｇ　／　ｍ　ｌ、１０％ウシ胎児血清を含むイーグルＭ
ＥＭ培養液にて３７℃、５％Ｃｏ２下で２４時間培養し
た。培養後、メタノール固定、ギムザ染色して、ＷＪ微
鏡下にて観察した。本結果を細胞の初期接着性のテスト
とした。

この詩得られた顕微鏡像を第２図に示す、第２図で明ら
かなように、該ポリエチレン製多孔質膜上にＨｅＬａは
均一に広がって付着しており、細胞の初期接着性は高か
った。

（実施例２） 実施例１で得たポリエチレン製多孔質膜を用いて中空糸
法にて、細胞の培養を行った。培養に用いた回路を第３
図に示す、該ポリエチレン製多孔賀膜１５０本（図中２
）を１両端が開き、表面に２ケ所の細胞注入／取出口（
図中３）を設けたガラス管（φ８．４Ｘ　９４ｍｍ）に
、ボッティング材としてシリコンを用いて固定化し、中
空系法用細胞培養用ガラス管モジュール（以下細胞培養
器と称す、図中１）を作成した。

細胞培養器はエチレンオキサイドガス滅菌後、７０％エ
タノールにて湿潤化、滅菌２回蒸留水にて十分に洗炸後
実験に供した。別に培養清溜（リザーバー、図中４）、
及びシゴキボンプ（図中５）に装着するシゴキチューブ
（図中６）をシリコン争チューブ（図中７）にて接続し
て回路を形成し、ｌ　２１　’Ｃ！、２０分間オートク
レーブ滅菌しておき、該細胞培養器と接続した。この細
胞培養器の、ポリエチレン製多孔質膜外側にＨｅＬａを
添加して培養を行なった。最初の添加細胞数５×１０　
細胞、培養液は、ペニシリン１００　Ｉ　Ｕ／ｍｌ、ス
トレプトマイシン５０１４−ｇ／ｍｌ、カナマイシン５
０４　ｇ　／　ｍ　ｌ、１０％ウシ胎児血清を含むイー
グルＭＥＭ培養液を用いた。培養は、ＨｅＬａ添加後２
時間静置した後、流速的１ｍｌ／分で行なった。

３日間培養後、細胞培養器を壊してポリエチレン製多孔
質膜を取り出して、実施例１と同様にしてギムザ染色し
て顕微鏡下で観察した。結果を第４図に示す。第４図で
明らかなように、ポリエチレン製多孔質膜上でＨｅＬａ
は均一に広がって増殖しており、しかも個々のＨｅＬａ
の伸展性も良かった。即ち、本ポリエチレン製多孔質膜
は優れた細胞付着性、及び細胞増殖性を示した。

（実施例３） 実施例２と同様にして細胞培養器にてＨｅＬａの培養を
行なった。ＨｅＬａ添加後添加量３時間静置の後流速約
０．１５ｍ１／分、培養４日目より流速約１ｍｌ／分と
した。培養液の交換は適宜行なった。細胞の回収は、ダ
ルベツコのＰＢＳ（−）（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’５ＰＢＳ
（−））で洗浄後、トリプシン液（ダルベツコのＰＢＳ
（−）にトリプシン０．２５％、エチレンジアミン四酢
酸（ＥＤＴＡ）０．０２％を溶解した液）にて処理して
行なった。

比較例としてポリスルフォン中空糸を用いて培養を行な
った。ポリスルフォン中空系は、芳香族ポリスルフォン
（ユニオンカーバイト社ｙｐ−ｔ７００、米国）１０重
量％、ジメチルアセトアミド７０　玉Ｑ％、トリエチレ
ングリコール２０重ν％の混液を脱泡して原液とした。

該原液は円形二重紡口を用いて３．３ｍｌ／分にて３０
°Ｃのフロロカーボン液中（鉛直上方に１．５ｍ）に紡
出した。この時中空形成剤として水を３．４ｍｌ／分で
導入した。水槽を通過後、巻取速度２０ｍ／分で巻取り
、水洗して１２５℃、１時間オートクレーブ処理した。

こうして得た該ポリスルフォン中空糸は、内径３６０　
ｐｍ、膜厚８０ＪＬｍであった。該ポリスルフォン中空
糸は、該ポリエチレン製多孔質膜と同様にしてガラス管
モジュールに組こんだ（ボ゛リスルフォンモジュール）
、このポリスルフォンモジュールを比較例として、上記
と同様の手法にて培養を行なった。但し流速は予備実験
によりもとめた至適流速５ｍ　１７分にて行なった０本
細胞培養器及びポリスルフォンモジュールによるＨｅＬ
ａの増殖曲線を曲線Ａ及び白線Ｂとして第５図に示す。

生死の判定はトリパンブルーにて行なった０本細胞培養
器ではＨｅＬａは培養開始後対数的に増殖し、培養１２
２日目は生細胞数でおよそ４．４Ｘ１０　　に達したの
に対して、比較例では８　、３　Ｘ　１０’　　にすぎ
ず、本細胞培養器で明らかに高い増殖速度を示した。

（発明の効果） 本多孔質膜の網目構造は細胞の初期接着性、細胞の伸展
性及び増殖性において優れた性能を示す。更に、本多孔
質膜は高い強度を持ち、ポリスルフォン膜に比べてはる
かに実用性が高い。よって網目構造をもつ本多孔質膜か
ら成る細胞培養器、及び該細胞培養器を用いた細胞培養
方法は従来法よりはるかに優れた細胞の培養性能を示す
。

【図面の簡単な説明】

第１図はポリエチレン製多孔質膜の、ｉａ　ｍの形状を
示す走査型電子顕微鏡像である。第２図は実施例１でＨ
ｅＬａ細胞を培養した時の、生物の形態を示す顕微鏡写
真である。第３図はポリエチレン製多孔質膜を用いた中
空糸法による培養システムの実施例である。第４図は実
施例２でＨｅＬａを培養した時の、生物の形態を示す顕
微鏡写真である。第５図は実施例３でＨｅＬａを培養し
た時の増殖曲線（図中Ａ）、及び比較例の増殖曲線（図
中Ｂ）である。 １、細胞培養器　　　　　　５．シゴキボンブ２、ポリ
エチレン製多孔質膜６．シゴギチューブ３、細胞注入／
取出口　　７．シリコンチューブ４、培養液溜

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）長手方向に延びるミクロフィブリルと、スタック
   ドラメラからなる結節部とに囲まれて形成される櫛状長
   方形の櫛状均質な網目構造よりなる多孔質膜を有する細
   胞培養器。
2. （２）多孔質膜の、水銀ポロシメーターで測定される孔
   径及び空孔率がそれぞれ０．０２〜４．０μｍ及び３０
   〜９０％である特許請求の範囲第１項記載の細胞培養器
   。
3. （３）多孔質膜がポリオレフィンから成る特許請求の範
   囲第１項又は第２項記載の細胞培養器。
4. （４）長手方向に延びるミクロフィブリルと、スタック
   ドラメラからなる結節部とに囲まれて形成される櫛状長
   方形の櫛状均質な網目構造よりなる膜壁を有する多孔質
   膜を用いる細胞培養方法。
5. （５）多孔質膜で区切られた一方の空間より被培養細胞
   の栄養素及び酸素を該多孔質膜で区切られた被培養細胞
   の存在する他方の空間へ膜壁を通して供給する、あるい
   は被培養細胞の生成物ないしは老廃物を被培養細胞側空
   間より他方の空間へ膜壁を通して除去することを特徴と
   する特許請求の範囲第４項記載の細胞培養方法。
6. （６）多孔質膜の、水銀ポロシメーターで測定される孔
   径及び空孔率がそれぞれ０．０２〜４．０μｍ及び３０
   〜９０％である特許請求の範囲第４項又は第５項記載の
   細胞培養方法。
7. （７）多孔質膜がポリオレフィンから成る特許請求の範
   囲第４項乃至第６項のいずれか１つに記載の細胞培養方
   法。