JPS63109772A - 植物細胞等の培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、植物の細胞や組織を大量に効率よく培養する
方法に関する。

（従来の技術） 植物の細胞や組織から、医薬などの有用な物質が得られ
ることがあり、このような有用な物質を恒常的に得るべ
く、植物の細胞や組織を工業的に培養することが試みら
れている。植物の細胞等は培養槽内で液内培養すること
が、大量培養し得るため、工業的には好適である。この
ため、従来は。

培養槽を大型化することにより、大量に培養するという
方法が試みられていた。しかし、培養槽の大型化に伴い
、植物細胞は水頭圧や重力等により物理化学的な損傷を
受けやすくなると共に、培養条件の制御（二酸化炭素濃
度、　ｐｉｔ値、細胞の攪拌速度等の制御）が困難にな
る。という欠点を生じるものであった。このため、培養
槽を大型化することによる培養効率の向上が図れなかっ
た。

そこで、一定の条件化で連続的に培養する連続培養を用
い、細胞の培養速度を向上させる方法が試みられている
。理論的には、連続培養による培養が最も生産効率に優
れているが、植物細胞を無菌的にかつ連続的に収穫する
ことが技術的に困難である、しかも、連続培養を行うた
めの装置は。

その連続培養に最も適した条件にて設計、製作しなけれ
ばならず、また運転条件の決定も非常に困難であり、連
続培養を用いて、植物細胞等を工業的に培養することは
、実用化されていないのが現状である。

一方、連続培養に対し、植物の細胞等を一定量の培地内
にて培養する回分培養も行われている。

第４図に、従来の回分培養装置の一例を示す。この図に
基づいて回分培養を説明すると、まず、植物細胞等を、
フラスコ５１にて振とう培養する０次に、調整・細菌さ
れた培地を仕込んだ前培養槽５２に振とう培養された植
物細胞を移植し、植物細胞を増殖させる。他方、前培養
槽５２による前培養と平行して、主培養槽５３では主培
養に備えて、培地の調整・細菌、および前培養槽５２か
ら主培養槽５３に連通ずる移送管５４の殺菌を行う。主
培養槽５３が大容量の場合には、培地膜面は連続殺菌装
置によって別に行い、その培地は、殺菌された主培養槽
へ連続的に仕込まれる。

次いで、雑菌汚染を防ぐために、主培養槽５３を通気加
圧しつつ培養温度に冷却後、前培養槽５２から前培養し
た植物細胞を、移送管５４にて主培養槽５３へ移植し、
該主培養槽５３内にて主培養が行われる。主培養槽５３
による培養中は、該主培養５３内の温度・ｐｔｉを設定
値に制御し、好気培養の場合には攪拌翼５３ａにより攪
拌を行うと共に、空気供給管５５より送給される無菌空
気にて通気する。そして。

このような主培養により、植物細胞が所定濃度に達した
時点で培養は終了する。培養終了後、所定濃度の植物細
胞を含む培養液は、主培養槽５３の収穫口５３ｂから生
産物回収工程へと移され、主培養槽５３は２次の培養の
ために、洗浄・殺菌が行われる。以上の工程で、保存植
物細胞から出発して。

大量培養による植物細胞の生産が行われる。

このような主培養槽５３を中心にした回分培養では、培
養槽の準備時間（洗浄・培地調整・殺菌・冷却等に要す
る時間）、培養時間（接種時間も含む）、培養液の排出
時間の和が、１回の回分培養に要する時間となる。

このように２回分培養では、主培養槽５３による生産段
階の前に、数段の“種（ｓｅｅｄ）　　”培養段階の前
培養が必要である。主培養は前培養の約１０倍の規模と
なるため、前培養の過程を多段階にしなければならず、
また前培養槽５２自体の容量も大きくしなければならな
い。従って２回分培養では。

設備効率が悪く、また大量生産ができないために。

工業的には不向きである。回分培養では１種培養段階で
ある前培養を不要にした反復回分培養もあるが、このよ
うな反復回分培養も生産効率が悪く。

収Ｎ量そのものは増大しない。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明は上記従来の問題を解決するものであり。

その目的は、前培養を行う前培養槽と主培養を行う主培
養槽とを用いて、植物細胞等の生産効率を著しく向上さ
せることができる培養方法を提供することにある。

（問題点を解決するための手段） 本発明の植物細胞等の培養方法は、主培養を行う主培養
槽と、該主培養槽の前段にて前培養を行う前培養槽とに
より、植物の細胞や組織等を培養する方法であり、主培
養槽にて植物細胞等を所定濃度にまで培養する工程と、
植物細胞等が所定濃度にまで培養された該培養液を培地
にて希釈する工程と、希釈された該培養液の一部を前培
養槽にて植物細胞等が所定濃度になるまで培養する工程
と、植物細胞が所定濃度にまで培養された前培養槽内の
該培養液を取り出す工程と、を包含し、そのことにより
上記目的が達成される。

（実施例） 以下に本発明を実施例について説明する。

本発明の培養方法は９例えば第１図に示すように、前培
養を行う前培養槽１１と、主培養を行う主培養槽１２と
により、植物の細胞や組織の培養が行われる。前培養槽
１１の下部は主培養槽１２の上部に。

移送管１３を介して連通している。また、該前培養槽１
１の下部は収穫口１６にも連通している。主培養槽１２
の下部は、循環路１４を介して前培養槽１１の上部に連
通している。前培養槽１１の下部および主培養槽１２の
下部には、無菌空気の供給管１５の排出口がそれぞれ配
設されている。前培養槽１１内および主培養槽１２内に
は、それぞれ攪拌翼１１ａおよび１２ａが配設されてい
る。

このような培養装置による本発明方法を説明すると、ま
ず、植物細胞をフラスコ１７内にて振とう培養し増殖さ
せる。次に、！ｊ１整・殺菌された培地を前培養槽１１
に仕込んでおき、該前培養槽１１内の培地内へ、振とう
培養により増殖された植物細胞を移植する。そして、該
前培養槽１１にて植物細胞を前培養する。

この前培養の間に、主培養槽１２内での主培養に備えて
、培地の調整・殺菌および移送管１３の殺菌を行う。主
培養槽１２が大容量の場合には、培地殺菌は培地調整槽
あるいは連続培地殺菌装置によって別に行われ、殺菌さ
れた培地が主培養槽１２へ連続的に仕込まれる。

次いで雑菌汚染を防止するために、主培養槽１２を、供
給管１５からの無菌空気により通気加圧しつつ培養温度
に冷却後、前培養槽１１にて前培養した植物細胞を、移
送管１３から主培養槽１２内へ移植して、主培養が開始
される。

主培養槽１２内での主培養中は、温度・ｐＨを設定値に
制御し、また、好気培養の場合には供給管１５から主培
養槽１２内へ無菌空気を通気しつつ攪拌翼１２ａにて攪
拌する。植物細胞が所定濃度に達すると、主培養は終了
する。

主培養槽１２内における主培養が終了した時点で。

前培養槽１１内で培地を調整・殺菌し、該培地を加圧し
た状態で移送管１３から主培養槽１２へ送給する。

培地調整槽あるいは連続培地殺菌装置が配設される場合
には、新鮮培地を必要量だけ主培養槽１２内へ送給する
。

主培養槽１２内へ送給された培地は、所定濃度の植物細
胞を有する培養液と共に攪拌・混合されて。

該培養液は希釈される。主培養槽１２内で、培養液は十
分に攪拌されて、植物細胞が均一に分散される。次いで
、主培養槽１２の内圧は、供給管１５から送給される無
菌空気にて、前培養槽１１の内圧と培養液圧との和以上
の圧力とされ、希釈された培養液は、殺菌された循環路
１４を通って、前培養槽１１内へ送給される。これによ
り、前培養槽１１内および主培養槽１２内には、植物細
胞の濃度、培地成分等が等しい培養液が仕込まれた状態
となる。

前培養槽１１内に送給された培養液は、植物細胞が所定
濃度になるまで培養され、植物細胞が所定濃度になると
前培養槽１１内の培養は終了する。そして、該前培養槽
１１内の培養液は収穫口１６より収穫される。主培養槽
１２内では、前培養槽１１内にて培養が行われている間
も培養が行われる。

培養液が収穫された前培養槽１１内では、引き続き、培
地を調整・殺菌し、その培地は移送管１４から主培養槽
１２内へ送給される。この場合、前述のように、培地調
整槽あるいは連続培地殺菌装置が配設されていれば、培
地調整槽あるいは連続培地殺菌装置から新鮮培地が主培
養槽１２内へ送給される。そして、前培養槽１１におけ
る培養の間に、主培養槽１２内にて植物細胞が培養され
た培養液は。

送給される培地により希釈される。

以後、前述したように、希釈された培養液の一部が前培
養槽１１へ送給されて培養され、植物細胞が所定濃度に
なれば収穫口１６から収穫される。

第２図は１本発明方法の実施に使用する装置の別の実施
例を示す模式図である。この実施例では。

主培養槽１２における主培養の前段階である前培養を、
２つの前培養槽１１および１１′で行うようになってい
る。このような装置では、主培養槽１２にて植物細胞が
所定濃度にまで培養された培養液を。

培地で希釈して、各前培養槽１１および１１″で再び植
物細胞が所定濃度になるまで培養し、各前培養槽１１お
よび１１°の収穫口１６および１６゛から植物細胞が収
穫される。

植物の細胞等は、′Ｒ１生物とは異なり２体外（培地）
に生長限外物を作らないために２本発明方法のように、
新鮮培地と酸素、さらには適当な空間を与えれば効率よ
く生長する。

本発明方法による生産量と、従来の回分培養による生産
量とを簡単なモデルにより比較する。今。

３０日間の回分培養で、濃度（ＷＥＴ　）が３％から３
０％に生長する植物細胞を考える。通常、誘導期間とし
て３〜５日程度考えられるが、比増殖速度（μ）が一定
であり、常に対数増殖するとすれば。

比増殖速度（μ）は２通常、（ｌ）式で表される。

ただし　Δｔ：時間（日数） χｏ：カルスの初期濃度 Ｘ　：Δを後のカルス濃度 上記モデルをこの（１１式に当てはめると、比増殖速度
μは。

・・・・（１）。

となる。

１年間の収穫量Ｙは。

Ｙ−（収穫時のカルス濃度（％）〕　・　〔主培養容量
（１）〕　・　〔１１年の培養回数〕・　・　・　・（
２） で表されるので、主培養槽の容量を１００１とすると、
従来の回分培養による１年間の収１量Ｙは。

＝　　３６０　（ｋｇ／ｙｅａｒ）　　　　　　　・・
・・（２）’（ただし主培養槽の洗浄時間は含まれない
）となる。

このような植物細胞を本発明方法により培養した場合を
考える。ただし１本発明方法では、濃度が３０％に増殖
した植物細胞を、−旦、２７％まで培地により希釈し、
その後に前培養槽にて３０％まで増殖させて収穫するも
のとする。　（１）’　式より、該植物細胞の比増殖速
度μが０．０７６７　（ｄａｙ”）であることから、植
物細胞が２７％から３０％までに増殖する時間Δｔは、
（１）式より となる。収穫時のロスタイムを考慮して、１．５（ｄａ
ｙ）に１回収穫するものとすると、１年間の収穫量Ｙは
、（２）式から次のようになる。ただし１本発明方法に
よれば、植物細胞を３％から３０％まで増殖し、その後
、−旦２７％に希釈した後３０％に増殖させるものであ
るため、３％から３０％まで増殖する当初の３０日間は
収穫されない。従って。

＋ａｏ−６９０（ｋｇ／ｙｅａｒ） となる。

このように３本発明方法によれば、１年間に植物細胞が
従来の回分培養の約２倍収穫することができる。

（実験例） 第１図に示す装置を用い、容ｆｉｘ、１ｏｚＯ前培養槽
に、８（Ｈ！の培地を仕込み、また、容１６ｏｏｚの主
培養槽に４００１の培地を仕込んで、オタネニンジンを
通気・攪拌培養した。培地としてはＢ５培地を使用し、
培養温度を２５℃９通気空気量を０．１〜０．４ＶＶＭ
とした。当初の１か月間は収穫できないが、１か月経過
後７日ごとに前培養槽から植物細胞を収穫した。従来の
回分培養では、２８日間の培養で８０ｋｇ　（ＷＥＴ　
）の細胞が得られ、６か月では４８０　ｋｇの細胞が得
られるが１本発明方法では、６か月間に７７０ｋｇ　（
従来より６０％増）の植物細胞が得られた。第３図にそ
の結果を示す。

（発明の効果） 本発明方法は、このように、主培養槽内の植物細胞等の
濃度を、常に、収穫時の所定濃度付近の高濃度に維持で
き、容量の小さい前培養槽内にて所定濃度にまで培養し
て収穫するものであるから。

植物細胞等を高効率に収穫できる。当初、前培養槽に種
培養された植物細胞を主培養槽に移植すれば、その後の
種培養は不要になり掻作が簡略化される。従来の回分培
養の装置に対して、無菌フィルタを用いて循環路を配設
すればよく、従って。

既設設備を利用して収穫量を増大させることができる。

４、　パ　　の　　゛なＵ 第１図は本発明方法の実施に使用する装置の一例を示す
模式図、第２図はその別の例を示す模式図、第３図は本
発明方法による収Ｐｉ量を示すグラフ、第４図は従来の
回分培養装置の一例を示す模式図である。

１１、１１’　・・・前培養槽、１２・・・主培養槽、
１３・・・移送管、１４・・・循環路、１５・・・供給
管、　１６．１６’　・・・収穫口。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、主培養を行う主培養槽と、該主培養槽の前段にて前
   培養を行う前培養槽とにより、植物の細胞や組織等を培
   養する方法であり、 主培養槽にて植物細胞等を所定濃度にまで培養する工程
   と、 植物細胞等が所定濃度にまで培養された該培養液を培地
   にて希釈する工程と、 希釈された該培養液の一部を前培養槽にて植物細胞等が
   所定濃度になるまで培養する工程と、植物細胞が所定濃
   度にまで培養された前培養槽内の該培養液を取り出す工
   程と、 を包含する植物細胞等の培養方法。