JPS63158459A - Method of adjusting precision of sensitive assay - Google Patents
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Landscapes
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。(57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.
Description
【発明の詳細な説明】
ｌ豆立豆！
本発明は、種々の作用物の細胞に対する有効毒性の測定
方法であって、種々の化学的及び物理的作用物、例えば
限定はされないが化学治療薬剤及び照射のようなものに
対する細胞の感受性の組織培養試験（感受性試験）を行
うことによる方法に係わる。[Detailed description of the invention] l Mame Tate Mame! The present invention is a method for determining the effective toxicity of various agents to cells, including but not limited to the sensitivity of cells to various chemical and physical agents, such as, but not limited to, chemotherapeutic agents and radiation. Relates to methods by conducting culture tests (susceptibility tests).
従来の技術
ｍｔｓ細胞の治療薬剤に対する応答を正確に定量し得る
ということは、個体レベルにおいては、例えば特定の患
者について最も有効な治療を選択するために重要であり
、また研究レベルにおいては、例えば新規な薬剤あるい
は薬剤の組合わせを試験するのに重要である。細胞生物
学、生化学及び癌の研究を含む医学研究においては、組
織培養において細胞増殖を行うのが標準的な方法である
。癌の研究においてこのような方法で細胞増殖を行なう
１つの目的は、正常細胞に対するのと比較した腫瘍細胞
に対する種々の薬剤の毒性を試験することである。毒性
は、これ等の培養中での癌治療薬剤により腫瘍細胞の増
殖速度が鈍化させられるかあるいは該細胞が完全に破壊
されることにより明らかにされ得る。BACKGROUND OF THE INVENTION Being able to accurately quantify the response of mts cells to therapeutic agents is important at the individual level, e.g. to select the most effective treatment for a particular patient, and at the research level, e.g. Important for testing new drugs or drug combinations. In medical research, including cell biology, biochemistry and cancer research, it is standard practice to grow cells in tissue culture. One purpose of performing cell expansion in this manner in cancer research is to test the toxicity of various drugs on tumor cells compared to normal cells. Toxicity may be manifested by a slowing of the growth rate or complete destruction of tumor cells by these cancer therapeutic agents in culture.
一つのインビトロ法では、半固体アガー懸濁物系中で細
胞増殖を行う。Ｓａｌｍｏｎ等の米国特許第４４１１９
９０号は、２層ゲル系中で悪性細胞を増殖さ化剤を含む
。上部には、ゲル化可能剤を含む液体栄養培地中に入れ
た試験する腫瘍細胞が置かれている。この培地がゲル化
すると前者の層の上に第２の層を形成し、この中で細胞
は独立したコロニーあるいはクローンとして増殖し得、
各コロニーあるいはクローンは単一の母輔胞に由来する
ものである。このシステムにおいては、薬剤の毒性はコ
ロニーあるいはクローンの数の減少により観察され、こ
れは増殖の終了時に目視によりカウントすることができ
る。変形方法を含めてこのタイプのアッセイはクローン
発生法（ＣＩＯｎｏｏｅｎｉＣａｓｓａｙ）と呼ばれる
。クローン発生法はいくつかの欠点を有していることが
判明した。第１に、アッセイにおいて増殖しないかある
いは良く増殖しない細胞が多いので、通常数多くの腫瘍
細胞が必要となる。One in vitro method involves cell growth in a semi-solid agar suspension system. U.S. Patent No. 44119 to Salmon et al.
No. 90 contains an agent to grow malignant cells in a two-layer gel system. On top are placed the tumor cells to be tested in a liquid nutrient medium containing a gelling agent. When this medium gels, it forms a second layer on top of the first layer, in which cells can grow as independent colonies or clones;
Each colony or clone is derived from a single maternal follicle. In this system, drug toxicity is observed by a decrease in the number of colonies or clones, which can be counted visually at the end of growth. This type of assay, including modified methods, is called a clonogenic assay. It has been found that clonal generation methods have several drawbacks. First, a large number of tumor cells are usually required since many cells do not proliferate or do not proliferate well in the assay.
第２に、個々の細胞が塊あるいは凝集の形で互いに接触
していない腫瘍細胞の均一な懸濁物を形成するのが技術
的に困難であり、クローン発生法に使用するための均質
な懸濁物を調製できないと、アッセイにおいてエラーが
発生する可能性がある。Second, it is technically difficult to form a homogeneous suspension of tumor cells in which individual cells are not in contact with each other in clumps or clumps, making it difficult to form a homogeneous suspension for use in clonogenic methods. Failure to prepare a suspension can lead to errors in the assay.
５ａｒａ Ｒｏｃｋｗｅｌｌは、このタイプの問題を“
ＥＦＦＥＣＴＯＦ ＣＬＵＨＰＳ ＡＮＤ ＣＬＵＳＴ
ＥＲ３ＯＮ ５ＵＲＶＩＶＡＬ ＨＥＡＳＵＲＥＨＥＮ
ＴＳ ＷＩＴＨＣＬＯＮＯＧＥＮＩＣＡＳＳＡＹＳ、Ｃ
ｎｃｅｒ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。5ara Rockwell describes this type of problem as “
EFFECTOF CLUHPS AND CLUST
ER3ON 5URVIVAL HEASUREHEN
TS WITHCLONOGENICASSAYS,C
ncerRe5earch.
４５：、１６０１−１６０７．１９８５”に記載してい
る。第３に、互いに接近したコロニーは成長して重なっ
てしまうことがあり、それ等は別々に区別することがで
きないので、コロニーを実際にカウントしようとするこ
とは非常に非現実的な技術である。第４に、コロニーを
実際にカウントするのにはｆｆＨＦ！Ｉがかかり、労力
を必要とし、また機械化もしにくい。技術的な問題によ
り、クローン発生法においては患者から外科的に採取さ
れた１Ｍｇ！１９ンプルの３０〜４０％のみが増殖する
にすぎない。またクローン発生法においてはかなりの制
御し得ない技術的エラーが存在（、結果に有意なばらつ
きが生じてしまう。45:, 1601-1607.1985''. Third, colonies that are close to each other can grow and overlap, making it impossible to distinguish them separately, so it is difficult to distinguish between colonies in real life. Trying to count them is a very impractical technique.Fourth, actually counting colonies takes ffHF!I, requires labor, and is difficult to mechanize.Due to technical problems, In the clonogenic method, only 30-40% of a 1Mg!19 sample surgically taken from a patient grows.Also, there are considerable uncontrollable technical errors in the clonogenic method ( This results in significant variation in results.
このような研究に商業的可能性のないことの証拠として
、ＲＯＣｈｅが１９８４年より“Ｃｈｅｌｃｈｅｋ
ｔｍ”の商標で販売を開始したクローン発生法は、あま
りに売れず科学的な批判もあったため、１９８５年に市
場から撤退してしまったということがある。As evidence that such research has no commercial potential, ROChe has since 1984
The cloning method, which was first sold under the trademark ``TM'', did not sell well and received scientific criticism, so it was withdrawn from the market in 1985.
従来の単−腸組織培養法においては、細胞は直接例えば
プラスチックやガラスのような培養表面で増殖させられ
る。これは多くの細胞の増殖が、該培養表面に付着した
ｍ胞によってのみ起り得るからである。多くの癌患者か
ら得られた生検試料に含まれるａｇｉｉ胞についてもこ
れは言えることである。これ等のタイプの固着細胞の増
殖特性は、“固定依存″と呼ばれる。腫瘍１１１胞の“
固定依存”増殖の問題を解決することは、２０年以上前
から大きな科学的課題であった。In traditional single-gut tissue culture methods, cells are grown directly on a culture surface such as plastic or glass. This is because the proliferation of many cells can only occur by m cells attached to the culture surface. This is also true for AgII cysts contained in biopsy samples obtained from many cancer patients. The proliferative properties of these types of sessile cells are referred to as "fixation dependent." 111 tumor cells “
Solving the problem of "fixation-dependent" growth has been a major scientific challenge for more than 20 years.
ごく僅かの可能性のある例外を除いて、全ての細胞は組
織及び器官中において″゛細胞外マトリックス”と呼ば
れる物質により緊密に包囲されている。細胞外マトリッ
クスは細胞を互いに接着し、物理的支持及び固定をもた
らし、また選択的透過性障壁として働き、さらには細胞
増殖及び胚発生の間の変異を制御するものとしてｍ能し
得る。腫瘍細胞の表面への固着を促進する因子が細胞外
マトリックスから単離されており、これ等の因子のなか
には組織培養において“固定依存″腫瘍細胞の増殖をも
促進するものがある。このような因子は、例えば下記の
ような文献に記載されている。With few possible exceptions, all cells in tissues and organs are tightly surrounded by a substance called the "extracellular matrix." The extracellular matrix adheres cells to each other, provides physical support and immobilization, and can serve as a selective permeability barrier and even control mutations during cell proliferation and embryonic development. Factors that promote the attachment of tumor cells to surfaces have been isolated from the extracellular matrix, and some of these factors also promote the growth of "anchorage-dependent" tumor cells in tissue culture. Such factors are described, for example, in the following literature.
ＡＬＰＩＮ等、“Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ
ａｔｅｓ ｏｆ ｔｈｅＥｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ
Ｍａｔｒｉｘ ５ｔｒｕｃｔｕｒｅｓ、Ｉｎｔｅｒａｃ
ｔｉｏｎｓ。ALPIN, etc., “Complex Carbohydr
ates of the Extracellular
Matrix 5structures, Interac
tions.
ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｏｌｅｓ” 、Ｂｉ
ｏｃｈ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ａｃｔａ。and Biological Roles”, Bi
och, Biophys, Acta.
Ｖｏｌ、 ６９４． ｐｐ、 ３７５−４１８ （１９
８３）は、 ３９８頁第２列において、フィブロネクチ
ンがＩｆ細砲を含む特定の細胞型のプラスチック及びガ
ラス上での接着と展開の両方を促進することが知られて
いると記載している。Vol, 694. pp, 375-418 (19
83) state on page 398, column 2, that fibronectin is known to promote both adhesion and spreading of certain cell types, including If cells, on plastic and glass.
ＬＴＯＴＴＡ等、”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｔ
ｅｒａＣｔｉＯｎＳ ｏｆＴｕｍｏｒ Ｃｅ１ｌｓ
ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｂａｓｅｍｅｎｔ Ｍｅｍｂｒａｎ
ｅ”、＾ｎｎ、 Ｒｅｖ、 Ｂ１０ＣｈＱ１１．、 Ｖ
ｏｌ、 ｓｓ、 ｐｐ、１０３７−１０５７゜１９８６
は、腫瘍細胞増殖におけるラミニン、■型コラーゲン、
ヘパランスルフェートプロテオグリカン及びフィブロネ
クチンの重要性について開示している。LTOTTA etc., “Biochemical Int.
eraCtiOnS ofTumor Ce1ls
With the Basement Membrane
e”, ^nn, Rev, B10ChQ11., V
ol, ss, pp, 1037-1057゜1986
are laminin, type collagen, and type II collagen in tumor cell proliferation.
Discloses the importance of heparan sulfate proteoglycans and fibronectin.
組織培養において腫瘍細胞の増殖を促進することができ
る増殖因子が開示されてきた。それ等は例えば血清、血
漿、腫瘍細胞が増殖した組織培養培地及び血小板のよう
な種々の生物学的ソースから単離されたものである。組
織培養において特定の型の腫ｆ！細胞の増殖を促進する
ことが知られている成長因子もあるー。例えば下記のよ
うな文献に記載されている。Growth factors have been disclosed that can promote the growth of tumor cells in tissue culture. They have been isolated from a variety of biological sources, such as serum, plasma, tissue culture media in which tumor cells are grown, and platelets. Certain types of tumors in tissue culture f! There are also growth factors that are known to promote cell proliferation. For example, it is described in the following documents.
ＨＭＣＩＡＧ等、 “Ｈｏｒｍｏｎａｌ Ｒｅｑｕ
ｉｒｅａ＋ｅｎｔｓ ｏｆ ＢａｂｙＨａｌＳｔｅ
ｒに１ｄｎｅｙ Ｃｅ１ｌｓ ｉｎ Ｃｕ１ｔｕｒｅ”
、Ｃｅ１ｌｅｔｏ＋ｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ
ａｌ ＲｅｐＯｒｔＳ、 １９８０年 １月は、その
要約において、フィブロネクチンでコートした細胞培養
皿にインシュリン、トランスフェリン、フィブロブラス
ト増殖因子及び上皮漏殖囚子を添加した合成培地におけ
る新生ハムスター腎細胞の増殖を開示している。HMCIAG et al., “Hormonal Requ.
irea+ents of BabyHalSte
1dney Ce1ls in Culture”
, Ce1leto+ogy International
al RepOrtS, January 1980, in its abstract, discloses the growth of newborn hamster kidney cells in a synthetic medium supplemented with insulin, transferrin, fibroblast growth factor, and epithelial leakage prisoners in cell culture dishes coated with fibronectin. ing.
現在、最も効果的な固着因子の組合せと最良の増殖因子
の組合せを含む腫瘍細胞増殖用の最良の組成物は知られ
ていない。しかしながら、最近の幾多の進歩により固着
因子をコートした表面上で腫瘍細胞を日常的に増殖させ
ることが可能になった。市販されている例としては、Ｉ
ＢＴ、 Ｊｅｒｕｓａ ｆｅｗ。Currently, the best composition for tumor cell growth that includes the most effective combination of fixation factors and the best combination of growth factors is unknown. However, a number of recent advances have made it possible to routinely grow tumor cells on surfaces coated with fixation factors. Commercially available examples include I
BT, Jerusalem few.
ｌ５ｒａｅｌにより市販されている細胞外マトリックス
物質（ＥＣＭ） 、Ｌｉｆｅｔｒａｃ、 Ｉｒｖｉｎｅ
、 Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａより市販されている細胞固着
マトリックスでコートしたプレート（ＣＡＭ） 、Ｃｏ
ｌＣｏ１１ａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、 Ｐａ１〇八
ｌｔｏ、 Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａより市販されている被
覆プレート用のコラーゲン（Ｖｉｔｒｏｇｅｎ）等があ
る。これ等の方法により、当業者は外科的腫瘍物質から
の１瘍細胞の増殖を良好な自然の増殖により特別に被覆
された表面上で日常的に行うことができるようになった
。Extracellular matrix material (ECM) commercially available by l5rael, Lifetrac, Irvine
, Cell Adhesion Matrix Coated Plates (CAM) commercially available from California, Co
Collagen for coated plates (Vitrogen) commercially available from Co11a Corporation, Palo Alto, California, etc. These methods have enabled those skilled in the art to routinely carry out the growth of tumor cells from surgical tumor material on specially coated surfaces with good natural growth.
このようなＩ！瘍細胞の増殖における最近の多くの進歩
は、化学治療薬剤あるいは放射線照射に対する腫瘍ｍ胞
の感受性の日常的な試験を阻害している有意な技術的障
害に注目を集めさせることとなった。特にこれ等の障害
は、細胞の凝集及び集塊化による技術的問題（上記の通
り）、細胞増殖の定量における問題、腫瘍細胞増殖速度
の差異と接種物の質の種類（これ等は細胞の過剰増殖あ
るいは増殖不足を招く）の正確な制御及び最終試験結果
に及ぼされるそれ等の影響の問題、及び異なる作用物の
腫瘍細胞に対する毒性の正確な計算における問題を含む
。以下のいくつかの段落の記載は、これ等の技術的問題
の重要性についての説明に及ぶものである。I like this! Many recent advances in tumor cell proliferation have brought attention to the significant technical obstacles that impede routine testing of the sensitivity of tumor cells to chemotherapeutic agents or radiation. In particular, these obstacles include technical problems due to cell aggregation and agglomeration (as mentioned above), problems in quantifying cell proliferation, differences in tumor cell growth rates and the type of inoculum quality (these are problems in the precise control of the effects on tumor cells (leading to over- or under-proliferation) and their influence on the final test results, as well as in the accurate calculation of the toxicity of different agents to tumor cells. The following several paragraphs are intended to explain the importance of these technical issues.
細胞の凝集（即ち集塊化）及び不均一な分布は、アッセ
イ隔室を構成する種々の組織培養ウェル中で再分布する
ことによって起こり、両者はいずれも２つ以上のコロニ
ー形成母細胞を含む集団からの腫瘍細胞コロニーの発生
を生起する。これは放射線感受性試験においては、この
ようなコロニーが単一のコロニー形成単位から発生した
のに較べて２倍の照射を必要とすることになる。このよ
うな欠陥のあるデータをプロットすると照射生存曲線に
おいて本来のものではないプラトーが示されることにな
り、結果全体が歪められてしまうか、あるいはｌ１ｉｓ
が２つ以上の異なる放射線感受性タイプからなるように
見えるために結果の解析が困難になってしまう。Aggregation (i.e., clumping) and uneven distribution of cells occurs by redistribution among the various tissue culture wells that make up the assay compartment, both of which contain two or more colony-forming mother cells. This results in the development of tumor cell colonies from the population. In radiosensitivity testing, this would require twice as much irradiation as if such a colony were developed from a single colony-forming unit. Plotting such flawed data will either show an unintended plateau in the irradiation survival curve, skewing the overall results, or
The results appear to be composed of two or more different radiosensitivity types, making analysis of the results difficult.
さらに培養培地の流動性のために感受性試験に通常使用
されるアッセイ隔室の底部で細胞が不均一になるという
技術的問題もある。液体培地の高流動性のために、取扱
い中の動きや環境中の震動により組織培養ウェルの中央
部よりも辺縁部により多くのｆ４ｓ細胞が集まる可能性
がある。やはりこれも不確定要素であって現状では殆ど
のアッセイにおいてコントロールされておらず、ウェル
縁部のコロニーは正確にカウントすることが困難なので
結果に重大な影響を与え得る。There is also the technical problem of cell heterogeneity at the bottom of the assay compartment commonly used for susceptibility testing due to the fluidity of the culture medium. Due to the high fluidity of the liquid medium, movement during handling and vibrations in the environment may cause more f4s cells to collect at the edges of the tissue culture well than at the center. Again, this is an element of uncertainty that is currently uncontrolled in most assays, and colonies at the edges of wells are difficult to count accurately and can seriously affect results.
コロニーのカウントのような細胞増殖の非現実的な定量
の問題は、カウントしたコロニーの数において大幅な誤
りを出す可能性がある。試験に使用し得る腫瘍細胞の数
は通常限られているので、試験は薬剤あるいは放射線の
各治療用量につき腫瘍試料のレプリカを２つしか使用し
ないのが普通である。２つの同じものについての結果を
平均して最終なアッセイ値を得る。従って、個々の誤差
を平均することの累積効果はかなり重大なものとなり得
、実際は腫瘍がある特定の薬剤に対して感受性を有する
のに、抵抗性を有するかのごとく解されてしまうことも
あり得る。これはより定石的な方法を使用した場合に見
られる。従って、化学薬剤、放射線あるいはその他の作
用物に対する種々のＷＱの相対的感受性／抵抗性をラン
ク付けしようとするアッセイシステムはどれ“も正確で
明確なデータを必要とする。Problems with unrealistic quantification of cell proliferation, such as colony counting, can lead to significant errors in the number of colonies counted. Because the number of tumor cells available for testing is usually limited, testing typically uses only two replica tumor samples for each therapeutic dose of drug or radiation. Results for two identicals are averaged to obtain the final assay value. Therefore, the cumulative effect of averaging individual errors can be quite significant, and a tumor may be interpreted as being resistant to a particular drug when in fact it is sensitive. obtain. This can be seen when using more routine methods. Therefore, any assay system that attempts to rank the relative susceptibility/resistance of various WQs to chemical agents, radiation, or other agents requires accurate and unambiguous data.
ｌｌ１１瘍ｍ胞の増殖効率の差は、同じ組織学型の腫瘍
間でも存在するのが普通である。これが組織培養プレー
トに接種するのにとのぐらいの数のａ胞を使用すればよ
いかを予想するのを当業者にとって困難にしている原因
である。多すぎる細胞を使用すると、アッセイの終了前
に腫瘍細胞がアッセイウェルで過剰増殖してしまい、そ
の結果多くの細胞が死滅したりお互いの上で増殖するこ
とになるので増殖量を定量することができなくなる。さ
らに、腫瘍が増殖の対数期にあって盛んに増殖している
ときに癌治療薬剤の毒性効果を試験することが重要であ
る。これは細胞増殖を鈍化させるが、直接細胞を殺すこ
とはない薬剤の場合特に重要である。この場合、多すぎ
る細胞を接種して細胞培養を行うと、培養期間の終了時
にこれらのタイプの治療薬剤の増殖鈍化効果を観察する
ことができず、患者にとって可能性のあり得る効果が完
全に見過ごされてしまうことがある。また使用する細胞
が少なすぎると、やはり増殖を定量することは不可能で
ある。Differences in the growth efficiency of ll11 tumors commonly exist even between tumors of the same histological type. This is what makes it difficult for those skilled in the art to predict how many a vacuoles to use to inoculate a tissue culture plate. If too many cells are used, tumor cells will overgrow in the assay wells before the end of the assay, resulting in many cells dying or growing on top of each other, making it difficult to quantify the amount of proliferation. become unable. Additionally, it is important to test the toxic effects of cancer therapeutic agents when tumors are in the log phase of growth and actively proliferating. This is especially important for drugs that slow cell growth but do not directly kill cells. In this case, if too many cells are inoculated and the cell culture is carried out, it will not be possible to observe the growth-slowing effect of these types of therapeutic agents at the end of the culture period, and the potential benefit to the patient will be completely lost. Sometimes it gets overlooked. Also, if too few cells are used, it is still impossible to quantify proliferation.
上述の問題に加えて、ヒト腫瘍の外科的生検体から得ら
れる組織サンプルは、その組成が非常に多様であるとい
うことがある。このことから起こる１つの問題は、サン
プル中の粉砕されていない塊や組織断片が、アッセイの
定量において１ｖｉの増殖を反映するものとして誤って
判読されてしまい得ることである。このためランダムな
誤差が含まれることになり、極端な場合には判読不可能
な結果を導いてしまうことがある。In addition to the problems mentioned above, tissue samples obtained from surgical biopsies of human tumors can be highly variable in composition. One problem that arises from this is that unground clumps or tissue fragments in the sample can be misinterpreted as reflecting 1vi growth in assay quantification. As a result, random errors are included, which in extreme cases can lead to unreadable results.
上記のような技術的問題があるので、計算において適切
な定量コントロールを使用するようにすること、及び種
々の患者から得られた腫瘍サンプルの治療薬剤に対する
応答性（あるいは非応答性）の相対的程度を定倦的に比
較することができるよう１にすることのために、いかに
して最終データを計算し、表現するかが当業者にとって
非常に重要な課題となっている。Technical issues such as those mentioned above ensure that appropriate quantitative controls are used in calculations and that the relative responsiveness (or non-responsiveness) of tumor samples obtained from different patients to therapeutic agents is How to calculate and represent the final data in order to be able to compare the magnitudes constant is a very important issue for those skilled in the art.
これまで、ある個体からの細胞における１つの試験薬剤
の相対臨床能力（即ち、他の個体に対して相対的な）を
確かめることはできなかった。これは、既に述べたよう
に細胞増殖の定量に関連する大きな誤差によるものであ
る。このような誤差は、各個体間での１つの試Ｍ薬剤の
臨床能力の有意な比較を実質的に不可能にしていたもの
である。Until now, it has not been possible to ascertain the relative clinical potency of one test agent in cells from one individual (ie, relative to another individual). This is due to the large errors associated with the quantification of cell proliferation, as already mentioned. Such errors made it virtually impossible to meaningfully compare the clinical performance of a single trial M drug between individuals.
要するに、腫瘍細胞の薬剤及び物理的作用物（例えば放
射Ｉりに対する感受性を測定するためのインビトロでの
アッセイの正確さを技術的に改良するための方法を見付
けることが重要になっているものである。In summary, it has become important to find ways to technically improve the accuracy of in vitro assays for determining the susceptibility of tumor cells to drugs and physical agents (e.g. radiation). be.
従って、腫瘍細胞を組織培養プレート中に正確に分布さ
せることができるようにするために、腫瘍細胞の凝集を
簡単に防止する方法が強く求められる。また、容易に自
動化及びコンピューター解析できるような、細胞コロニ
ーの増殖を容易にカウントできるような１方法も強く求
められるであろう。さらには、異なる個体から得られた
細胞サンプルの増殖速度における個々の変化を制御する
方法もまた強く求められる。また、試験サンプル中の分
裂していないｌ１ｌＩｌ！！や組織断片の影響が、アッ
セイで得られた値においてどの程度バックグラウンドノ
イズとして含まれているかを定量し得、それを最終結果
から差引くことができるようにすることも有利であろう
。また、感受性アッセイにおいて得られたデータを正確
に取扱い、種々の薬剤及び物理的作用物の毒性を計算す
る方法が提供されることも望ましい。Therefore, there is a strong need for a method to simply prevent tumor cell aggregation so that tumor cells can be accurately distributed in tissue culture plates. There would also be a strong need for a method for easily counting the proliferation of cell colonies that could be easily automated and computer analyzed. Additionally, there is also a strong need for methods to control individual variations in proliferation rates of cell samples obtained from different individuals. Also, the unsplit l1lIl! in the test sample! ! It would also be advantageous to be able to quantify the extent to which the effects of tissue fragments and tissue fragments are included as background noise in the values obtained in the assay, and subtract this from the final result. It would also be desirable to provide a method for accurately handling data obtained in susceptibility assays and calculating the toxicity of various drugs and physical agents.
発明の要旨
本発明は、種々の作用物の細胞に対する有効毒性の測定
を同じく目的とするいくつかの方法であって、種々の化
学的及び物理的作用物、例えば限定はされないが癌化学
治療薬剤及び放射線のようなものに対する細胞の感受性
の組織培養試験を行うことによる方法を提供する。その
他の応用としては、正常細胞に対する作用物の毒性試験
に係わるものでもよく、これは例えば化学的毒物の作用
の環境安全試験、あるいは作業場所で遭遇するような作
用物の職業健東上及び安全上の試験のようなものである
。本発明は、ａ）細胞の液体懸濁物中での凝集を防止し
、細胞を均一に分布させる方法、ｂ）ｍｌ胞増加効率の
変化の制御方法、Ｃ）作用物の細胞に対する毒性を感受
性試験において測定するための光学密度法、ｄ）アッセ
イでコントロールとして使用するためのバックグラウン
ド消去法、及びｅ）処理効率を決定するための生存曲線
の計算方法を提供する。これ等の種々の方法は、組合わ
せであるいは独立して実施することができる。これ等を
組合わせれば、Ｍ瘍細胞あるいは正常細胞の種々の試験
作用物に対する感受性を試験するための、高い正確度を
もった１つのｔｉｌＩＩｌｌされたシステムとなる。従
って、試験作用物の相対臨床能力を高い信頼度をもって
決定することができる。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention describes several methods that are also directed at determining the effective toxicity of various agents to cells, including but not limited to cancer chemotherapeutic agents. and by conducting tissue culture tests for the sensitivity of cells to radiation. Other applications may involve testing the toxicity of agents on normal cells, such as environmental safety testing of the effects of chemical toxicants, or occupational health and safety testing of agents such as those encountered in the workplace. It's like a test. The present invention provides a) a method for preventing aggregation and uniformly distributing cells in a liquid suspension of cells; b) a method for controlling changes in ml follicle expansion efficiency; and C) a method for sensitizing the toxicity of agents to cells. Optical density methods for measurement in tests; d) background subtraction methods for use as controls in assays; and e) methods for calculating survival curves to determine treatment efficiency. These various methods can be performed in combination or independently. Together, they provide a highly accurate system for testing the sensitivity of tumor cells or normal cells to various test agents. Therefore, the relative clinical potency of the test agent can be determined with a high degree of confidence.
本発明は、液体培養培地の流動性による問題を取除く、
Ｕ瘍細胞の均一な懸濁を確保する方法を提供する。該方
法は、細胞を懸濁する培地に有効量の粘度調整剤を添加
することからなる。粘度調整剤はゲルあるいは架橋マト
リックスを形成するために使用されるのではなく、これ
等が生ずるのは望ましくない。The present invention eliminates problems due to the fluidity of liquid culture media,
A method is provided to ensure uniform suspension of U tumor cells. The method consists of adding an effective amount of a viscosity modifier to the medium in which the cells are suspended. Viscosity modifiers are not used to form gels or crosslinked matrices, the formation of which is undesirable.
粘度調整剤は、限定されるものではないが好ましくは、
メチルセルロース、ペクチン、植物ゴムあるいは限定は
されないがシュクロースのような化学的粘性物質である
。粘度調整剤がメチルセルロースの場合、０．６％の量
で加える。本発明によれば、細胞懸濁物は、限定はされ
ないがＤｕｌｂｅｃｃ。The viscosity modifier is preferably, but not limited to,
A chemical viscosity such as, but not limited to, methylcellulose, pectin, vegetable gum or sucrose. If the viscosity modifier is methylcellulose, add it in an amount of 0.6%. According to the present invention, the cell suspension may include, but is not limited to, Dulbec.
の改変イーグル最小必須培地のような適当な液体中に：
約２，０００−５００，０００１１胞／ｌｄヲ含む。In a suitable liquid such as modified Eagle's Minimum Essential Medium:
Contains approximately 2,000-500,00011 cells/ld.
さらに本発明は、
ａ）細胞試料、
ｂ）懸濁液体、及び
Ｃ）毛管作用により細胞が周辺部に分布することを実質
的に防止し、細胞が細胞培養表面に置かれたときにその
均一な分布を促進するのに充分な吊の粘度調整剤、
からなる、アッセイ隔室に導入する細胞懸濁物にも係わ
る。Additionally, the present invention provides a) a cell sample; b) a liquid suspension; and a viscosity modifier sufficient to promote a uniform distribution of cells into the assay compartment.
また本発明は、実質的に架橋したゲルマトリックスを形
成することなく細胞懸濁物中に有効ａの粘度調整剤を添
加することからなる、細胞懸濁物中の細胞の均一な分布
を確保する方法にも係わる。The present invention also comprises adding an effective a viscosity modifier into the cell suspension without forming a substantially cross-linked gel matrix, thereby ensuring a uniform distribution of cells in the cell suspension. It also concerns the method.
このような方法は、その後の細胞培養隔室に分散懸濁物
のアリコート部分を取る段階も含んでもよい。Such methods may also include taking an aliquot portion of the dispersed suspension into a subsequent cell culture compartment.
また本発明は、アッセイにおける腫瘍細胞増殖の速度及
び程度の差異に起因する問題を軽減する方法を提供する
ことも目的とする。これ等の差異は、増殖過剰を招き、
これは光学密度測定により細胞増殖の定量を行なう場合
に不正確な結果を導き得る。It is also an object of the present invention to provide methods that alleviate problems due to differences in the rate and extent of tumor cell proliferation in assays. These differences lead to overgrowth,
This can lead to inaccurate results when quantifying cell proliferation by optical density measurements.
上記の目的は、本発明の細胞集団の過剰増殖の存在を検
出する方法により達成される。該方法は以下の段階、
ａ）３つの培養隔室に、３種以上の異なる濃度（細胞数
／ｄ）の胛＊＊細胞を接種し、
ｂ）増殖促進培地の存在下に、所与の期間細胞試料を増
殖させ、これらのコントロール細胞試料のそれぞれの密
度を光学的に測定し、
Ｃ）Ｉｆ胞の当初試料中量も低い２つの濃度で測定した
光学密度と、それぞれの細胞濃度の間のグラフ的あるい
は数学的な関係を決定し、
ｄ）その数学的あるいはグラフ的な関係を使用して第３
の試料について外挿し、その試料について外挿された（
予想された）光学密度と実際に測定された光学密度の比
率を計算し、
ｅ）この比率に基づいて過剰増殖が起ったアッセイを拒
絶する段階からなる。The above object is achieved by the method of detecting the presence of hyperproliferation of a cell population according to the invention. The method comprises the following steps: a) inoculating three or more culture compartments with three or more different concentrations (number of cells/d) of L. C) Grow the cell samples for a period of time and optically measure the density of each of these control cell samples; d) use that mathematical or graphical relationship to determine a third
extrapolated for the sample, and extrapolated for the sample (
e) calculating the ratio between the expected) optical density and the actually measured optical density; and e) rejecting assays in which overgrowth occurred based on this ratio.
好ましい実施態様においては、３つの細胞試料のうち少
なくとも２つは第３の試料に比べて低い細胞濃度のコン
トロール試料であり、この第３の試料がアッセイのため
の試験接種に使用される細Ｗ＆濃度と実質的に同じ濃度
を有しているものである。細胞の増殖に従い、２つのよ
り低い細胞濃度について測定した光学密度の間に実質的
に直線的な関係が決定される。この直線的な関係により
数学的に外挿して第３のコントロール細胞濃度について
予想される光学密度値を推定する。予想される値と実際
に測定された値の比率を計算し、この比率が許容できな
いぐらい大きい場合にはそのアッセイを拒絶する。In a preferred embodiment, at least two of the three cell samples are control samples with lower cell concentrations compared to a third sample, and the third sample is a sample of the cells used for the test inoculation for the assay. It has substantially the same concentration as the concentration. As the cells grow, a substantially linear relationship is determined between the optical densities measured for the two lower cell concentrations. This linear relationship is mathematically extrapolated to estimate the expected optical density value for the third control cell concentration. The ratio of the expected value to the actually measured value is calculated and the assay is rejected if this ratio is unacceptably large.
最も好ましくは、細胞は癌細胞であり、該方法は、１：
２：４：８の細胞個数の比率、即ち直径１６＃ｌＩのウ
ェル当り２５０．５００．１０００．２０００個の細胞
の４つの細胞コントロール試料を接種することからなる
。Most preferably, the cell is a cancer cell and the method comprises: 1:
It consists of seeding four cell control samples at a cell number ratio of 2:4:8, ie 250.500.1000.2000 cells per well of diameter 16 #lI.
アッセイは化学的感受性アッセイあるいは放射線感受性
アッセイのいずれでもよく、あるいは正常または腫瘍細
胞に対する作用物の毒性を試験するその他のアッセイで
あってもよい。The assay may be either a chemical sensitivity assay or a radiosensitivity assay, or other assay that tests the toxicity of the agent to normal or tumor cells.
外挿した予想される光学密度値を実際に観察された値と
比較して、自動的に細胞の過剰増殖あるいは過剰増加を
検出する装置を設けるのが好ましい。このような装置は
、適当なプログラムを設定したコンピューターを光学密
度測定用装置に接続したものが好ましい。プログラムを
組込んだコンピューターは、少なくとも２つの試料で測
定された光学密度値の間の実質的に直線的な関係を決定
するものであり、より高い細胞接種濃度において予想さ
れる光学密度値を外挿して計算する手段を含むものとし
得る。このようなコンピューターシステムは、予想され
る値と実際に観察される値の間の偏差を計算する方法も
含み得、またその偏差が許容できない場合は自動的にア
ッセイを拒絶する手段をも含み得る。Preferably, a device is provided which automatically detects cell overgrowth or increase by comparing the extrapolated expected optical density values with the actually observed values. Preferably, such a device is one in which a computer with an appropriate program is connected to a device for measuring optical density. The computer is programmed to determine a substantially linear relationship between optical density values measured in at least two samples, and to exclude expected optical density values at higher cell seeding concentrations. It may include means for inserting and calculating. Such a computer system may also include a method for calculating the deviation between the expected value and the actually observed value, and may also include means for automatically rejecting the assay if the deviation is unacceptable. .
本発明はさらに、細胞コロニーを定量する方法と装置を
提供することも目的としており、これは従来のり０−ン
発生法でそうであったように非現実的なものではなく、
実際的で容易に自動化をすることもできるものである。It is a further object of the present invention to provide a method and apparatus for quantifying cell colonies, which is not impractical as was the case with conventional linear generation methods.
It is practical and can be easily automated.
上記の目的は、細胞コロニーをアルコール、ホルムアル
デヒド、あるいはその他の通常使用される組織学的固定
剤で固定し、それ等を染料（限定されるものではないが
例えばクリスタルバイオレット、あるいはＧｉｅｍｓａ
、あるいはＨａｌｙ ＧｒＵｎＷａｌｄＧｉｅｍｓａ）
で染色し、試料に光線を当て、そして試料の光学密度を
測定することからなる本発明の方法により達成される。The above purpose is to fix cell colonies in alcohol, formaldehyde, or other commonly used histological fixatives and to dye them with dyes such as, but not limited to, crystal violet or Giemsa.
, or Haly GrUnWaldGiemsa)
This is accomplished by the method of the invention, which consists of staining the sample with a light beam, exposing the sample to a light beam, and measuring the optical density of the sample.
本発明の方法によれば、コロニーは腫瘍細胞あるいは正
常細胞であり、該方法は、
ａ）直径１６ｍのウェル当り２５０〜１６，０００の細
胞を培養隔室に接種し、
ｂ）ｌ！瘍細胞を接種しないコントロールウェルでのア
ッセイも行い、
Ｃ）細胞試料を増殖促進培地の存在下に所与の期間増殖
させ、
ｄ）限定はされないが例えばアルコール、ホルムアルデ
ヒドのような適当な組織学的固定剤で細胞を固定し、次
に限定されるものではないが例えばクリスタルバイオレ
ットあるいはＨａｙ ＧｒｕｎｗａｌｄＧｉｅｍｓａの
ような染料で細胞コロニーを染色し、ｅ）染色した細胞
コロニーに光線を当て、各細胞培養中の密度を光学的に
測定することからなる。According to the method of the invention, the colonies are tumor cells or normal cells, and the method comprises: a) seeding a culture compartment with 250 to 16,000 cells per 16 m diameter well; b) l! Assays are also performed in control wells that are not seeded with tumor cells; C) the cell sample is grown for a given period of time in the presence of a growth-promoting medium; and d) an appropriate histological treatment such as, but not limited to, alcohol, formaldehyde, etc. fixing the cells with a fixative, then staining the cell colonies with a dye such as, but not limited to, crystal violet or Hay Grunwald Giemsa; e) applying a light beam to the stained cell colonies and determining the It consists of measuring the density optically.
感受性アッセイにおいては、各アッセイ隔室は、例えば
異なる用量の化学治療薬剤や異なる用量のイオン化照射
のような異なる治療条件にさらされ、作用物に対して生
き残る細胞コロニーを増殖させ、それらの増殖を固定、
染色及び光学密度の測定によって定量する。In a sensitivity assay, each assay compartment is exposed to different treatment conditions, such as different doses of chemotherapeutic agents or different doses of ionizing radiation, to grow cell colonies that survive the agent and to stimulate their growth. fixed,
Quantitated by staining and measurement of optical density.
当初試料に含まれる非増殖細胞あるいは非細胞質破片の
塊に起因し、アッセイに影響を与えるバックグラウンド
ノイズを定量し消去する方法を提供することも本発明の
目的である。該方法は、接種物に作用物を加えて***細
胞を殺し、その後この細胞の死滅した接種物をアッセイ
の培養隔室に加える。この方法により、アッセイの最後
に当初試料の全光学密度に対する影響を測定し消去する
ことができる。この作用物は、トリチウム化チミジン、
コルキシン及びマイトマイシンＣからなる化合物の群か
ら選択されるが、同様に作用し、実質的に同じ結果を達
成するその他の作用物も使用できることは極めて明らか
である。It is also an object of the present invention to provide a method for quantifying and eliminating background noise that may be due to non-proliferating cells or non-cytoplasmic debris clumps initially included in the sample and which may otherwise affect the assay. The method involves adding an agent to the inoculum to kill dividing cells, and then adding the killed inoculum of cells to the culture compartment of the assay. This method allows the influence on the total optical density of the original sample to be measured and eliminated at the end of the assay. This agent is tritiated thymidine,
Although selected from the group of compounds consisting of corxin and mitomycin C, it is quite clear that other agents which act similarly and achieve substantially the same results can also be used.
本発明は、アッセイにおける多数の変動を数学的に調整
し制御してアッセイの結果を計算する方法を提供するこ
とも目的とする。これにより、試験される特定の細胞に
対する試験中の種々の作用物の毒性を示す正確かつ詳細
で鋭敏なデータが提供される。そしてこのデータは、試
験中の作用物に対する試験される細胞の相対的な感受性
あるいは抵抗性を決定するのに用いられる。It is also an object of the present invention to provide a method for mathematically adjusting and controlling the multiple variations in an assay to calculate the results of the assay. This provides accurate, detailed, and sensitive data indicating the toxicity of the various agents under test to the specific cells being tested. This data is then used to determine the relative sensitivity or resistance of the cells being tested to the agent under test.
さらに本発明は、・アッセイの結果を分析する方法を提
供することも目的とする。この方法は、それ自体容易に
コンピューターによるデータ処理及び評価とすることが
できる。Furthermore, it is an object of the present invention to provide a method for analyzing the results of an assay. This method itself can easily be computerized data processing and evaluation.
これらの目的は他のアッセイステップ（上述）と、以下
の付加的ステップを組合せることにより達成される。即
ち、
ａ）アッセイにおける複数の細胞試料を、試験する作用
物の異なる処理量で処理するか、作用物の異なる条件で
処理し、
ｂ）光学密度測定により細胞の増殖を定量して（上述の
通り）各処理の効率を測定し、
Ｃ）過剰増殖あるいは増殖不足についての細胞増加コン
トロール（上述）を使用してアッセイの有効性を計算し
、
ｄ）バックグラウンド消去コントロール（上述）を使用
してアッセイ結果から非特異的バックグラウンドノイズ
を消去し、
ｅ）データをプロットするかあるいは数学的に表して生
存曲線の形にし、細胞増殖（光学密度測定により表され
る）と処置用量あるいは条件との相関を示し、
ｆ）ＩＩＩ胞の９０％が作用物により死滅する用量ある
いは条件（９０％細胞毒性あるいはＩＣ９０値と呼ぶ）
を数学的に決定し、
１；ｌ ） ＩＣ９０値を試用して特定の処理作用物の
相対効率を決定するステップである。These objectives are achieved by combining other assay steps (described above) and the following additional steps. a) treating multiple cell samples in the assay with different doses of the agent to be tested or different conditions of the agent; and b) quantifying cell proliferation by optical density measurements (as described above). c) calculate the efficacy of the assay using the cell proliferation controls (described above) for over- or under-proliferation; and d) use the background suppression controls (described above). eliminate non-specific background noise from the assay results; and e) plot or mathematically represent the data in the form of survival curves to compare cell proliferation (as expressed by optical density measurements) with treatment doses or conditions. f) the dose or conditions under which 90% of III cells are killed by the agent (referred to as 90% cytotoxicity or IC90 value);
1;l) and the IC90 value is used to determine the relative efficiency of a particular treatment agent.
ステップｂ）で行なう測定間の連続的なデータ曲線を作
成して上記分析方法を自動化・し、ステップＣ）〜ｇ）
の数学的作業をコンピューター化するのが最も好ましい
。処理は、同じ数の腫瘍細胞を化学治療薬剤の異なる用
量あるいは放射線の異なる用量により処理する形にし得
る。Automate the above analysis method by creating a continuous data curve between the measurements performed in step b), and step C) to g)
Most preferably, the mathematical work is computerized. Treatment can be in the form of treating the same number of tumor cells with different doses of chemotherapeutic agents or different doses of radiation.
また前記一方法は、アッセイからの少なくとも１つの数
値、即ちＩＣ９Ｇ値をノートあるいはコンピューター中
に記録し、異なる患者から得られた細胞に対する１つの
作用物の相対治療効果の間での比較、あるいは同じ細胞
に対する異なる作用物の間での比較ができるようにする
ことも含む。同じ化学治療薬剤、あるいは放射線の同じ
用量に対する、異なる患者からの腫瘍の感受性の比較を
行なうのが最も好ましい。この特に好ましい態様におけ
る方法は、１人の患者の腫瘍の増殖を鈍化させ・る・、
かあるいは消滅させることについての種々の制癌゛剤の
相対効率をランク付けすることに一致する。その他の態
様においては、種々の現存する（あるいは新しく開発さ
れた）化学治療作用物、薬剤或いは毒性物質について、
あらゆる哺乳類あるいは動物ソースからのＩ！！瘍細胞
または正常細胞を含む細胞の増殖を鈍化せしめたり、消
滅せしめたりする能力に関し統計的にランク付けするこ
とができる。Said one method also includes recording at least one value from the assay, i.e., the IC9G value, in a notebook or computer and comparing between the relative therapeutic effects of one agent on cells obtained from different patients, or the same It also includes allowing comparisons to be made between different agents on cells. Most preferably, a comparison is made of the sensitivity of tumors from different patients to the same chemotherapeutic agent or the same dose of radiation. In this particularly preferred embodiment, the method slows tumor growth in one patient.
It is consistent with ranking the relative efficiency of various anticancer agents in killing or eliminating cancer. In other embodiments, for various existing (or newly developed) chemotherapeutic agents, drugs, or toxic substances,
I from any mammalian or animal source! ! They can be statistically ranked for their ability to slow down or eliminate the proliferation of cells, including tumor cells or normal cells.
（以下余白）
好ましい イ例の 細な説
本願発明の手法は、例えば腫瘍細胞の化学薬品感受性又
は放射線感受性テストのような、細胞用化学薬品又は物
理薬品の毒性をテストするアッセイと組合わせて採用す
るのが好ましい。(Leaving space below) Preferred Examples Detailed Description The method of the present invention is employed in combination with assays for testing the toxicity of cellular chemicals or physical agents, such as chemical sensitivity or radiosensitivity testing of tumor cells. It is preferable to do so.
アッセイは、（ａ ）例えばガラス又はポリスチレンプ
ラスチックを含むプラスチックのような、組織培養室の
器壁に塗布された細胞外マトリックス物質、及び（ｂ）
インシュリン、インシュリン様増殖因子、上皮生長因子
、血小板由来生長因子、酸性又は塩基性の繊維芽細胞生
長因子を含有してなる組織培養基のような、０．１〜６
５％の血清（ウシ、ウマ、ブタ、ヒト又はその他の）及
び／又は細胞増殖を促進するその他の増殖及び栄養因子
を含有してなる細胞増殖を促進する適当な液体培地、の
使用により細胞増殖が最適化される細胞培養手法を使用
して行なわれる。細胞外マトリックス物質は増殖に「足
場依存性」を必要とする細胞の付着を促進し、液体組織
培養基と組合わせて使用されると細胞増殖が促進され、
肺癌、黒色腫、肉腫、乳癌及びその他の一次又は転移腫
瘍からの培養物を樹立することができる。The assay involves (a) extracellular matrix material applied to the walls of a tissue culture chamber, such as glass or plastic, including polystyrene plastic, and (b)
0.1-6, such as a tissue culture medium containing insulin, insulin-like growth factor, epidermal growth factor, platelet-derived growth factor, acidic or basic fibroblast growth factor.
Cell growth by the use of a suitable liquid medium that promotes cell growth, containing 5% serum (bovine, equine, porcine, human or other) and/or other growth and trophic factors that promote cell growth. is performed using optimized cell culture techniques. Extracellular matrix materials promote attachment of cells that require "anchorage dependence" for proliferation, and when used in combination with liquid tissue culture media promote cell proliferation;
Cultures can be established from lung cancer, melanoma, sarcoma, breast cancer and other primary or metastatic tumors.
細胞懸濁液は、当業者に標準的な方法により組織及び器
官サンプルから得られる。このような方法には、例えば
メスとはさみにより組織を切り刻むといったような機械
的方法、コラゲナーゼを含む酵素により組織を消化して
細胞を結合組織から遊離すること、及びサンプルを遠心
分離にかけて細胞の集合体及び不消化の組織片を除去す
ることが含まれる。Cell suspensions are obtained from tissue and organ samples by methods standard to those skilled in the art. These methods include mechanical methods such as cutting the tissue with a scalpel and scissors, digestion of the tissue with enzymes including collagenase to release cells from connective tissue, and centrifugation of the sample to aggregate cells. Includes removal of body and undigested tissue debris.
細胞が組織培養アッセイに適切に分散し均一に分布する
ことが、再現性のある結果を得るための鍵である。組織
培養室（すなわち、組織培養板の穴）のぶち又は組織培
養フラスコ若しくは平板のふちにＳＵｌが局部的に蓄積
すると細胞濃度が局部的に高いものとなる。本発明によ
る粘度調節剤の添加はその効果としてふちにおける毛管
力減少作用を有し、組織培養室における細胞の均一な分
布をもたらす。Proper dispersion and uniform distribution of cells in tissue culture assays is key to obtaining reproducible results. Local accumulation of SUI at the edges of the tissue culture chamber (ie, holes in the tissue culture plate) or at the edges of the tissue culture flask or plate results in locally high cell concentrations. The addition of the viscosity modifier according to the invention has as its effect a reduction in capillary forces at the edges, resulting in a uniform distribution of cells in the tissue culture chamber.
本発明の好ましい具体化によれば、メチルセルロースを
細胞が０．６％濃度で分散している液体培地に添加する
。メチルセルロース範囲は、０．３〜０．８％、好まし
くは０．５〜０．１％、そして最も好ましくは０．６％
である。本発明の目的上はメチルセルロースが好ましい
けれども、本発明はこの特定の粘度調節剤に限定される
わけではなく全ての調節剤に及ぶ。According to a preferred embodiment of the invention, methylcellulose is added to the liquid medium in which the cells are dispersed at a concentration of 0.6%. Methylcellulose range is 0.3-0.8%, preferably 0.5-0.1% and most preferably 0.6%
It is. Although methylcellulose is preferred for purposes of this invention, the invention is not limited to this particular viscosity modifier, but extends to all modifiers.
粘度調節剤の使用量は、使用される調節剤のタイプに依
存し、１＃Ｉｉ！当り２，０００〜ｓｏｏ、ｏｏｏ個の
細胞を含む細胞懸濁液に種々の量の調節剤を添加してみ
ることにより経験的に決定される。細胞はヒトの一次腫
瘍または正常組織から得られる細胞並びにヒト及び動物
の樹立細胞系の細胞から選ぶことができる。得られるＩ
Ｉｌ胞分数分散液覆組織培養室に加えられ、細胞は空気
中５〜１％ＣＯ□を用いる３７℃におけるインキュベー
ション中に培養室の表面に付着することができる。適当
Ｖ＃間（通常６〜２４時間）後分散培地を除去し、細胞
を０．０１Ｍ燐酸塩で緩衝した０、１４ Ｍ塩化ナトリ
ウム（ＰＢＳ）で静かに洗浄し、ついでこれを増殖培地
で置き代える。適当時間（通常５〜１３日）後生長した
細胞コロニーを固定・染色して原細胞接種材料（１ｎｏ
ｏｕｌｕｌ）の分布の均一性を視覚的に検査する。The amount of viscosity modifier used depends on the type of modifier used and is 1#Ii! It is determined empirically by adding various amounts of modulating agent to cell suspensions containing from 2,000 to soooo cells per cell. Cells can be selected from cells obtained from human primary tumors or normal tissues as well as from established human and animal cell lines. Obtained I
The Il cell fraction dispersion is added to a liquid-covered tissue culture chamber and the cells are allowed to adhere to the surface of the culture chamber during incubation at 37°C with 5-1% CO□ in air. After an appropriate V# period (usually 6-24 hours), the dispersion medium is removed and the cells are gently washed with 0.14 M sodium chloride (PBS) buffered with 0.01 M phosphate, which is then replaced with growth medium. Replace. After an appropriate period of time (usually 5 to 13 days), the grown cell colony is fixed and stained to prepare the original cell inoculum (1no.
Visually inspect the uniformity of the distribution of oulul).
本発明はまたアッセイにおけるｌ１１ｗ＆の［過増殖（
ｏｖｅｒｇｒｏｗｔｈ） Ｊの対照（Ｃｏｎｔｒｏｌｓ
）製造法と関連して使用される。対照は、毒物が最適
条件下で例えば細胞の対数増殖期中にテストされること
を確保し、またアッセイの結果が適切に解釈されること
を確保するのに極めて重要である。細胞増殖を定量する
のに自動光学濃度測定装置を使用できるアッセイにおけ
る許容（ｔｏｌｅｒａｎｃｅｓ）を定める対照法を使用
することはとりわけ重要である。The present invention also provides an assay for l11w & [hyperproliferation (
overgrowth) J Controls
) used in connection with manufacturing methods. Controls are critical to ensure that toxicants are tested under optimal conditions, eg, during the logarithmic growth phase of the cells, and to ensure that the results of the assay are interpreted appropriately. It is especially important to use control methods to define the tolerances in assays in which automated optical densitometry devices can be used to quantify cell proliferation.
要するに、アッセイは上記のように適当な粘度調節剤を
含む液体培地における分散細胞を適当な細胞外マトリッ
クス物質で被覆した組織培養室に加えることにより始ま
る。細胞を加える發は１ｄ当り２，０００〜ｓｏｏ、ｏ
ｏｏ個であって、好ましい具体化においては組織培養室
は２４穴組織培養板であり、各穴に細胞懸濁液を１ｍ宛
加える。組織培養板は空気中５〜１％Ｃｏ２を用い、３
７℃で６〜２４時間インキュベートし、これにより細胞
は穴の表面に付着できる。インキュベーションの終りに
穴をＰＢＳで静かに洗浄し、ついで新鮮組織培養増殖培
地を加える。Briefly, the assay begins by adding dispersed cells in a liquid medium containing a suitable viscosity modifier as described above to a tissue culture chamber coated with a suitable extracellular matrix material. The rate of adding cells is 2,000 to soo, o per 1 d.
In a preferred embodiment, the tissue culture chamber is a 24-well tissue culture plate, with 1 m of cell suspension added to each well. Tissue culture plates were prepared using 5-1% CO2 in air.
Incubate at 7°C for 6-24 hours, allowing cells to attach to the surface of the wells. At the end of the incubation, the wells are gently washed with PBS and then fresh tissue culture growth medium is added.
薬物又は毒物のテストには、テストすべき薬物又は毒物
を種々の用量で又は種々の処理条件（＃、’ｏｄａｌｉ
ｔｉｅｓ）とともに新鮮培地に含有せしめる。放ｌＨｍ
感受性テストには、穴中の細胞に種々の用量の放射線を
照射する。Testing of drugs or poisons involves testing the drug or poison to be tested at different doses or under different treatment conditions (#, 'odali
Ties) in fresh medium. Release lHm
For susceptibility testing, cells in the wells are exposed to various doses of radiation.
アッセイは全て第６日に培地を薬物又は毒物を含まない
新しい新鮮培地と交換し、培養物はテスト接種材料のス
ポット汚染又は［増殖なしくｎ。For all assays, on day 6, the medium was replaced with fresh medium without drug or toxin, and the cultures were tested for spot contamination of the test inoculum or [no growth].
ｇｒｏｗｔｈ） Ｊをチェックし、そして増殖中の培養
物はさらに７日間３１℃で５〜１％ＣＯ２内でインキュ
ベートする。汚染培養物は毒物、好ましくは９５％エタ
ノールを添加して「消毒」する。これにより汚染培養物
は近隣培養物に影響を与えないようになる。growth) J and the growing culture is incubated for an additional 7 days at 31 °C in 5-1% CO2. Contaminated cultures are "disinfected" by adding a poison, preferably 95% ethanol. This ensures that contaminated cultures do not affect neighboring cultures.
アッセイは細胞をエタノール（又は適当な組織学的固定
液）で固定することで終了し、クリスタルバイオレット
（又はその他の適当な染料）で染色し、光を照射して各
染色培養穴の光学濃度を測定する。The assay is completed by fixing the cells with ethanol (or a suitable histological fixative), staining with crystal violet (or other suitable dye), and illuminating the optical density of each stained culture well. Measure.
薬物又は毒物テストには、１〜４枚の多穴板に接種する
。これにより、原組織又は腫瘍サンプルから得られる細
胞の収率に依存して決まる、比較的狭い濃度範囲の２〜
６種の用量での３〜９種の薬物の二重テストが可能とな
る。アッセイで使用すべき種々の薬物の用量は、当該薬
物の既知の骨髄毒性ｍに等しい濃度としての最高濃度を
使用して、最初に決定する。用量はついで経験的に下方
調整し、当該アッセイで当該薬物について蓄積された経
験に基き「微調整」する。最終アッセイで使用されるで
あろう濃度の２０倍の濃度で０．２−のアリコート闇の
薬物用量の組をいくつも調整する。For drug or toxicological testing, inoculate 1 to 4 perforated plates. This allows for a relatively narrow concentration range of 2 to 2, depending on the yield of cells obtained from the original tissue or tumor sample.
Duplicate testing of 3 to 9 drugs at 6 doses is possible. The doses of the various drugs to be used in the assay are initially determined using the highest concentration as the concentration equivalent to the drug's known myelotoxic m. Doses are then adjusted downward empirically and "tweaked" based on experience accumulated with the drug in the assay. Prepare a number of 0.2-aliquot drug dose sets at 20 times the concentration that will be used in the final assay.
これら濃厚「貯蔵」液はついで使用するまで一７０℃で
凍結貯蔵する。These concentrated "stock" solutions are then stored frozen at -70°C until use.
薬物又は毒物感受性アッセイにおける対照には次のもの
が含まれる：
ａ）ブランク対照：細胞を接種してない被覆組織培養穴
（好ましい具体化においては通常少なくとも２個） （
培養物の光学濃度の最終測定値に対する塗布表面の寄与
に対する対照として；この対照は「マトリックス」対照
と称する。）：ｂ）バックグランド対照二本発明方法の
もう１つの主題である対照で、被覆培養穴（又は副尺）
に特別に調整した「殺菌した」 （死んだ）接種材料を
接種することを含む（培養物の光学濃度の最終測定値に
対する接種材料の寄与の変動に対する対照として）：そ
して
Ｃ）接種材料対照：少なくとも３つの対照からなるもう
１つの組で、もう１つの発明方法の主題であって、被覆
穴に３種の異なる濃度に調製した細胞を、好ましくは例
えば１：２：４：８の比の細胞数からなる接種材料を、
直径１６１１ｍの穴当り２５０．５００．１，０００及
び２，０００個の細胞を、細胞の［過増殖」を確認する
ための対照（「接種材料滴定」対照と称することができ
る）として、接種することを含む。アッセイサンプルの
１００％基準点（＃−ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｐｏｉｎｔ
）は上記の組から決定することができる。Controls in drug or toxin sensitivity assays include: a) Blank controls: coated tissue culture wells (usually at least two in preferred embodiments) that are not seeded with cells (
As a control for the contribution of the coated surface to the final measurement of optical density of the culture; this control is referred to as the "matrix" control. ): b) Background control Two controls, which are another subject of the method of the invention, cover culture wells (or vernier measures).
(as a control for variations in the contribution of the inoculum to the final measurement of optical density of the culture): and C) inoculum control: In another set of at least three controls, the subject of another inventive method, the cells prepared in the coated wells at three different concentrations, preferably in a ratio of, for example, 1:2:4:8. An inoculum consisting of a number of cells,
250.500.1,000 and 2,000 cells per 1611 m diameter hole are seeded as a control (which can be referred to as an "inoculum titration" control) to confirm "overgrowth" of cells. Including. 100% reference point of the assay sample (#-reference point
) can be determined from the above set.
上記のステップｂ）の主題であるバックグランド対照の
調製に用いられる本発明の手法は、細胞を殺して接種材
料を増殖に関して「殺菌した」ものとする薬剤に細胞懸
濁液をさらすことを含んでなる。本発明による好ましい
薬剤は、***（癌又は正常）細胞のみを絶滅し、非***
（死んだ）残骸を残し、その結果光学濃度に対するその
寄与が測定可能となるものである。そのような薬剤は、
好ましくは、トリチウム化チミジン−、コルヒチン（Ｃ
ｏｌｃｅｍｉｄｅ−ｔｍ）及びマイトマイシンＣから選
ばれる。トリチウム化チミジンの添加母は一般に１１Ｒ
１当り０．５〜５マイクロキユリー、より好ましくは１
〜５マイクロキユリーそして最も好ましくは５マイクロ
キユリーである。コルヒチンの使用量は一般に１Ｍ１当
り １〜１０埒として最も好ましくは２馬である。The method of the invention used for the preparation of the background control, which is the subject of step b) above, involves exposing the cell suspension to an agent that kills the cells and renders the inoculum "sterile" with respect to growth. It becomes. Preferred agents according to the invention are those that kill only dividing (cancer or normal) cells and leave behind non-dividing (dead) debris so that their contribution to optical density can be measured. Such drugs are
Preferably, tritiated thymidine-, colchicine (C
olcemide-tm) and mitomycin C. The additive base of tritiated thymidine is generally 11R.
0.5 to 5 microcuries per 1, more preferably 1
~5 microcuries and most preferably 5 microcuries. The amount of colchicine used is generally 1 to 10 grammes per ml, most preferably 2 grammes per ml.
放射線感受性をテストする対照は約２個の多穴板を必要
とする。アッセイは６種の放射線量で行い、副尺を各線
量で処理する。線量は０．５〜６グレイ（ＧＹ、放射線
量の１単位）である。対照は上に詳述したものと同じで
あり、培養物は同じ（第６日に上に詳述したように新鮮
培地が「与えられる。Ｊ培養は、上に詳述したと同一の
仕方での固定・染色により終了する。Controls for testing radiosensitivity require approximately 2 perforated plates. The assay is performed at six radiation doses and a vernier is treated with each dose. The dose is 0.5-6 Gy (GY, 1 unit of radiation dose). Controls were the same as detailed above and cultures were fed the same (day 6 with fresh medium as detailed above. J cultures were grown in the same manner as detailed above. Finish by fixing and staining.
本発明方法によるアッセイが終了すると、穴の光学濃度
を、個々の組織培養穴を照射し、例えばニコンマジスキ
ャン（Ｎｉｋｏｎ Ｍａｏｉｓｃａｎ ）自動像解析
器のような光学的像解析器を用いて各穴の光学濃度を測
定して確認する。極めて明らかなことであるが、治療薬
の効能を測定する目的のいかなる利用可能な代替方法、
例えば細胞コロニー計数法等、を使用することができる
。Upon completion of the assay according to the method of the present invention, the optical density of the wells is determined by illuminating the individual tissue culture wells and measuring the optical density of each well using an optical image analyzer, such as a Nikon Maoiscan automatic image analyzer. Confirm by measuring the optical density. Obviously, any available alternative methods for measuring the efficacy of therapeutic agents;
For example, a cell colony counting method can be used.
次に、「接種材料滴定」対照の低い方から２又は３個の
穴の光学濃度を、初期細胞接種材料濃度に対してプロッ
トする。この結果は理想的にはリニアプロトであって、
データは好ましくはできるだけぴったりと線形数学モデ
ルに一致していることである。しかしながら、「過増殖
」が生じたかも知れない細胞接種材料の高濃度域では光
学濃度の測定値はより低い接種材料値の線形外挿により
予測される値よりも低い値を示すことがあり、そしてこ
の場合考慮できるのは曲線の低い方の（線形）部分のみ
である。The optical density of the lowest two or three wells of the "inoculum titration" control is then plotted against the initial cell inoculum concentration. This result would ideally be a linear prototype,
The data preferably fit a linear mathematical model as closely as possible. However, at high concentrations of cell inoculum where "overgrowth" may have occurred, the measured optical density may be lower than that predicted by linear extrapolation of lower inoculum values; And in this case only the lower (linear) part of the curve can be considered.
細胞接種材料の濃度と光学濃度との間の算出された最終
の線形関係は、感受性アッセイにおける接種材料、これ
は５ｔｅｐ ｃ）の対照接種材料であるが、として用い
られる細胞接種材料に対する光学濃度の「期待」測定値
を数学的外挿によって得るのに用いられる。［プラス対
照（ＥｌｏＳｉｔｉＶｅ ０ＯｎｔＦＯＩシ畔）」の
光学濃度の「期待」値と「実測」値との比を計算する。The calculated final linear relationship between the concentration and optical density of the cell inoculum is the optical density for the cell inoculum used as the inoculum in the susceptibility assay, which is the control inoculum for 5 tep c). Used to obtain "expected" measurements by mathematical extrapolation. Calculate the ratio of the "expected" and "actual" values of the optical density of [Plus Control (EloSitiVe 0OntFOI)].
この比が容認し難いほど高い場合は、そのことは当該ア
ッセイを考慮外におく根拠となる。光学濃度の「期待」
値対「実測」値の比が容認できるものであるかどうかの
評価基準は当該アッセイが行なわれる［致死率ベース（
ｋｉｌｌｒａｔｅ ｂａｓｉｓ ） Ｊの凶数である
。理想的には、容認できるアッセイは次の場合に生起し
たといえる：ＯＤｅ １０Ｄａ ＜ １００／Ｋｒ
ここで、ＯＤｅは外挿によって得られる光学濃度値又は
「期待」値であり、ＯＯａはプラス対照の「実測」値で
あり、そしてｌ（ｒは当該アッセイにおける生残率（％
）で表わした抑制性値（ｉｎｈｉｂｉ−ｔｏｒｙ ｖ
ａｌｕｅ ）である。好ましくはこれは１０％であるが
、他の生残率（５０％）を選んでもよい。If this ratio is unacceptably high, that is grounds for excluding the assay from consideration. “Expectations” for optical density
The criteria for evaluating whether the ratio of value to "actual" value is acceptable is the basis on which the assay is performed [lethality-based (
killrate basis) J is a bad number. Ideally, an acceptable assay would have occurred if: ODe 10Da < 100/Kr where ODe is the optical density value obtained by extrapolation or the "expected" value and OOa is the positive value of the control. is the “actual” value, and l(r is the survival rate in the assay (%
) expressed as inhibitory value (inhibi-tory v
alue). Preferably this is 10%, but other survival rates (50%) may be chosen.
最後に、本発明の方法によれば、補正データは「生残曲
線」を得るためのプロット用に使用される。生残曲線に
おいては、（処理培養物で測定された光学濃度により又
は他の自明の利用可能なコロニー計数法のような方法に
より測定される）「生残」又はその逆の「致死」を、処
理として用いられた毒物の用量又は条件に対してプロッ
トする。薬剤感受性テストの好ましい具体化においては
、これには半対数プロットでテストサンプルの補正光学
濃度を当該アッセイの処理に用いられた薬物の濃度に対
してプロットすること（例えば、「生残」又は「致死」
を対数縦座標にとり、濃度を線形横座標にとる）が含ま
れる。結果は、データの線形回帰分析その他の各種の標
準曲線調整手法のいずれかにより、ある曲線に数学的に
調整することができる。データの曲線への調整はまた明
らかに自動的に例えばコンピューターにより行なうこと
もできる。（「プラス対照」の調整値の１０％である光
学濃度によって示されるがごとき）９０％の細胞が殺さ
れる（又は１０％が生残っている）薬物濃度、用量又は
条件は当該特定の細胞に対してテストされている薬物又
は毒物の１Ｑ９０値と定義する。ある増殖（即ち、生残
）値を選ぶので、そのような増殖をもたらす用量値を「
抑制性値」と定義する。抑制性値、この場合はＩＣ９０
値は、例えばコンピューターにより自動的に計算するこ
とができそして「生残曲線」は全て又は一部分及びＩＣ
９０値は将来の参照のためにコンピューターデータファ
イルまたはノートブックに保存することができる。蓄積
された経験をこれらのデータファイルに関連づけること
によって本発明は百分位数スケールで細胞のある特定の
一連の薬剤に対す相対的感受性又は抵抗性を統計的に「
ランク付けする」方法を提供する。Finally, according to the method of the invention, the corrected data is used for plotting to obtain a "survival curve". In a survival curve, "survival" or vice versa "lethal" (as measured by optical density measured on treated cultures or by other methods such as obvious colony counting methods available) Plot against the dose or condition of toxicant used as treatment. In a preferred embodiment of a drug susceptibility test, this involves plotting the corrected optical density of the test sample on a semi-log plot against the concentration of drug used to process the assay (e.g., "survival" or "lethal"
on the logarithmic ordinate and concentration on the linear abscissa). The results can be mathematically adjusted to a curve by linear regression analysis of the data or any of a variety of standard curve adjustment techniques. Adjustment of the data to the curve can obviously also be carried out automatically, for example by computer. The drug concentration, dose, or condition at which 90% of the cells are killed (or 10% survive) (as indicated by an optical density that is 10% of the "plus control" adjusted value) is specific to the particular cell in question. Defined as the 1Q90 value of a drug or poison that has been tested against. Since we choose a certain proliferation (i.e., survival) value, the dose value that results in such proliferation is
It is defined as "inhibitory value". Inhibitory value, in this case IC90
The values can be calculated automatically, for example by a computer, and the "survival curve" can be calculated in whole or in part and the IC
90 values can be saved in a computer data file or notebook for future reference. By associating accumulated experience with these data files, the present invention statistically estimates the relative susceptibility or resistance of a cell to a given set of drugs on a percentile scale.
provide a way to rank
化学療法薬感受性、放射線感受性又は毒物テストの好ま
しい具体化において、ある特定の患者の腫瘍細胞のある
特定の薬剤に対する、生残曲線（全て又は一部分）及び
ＩＣ９０値により定義される反応を、テスト薬剤に対す
るある特定の感受性又は抵抗性について観察されたテス
トサンプルのパーセントが当該薬剤の横座標に対して縦
座標としてプロットされている百分位数ヒストグラムの
類似する他の保存されている結果の反応と比較する。か
くして、あるテスト薬剤の相対的な臨床効能が確認され
る。In a preferred embodiment of chemotherapeutic drug sensitivity, radiosensitivity, or toxicology testing, the response of a given patient's tumor cells to a given drug, as defined by the survival curve (in whole or in part) and the IC90 value, is determined by the test drug. The response of similar other stored results in a percentile histogram in which the percentage of the test sample observed for a particular susceptibility or resistance to the drug is plotted as the ordinate against the abscissa of that drug. compare. Thus, the relative clinical efficacy of a given test agent is ascertained.
薬剤感受性テストの好ましい具体化においては、薬剤の
各濃度において所与のＩＣ９０値を示す患者サンプルの
パーセントを計算し、これを薬剤濃度の横座標に対して
縦座標としてプロットする。In a preferred implementation of the drug susceptibility test, the percentage of patient samples exhibiting a given IC90 value at each concentration of drug is calculated and this is plotted as the ordinate against the abscissa of drug concentration.
放射線感受性テストの具体化においては、各放射ｍｌに
おいて所与のＩＣ９０値を示す患者サンプルのパーセン
トを計算し、これをグレイ（ＧＹ）単位で示した放射線
量の横座標に対して縦座標としてプロットする。ヒスト
グラム上の特定のテスト値の位置によりテストサンプル
の当該特定の薬剤に対する相対的「反応性」又は「感受
性」が定まる。ヒストグラムからの百分位数が低い。例
えば当該薬物（又は放射線）に対してそのような低濃度
で反応する腫瘍を保持する患者が極めて少ないならば感
受性のあることがうかがわれる。In a radiosensitivity test implementation, the percentage of the patient sample exhibiting a given IC90 value for each ml of radiation is calculated and this is plotted as an ordinate against an abscissa of radiation dose in Grays (GY). do. The position of a particular test value on the histogram determines the relative "reactivity" or "susceptibility" of the test sample to that particular drug. Low percentile from histogram. For example, if very few patients have tumors that respond to the drug (or radiation) at such low concentrations, this would indicate susceptibility.
あるいはまた、放射線感受性テストには綜目のある選択
値を選ぶことができ、そしてその選択線量（典型的には
２グレイ）における増殖（即ち、生残又は致死）を「抑
制性値」として測定する。Alternatively, a selection of selected values can be selected for radiosensitivity testing, and the proliferation (i.e., survival or lethality) at that selected dose (typically 2 Gy) is measured as the "inhibitory value." do.
そのような抑制性値はついで他の人間からの細胞に対す
る抑制性値と比較することができる。Such inhibitory values can then be compared to inhibitory values for cells from other humans.
少なくとも用量のある選択値を選ぶ状況では、アッセイ
細胞サンプルを１個だけ使用することもまた可能となら
しめられ得る。このことは薬剤及び放射線のいずれのテ
ストにも可能である。そのような場合、その用量におけ
る増殖値は個人間で比較可能である。It may also be possible to use only one assay cell sample, at least in situations where certain selections of doses are chosen. This is possible for both drug and radiation tests. In such cases, proliferation values at that dose are comparable between individuals.
本発明はかくして患者の癌の処置に使うことができるで
あろう種々の薬剤及び物理的作用物の比較的な処置効能
を正確に支持する方法を与える。The present invention thus provides a method to accurately support the relative therapeutic efficacy of various drugs and physical agents that could be used to treat cancer in patients.
あるいはまた、本発明は人間及び動物組織由来の正常細
胞に対する種々の化学薬品又は物理的作用物の毒性を正
確に比較する方法を与える。下に掲げる実施例は本発明
の様々な側面を示す。Alternatively, the present invention provides a method for accurately comparing the toxicity of various chemicals or physical agents to normal cells from human and animal tissues. The examples listed below illustrate various aspects of the invention.
ＬＬＬ
この実施例は、細胞培養物の接種における粘度調節剤の
使用を示すためのものである。LLL This example is to demonstrate the use of viscosity modifiers in inoculating cell cultures.
腫瘍のバイオプシーサンプルを、癌患者から日常の診断
又は治療行為の間に得た。Tumor biopsy samples were obtained from cancer patients during routine diagnostic or therapeutic procedures.
固体腫瘍バイオプシーをメスで１ｍ１１の細片に切り刻
んだ。液体腫瘍サンプル中で凝固が起るのを防止するた
めに、ヘパリンを抗凝固剤として１０単位／ｄの濃度で
加えた。これらサンプル中の腫瘍細胞を遠心分離により
回収した。固体又は液体検体からの組織を、０．０７５
％のコラゲナーゼタイプｍ （Ｃｏｏｐｅｒ Ｂ ｉｏ
ｍｅｄｉｃａｌ 、 Ｍａｌｖｅｒｎ、 ＰＡ、 ）、
０．０５％のＤＮアーゼ（Ｓｉｇａ＋ａ、 Ｓｔ 、
Ｌｏｕｉｓ。Solid tumor biopsies were minced with a scalpel into 1 ml strips. To prevent coagulation from occurring in the liquid tumor samples, heparin was added as an anticoagulant at a concentration of 10 units/d. Tumor cells in these samples were collected by centrifugation. Tissue from solid or liquid specimens to 0.075
% of collagenase type m (Cooper Bio
medical, Malvern, PA,)
0.05% DNase (Siga+a, St,
Louis.
ＭＯ，）及び１０％のウシ胎児血清を含む組織培養培地
中に一定の攪拌下に一夜インキユベーションすることに
より分解した。MO, ) and 10% fetal bovine serum by incubation overnight with constant agitation.
一夜酵素消化した後、得られた細胞懸濁液は遠心分離に
かけて酵素溶液を除去し、細胞塊はその大きさに応じて
１〜１０ｊｄ！のリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に再懸濁し
た。少岱のアリコート（０，０５ｄ）を細胞懸濁液から
分取し、等体積のトリバンブルー染料（０，５％）を混
合し、サンプル中の腫瘍生細胞数を顕微鏡と血球計数器
計数室を用いて計測した。この過程は生細胞を視覚化す
る相グラジェント・イマジング・システムの使用により
促進された。要するに、生存の基準は次の通りである：
１、細胞がトリバンブルーで染色されない、２゜細胞の
サイズが比較的大きい（＞１５戸） 、３．細胞の核対
細胞質比が大きい、４．核内で核小体が顕著である、そ
して５３位相差検査の際、細胞は殺性（ｏｒａｎｕｌａ
ｒｉｔｙ ）を加減するものを有しない。After overnight enzymatic digestion, the resulting cell suspension is centrifuged to remove the enzyme solution, and the cell clumps are separated from 1 to 10 jd depending on their size. of phosphate buffered saline (PBS). An aliquot (0.05 d) of shodai was taken from the cell suspension, mixed with an equal volume of triban blue dye (0.5%), and the number of viable tumor cells in the sample was determined using a microscope and a hemocytometer counting chamber. It was measured using This process was facilitated by the use of a phase gradient imaging system to visualize living cells. In short, the criteria for survival are:
1. Cells are not stained with Triban blue; 2. Cell size is relatively large (>15 cells); 3. 4. The cell has a large nucleus-to-cytoplasm ratio. The nucleolus is prominent within the nucleus, and upon phase-contrast examination, the cells are
property).
拡大率ｘ４００で計測した腫瘍生細胞数を細胞濃度（細
胞数／ｍ１）の計算に使用し、当該アッセイに必要な数
の細胞（即ち、９薬物感受性アツセイには約２００，０
００個）を含むアリコートを引き扱き、所望の最終細胞
濃度（即ち、１ｄ当り細胞２，０００個）になるまで「
付着培地」で希釈した。ここに付着培地は、０．６％の
メチルセルロースを他の添加物、即ち、トランスフェリ
ン（１０１１ｇ／ｊ１１！）、ヒドロコーチシン（０，
５１Ｍｍ） 、へベス緩衝液（２，７ｍＭｍ）上皮生長
因子＜５ｎＱ ／ｄ ： Ｃｏ１１ａ−ｂｏｒａｔｉｖ
ｅ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ 、 Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、
ＭＡ、 ）、インシュリン（５ＩＩ１ｇ／ｊ！１り、抗
生物質（ペニシリン士ストレプトマイシン；１００単位
／Ｍ１）及び１０％の牛胎児血清又はブタ胎児血ＷＩ
Ｌｌ、 Ｒ，５ｃｉ−ｅｎｔｉｆｉｃ 、 Ｗｏｏｄｌ
ａｎｄ １ＣＡ、 ）に加えて含有するａｌｐｈａ Ｍ
Ｅ Ｍであった。１〆の最終細胞懸濁液を、細胞付着
マトリックス（Ｌ １ｆｅｔｒａｃ 、 Ｉ ｒＶｉｎ
ｅ／、ＣＡ、）又は細胞外マトリックス物質（１８Ｔ、
Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、 ｌ５ｒａｅｌ ）をプレコ
ートシた３４穴組織培養板（Ｃｏｓｔａｒ 、 Ｃａｍ
ｂｒｉｄｇｅ、 ＭＡ、 ）に接種するのに用いた。「
付着培地ｊ中の粘度調節剤の使用（０，６％メチルセル
ロース）は、穴底面に付着している間における細胞の凝
集を防止し、また取扱中に生ずる擾乱振動によっては容
易には妨げられない均一な細胞懸濁性を維持するのに役
立った。細胞は約２〜６時間にわたって粘性の付着培地
内に徐々に「雨のようにしみこみ」、培養表面との接触
２〜１２時間後に細胞は同表面にかたく付着し始めた。The number of live tumor cells measured at x400 magnification was used to calculate the cell concentration (cells/ml) and the number of cells required for the assay (i.e. approximately 200,0
00 cells) until the desired final cell concentration (i.e. 2,000 cells per d).
Attachment medium. Here, the attachment medium contains 0.6% methylcellulose with other additives, namely transferrin (1011 g/j11!), hydrocortiscin (0.
51Mm), Heves buffer (2,7mMm) Epidermal growth factor <5nQ/d: Co11a-borativ
e Research, Lexington,
MA, ), insulin (5II 1g/j!1), antibiotics (penicillin streptomycin; 100 units/M1) and 10% fetal bovine serum or fetal pig blood WI
Ll, R, 5ci-entific, Woodl
alpha M containing in addition to and 1CA, )
It was E.M. The final cell suspension of
e/, CA, ) or extracellular matrix material (18T,
A 34-well tissue culture plate (Costar, Cam.
bridge, MA, ). "
The use of a viscosity modifier (0.6% methylcellulose) in the attachment medium prevents agglomeration of cells while attached to the bottom of the hole and is not easily disturbed by disturbing vibrations generated during handling. Helped maintain uniform cell suspension. The cells gradually "rained" into the viscous attachment medium over a period of about 2-6 hours, and after 2-12 hours of contact with the culture surface, the cells began to firmly adhere to the same surface.
付着過程は通常２４時間で極めて充分に発現する。２４
時間侵、「付着培地」を注意深く穴から除去し、付着細
胞はＰＢＳで２〜３回静かに洗浄し、そして最後に、（
全て上記の１度の）トランスフェリン、ヒドロコーチシ
ン、へベス緩衝液、上皮成長因子、インシュリン、抗生
物質及び１０％のウシ胎児血清を添加したａｌｐｈａＭ
ＥＭに溶解又は懸濁したテスト薬物又は毒物を含む完全
組織培養培地を穴に加えた。The adhesion process usually develops very fully in 24 hours. 24
After a time lapse, the "adherent medium" was carefully removed from the wells, the adherent cells were gently washed 2-3 times with PBS, and finally (
alphaM supplemented with transferrin, hydrocortiscin, Hebbes buffer, epidermal growth factor, insulin, antibiotics, and 10% fetal bovine serum (all above)
Complete tissue culture medium containing the test drug or toxin dissolved or suspended in EM was added to the wells.
粘度調節剤の利点を「付着培地」から粘度調節剤を含有
せぬ組織培着培地より成立っていた初期の研究と比較す
ることにより見ることができた。The benefits of viscosity modifiers could be seen by comparing "attachment media" to earlier studies that consisted of tissue culture media without viscosity modifiers.
初期の研究においては、細胞が表面に付着する時間の経
過前に培養穴の周囲に迅速かつ顕著な、細胞の再分布が
見られた。取扱い中の及び組織培養インキュベーター内
の環境からの振動は細胞に特に顕著な影響を及ぼし、即
ち、細胞は培養穴のふちから振動により徐々により深く
培地に入り込んでいった。そのような問題は、電気送風
機を用いてＣｏ２雰囲気を強制空気循環するインキュベ
ーターにおいて特に顕著であった。細胞の周囲付着によ
りアッセイに持ち込まれる誤差は、穴により、培養板に
より、また組織培養インキュベーター内の位置により変
化するところが大であった。最終結果におけるこの誤差
の変動寄与は量を決めることが難かしく従って最終計算
から除去するのが困難であった。Early studies showed a rapid and significant redistribution of cells around the culture well before the cells had time to attach to the surface. Vibrations during handling and from the environment within the tissue culture incubator had a particularly pronounced effect on the cells, ie, the cells gradually penetrated deeper into the medium from the edges of the culture well due to the vibrations. Such problems were particularly pronounced in incubators that used electric blowers to force-air-circulate the Co2 atmosphere. Errors introduced into the assay by peripheral adhesion of cells varied widely by hole, culture plate, and location within the tissue culture incubator. The variable contribution of this error in the final results was difficult to quantify and therefore difficult to remove from the final calculations.
（以下余白）
尖Ｊ１九２
この実施例は、本アッセイで細胞の「過剰僧殖」を調整
するために本アッセイで使用した「接種コントロールサ
ンプル」の使用を例示するものである。(White space below) Cusp J192 This example illustrates the use of the "inoculation control sample" used in this assay to adjust for "overcrowding" of cells in this assay.
本実施例は、電離放射線に対するヒト腫瘍細胞の感受性
をテストするためのアッセイと組合せた本発明の使用と
正当性を例示する。本実施例のプロトコルは、Ｂａｋｅ
ｒら、Ｄｒｕｇ ａｎｄ ＲａｄｉａｔｉｏｎＳｅｎｓ
ｉｔｉｖｉｔｙ Ｈｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ５
ｕｃｃｅｓｓｆｕｌ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｕ１ｔｕｒｅ
ｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｔｕｌｌｌｏｒ Ｃｅ１ｌｓ、
Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、 ＶＯｌ、 ４６
． ｌ１ｌ）、 １２６３−１２７４ （１９８６）ニ
記載すレテいる。This example illustrates the use and validation of the present invention in conjunction with an assay to test the sensitivity of human tumor cells to ionizing radiation. The protocol of this example is Bake
r et al., Drug and RadiationSens
ity Heasurements of 5
successful Primary Culture
s of Human Tullor Ce1ls,
Cancer Research, VOl, 46
．． 111), 1263-1274 (1986).
細胞接種材料を上記と同様にしてヒトミ！瘍組織から調
製し、細胞をやはり上記と同様にして［付着培地」に１
６．０００コ／ｄ、８，０００コ／ｄ１４，０００：］
／ｄ、２．Ｇｏｏ：ｌ／ｄ、およヒＯ：ｌ／Ｉｌｄ！（
７）濃度で懸濁した。次にこの細ＩＩ！ １ｍを、上に
詳細に説明したようにして、細胞外マトリックス材料で
予め被覆した２４ウエルのマイクロタイタープレートの
各ウェルに入れる。上記と同様に、被覆されたウェルの
表面に細胞を接着せしめた後洗浄し、新しい培地に入れ
、１Ｂ、Ｇｏｏコ／Ｉｄのテストウェル１列と別のａ、
ｏｏｏコ／ｍｅのテストウェル１列とを、０．５〜６グ
レイ（Ｇｒａｙ）のいろいろな段階に分けられた照０４
量の電離放射線にそれぞれ゛さらした。Use the cell inoculum as above and use it as a seed! Prepared from tumor tissue, cells were added to [adhesion medium] in the same manner as above.
6,000 pieces/d, 8,000 pieces/d14,000:]
/d, 2. Goo:l/d, yohi O:l/Ild! (
7) Suspended at concentration. Next is this thin II! 1 m is placed into each well of a 24-well microtiter plate pre-coated with extracellular matrix material as detailed above. In the same manner as above, cells were allowed to adhere to the surface of the coated wells, washed, placed in fresh medium, and placed in one row of test wells in 1B, Goo/Id, and another a.
One row of ooo co/me test wells was divided into various levels of 0.5 to 6 Gray.
Each was exposed to a certain amount of ionizing radiation.
さらに５日間細胞をインキュベートし、この時点で培地
を交換する。この培養細胞をさらに６日間インキュベー
トし、この時点で固定してクリスタルバイオレットで染
色する。各ウェルの光学密度を測定して細胞の成長を定
量化する。Incubate the cells for an additional 5 days, at which point change the medium. The cultured cells are incubated for an additional 6 days, at which point they are fixed and stained with crystal violet. Quantify cell growth by measuring the optical density of each well.
光学密度を測定するのに使用する装置は任意の適当なも
のでよいが、マルチウェルプレートの個々のウェルの光
学密度を読取るように適切に改良されたコンピューター
を備えたＮ１ｋｏｎ＝Ｈａｏｉｓｃａｎ Ｉｌａｇｏ
ＡｎａｌｙＺｅｒが最も好ましい。The apparatus used to measure optical density may be any suitable device, but a N1kon=Haoiscan Ilago device equipped with a suitably modified computer to read the optical density of individual wells of a multiwell plate may be used.
AnalyZer is most preferred.
この接種材料の滴定の光学密度測定結果を第１Ａ図に示
す。本実施例においては、細胞４，０００コ／ウエルま
では接種材料中の細胞の数が増加すると光学密度が直線
的に増加した。細胞８．０００コ／ウエルまでは光学密
度が上昇し続けたが、１６．０００細胞／ウエルになる
と直線からのずれが顕著になる。本実施例では、直線か
らのずれは接種材料の細胞数が４．０００コ／ウエルと
ａ、 ｏｏｏコ／ウェルの間で起こり、１６，０００で
の「予想される」光学密度の外挿値（テストウェル中の
接種細胞数）は、細胞数が０．２，０００．４，０００
および８．０００の点で測定した光学密度の値に対して
引いた直線を外挿して決定する。本実施例の接種細胞密
度１６，０００コの点における外挿した「予想される」
値は６．０００であり、接種ＩＢＪｌａが１６．０００
の点における「予想される」値と「実際の」値の比率は
６０００／２０５０ ＝ ２．９３である。The optical density measurement results of the titration of this inoculum are shown in Figure 1A. In this example, optical density increased linearly with increasing number of cells in the inoculum up to 4,000 cells/well. The optical density continued to increase up to 8,000 cells/well, but the deviation from the straight line became noticeable at 16,000 cells/well. In this example, deviations from the straight line occur between inoculum cell counts of 4,000 cells/well and a,ooo cells/well, and the extrapolation of the "expected" optical density at 16,000 (Number of inoculated cells in test well) is 0.2,000.4,000 cells.
It is determined by extrapolating a straight line drawn to the optical density value measured at the point 8.000 and 8.000. "Expected" extrapolated at the inoculated cell density of 16,000 cells in this example
The value is 6.000 and the inoculation IBJla is 16.000
The ratio between the "expected" and "actual" values at the point is 6000/2050 = 2.93.
「予想」と「実際」の比の値が許容できなくなるレベル
を決定するために、接種細胞濃度ａ、ｏｏ。Inoculum cell concentration a,oo to determine the level at which the value of the "expected" to "actual" ratio becomes unacceptable.
コ／ウェルと１６，０００コ／ウエルの両者に対してＩ
Ｄ９０値（９０％の細胞が死ぬ放射線旦）を決定した。I for both co/well and 16,000 co/well
The D90 value (the radiation dose at which 90% of cells die) was determined.
これは、細胞を８，０００コ／ウエルかｉｅ、ｏｏｏコ
／ウェルで接種した複数のウェルを０．５〜５ＧＹの１
！聞の電離放射線にさらすことによって行なった。結果
を第１Ｂ図に示す。どららの接種濃度の値に対しても決
定されたｌ０９０値は同じであり、したがってこの場合
「予想」／「実際」の比−２，９３（上で計算した値）
は放射線感受性アッセイに対して受は入れられる比であ
る。さらに、これらの結果によって「正のコントロール
」が「過剰増殖」を示す際の培養における「予想」値に
対する外挿値の使用が正当化され、たとえば、「正のコ
ント０−ル」が「過剰増殖」を示す場合でもこの方法を
用いてデータを解釈することが可能であろう。This is done by seeding multiple wells with cells at 8,000 cells/well or ie, ooo cells/well at 0.5-5 GY.
! This was done by exposure to ionizing radiation for a period of time. The results are shown in Figure 1B. The l090 values determined for the values of the inoculum concentration of Dorara are the same, so in this case the "expected"/"actual" ratio - 2,93 (value calculated above)
is an acceptable ratio for radiosensitivity assays. Furthermore, these results justify the use of extrapolated values to the "expected" values in cultures when "positive controls" indicate "overgrowth," e.g. It would be possible to interpret the data using this method even if the cells show "proliferation."
すなわち、本実施例において、細胞１６，０００コ／ウ
エルの正のコントロールは「過剰増殖」するがこの１６
，０００細胞／ウエルの正のコントロールの「予想」値
の外挿値はｅ、ｏｏｏであった（第１Ａ図）。That is, in this example, the positive control of 16,000 cells/well resulted in "overgrowth," but this 16,000 cells/well
The extrapolation of the "expected" value for the positive control of ,000 cells/well was e,ooo (Figure 1A).
細胞の１０％だけが生存している場合（たとえばＩＤ９
０値）の光学密度は６．０００の１０％、すなわち６０
０となるであろう。生存曲線上で６００の値になった点
は３．３０ｒａｙであり、この値は、細胞を１６，００
０コではな（８，０００コ接種した非過剰増殖ウェル（
第１Ｂ図）から得られたＩＤ９０の観察値とよく一致し
°Ｃいる。このように、上記のようにＯＤ。If only 10% of the cells are alive (e.g. ID9
0 value) is 10% of 6.000, or 60
It will be 0. The point on the survival curve that reached a value of 600 was 3.30ray, which means that the cells were
Not 0 (non-overgrowth well inoculated with 8,000)
It is in good agreement with the observed value of ID90 obtained from Figure 1B). Thus, OD as above.
ＺＯＤａ比を１００７Ｋｒに見做す技術は有効である。The technique of considering the ZODa ratio as 1007Kr is effective.
１１里ユ
次の実験は、成長の光学密度測定から得られる主要なヒ
ト腫ｓｍ胞の薬剤および放射線生存曲線が上で説明した
カウント（計数） （多重度）の問題を回避することを
例示するためのものである。The following experiments illustrate that drug and radiation survival curves of primary human tumors obtained from optical density measurements of growth avoid the counting (multiplicity) problem described above. It is for.
腫瘍細胞の調製
日常の診断または治療処置の間にガン患者から生検腫瘍
組織を得た。この生検組織を研究室に運んだ。Preparation of Tumor Cells Biopsied tumor tissue was obtained from cancer patients during routine diagnostic or therapeutic procedures. The biopsy tissue was transported to the laboratory.
固形腫瘍の生検組織は細断してＩｊｌｌの細片にした。Biopsy tissue from solid tumors was minced into Ijll strips.
流体試料は１０Ｕｎｉｔ／＃ｔｅのヘパリンで抗凝固処
理をし、遠心して細胞を回収した。固体試料または流体
試料から得た組織は、１０％子ウシつ児血清を添加した
培地中で、コラゲナーゼ（０，０７５％）とＤＮａｓｅ
（０，００５％）から成る酵素混合物を用いて、常
時撹拌しながら一晩インキユベーションしてばらばらに
分解した。The fluid sample was anticoagulated with 10 units/#te of heparin, and cells were collected by centrifugation. Tissues obtained from solid or fluid samples were treated with collagenase (0,075%) and DNase in medium supplemented with 10% calf serum.
(0,005%) by incubation overnight with constant stirring.
一晩酵素で消化した後、得られた細胞懸濁液を洗浄して
酵素溶液を除く。これは、消化物を遠心した後細胞ベレ
ットをそのサイズに応じて１〜１０ｄのリン酸緩衝生理
食塩水に再度懸濁して行なう。After overnight enzyme digestion, the resulting cell suspension is washed to remove the enzyme solution. This is done by centrifuging the digest and resuspending the cell pellet in 1-10 d of phosphate buffered saline depending on its size.
この細胞懸濁液から受石の試料（０，０５ｒｄ”）を取
り、等量のトリパンブルーと混合し、腫瘍細胞計数を実
施する。A stone sample (0.05rd'') is taken from this cell suspension, mixed with an equal volume of trypan blue, and tumor cell counting is performed.
腫瘍細胞をカウントするには、生存細胞が目で見えるよ
うにできる相勾配造影システムを備えた顕微鏡と血球計
数機を用いる。目に見える腫瘍細胞の数を４００倍の倍
率で以下の基準に準じて計数する。To count tumor cells, a microscope and hemocytometer equipped with a phase gradient imaging system that allows viable cells to be visualized is used. The number of visible tumor cells is counted at 400x magnification according to the following criteria.
１、トリパンブルー染料で染色されない。1. Not stained with trypan blue dye.
２、大きいく〉１５ミクロン）。2. Larger than 15 microns).
３、核／細胞質の比率が大きい。3. Large nucleus/cytoplasm ratio.
４、核小体が目立つ。4. The nucleolus is prominent.
５、顆粒性がないかまたは中程度までである。5. No or moderate granularity.
これらの基準に合う領域を血球計数器で印を付け、その
１／９の中にある細胞の数をカウントする。Mark the area meeting these criteria with a hemocytometer and count the number of cells within 1/9 of the area.
細胞濃度を計算し、アッセイに必要な数の細胞（αＭＥ
Ｍ培地を用いる９ドラツグアツセイでは細ｍ２０Ｇ、０
００コ）を含有する試料を取る。Calculate the cell concentration and select the number of cells required for the assay (αME
In a 9-drug assay using M medium, fine m20G, 0
Take a sample containing 00 pieces).
アッセイに必要な細胞の試料を付着培地で希釈して最終
的に細胞２．０００コ／ｄの細！！濃度とする。A sample of cells required for the assay was diluted with attachment medium to a final concentration of 2,000 cells/d! ! Let it be the concentration.
付着培地は、トランスフェリン（１０４／ａｉり、ヒド
ロコルチゾン（０，５＊／ｄ） 、ＨＥＰＥＳバッファ
ー （５ｍｇ／ｍｌり 、Ｊ：皮成長因子（５ｎａ／ｄ
）、インシュリン（５４／ｄ） 、抗生物質、および１
０％子ウシつ児血清に加えて０．６％メチルセルロース
を含有するαＭＥＭで構成する。前もって細胞接着マト
リックス（ＣＡＭ）またはＥＣＭ（１８Ｔ１イスラエル
、エルサルム）をコートしたマルチウェルプレート（Ｃ
０３ｔａｒ１米国マサチューセッツ州ケンブリッジ）の
各つｌルに、付着培地に懸濁した細胞１１１１を接種す
る。The attachment medium contained transferrin (104/ai), hydrocortisone (0.5*/d), HEPES buffer (5 mg/ml), and skin growth factor (5 na/d).
), insulin (54/d), antibiotics, and 1
It consists of αMEM containing 0% calf serum plus 0.6% methylcellulose. Multiwell plates (C
Cells 1111 suspended in attachment medium are inoculated into each tube of 03tar1 (Cambridge, Mass., USA).
培養
細胞を以下のようにして、前もってＣＡＭをコートした
マルチウェルプレートに接種する。（１）各ウェルに付
き細胞が２，０００コ、１ 、０００コ、５００コ、２
５０コ、または０コ入れである接種コントロールサンプ
ル（これらは１００％生存レベルを確立するために使用
する）と、（２）各ウェルにつき２１０００コの細胞を
高用量のトリヂウム化チミジンと共にインキュベートし
た接種材Ｆｌ（これはバックグラウンドレベルを確立す
るために使用する）とから成るコントロール培養物を、
４個のウェルからなる最初の２列にセットする。プレー
トの残りのウェルには薬剤試験用の細胞を各ウェルに付
き２．０００コずつ接種する。Cultured cells are inoculated into multiwell plates previously coated with CAM as follows. (1) 2,000 cells per well, 1,000 cells, 500 cells, 2 cells per well
(2) inoculation control samples containing 50 or 0 cells (these are used to establish 100% viability levels) and (2) inoculations in which 21,000 cells per well were incubated with a high dose of tridium thymidine. A control culture consisting of material Fl (which is used to establish background levels)
Set in the first two rows of four wells. The remaining wells of the plate are inoculated with 2,000 cells per well for drug testing.
接種後標準的な条件で２４時間インキュベートして、接
種した細胞を培養器表面に固く接着させる。After inoculation, incubate for 24 hours under standard conditions to allow the inoculated cells to firmly adhere to the culture surface.
この２４時間の接着期間の後上清培地を除き、接着細胞
をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、新しい補足αＭＥＭ
培地を加える。試験対象が放射線であれば、個々のウェ
ルに照射を限定するためにシールドを用いて０．５〜６
Ｇｒａｌ／の範囲に亘ってクラス分けした用量の？ｌ
１ｉｔ１１射線をウェルに照射する。After this 24-hour adhesion period, the supernatant medium was removed, the adherent cells were washed with phosphate-buffered saline, and freshly supplemented αMEM was added.
Add medium. If the test target is radiation, use a shield to limit radiation to individual wells.
of doses divided into classes over a range of Gral/? l
Irradiate the wells with 1it11 rays.
試験対象が化学療法剤であれば、その薬剤を含有する培
地を加える。If the test subject is a chemotherapeutic agent, add media containing that agent.
薬剤の用量は４種用いる。その用量は比較的狭い範囲に
亘っており、これは通常１：２：４：６または８のスケ
ール値で記載される。基準参照濃度は単位スケール値の
濃度とする。標準的な化学療法剤を９種まで試験する。Four drug doses are used. The doses fall over a relatively narrow range, which is usually expressed on a scale of 1:2:4:6 or 8. The standard reference concentration shall be the concentration of unit scale value. Up to nine standard chemotherapeutic agents will be tested.
１種の薬剤を４つのウェルからなる各列で試験する。各
列内の４つのウェルに４種の用量を適用するが、最低の
用量（スケール値１）は頂部のウェルに、最高の用量（
スケール値６または８）は底部のウェルに用いる。One drug is tested in each row of four wells. Apply the four doses to the four wells in each column, with the lowest dose (scale value 1) in the top well and the highest dose (scale value 1) in the top well.
A scale value of 6 or 8) is used for the bottom well.
薬剤を加えた後、または放射線を照射した後、５日間イ
ンキュベートし、その後培地を新しい培地と交換して薬
剤にさらされる期間を５日に限定する。次いでさらに７
日間インキュベートした後プレートをエタノール（７０
％）で固定し、クリスタルバイオレット（０，５％）で
染色する。After addition of drug or irradiation, incubation is performed for 5 days, after which the medium is replaced with fresh medium to limit the period of drug exposure to 5 days. Then another 7
After incubation for days, the plates were soaked in ethanol (70
%) and stained with crystal violet (0.5%).
本発明の手順によると、各ウェルの全表面に亘る細胞染
色密度または光学密度はコンピューター化された影像分
析によって測定される。これによると各ウェルでの細胞
染色密度に比例する数が得られる。各供試薬剤に対する
生存率は１００％生存値と供試薬剤の各用量に対して測
定された光学密度とを用いて計算される。生存曲線は最
小二乗法によるコンピュータープログラムを用いて作成
する。これによって最もよく合った線が得られる。According to the procedure of the invention, the cell staining density or optical density over the entire surface of each well is determined by computerized image analysis. According to this, a number proportional to the cell staining density in each well is obtained. Percent survival for each test drug is calculated using the 100% survival value and the optical density measured for each dose of test drug. Survival curves are constructed using a least squares computer program. This will give you the line of best fit.
放射線の場合を第２Ａ図に、薬剤の場合を第２Ｂ図に示
す。The case of radiation is shown in FIG. 2A, and the case of medicine is shown in FIG. 2B.
生存曲線の典型的なものを第２Ａ図と第２Ｂ図に示す。Typical survival curves are shown in Figures 2A and 2B.
注目すべきことは、用ａレベルが高いときにプラトーが
ないということである。プラトー、特に放射線の生存曲
線の場合のプラトーは多重性（すなわち細胞凝集）によ
って起こるものであり、本発明の光学密度を記録する方
法においてプラトーが生じないということは、この記録
方法では以下のような多重性の問題が回避されることを
示唆している。一般に、ひとつのコロニーはひとつのコ
ロニー形成細胞から生じ、このコロニーはある程度のサ
イズまで成長し、一定堡の細胞染色密度に寄与する。し
かし、ｆ４瘍細胞は凝集して集合体を形成することか多
いので、２個以上のコロニー形成細胞の集合体からひと
つのコロニーが派生していることがある。この場合、コ
ロニー形成細胞の集合体に由来するコロニーは大きさが
大きく、細胞染色密度に比例する以上に寄与することに
なる。What is noteworthy is that there is no plateau when the a level is high. Plateaus, especially in the case of radiation survival curves, are caused by multiplicity (i.e., cell aggregation), and the fact that plateaus do not occur in the method of recording optical density of the present invention means that this recording method: This suggests that the redundancy problem can be avoided. Generally, a colony originates from a single colony-forming cell, which grows to a certain size and contributes to a certain cell density of cell staining. However, since f4 tumor cells often aggregate to form aggregates, a single colony may be derived from an aggregate of two or more colony-forming cells. In this case, colonies derived from aggregates of colony-forming cells will be large in size and will contribute more than proportionately to the cell staining density.
第３図に、この考え方と一致するコロニーサイズの異種
性を示す培養物を例示する。この図は培養期間の終りに
典型的なコロニー形成を示す染色培養物の写真である。Figure 3 illustrates a culture that exhibits heterogeneity in colony size consistent with this idea. This figure is a photograph of a stained culture showing typical colony formation at the end of the culture period.
この写真には１３個のコロニーが明らかに見える。それ
らのコロニーのうち１０個は７５〜約２５０個の範囲の
細胞からなるサイズをもっている。これらの１０個のコ
ロニーは単一のコロニー形成細胞に由来していると思わ
れる。２個の大きいコロニーは細胞３，０００個を越え
る数だけ含有しており、おそらく集合したコロニー形成
細胞に由来するのであろう。コロニーアッセイではこれ
らの大きいコロニーも申−のコロニー形成細胞に由来す
るものとして数えてしまうのに対して、本発明の手順で
はこれらの大きいコロニーは複数のコロニー形成細胞に
由来するものとして計数されるであろう。したがって、
細胞染色密度はコロニー形成細胞および多重性の数に比
例する。これはコロニーアッセイの問題であって、本発
明による成長を光学密度で測定する方法では相殺される
。Thirteen colonies are clearly visible in this photo. Ten of these colonies have sizes ranging from 75 to about 250 cells. These 10 colonies appear to be derived from a single colony forming cell. Two large colonies contained over 3,000 cells and were probably derived from aggregated colony-forming cells. Whereas the colony assay would count these large colonies as originating from the individual colony-forming cells, our procedure would count these large colonies as originating from multiple colony-forming cells. Will. therefore,
Cell staining density is proportional to the number of colony forming cells and multiplicity. This is a problem with colony assays and is offset by the optical density method of measuring growth according to the present invention.
実施例４
次の実施例は、バックグラウンド値の確立と、生存曲線
の構築におけるその使用とを例示するためのものである
。Example 4 The following example is intended to illustrate the establishment of a background value and its use in constructing survival curves.
細胞の調製 実施例３参照。Cell preparation See Example 3.
培養
子めＣＡＭかＥＣＭでコートしたマルチウェルプレート
に細胞を以下のようにして接種する。各ウェル当り細胞
２ 、 Ｇｏｏコ、 １ 、０００コ、 ５００コ、２
５０コ、および０コを入れて構成した接種滴定から成る
接種コントロールサンプルを１００％生存レベルを確立
するために使用する。Culture cells: Inoculate cells into multiwell plates coated with CAM or ECM as follows. 2 cells per well, 1,000 cells, 500 cells, 2 cells per well
An inoculum control sample consisting of an inoculum titration made up of 50 and 0 is used to establish a 100% survival level.
本発明の手順では、バックグラウンドを確立する目的で
２粗目のコントロール培養物に細胞をウェル当り２，０
００コ接種する。プレートの残りには薬剤を試験する目
的でウェル当り２，０００コの細胞を接種する。In our procedure, cells were added to a second coarse control culture at 2.0% per well to establish background.
00 vaccination. The remainder of the plate is seeded with 2,000 cells per well for drug testing purposes.
接種機標準的な条件で２４時間インキュベートして、接
種した細胞を培！器表面に固く接着させる。Inoculate the inoculated cells by incubating them for 24 hours under standard conditions! Adhere firmly to the surface of the container.
この２４Ｒ間の接着期間の後、上清培地を除き、接着ｌ
ｌｌ胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、新しい補足α
ＭＥＭ培地を加える。After this 24R adhesion period, the supernatant medium was removed and the adhesion l
Wash the ll cysts with phosphate buffered saline and add fresh supplemented α
Add MEM medium.
本発明の手順では、同様に２４時間の接着期間の後５μ
Ｃ／ｄのトリチウム化チミジンを含有する培地を２粗目
のコントロール培養物に加える。The procedure of the present invention also uses 5μ after a 24 hour adhesion period.
Add medium containing C/d of tritiated thymidine to the second coarse control culture.
薬剤または放射線のいずれの感受性を試験するかによっ
て、やはり２４時間の接着期間の後残りのウェルに薬剤
を加えるかまたは放射線を照射する。Depending on whether drug or radiation sensitivity is being tested, drug or radiation is added to the remaining wells, also after the 24 hour adhesion period.
５日間インキュベートした後、培地を新しい培地と交換
して薬剤暴露を５日に限定する。次いでさらに７日間イ
ンキュベートした後、プレートをエタノール（７０％）
で固定し、クリスタルバイオレット（０，５％）で染色
する。After 5 days of incubation, the medium is replaced with fresh medium to limit drug exposure to 5 days. After an additional 7 days of incubation, the plates were then washed with ethanol (70%).
and stain with crystal violet (0.5%).
すでに記載したのと同様にして、つンビューター化され
た影像分析によって、各ウェルの全表面に亘って合わせ
た細胞染色密度または光学密度を測定する。これによっ
て各ウェルでの細胞染色密度に比例する数が得られる。The combined cell staining density or optical density is determined over the entire surface of each well by tunable image analysis as previously described. This yields a number proportional to the density of cell staining in each well.
試験する薬剤または放射線の各用量に対して生存割合を
算出する前に、コントロール値からバックグラウンド値
を差し引いて１００％生存値を求めると共に残りの全て
の光学密度値からもバックグラウンドの値を差し引く。Before calculating percent survival for each dose of drug or radiation tested, subtract the background value from the control value to obtain a 100% survival value and subtract the background value from all remaining optical density values. .
各供試薬剤に対する生存率を、１００％生存値と供試薬
剤の各用量に対して測定された光学密度とを用いて計算
する。生存曲線は最小二乗法によるコンピュータープロ
グラムを用いて作成する。これによって最もよく合った
線が得られる。The survival rate for each test drug is calculated using the 100% survival value and the optical density measured for each dose of test drug. Survival curves are constructed using a least squares computer program. This will give you the line of best fit.
最後の点は、増殖している細胞の９０％を殺すかまたは
抑制した薬剤の濃度（ＩＣ９０）であり、これは、個々
の生存曲線の交点を決定することによって計算され、こ
の点は１０％生存として定義される点であり、９０％が
死ぬということと同じである。The last point is the concentration of drug that killed or inhibited 90% of the proliferating cells (IC90), which is calculated by determining the intersection of the individual survival curves, and this point is 10% This is the point defined as survival, which is equivalent to 90% death.
実施例５
次の実験は、多重点生存曲線の確立を例示するためと、
治療に対してさまざまな応答を示す患者における感受性
の違いをこれらの曲線がどのように反映するかを例示す
るためのものである。Example 5 The following experiment was conducted to illustrate the establishment of a multipoint survival curve and
It is intended to illustrate how these curves reflect differences in susceptibility in patients with varying responses to treatment.
細胞の調製 実施例３参照。Cell preparation See Example 3.
■
予めＣＡＭでコートしたマルチウェルプレートに細胞を
以下のようにして接種する。（１）各ウェルに付き細胞
が２．０００コ、１ 、０００コ、５００コ、２５０コ
、または０コ入れである接種コントロールサンプル（こ
れらは１００％生存レベルを確立するために使用する）
と、（２）各ウェルにつき２，０００コの細胞を高用曲
のトリチウム化チミジンと共にインキュベートした接種
材料（これはバックグラウンドレベルを確立するために
使用する）とから成るコントロール培養物を、４個のウ
ェルからなる最初の２列にセットする。プレートの残り
には薬剤試験用の細胞を各ウェルに付き２ 、０００コ
ずつ接種する。■ Inoculate cells into a multiwell plate previously coated with CAM as follows. (1) Inoculation control samples with 2,000, 1,000, 500, 250, or 0 cells per well (these are used to establish 100% survival levels)
and (2) an inoculum in which 2,000 cells per well were incubated with a high concentration of tritiated thymidine (this is used to establish background levels). the first two rows of wells. The remainder of the plate is inoculated with 2,000 cells per well for drug testing.
接種後、標準的な条件で２４時間インキュベートして、
接種した細胞を培養器表面に固く接着させる。この２４
時間の接着期間の後上清培地を除き、接＠細胞をリン酸
緩衝生理食塩水で洗浄し、新しい補足αＭＥＭ培地を加
える。試験対象が放射線であれば、個々のウェルに照射
を限定するためにシールドを用いて０．５〜６ Ｇｒａ
ｙの範囲に亘ってクラス分けした用量の電離放射線をつ
Ｉルに照射する。試験対象が化学療法剤であれば、その
薬剤を含有する培地を加える。After inoculation, incubate for 24 hours under standard conditions.
Allow the inoculated cells to adhere firmly to the culture vessel surface. This 24
After an hour adhesion period, remove the supernatant medium, wash the attached cells with phosphate-buffered saline, and add fresh supplemented αMEM medium. If the test target is radiation, use a shield to limit radiation to individual wells.
The tree is irradiated with doses of ionizing radiation classified over a range of y. If the test subject is a chemotherapeutic agent, add media containing that agent.
本発明の方法では、薬剤の用量は４種用いる。In the method of the invention, four doses of drug are used.
その用量は比較的狭い範囲に亘っており、これは通常１
：２：４：６のスケール値で記載される。基準参照ｉｕ
ｔは単位スケール値とする。このスケール範囲は概ね直
線の生存曲線を示す試験対象について用いる。肩付きの
生存曲線を示す対象に対してはスケール範囲は３：４：
５：６であろう。標準的な化学療法剤を９種まで試験す
る。本発明の好ましい具体例においては、１種の薬剤を
４つのウェルからなる各列で試験する。各列内の４つの
ウェルに４種の用量を適用するが、最低の用量（スケー
ル値１）は頂部のウェルに、最高の用量（スケール値６
）は底部のウェルに用いる。Its dosage spans a relatively narrow range, which is usually 1
:2:4:6 scale values. Standard reference iu
Let t be a unit scale value. This scale range is used for test subjects that exhibit approximately linear survival curves. For subjects exhibiting shouldered survival curves, the scale range is 3:4:
It would be 5:6. Up to nine standard chemotherapeutic agents will be tested. In a preferred embodiment of the invention, one drug is tested in each row of four wells. Apply the four doses to the four wells in each column, with the lowest dose (scale value 1) in the top well and the highest dose (scale value 6) in the top well.
) is used for the bottom well.
薬剤を加えた後、または放射線を照射した後、 □
５日間インキュベートし、その後培地を新しい培地と交
換して薬剤にさらされる期間を５日に限定する。次いで
さらに７日間インキュベートした後プレートをエタノー
ル（７０％）で固定し、クリスタルバイオレット（０，
５％）で染色する。After adding drugs or administering radiation, □
Incubate for 5 days, then replace the medium with fresh medium to limit drug exposure to 5 days. After further incubation for 7 days, the plates were then fixed with ethanol (70%) and crystal violet (0,
5%).
コンピューター化された影像分析によって各ウェルの全
表面に亘って合計された細胞染色密度または光学密度を
測定する。これによると各ウェルでの細胞染色密度に比
例する数が得られる。各供試薬剤に対する生存率は、１
００％生存値と供試薬剤の各用量に対して測定された光
学密度とを用いて計算する。生存曲線は最小二乗法によ
るコンピュータープログラムを用いて作成する。これに
よって第４図に示したような最もよく合った線が得られ
る。The total cell staining density or optical density is determined over the entire surface of each well by computerized image analysis. According to this, a number proportional to the cell staining density in each well is obtained. The survival rate for each test drug was 1
Calculated using the 00% survival value and the optical density measured for each dose of drug tested. Survival curves are constructed using a least squares computer program. This results in a line of best fit as shown in FIG.
最後の点は、増殖している細胞の９０％を殺すかまたは
抑制した薬剤の濃度（ＩＣ９０）であり、これは、個々
の生存曲線の交点を決定することによって計算され、こ
の点は１０％生存として定義される点であり、９０％が
死ぬということと同じである。The last point is the concentration of drug that killed or inhibited 90% of the proliferating cells (IC90), which is calculated by determining the intersection of the individual survival curves, and this point is 10% This is the point defined as survival, which is equivalent to 90% death.
これらの用量は第１図に見ることができる。すなわち、
生存曲線が水平の１０％生存線と交わる点である。ＩＣ
９Ｇスケール値はアッセイで使用した実際の薬剤濃度に
変換される。それには、ＩＣ９０スケール値にｃｉｓｐ
ｌａｔｉｎの場合０．０７５ｕＪ／ｄの値である基準濃
度を掛ければよい。しかし、このアッセイでは、実際に
投与すべき用量に関するデータは何も得られない。These doses can be seen in FIG. That is,
This is the point where the survival curve intersects the horizontal 10% survival line. IC
The 9G scale value is converted to the actual drug concentration used in the assay. To do this, cisp is added to the IC90 scale value.
In the case of latin, it is sufficient to multiply by the standard concentration, which is a value of 0.075 uJ/d. However, this assay does not provide any data regarding the actual dose to be administered.
第４図に示した例は、感受性の異なる３人の患者に対す
るｃｉｓｐｌａｔｉｎに関する典型的な生存曲線である
。図中の左の曲線は最も小さいＩＣ９０をもっており、
この３つの中で最も感受性が高い。右にある曲線はＩＣ
９０が最も大きく、この３つの中では感受性が最も低く
、中央の曲線は中間の感受性である。The example shown in Figure 4 is a typical survival curve for cisplatin for three patients with different susceptibilities. The left curve in the figure has the smallest IC90,
It is the most sensitive of these three. The curve on the right is IC
90 is the largest and the least sensitive of the three, with the middle curve having intermediate sensitivity.
ＩＣ９０ｉｆｉに対するこのタイプの解析を、各種の組
織構造をもつ百以上のいろいろな主要ヒト腫瘍に関する
ほとんどの普遍的な化学療法剤に対して繰返して行なっ
た。こうして蓄積されたＩＣ９０ｉ１はＣ１５ｐｌａｔ
ｉｎについて第５図に示したように平均のまわりに正規
分布を示している。This type of analysis for IC90ifi was repeated for most common chemotherapeutic agents on over a hundred different major human tumors with various histologies. The IC90i1 accumulated in this way is C15plat.
As shown in FIG. 5 for in, a normal distribution is shown around the mean.
たとえば、個々の患者の腫瘍のＣ１５ｐｌａｔｉｎに対
する感受性は、個々のＩＣ９０値と第５図に示したＩＣ
９０値の分布とを比較することによって決定される。こ
の場合、特定のＩＣ９０は分布の感受性の端に近いので
最も小さいＩＣ９０がこの薬剤に対して感受性であると
考えられる。For example, the sensitivity of an individual patient's tumor to C15platin is determined by the individual IC90 value and the IC shown in Figure 5.
90 value distribution. In this case, the lowest IC90 would be considered sensitive to this drug since the particular IC90 is near the sensitive end of the distribution.
まとめ
主要ヒト腫瘍細胞を薬剤ＩＣ９０値についてアッセイす
る際に上述の改良点を全て適用した結果、主要ヒトｆ！
瘍細胞の同じ試料に対して５回アッセイをして決定した
変動係数（標準偏差で平均を割った値）は３．９５％で
あった。寒天懸濁アッセイシステムは再現性が非常に悪
いことはよく知られており、それは２０％を越えるよう
なものであるが、本発明のアッセイシステムの優れた再
現性は本出願中で議論した本発明の新規で優れた改良を
組合ゼて適用した結果であると考えられる。Summary Application of all the improvements described above in assaying primary human tumor cells for drug IC90 values resulted in primary human f!
The coefficient of variation (average divided by standard deviation) determined from five assays on the same sample of tumor cells was 3.95%. It is well known that the agar suspension assay system has very poor reproducibility, which is more than 20%, but the excellent reproducibility of the assay system of the present invention is demonstrated in the book discussed in this application. This is believed to be the result of combining and applying new and superior improvements in the invention.
さらに、以上の記載は本発明の好ましい態様に関するも
のであり、本発明の思想と範囲を外れることなくさまざ
まな変更や修正が可能であることは当業者には理解でき
るであろう。Further, the above description relates to preferred embodiments of the present invention, and those skilled in the art will understand that various changes and modifications can be made without departing from the spirit and scope of the present invention.
第１Ａ図は、一連の［接種コントロールサンプル］につ
いて、相対的初期１１１ＪＩｌ数に対して光学密度をプ
ロットした図であり（実施例２参照）、第１８図は、Ｇ
ｒａｙ単位の放射線用量に対して光学密度（対数目盛り
）をプロットした図であり（実施例２参照）、
第２Ａ図は、いろいろな細胞タイプの生存割合対Ｇｒａ
ｙ （ＧＶ）単位の放１）１線用吊の関係を示す図であ
り（実施例３参照）、
第２Ｂ図は、細胞の生存割合対いろいろな用量の各種細
胞毒性薬剤の関係を示す図であり（実施例３参照）、
第３図は、染色された培養細胞の写真であり（実施例３
参照）、
第４図は、３体の異なる個体から得た腫瘍細胞に対する
生存曲線（％生存対薬剤濃度）を示す図であり（実施例
５参照）、
第５図は、腫瘍細胞がｌ１ｌＩｌｌ毒性薬剤の各濃度で
ＩＣ９０値をもつ大集団における個体の数を示すグラフ
である。
代理人弁理士 ｆ４ａ 山 武
図面の浄、）（内）ンに変更なし）
手続補正書団式）
昭和６３年１月１８８
１、事件の表示 昭和６２年特願第２２１７８９号
２、発明の名称 感受性アッセイの精度を調整する
方法３、補正をする者
事件との関係 特許出願人
名 称 ライフトレイク
４、代 理 人 東京都新宿区新宿１丁目１番１４
号 山田ピル５、補正指令の日付 昭和６２年１１月４
日６、補正の対象 願出中、出願人の代表者の欄、
明［ｌ素中、図面の簡単な説明の欄、図面、委任状及び
法人７、補正の内容
（１）明ｔＩＡｓ中、第７９頁第５行目の［染色された
培養細胞の写真であり］を、［染色された培養細胞生物
の形態を示す図面に代る写真であり］と補正する。
■ 上分に濃厚な黒色で鮮明に描いた適正な図面を別紙
の通り補正するＳ （内容に変更なし）
■ 出願人の代表者を記載した適正な願出、委任状及び
法人格証明書については本願に関する昭和６２年１１月
１３日付提出の手続補正Ｉ！（自発）にて提出致しまし
た。Figure 1A is a plot of optical density against relative initial 111 JIl counts for a series of [inoculation control samples] (see Example 2);
FIG. 2A is a plot of optical density (logarithmic scale) against radiation dose in rays (see Example 2); FIG.
Figure 2B is a diagram showing the relationship between cell survival rate and various doses of various cytotoxic drugs. (See Example 3), and FIG. 3 is a photograph of stained cultured cells (Example 3).
Figure 4 shows survival curves (% survival vs. drug concentration) for tumor cells obtained from three different individuals (see Example 5); Figure 5 shows that tumor cells are Figure 2 is a graph showing the number of individuals in a large population with IC90 values at each concentration of drug. Representative Patent Attorney f4a Takeshi Yama no change in drawings, ) (in) No change) Procedural amendment form) January 1988 188 1. Indication of the case 1988 Patent Application No. 221789 2. Title of the invention Method for adjusting the accuracy of a sensitivity assay 3, relationship with the amendment person case Patent applicant name: Lifetrake 4, agent: 1-14 Shinjuku, Shinjuku-ku, Tokyo
No. Yamada Pill 5, date of amendment order November 4, 1986
Day 6, Subject of amendment: During application, column for applicant's representative,
[Photograph of stained cultured cells, page 79, line 5, in the light [l] column for a brief explanation of the drawings, drawings, power of attorney, and corporation 7, contents of amendments (1) ] is corrected to [This is a photograph in place of a drawing showing the morphology of a stained cultured cell organism.] ■ Correct the appropriate drawing clearly drawn in deep black on the upper part as shown in the attached sheet S (no changes to the content) ■ Appropriate application stating the representative of the applicant, power of attorney, and certificate of corporate personality should be submitted in this application. Procedural amendment I submitted on November 13, 1986 regarding! (Voluntary submission)
Claims (9)
臨床効力を決定する方法であって、 前記個体由来の複数個のアッセイ細胞サンプルをさまざ
まな用量の前記因子で処理してその細胞サンプルの成長
を測定し、この用量と成長のどちらか一方の予め選定さ
れた値に対応する他方の値として抑制値を計算し、次い
で、この抑制値を、複数の別の個体に由来する細胞に対
する抑制値と比較して、このテスト因子の相対的臨床効
力を確認することからなる方法。(1) A method for determining the relative clinical efficacy of a test agent on cells derived from an individual, the method comprising: treating a plurality of assay cell samples from the individual with varying doses of the agent to grow the cell samples; , calculate the inhibition value as the other value corresponding to a preselected value of either dose or growth, and then use this inhibition value as the inhibition value for cells derived from multiple different individuals. The method consists of ascertaining the relative clinical efficacy of this test factor in comparison with.
し、次にそれらの光学密度を測定して、各サンプル中で
前記処理後に生存する細胞の成長の尺度を得ることによ
り、前記細胞サンプルの成長を測定することを特徴とす
る特許請求の範囲第１項に記載の方法。(2) culturing said cell samples after exposure to said factor and then measuring their optical density to obtain a measure of the growth of cells surviving after said treatment in each sample; 2. A method according to claim 1, characterized in that growth is measured.
プルを毒性物質で処理して***している細胞だけを殺し
、これを前記のアッセイサンプルと同様な方法で培養し
、その後その光学密度を測定して得られた値を、前記ア
ッセイ細胞サンプルに対して測定された光学密度から差
引いて、前記アッセイ細胞サンプルに対する補正された
光学密度を得ることを含む、特許請求の範囲第２項に記
載の方法。(3) Furthermore, the background control cell sample was treated with a toxic substance to kill only the dividing cells, cultured in the same manner as the assay sample described above, and then the optical density was measured. 3. The method of claim 2, comprising subtracting the measured value from the optical density measured for the assay cell sample to obtain a corrected optical density for the assay cell sample.
個の接種コントロールサンプルを前記アッセイサンプル
と同様に培養した後、この接種コントロールサンプルの
光学密度を測定し、これらの接種コントロールサンプル
に対して測定された光学密度と初期細胞カウントとの最
良の直線関係に基づいて、前記アッセイに用いたのと同
じ初期細胞カウントをもつ特定の接種コントロールサン
プルに対して予測される光学密度を計算し、この特定の
接種コントロールサンプルに対して計算された光学密度
と測定された光学密度の比が、培養されたアッセイ細胞
サンプル中の細胞の過剰増殖を示す値を越えている場合
にはそのアッセイ結果を捨てることを含む、特許請求の
範囲第２項に記載の方法。(4) Furthermore, after culturing a plurality of inoculation control samples each having a different initial cell count in the same manner as the assay sample, the optical density of this inoculation control sample was measured, and the optical density was measured for these inoculation control samples. Based on the best linear relationship between optical density and initial cell count, calculate the expected optical density for a particular inoculum control sample with the same initial cell count as used in the assay, and calculate the expected optical density for this particular inoculum. including discarding the assay result if the ratio of the optical density calculated to the measured optical density for the control sample exceeds a value indicative of hyperproliferation of cells in the cultured assay cell sample; , the method according to claim 2.
入れることと、前記方法がさらに、各細胞サンプル中に
粘度調節剤を混入してその中での細胞凝集および再分配
を阻止することを含む、特許請求の範囲第１項に記載の
方法。(5) placing each cell sample in a separate chamber; the method further comprising incorporating a viscosity modifier into each cell sample to inhibit cell aggregation and redistribution therein; A method according to claim 1.
請求の範囲第１項に記載の方法。(6) The method according to claim 1, wherein the cells are tumor cells.
請求の範囲第４項に記載の方法。(7) The method according to claim 4, wherein the cells are tumor cells.
択されることを特徴とする特許請求の範囲第６項に記載
の方法。(8) A method according to claim 6, characterized in that the test agent is selected from chemotherapeutic agents and radiation.
トロールサンプルの細胞カウントがこれらコントロール
サンプルの中で最も高いことと、特定の接種コントロー
ルサンプルに対して計算された光学密度と測定された光
学密度の比が、テスト因子にさらした後のこれら細胞の
選定された生存比の逆数を越えている場合には、これら
のアッセイ細胞サンプルに対して得られた光学密度測定
値を捨てることとを特徴とする特許請求の範囲第４項に
記載の方法。(9) that the test agent is a cytotoxic drug and that the cell count of the particular inoculation control sample is the highest among these control samples, and that the calculated optical density and measured optical density for the particular inoculation control sample are Optical density measurements obtained for these assay cell samples should be discarded if the ratio of densities exceeds the reciprocal of the selected survival ratio of these cells after exposure to the test agent. A method according to claim 4, characterized in:
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US90370986A | 1986-09-05 | 1986-09-05 | |
| US903,713 | 1986-09-05 | ||
| US903,712 | 1986-09-05 | ||
| US903,717 | 1986-09-05 | ||
| US903,709 | 1986-09-05 | ||
| US903,724 | 1986-09-05 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63158459A true JPS63158459A (en) | 1988-07-01 |
Family
ID=25417963
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62221789A Pending JPS63158459A (en) | 1986-09-05 | 1987-09-04 | Method of adjusting precision of sensitive assay |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS63158459A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20200002662A1 (en) * | 2016-02-18 | 2020-01-02 | University Health Network | Device, system and process for robotic radiobiology |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JPS5428891A (en) * | 1977-08-08 | 1979-03-03 | Olympus Optical Co | Growth detecting apparatus in automatic cell culturing apparatus |
| JPS5719646A (en) * | 1980-07-09 | 1982-02-01 | Olympus Optical Co Ltd | Calibration method for electrolyte measurement in automatic biochemical analyzer with builtin type flame light photometer |
| JPS59182347A (en) * | 1983-03-31 | 1984-10-17 | Shimadzu Corp | Automatic analytical instrument |
| JPS6073465A (en) * | 1983-09-30 | 1985-04-25 | Shimadzu Corp | Automatic analysis device |
| JPS60159630A (en) * | 1984-01-31 | 1985-08-21 | Hisashi Tokita | Kit for testing sensitivity to anticancerous agent |
| JPS6170972A (en) * | 1984-06-21 | 1986-04-11 | ブラウン・ユニバ−シテイ・リサ−チ・フアウンデイシヨン・インコ−ポレイテツド | Cell culture method and apparatus |
-
1987
- 1987-09-04 JP JP62221789A patent/JPS63158459A/en active Pending
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