JPS6285864A - 不均質系ジゴキシン免疫定量用テストキツト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明に改善されたジゴキシン免疫定量、そして詳細に
はインディケータ−試薬としての標識−価まｆｃは二価
抗ジゴキシン抗体および分離を行９手段としての不動化
ウアノくインカラムからなる非拮抗的不均質系免疫定量
用テストキットに関する。

迅速にそして正確に生物流体中に存在するジゴキシンの
濃度を測定しうろ臨床検査室診断テストに対する大きく
そして広い市場がある。ジゴキシンは往々にしてナノモ
ル−ｇｆｃ、はそれ以下ノ濃度で存在している。

近年、臨床的に重要なりガンどの測定のための多くの免
疫定量技術が開発された。代表的には、拮抗的結合免疫
定量ｆｆ：、は結合反応に関与する結合成分に結合した
標識物質のコンンユゲ゛−トよりなっていて、結合した
ものおよび遊離したもの・、つ二種の標識コンジュケ゛
−トを生成させる。結合したものおよび遊離したものを
与える標識コンジュゲートの相対量はテスト試料中の検
出させるべきリガンド濃度の函数である。

結合したものにおける標識コンジュケ゛−トと遊離し５
たものの標識コンジュケ゛−トが標識物質測定に使用さ
れる手段によって本質的に識別可能でない場合には、そ
の結合したものと遊離したものを物理的に分離させなく
てはならない。

このタイプの検定は不均質系と呼ばれる。

２つの最も広く使用されている不均質系免疫定量法は放
射免疫定量法（ＲＩＡ）および酵素結合免疫吸着検定（
ＥＬ工ｓＡ）である。ＲＩＡにおいては未知量の抗原を
含有する試料を既知量の放射標識抗原および抗体と混合
させる。系を平衡に近い点まで反応せしめ、次いで抗体
結合抗原と非結合抗原から分離させる。試料抗原は限定
された数の抗体結合部位に対して標識抗原と拮抗するの
で、試料中の抗原が多くなればなる程、結合分画中の標
識抗原はますます少なくなる（または非結合分画中では
ますます多くなる）。この方法は一般に時間がかかり（
１〜３時間）そして労力を要するものである。

極く最近になって、多孔性担体上での抗体の不動化によ
ってＲ，ｌは自動化された。抗原を含有すると疑われる
試料を既知量の標識抗原と混合させた後、限定された数
の不動化抗体結合部位を有するカラムにこの試料を通す
。遊離または結合された標識を定量化させることができ
る。

迅速ではあるけれどもこの検定法はそれを再現性のある
ものとするためには抗体の厳密な測量を必要とする。

ＲＩＡけ２つの主なる不利点を有している。第一に使用
される標識物質はその取扱い、保存および投棄に関して
多くの問題を有する放射性同位元素である。第二にＲＩ
Ａは拮抗様式で実施され（すなわちアナライトと標識ア
ナライトは抗体上の限定された数の結合部位に対して拮
抗する）、従って、抗体親和性定数が検定法の感度を代
表的には１０−８Ｍ’〜ｌｏ−１１Ｍ１の範囲に限定す
る。

ＥＬ工ＳＡはその標識物質が放射性同位元素よりはむし
ろ酵素であるという以外は原則においてＲＩＡと同様で
ある。それも感度がなお抗体親和性定数の厳密な函数で
あるという制限を受ける。

同位元素および酵素に加えてその他の標識物質が記載さ
れている。これらとしては螢光発生団、補酵素、生物発
光物質、酵素抑制剤があげ不均質系免疫定量法における
分離段階の種々の実施法が知られている。これらとして
は濾過、遠心分離、クロマトグラフィーその他があげら
ノする。

分離段階を実施するためのアフィニティーカラムの使用
はフランス特許出題第７９１５９９２号明細書に記載さ
れている。それは標識物質に対して親和性を有し、そし
て更に分子ふるい性を有しているりガントをそれにカン
プリングさせたゲルの使用を記載している。標識物質よ
りはむしろ関心のあるリガンドに対して親和性を有し、
そし７て分子ふるい性を有するケ゛ルの使用もまた開示
されている。記載されている検定法は拮抗的または非拮
抗的様式で実施することができる。

米国特許第４．．２９８，６８７号明細書は不均質系免
疫定量法を開示しているが、この場合測定すべき物質を
標識−次結合対応成分と反応させ、そして未反応結合対
応成分の量をその一次結合対応成分に対する特異的結合
性を与えた固体指上への吸収によって測定する。この−
次結合対応成分は限定された量で存在させる。

米国特許第３，６５４，０９０号明細書は人絨毛膜ゴナ
トドｏピン（ＨＯＧ　）に対する非拮抗的不均質系免疫
定量法を開示しているがこれはその分離段階を実施する
ために過剰の酵素標識二価抗体と不動化ＨＣＧカラムを
使用している。この検定法は１モルＨＣＧ結合抗体とＨ
ＣＧ結合のない抗体とを区別できないという事実により
その感度において限定されている。両種のものがアフィ
ニティーカラムにより保持される。

米国特許第４，１３４，７９２号明細書は関心あるリガ
ンドに対する標識特異的結合対応成分を過剰に存在させ
る不均質系免疫定量法を開示している。標識特異結合対
応成分は二価抗体であり、そしてこれは前記と同一の不
利点を有している。

ｒＢｒｉｔｉｓｈ　ｙ、　Ｈａｅｍａｔｏｌ、　Ｊ第４
７巻第２６９頁（１９８１）は凝固因子■に対する二部
位免疫放射能測定検定法（工ＲＭＡ　）を開示している
がここ−ではｍ個Ｆａｂ抗体フラグメントが使用されて
いる。それらの結果は二価抗体よりはむしろ一価抗体を
使用する場合に１０倍のより高い感度が得られることを
示している。

米国特許第４，２００，４３６号明細書は標識−価抗体
を使用する免疫定量法を開示しているが、この場合不動
化抗原（測定すべきものと同一の抗原）を使用して結合
分画および遊離分画を分離させる。測定されるのは第一
義的には結合分画なのでこの検定は拮抗様式で通常実施
される。

従って感度は検定が好ましい様式で実施される場合には
抗体の親和性定数によって限定される。

ある場合には免疫定量におけるアナライトをアナライト
同族体に代えることができる。一般に性能はアナライト
の使用とアナライト同族体の使用との間に差はなく等し
いものと予想される。意外なことに本発明のジゴキシン
検定においては、不動化抗原としてのジゴキシンをウア
バインに代えることによって検定の感度および精度を顕
著に改善することが発見された。本改善をもたらす正確
な機構はわかっていないが、それは抗原−抗体反応の性
質にあるものと考えられる。

当該技術においてはその感度および精度が抗体の親和性
定数によって限定されないジゴキシンの不均質系免疫定
量法に対する要求がちる。

本発明の非拮抗的不均質系免疫定量法は次の段階すなわ
ち、 （ａ）　　モル過剰の標識−価または二価抗ジゴキシン
抗体をジゴキシンを含有する疑いのあるテスト試料に接
触させることによって反応混合物を生成させ、それによ
って前記抗体の一分画がジゴキシンとコンプレックスを
形成し、そし７て一分画が遊離状態に留まり、 （ｂ）　　この反応混合物を遊離抗体の全部を結合させ
うる量で存在する、固体担体上で不動化させたウアバイ
ンを有する固体相と接触させて遊離抗体をこの反応混合
物から分離し、そして（Ｃ）　　標識を測定することに
よって固体相から溶出したコンプレックスの量を測定す
ることを包含する。次いで試料中のジゴキシン量を標準
曲線を比較することによシ決定することができる。

その他の態様においては、拮抗的不均質系免疫定量法が
提供されるが、これは次の一連の段階、すなわち （ａ）　　ジゴキシンを含有する疑いのある試料を固体
相上に不動化させたモル過剰のウアバインと接触させる
ことにより反応混合物を生成させ、（ｂ）　　この反応
混合物をジゴキシンに対してモル過剰の、但しウアバイ
ンに対してはモル以下の標識−価または二価抗ジゴキシ
ン抗体と接触させ、 （Ｃ）　　反応を行わせ、それによって抗体の一分画が
ジゴキシンと第一コンプレックスを形成しそして第二の
分画が不動化ウアバインとコンプレックスを形成するよ
うにし、 （、ｉ）　　第二分画から第一分画を分離し、そして（
ｅ）第一分画または第二分画のいずれか一つに存在する
標識量を測定すること を包含している。

一般に抗体を免疫定量法で使用する前に抗体を免疫学的
に精製することが望ましい。動物血清、腹水または組織
培養媒体からの−Ｇ単離法およびアフィニティークロマ
トグラフィーによるその免疫学的精製法もまた当該技術
では知られ−ｃいる。簡単に・ＩｇＧ分画を硫酸アンモ
ニウム沈殿により調製する。ＩｇＧ分画を次いでイオン
交換、ゲル濾過または蛋白質Ａクロマトグラフィーによ
り調製する。アフィニティー精製は抗原カラムからの溶
出により実施される。

抗体は多クローン性または単一クローン性のいずれであ
ってもよい。−価抗体は当該技術において既知の方法で
調製することができる。例えばＦａｂフラグメントは工
ｇＧのパパイン消化により得られ、Ｆａｂ’フラグメン
トは工ｇＧのＲプシン消化により得られたＦ（ａｂ′）
２７ラグメントのジサルファイド還元により得られる。

抗体への標識物質のカップリングに対しては任意の多数
の方法を使用しうる。標識物質は酵素、放射性同位元素
、発色団、螢光発生口、または単独でまたはその他の試
薬と組合せた場合に検出可能なシグナルを発生しうる任
意のその他の物質でありうる。一般に各抗体に対して少
くとも一つの標識を好ましくは共有結合的に、そして抗
体の免疫反応性および標識物質の活性を保存するような
方法でカップリングさせるべきである。Ｆａｂ’フラグ
メント中に存在する遊離のスルフヒドリル基は標識の共
有結合的結合に対して特異的な反応性の基を与える。マ
レイミドまたはチオピリジル基を有する複素三官能交叉
結合試薬がこの目的には有用でちる。一般に免疫学的活
性の保持を確実にするために、標識抗体の合成の最終段
階は免疫学的精製段階であるのが望ましい。

ウアバインまたはそのコンジュケ゛−トは例えばｒ　Ｂ
ｉｏｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｊ第９巻第３３１頁（１９７０
）による当該技術に既知の方法によって適当な担体上に
不動化させることができる。一般に、担体はその流れ特
性で選ばれ、そしてその例としてはビーズ化アガロース
、ビーズ化デキストラン、ポリアクリルアミドまたはガ
ラスをあげることができる。ウアバインは直接にまたは
蛋白質、ポリアミノ酸または合成結合成分でありうルス
ベーサーアームを介してこの担体に共有結合的に結合さ
せることができる。通常、アフィニティーカラム物質は
一回使用すると捨てられるがしかし所望によりそれを再
循環させることはできる。担体が分子ふるい特性を有し
ていることは一般に望ましくない。それはもし標識抗体
が試料アナライトから解離した場合、分子ふるいはそれ
らが相互に再び出会う可能性を減じさせる傾向があるか
らである。

非拮抗性様式においては、本発明の検定は次のようにし
て実施することができる。未知量のジゴキシンを含有す
る通常は５μ２〜５００μ２の血清である患者試料の既
知の容量をジゴキシンに対して明らかに過剰な量の標識
付けした一価または二価の抗体を含有する溶液と混合さ
せる。

通常標識付けした抗体はジゴキシンに比べて約１０〜１
００モル過剰で存在させる。ジゴキシンおよび抗体を通
常は少くとも５分、そして３０分未満のある特定の時間
の長さの間、４℃〜４５℃の間の一定の温度、通常は３
７℃で前培養（ｐｒｅｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ　）させる
。ジゴキシン結合抗体と非結合抗体を含有するこの溶液
の既知の容量（通常５μＡ〜５００μ２）を好ましくは
２ｒｍ×１０＝の寸法を有する、多孔性担体上に不動化
させたウアバインよりなるカラムに通過させる。すべて
の遊離の標識付き抗体を結合させるに充分なウアバイン
−カップリング担体が使用される。

カラムを０．２〜５．０−７分の流速で、通常は１〜５
ｍｌ全量の適当なバッファーで溶出させる。カラムから
溶出する分画は患者血清からのジゴキシンでコンプレッ
クス化された標識付き抗体を含有している。この分画中
の標識活性を次いで測定する。或いはまたこの分画を捨
て、そしてケイオトロピック（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ　
）剤または極端な値のｐＨによってカラムから保持され
ている抗体を溶出させることができる。第一の場合には
標識の量は試料中のジゴキシン濃度に直接比例する。第
二の場合はそれは逆比例する。

本発明の検定法は手動的に実施しうるしまたはそれは種
々の自動式まだは半自動式装置例えばａｃａ［Ｆ］独立
臨床アナライザー（デュポン社Ｍ）に適応することがで
きる。この場合には患者試料および過剰の標識−価また
は二価抗体を装置の外で前培養させる。既知の容Ｉのこ
の混合物を分析テストパック（ここに参考として包含さ
れているＲｅ２９，７２５に記載されている）中に、こ
の装置の充填ステーションにおいて自動的に注入し、次
いで最終パック内容量を５−とするに充分な量のバッフ
ァーを注入する。この試料混合物をパック通水管（ｈｅ
ａａｅｒ　）に置いた多孔性担体上で不動化させたウア
バインのカラムに通しそして直接パンク中に溶出させる
。この溶出された分画は患者血清中のアナライトでコン
プレックス化された標識抗体を含有している。このパッ
クは自動的に３７℃でブレーカ−／ミキサーＩまたはブ
レーカ−／ミキサーＨのいずれかでシグナル発生反応に
必要な試薬を添加し、そして、そのシグナルの光度計に
よる読出しを行なう。

本発明の検定法はまた、拮抗様式でも実施させうるが、
これは抗体を試料ジゴキシンとウアバインに、連続的と
いうよりはむしろ同時に露出させることを意味している
。

拮抗様式においては検定法は以下のように実施される。

ジゴキシンを含有する疑いのちる試料の一区分量、通常
は１０〜１００ｕｎｉ固体相上に不動化させたモル過剰
のウアバインを含有する試験管に加える（一般にはアフ
ィニティーカラム樹脂例えば交叉結合アガロースまたは
テキストランの１００〜１０００μ２充填容量）。次い
で一価または二価標識抗ジゴキノン抗体溶液を試料中に
予想されるジゴキシンの最大値よりモル過剰の、但しウ
アバインに対してはモル以下の量で加える。この抗体溶
液の量は一般には５〜５０μ２でちる。このようにして
生成された反応混合物を２３℃〜４５℃、好ましくは３
７℃の温度で、１５〜６０分、好ましくは１５分間、静
かに攪拌しつつ培養する。抗体−ジゴキシンコンプレッ
クスを次いで抗体／不動化ウアバインコンプレックスか
ら分離させる。親和性樹脂が使用される場合には約６分
間の２０００　Ｘ　Ｚの遠心が好ましい。次いで上澄流
体を吸引する。固体相生に吸着された標識の量または上
澄流体中の標識の量のどちらかを測定してテスト試料中
に最初に存在したジゴキシンの量を決定することができ
る。標識が酵素である場合には酵素をその基質と反応さ
せて検出可能な生成物を生成させることによって測定を
実施することができる。

非酵素標識例えば螢光発生口、発色団、および放射性同
位元素は当該技術でよく知られた技術により測定するこ
とができる。

固体相生でジゴキシンよシはむしろウアバインを使用す
ることの利点は次の実施例によって説明されている。こ
れら実施例中では種々の実験条件下にジゴキシン（アナ
ライト）およびウアバイン（アナライト同族体）カラム
の両方が調製され、そしてそれらのジゴキシンアフィニ
ティーカラムを使用する免疫学的検定における性能がバ
ックグラウンド、感度および精度に関して評価された。

各樹脂の合成に対する至適条件は異っているけれども、
最良のウアバイン樹脂は一貫して最良のジゴキシン樹脂
よりも秀れた性能を示した。

本明細書中ではウアバインのみが特定的に例示されてい
るけれども、均等物とじてンギトキシン、デスラノシド
、ジゴキシン樹脂、およびストロファンチンが予想され
る。

例　　１ Ａ　−価抗体一酵素コンジュゲートの合成ウアバイン−
ＵＳＡ免疫吸着剤を使用して先金血清から直接ジゴキシ
ン特異抗体を免疫精製した。

ウアバインは蛋白質（Ｈ６＋Ａ、人血清アルブミン）ス
ペーサーアームを介してアガロースマトリックスに結合
させた。第一の段階はウアバイン−アルブミンコンジュ
ゲートの合成を包含する。ウアバイン（０，５６ミリモ
ルを２０−の水に溶解）を暗所で室温で一時間、メタ過
沃素酸ナトリウム（１，０２ミリモル）で酸化した。定
量酸化は酢酸エチル：メタノールニＨ２０（７５：２５
：ｉ）で展開させたノリ力ゲルＧプレート上での薄層ク
ロマトグラフィーによって証明された。ダウエックスＡ
Ｇ−ＩＸ８イオン交換樹脂の６−〇カラム上にこの水性
混合物を通すことによって過剰の過沃素酸塩を除去した
。ウアバインの定量的回収は放射能標識（トリチウム化
）ウアバインを追跡することにより証明された。０．４
−の５％Ｎａ２００５を添加することによって酸化ウア
バインの溶液をｐＨ９，５に、＜ソファ−化させ、そし
て２０−のＨ８Ａ溶液（２８■／−）と合した。４５分
後、このコンジュケ゛−）＆２０−の水に新たに溶解さ
せた０、３？のす）　ＩＪウムボロハイドライドを添加
することによって還元させた。６時間後８−の１モル蟻
酸を加えてそのｐＨを６．５に下げた。ｐＨ６，５で１
時間置いた後、１モル、　　ＮＨ４ＯＨでそのｐＨを７
５に上昇させた。

全反応混合物を蒸留水で完全に透析させ次いで最後に０
．０１５モル燐酸ナトリウムバッファー（ｐＩ（７，８
）、０１１５モルＮａＣｆ１で透析した。こノコンジュ
ゲートをアミコンＰＭ−３０膜で濃縮させて、４、２　
ｒｑ／ｍｌとした。蛋白質濃度は当該技術では既知のロ
ーリ−法により測定された。

ウアバイン−ＵＳＡコンジュゲートをｒＢｉｉ−丘ａａ
ｍａｎｕａｌＪに記載の方法を使用してアフィゲル’１
０（ビオ−ラド・ラボラトリーズ社製）上で不動化させ
た。２５ゴのアフィゲル引０を７５ｒｎ！！の氷冷水で
洗った。このゲルを透析ウアバイン−Ｈ８Ａコンジュゲ
ートに加えそして４℃でロッカー上で一晩混合せしめた
。過剰の活性エステル基を０．１−の１モルエタノール
アミン（ｐＨａＯ）を室温で一時間加えることにより急
冷させた。

最後に、このゲルを蒸留水で完全に、次いで順に５０Ｍ
の０．５モルＮａＣ！ｎ、４００−の０．１モルグリシ
ン（ｐＨ２，５）、３００−の２．５モルＮＨａＳＯＮ
　。

１０００−のホスフェートバッファー化塩水で洗った。

ウアバイン親水性樹脂を６−のベッド容積になるように
カラム（０，７Ｘ　１５ｍ）中に充填して、そして燐酸
バッファー化塩水で平衡化した。

抗血清（４，５η／−モノ特異性抗体の力はル抗ジゴキ
シン血清１０−）を１−７分以下の流速で適用した。カ
ラムをその２８　Ｄ　ｎｍの吸光度がベースライン（＜
０．０１）に達するまで燐酸バッファー化塩水で洗った
。次いで６０−の３モルＮＨ４５ＯＮ　（ｐＨ７，５）
でこのカラムから抗体を溶出させ、そして直ちに４℃で
２２燐酸バツフアー化塩水で４回透析した。

アミコン攪拌セル装置（ＰＭ−３Ｑ膜）上でこの２７−
のアフィニティー精製抗ジゴキシン抗体を２．７−に濃
縮した。最終蛋白質濃度は１０！Ｎｉ／−であった。試
料を０．１モル酢酸ナトリウム（ｐＨ４，５）　１００
０−で４℃で４時間透析した。透析後、同一酢酸ナトＩ
Ｊウムバツファーに溶解させた１０ｒＩｌｉ／７！のは
プシン溶液２０μ２を加え、そして温度ｔｌ−３７℃に
加温して２０時間保った。

この消化時間の後、短時間遠心分離させることによシ試
料を清澄化させ、次いで１０１５モル燐酸ナトリウム（
ｐＨ７，４）、（１１５モルＮａＣＡ（燐酸バッファー
化塩水）中で平衡化させたセファデックスＧ−１５０カ
ラム（１，５Ｘ９０口）上でクロマトグラフィーに付し
た。ゲル電気泳動により同定された（Ｆａｂ’）２フラ
グメントを含有するカラム分画をプールしく１９．２ｒ
ｎｔ）、次いで加圧濾過（ＰＭ−３０アミコン膜）で２
．７艷に濃縮した。濃縮後との（Ｆ’ａｂつ２フラグメ
ントを５５４の１モルジチオスレイトール溶液を加える
ことにより還元させて相当するＦａｂ’フラグメントと
した。還元は２５℃で９０分間実施された。次いで４℃
で０．１５モルＮａＣ！ｆｉ、０．０１５モル燐酸ナト
リウム、ｐＩ（５，６（２Ｘ　１　］Ｄ　Ｃｌｍｊ’ｌ
　で透析を実施した。

このようにして調製されたＦａｂ’フラグメントを次い
で２０倍モル過剰のｍ−マレイミド安息香酸Ｎ−ヒドロ
キシサクシンイミドエステル（ＭＢＳ）と反応させた。

テトラヒドロフラン中の７９ミリモルのＭＢＳ溶液８５
μ２を２−のＦａｂ’フラグメントの溶液に加え、そり
、て２５℃でアルゴン下に１時間反応させた。この混合
物を燐酸バッファー化塩水中でセファデックスＧ−２５
（交叉結合ビーズデキストラン、５０００ドルトンの排
除限界を有する）の力・ラム（１，５Ｘ４０ｃ！ｎ）上
で脱塩させた。ボイド容量中に溶出される誘導体化され
たＦａｂ’フラグメントをプールし、そして４℃の燐酸
バッファー化塩水中１２ｒＭｉ／ｒｎｔのβ−ガラクト
シダーゼ２−と合した。１６時間後この溶液をアミコン
ＰＭ−３０加圧濾過攪拌セル中で２艷に濃縮させ、次い
でセファロース４Ｂ−（Ｌ（１，５Ｘ９０ｃｒｎカラム
中１〜５Ｘ１０６ドルトン排除限界を有するビーズ形交
叉結合マクロ細孔性アガロース）のカラムクロマトグラ
フィーに付した。Ｆａｂ’−β−ガラクトシダーゼコン
ジュゲートは遊離β−ガラ、クトンダーゼと共に溶出さ
れた。酵素活性の全ピークをプールし、次いでウアバイ
ンアフィニティーカラム上で免疫学的に精製させた。免
疫学的精製法は以下の通シであった。セファロース４Ｂ
−ＯＬカラムからのプールし九カラム分画をウアバイン
アフィニティーカラム（１，ＯＸ　７．０ｃｎ１）を通
して溶出させ、次いで１００ｄの燐酸バッファー化塩水
で溶出させた。

このＦａｂ’−β−ガラクトシダーゼコンジュゲートを
次いで燐酸バッファー化塩水中の２３ミリモルウアバイ
ン５０−で溶出させた。この溶出液は最終試薬に相当し
、これを４℃の４℃の燐酸バッファー化塩水で６回透析
した。

Ｂ、ウアバインとジゴキシン樹脂の合成ウアバインおよ
びジゴキシンをそれぞれ別々に種々の比率で有機スは−
サー成分トリエチレンテトラアミン（ＴＥＴＡ　）を介
してセファデックスＧ−１０（ファルマシア・ファイン
・ケミ゛′カルズ社より入手可能なビーズ型デキストラ
ン）にカップリングさせた。

ウアバイン（２０〜３２５ｆＩｑ）を蒸留水に溶解させ
、そして５倍のモル過剰のメタ過沃素酸ナトリウムを添
加することによって２５℃で２時間酸化させた。この時
間の終りに過剰の過沃素酸塩を除去させるダウエックス
ニーＸ８　（Ｏｒ−イオン交換樹脂）の５−〇カラムに
各溶液を通すことによって反応を停止させた。溶出液を
集めそして濃縮ストック溶液の添加によって０．１モル
燐酸ナトリウム（ｐＨ７，０）の最終濃度とした。ＴＥ
ＴＡ（５０〜１２５■）を各溶液に加え（表１Ａ参照）
そして最終溶液のｐＨをｐＨ７，ＯＫ調整した。この溶
液を２５℃で１時間培養し、この時間の終りに３０■の
ナトリウムシアノボロハイドライドを加えた。得られた
溶液を２５℃で４８時間攪拌した。

ウアバインについて前記した同一の方法を、但しジゴキ
シンを３０％エタノールに溶解させてジゴキシンに対し
て実施した。実験の詳細は表１Ｂに示されている。

各コンシュｙ−ト＜ウアバイン−ＴＺＴＡ　９０ツトお
よびジゴキシン−ＴＥＴＡ　９０ツト）を次いで次の方
法によってセファデックスＧ−１０にカップリングさせ
た。２１０ＦのセファデックスＧ−１０を１２蒸留水中
で膨潤させた。樹脂を次いで一回１Ｌの水で３回洗った
。最後に樹脂を１Ｌのメタ過沃素酸ナトリウム（１０？
／ｆ！、）に懸濁させることにより酸化させた。１時間
２５℃に置いた後、樹脂を沈降させ、上澄流体を除去し
、そして樹脂を約３ｘの０，２５モル燐酸ナトリウＡ　
（ｐＨ７，０）を使用して焼結ガラスロート上で洗った
。得られた樹脂を２５−区分に分け、そして前記合成コ
ンジュゲート各ロットにその一区分を混合させた。１時
間混合後、ナトリウムシアノボロハイドライド（３０■
）をコンジュゲートを加えた樹脂の各区分量に加えた。

得られた！！！！渇液を２５℃で６４時時間分六夛スづ
；との時樹脂を沈降させ、上澄流体を除去し、そして樹
脂（各区分別々に）を３０［１７！の水、３００−の０
．５モルＮａＣｆ１および５００−の０．１５モ／ｌ’
燐酸ナトリウム（ｐＨ７，１）で洗った。各樹脂区分を
ａｃａ■独立臨床アナライザー分析カラム（０，５Ｘ８
６ｎ１　カラム１本当り１．８　ｄ　）に充填させた。

そのカラムを次いで７■の０−ニトロフェニル−β−Ｄ
−ガラクトピラノシド（０ＮＰＧ　）を含有するａＣａ
Ｏ独立臨床アナライザー分析テスト・ξツクの通水管中
にくぼみ（ｄｉｍｐｌｅ　）　６で位置させた。

Ｃ，ウアバイン−ＴＥＴＡ−セファデックスとジゴキシ
ン−ＴＥＴ　Ａ−セファデックスの比較前記（Ｂ）で合
成された各樹脂ロットを次のプロトコールに従ってａｃ
ａ■独立臨床アナライザーで評価した。１０ピコモルの
前記（Ａ）で合成されたβ−ガラクトシダーゼ標識抗ジ
ゴキシンＴａｂ’を１００μ２の０または５ｎＰ／７の
ジゴキシンカラムする人プール血清試料に加えた。１０
分間２５℃で培養後、抗体−試料混合物を自動的に前記
のａＣａｏ独立臨床アナライザー分析テスト・ξツク中
に注入させそしてパック通水管中のカラムを通して溶出
させた。試料に続けて２−の０．１５モル燐酸ナトリウ
ム（ｐＨ１８）を流した。カラム流速は３４μ２／秒で
あった。このノミツクに次いで針位置２（カラムバイパ
ス）において更に２．９−の水を充填した。０ＮＰＧを
約３５Ａ分後にプレーカー／ミキサー■から放出させた
。薄紫活性は基質添加後４Ｑ５ｎｍで、２９秒および４
６秒で測定された。

表■によりすべての１８の樹脂ロットの性能をパックグ
ラウンド（表１１Ａ）および感度（表Ｉ［Ｂ）について
比較する。パックグラウンドは試料がＯｎ？／−のジゴ
キシンを含有する場合の４０５ｎｍの吸収変化として定
義された。これら条件下ではすべての標識抗体はカラム
に結合残存する筈である。感度は分離として、すなわち
ａｎｆ／−ジゴキシンと５ｒｓｆ／−ジゴキシンとの間
における４０５ｎｍの吸収における変化として定義され
る。

パックグラウンドは一般にカラムがジゴキシン−ＴＩＣ
ＴＡ−セファデックスよりなっている場合により低かっ
たが、感度はカラムがウアバイン−ＴＫＴＡ−セファデ
ックスよりなっている場合に常により良好であった。最
良のウアバイン樹脂は０．１５８吸収単位／分の感度を
有しており、一方最良のジゴキシン樹脂は０．１１０吸
収単位／分しか示さなかった。表１［Ｂにおいて星印を
付したこれらの樹脂は以後の研究用に選ばれたものであ
った。

Ｄ、精　度 表■において星印を付された樹脂、すなわちウアバイン
−ＴＫＴＡ−セファデックスよりなる一つのものとジゴ
キシン−ＴＥＴＡ−セファデックスよりなるその他のも
のを更にジゴキシンに対する検定精度に関して評価した
。０．１または１４ｎｆ／−ジゴキシンを含有する試料
を使用して前記と全く同じようにパックを操作した。少
くとも１６のパックが各薬剤濃度において操作された。

そして平均値体）、標準偏差（Ｓ、Ｄ、）および変動係
数％（Ｃ，Ｖ、　）が決定された。これらは表■に示さ
れている。

この薬物に対する医学的決定濃度である１ｎｌＦ／−ジ
ゴキシンにおいて測定の精度はジゴキシンカラムに比較
してウアバインカラムに対して有意に改善された。ジゴ
キシンカラムを使用する場合には、１ｎり／−ジゴキシ
ンの血清濃度を有する人は誤認され易い。そして場合に
より薬剤の過剰投与（または不充分投与）を導きうる。

ジゴキシンは１ｎ２／−以下の濃度では有効性はなく、
そしてそれより大きく上回る濃度では有毒なので、その
ような測定誤差の結果は重大なものでありうる。この理
由からジゴキシンカラムの代シにウアバインカラムを使
用することが本発明の基本を形成する。

表１人 ０Ｕ−Ａ　　　　　　３２５　　　　　１２５０Ｕ−Ｂ
　　　　　　１９５　　　　　　７５０Ｕ−Ｃ１３０５
０ ０Ｕ−Ｄ　　　　　　１２５　　　　　１２５０Ｕ−Ｋ
　　　　　　　７５　　　　　　７５０Ｕ−Ｆ　　　　
　　　５０　　　　　　５００Ｕ−Ｇ　　　　　　　５
０　　　　　１２５０Ｕ−Ｈ３０７５ ０Ｕ−工　　　　　　２０　　　　　５０表１Ｂ ＤＧ−Ａ　　　　　　　　　　３２５　　　　　　　　
　１２５ＤＧ−Ｂ　　　　　　　　　　１９５　　　　
　　　　　　７５ＤＧ−Ｃ１３０５０ ＤＧ−Ｄ　　　　　　　　　　１２５　　　　　　　　
　１２５ＤＧ−Ｅ　　　　　　　　　　　７５　　　　
　　　　　　７５ＤＧ−Ｆ　　　　　　　　　　　５０
　　　　　　　　　　５０ＤＧ−Ｇ　　　　　　　　　
　　５０　　　　　　　　　１２５ＤＧ−Ｈ３０７５ ＤＧ−工　　　　　　　　　　２０　　　　　　　　　
５０表Ｉ［Ａ 八〇、　２３４　　　　　　　　０．０４２Ｂ　　　　
　　　　　　　Ｏ，２５４０，１０８Ｃ０，２６１０，
３１８ Ｄ　　　　　　　　　　　Ｏ，１１１ｌ１１０４４Ｅ　
　　　　　　　　　Ｑ１２１　　　　　　　　０．２０
６Ｆ　　　　　　　　　　　　Ｄ、１２４　　　　　　
　　０．３１１Ｇ　　　　　　　　　　α１６４　　　
　　　　　０．１３７ＨＤ、１６６　　　　　　　　０
．２２４ｘ　　　　　　　　　　　Ｏ，１５９０，２６
８表［ＩＢ Ａ　　　　　　　　　　　　Ｏ，０３０ｃＬ００８Ｂ　
　　　　　　　　　　　０．０１９　　　　　　　　　
−−ｃ　　　　　　　　　　　　Ｑ、０１５　　　　　
　　　０．０１３Ｄ　　　　　　　　　Ｏ，１５Ｂ＊　
　　　　１０１２Ｅ　　　　　　　　　　　　Ｏ，１４
８０，０１１Ｆ　　　　　　　　　　　Ｄ、１４８　　
　　　　　　０．０４７０　　　　　　　　　　　　Ｇ
、１０６　　　　　　　　　Ｑ、０３３ＨＯ，１０８０
，０８７ Ｉ　　　　　　　　Ｑ、１１２　　　　　　Ｑ、１１０
＊表　　■ 樹脂０Ｕ−ＤとＤＧ−工の比較：精度 Ｘ　（ｎＰ／ｍ／）　　　　　０．８３　　　　　０．
９６Ｓ、Ｄ、　（ｎｆ／ｄ）　　　　０．１４　　　　
　　α５６Ｃ，Ｖ、（％）（ｎｒ／ｍ／）　　　１７　
　　　　　５５３．４ｎ帽ジゴキシン 父（ｎｒ／ｄ）　　　　　　　　３．４　　　　　　　
　五４Ｓ−Ｄ−（ｎＰ／＋＋ｔ）　　　　　　０．０９
　　　　　　０．３７Ｃ−Ｖ−＠）（ｎｆＡ）　　　　
２．５　　　　　　１１例　　２ 人、二価（Ｆ（ａｂす２）抗体酵素コンジュゲートの合
成１−のアフィニティー精製抗ジゴキシンＦ（ａｂ′）
２フラグメント（例１に記載のようにして調製）１：２
．８５■／−の蛋白質−ｏ、ｏｉｓモル燐酸ナトリウム
、０．１５モルＮａｃｊ！、１ミリモルーＡ　（ｐＨ７
，０）中〕を２３〜２５℃で９．１μ２の、ジメチルホ
ルムアミド中に溶解させた６０ミリモルサクシンイミジ
ル４−（Ｎ−マレイミド−メチル）シクロヘキサン−１
−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）溶液と混合させた。６
０分後、同一の燐酸ナトリウム−ＮａＯｆ！、−ＥＤＴ
Ａ　溶液で平衡化させたセファデックスＧ−２５カラム
（１，５Ｘ３０ｃｒｎ）上でこの溶液を脱塩させること
によってこの反応を停止させた。ボイド容積で溶出した
蛋白質を集め、そしてアミコン攪拌セル濃縮装置（ＰＭ
−３０膜）を使用して１−まで濃縮した。１艷の０，０
５モルトリスＨ（４，０，１５モルＮａｃｆｉ、１ミリ
モルＭｇ（４２（ｐＨ７，５）中に溶解させたβ−イガ
ラクトンダーゼ２４■このＦ（ａｂす２−ｓＭｃｃアダ
クトに加えそして４℃で２０時間反応させた。４℃で１
時間、０．１モルの２−メルカプトエタノール１０μλ
の添加によってこの反応を急冷させた。Ｆ（ａｂつ２−
β−ガラクトシダーゼコンジュゲートを０．０５モルト
リスＨｃｆｉ、０．１５モルＮａＣＡ、１ミリモルＭｇ
０ｆｉ２　（ｐＩ（７，ｓ　）で４℃で平衡化させたセ
ファローズ４Ｂカラム（１，５Ｘ　９０ｃｍ　）上での
クロマトグラフィーによってこのＦ（ａｂす２−β−ガ
ラクトシダーゼコンジュゲートを未反応β−ガラクトシ
グーゼから分離させた。

Ｂ。ウアバイン樹脂とシコキシン樹脂の合成ウアバイン
およびジゴキシンをそれぞれ牛血清アルブミン（ＢＳＡ
）を介して至適比率でセファデックスＧ〜１０に別々に
カップリングさせた。

１）ウアバイン−ＢＳＡは５００７！の熱蒸留水（７０
℃）に５２のウアバイン８水和物を溶解させることによ
り調製された。溶液を２５℃まで冷却させた後、Ｚ３？
のメタ過沃素酸ナトリウムを加え、次いで暗所で２５℃
で２時間連続混合させた。次いでこの混合物を２５０−
のダウエックス（ｉ−、ｘｓ）陰イオン交換樹脂床に通
すことによって酸化を停止させた。溶出液を集め、そし
て１モル燐酸すｌ・リウムバツファー（ｐＨ７，０）に
溶解させた牛血清アルブミン溶液（１０り１５００−）
と合した。２５℃で１時間置いた後、０．６４５’のナ
トリウムシアンボロハイドライドを攪拌しつつ加えそし
てこの混合物を２５℃で７２時間培養させた。カップリ
ングしなかったウアバインを、ウアバイン−ＢＳＡコン
ジュゲート溶液を２４時間蒸留水流水で次いで２ｏ容量
の０．０１５モル燐酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７，
０）で４℃で透析させることによってこの混合物から除
去した。セファデックス樹脂にカップリングする前にＮ
ａ（ＩＦ！　１４．６　？を加えることによって、この
コンジュゲート溶液の最終イオン強度を０．２５モルに
調整した。

２）ウアバイン−ＢＳＡのセファデックスＧ−１０への
カップリング セファデックスＧ−１０（ａｚｏｒ）（ファルマシア・
ファイン・ケミカルズ社Ｉ！りを１時間以上、２０００
ｍ／！の蒸留水中で膨潤させた。樹脂微粒子をデカント
および、５ｘ２０００−の水による再懸濁により除去さ
せた。次いで樹脂を２０？の溶解メタ過沃素酸ナトリウ
ムを含有する水１０００−に再懸濁させることにより酸
化させた。１０分後、樹脂を５Ｘ２０００−の水、次い
で４０００−の０．２５モル燐酸ナトリウムバッファー
（ｐＨ７，０）テ洗った。デカントさせた樹脂を１００
０ｍ／！のウアバイン−ＢＳＡ　ｉ液（前記よりのもの
）に再懸濁させ、２５℃で１時間混合させ、次いで０．
６６Ｆのナトリウムシアノボロ・・イドライドとｉ合さ
せた。７２時間後、水中の０．１％ナトリウムドデシル
サルフエー）　４０００ｍ１．　１２　ｆｔの蒸留水。

次いで４００　Ｍの０．１５モル燐酸ナトリウムバーリ
　−ｙ　　−ｒ　　　　　／　　　ｙ？ｆｆ　　７　４
　　　Ｘ　−ｍ　ｒｂ　　Δ　−＆　、４　　　　ＪＬ
　　＊ａ　　砺　ｎ＊をデュポンａＣａ１３１独立臨床
アナライザー中での自動分析に使用するための小形カラ
ム（０，５画×７　ｃｍ　）中にスラリー状態で充填さ
せた。

３ノ　ジゴキシン−ＢＩＳ’Ａば７５−のエタノールに
１．２５　Ｆのジゴキシンを溶解させ、ついでこの溶液
を１．８３Ｆのメタ過沃素酸ナトリウムを含有する水１
５０ｒｎｔと合することにより調製された。

２５℃で２時間攪拌した後、この混合物をダウエックス
（１−Ｘ８）陰イオン交換樹脂床（１００ｍ７）に通す
ととてよって酸化を停止させた。溶出液を０．１モル燐
酸ナトリウムＣｐＨａ５）に溶解させた牛血清アルブミ
ンＣ２−５ｆ′’）の溶液と合した。

ナトリウムシアノボロハイドライド（０，２４５’）を
次いで加え、そしてこの混合物を２５℃で４８時間混合
させた。遊離のコンジュゲートしていないジゴキシンを
２日間蒸留水流水で、次いで２０容量の０．０１５モル
燐酸ナトリウムバツファ−（ｐＨ７，０）で４℃で透析
させることによって除去した。

４）ジゴキシン−ＢＳＡのセファデックスＧ−１０への
カップリング セファデックスＧ−１０（５（１）を１時間以上、２５
０！Ｉ！７！の蒸留水中で膨潤させた。樹脂微粒子をデ
カントおよび再懸濁により除去させた。次いで樹脂を５
２の溶解メタ過沃素酸ナトリウムを含有する水２５０ｒ
ｎｔに再懸濁させることにより酸化させた。１０分後樹
脂を５Ｘ２５０−の水、次いで０．１モル燐酸ナトリウ
ムバッファー（ｐＨａ、５　）１０００−で洗った。デ
カントさせた樹脂（〜２５０−の沈降法容積）を次いで
１２５ηのす）　ＩＪウムシアノボロハイドライドを含
有する１２５−の０．１モル燐酸ナトリウムバッファー
（ｐＨａ５）でスラリー化させた。２４時間絶えず混合
した後樹脂を３Ｘ５００ｔｎｔの水、５［１０ｍ１の０
．１５モル燐酸ナトリウム（ｐＨ７，８）で洗い、そし
て１２５−の０．１５モル燐酸ナトリウム（ｐＨａ５）
に４℃で再懸濁させた。無水酢酸（１，２５ｄ）をスラ
リーに加えそして３０分間混合しつつ４℃で反応さ−せ
た。樹脂を１２のＯ，ＳモルＮａＣｊＬ、４あの蒸留水
および２２の０．１５モル燐酸ナトリウム（ｐＨ７，１
）で完全に洗った。最終樹脂をａＣａ［Ｆ］独立臨床ア
ナライザーテストパックの通水管中に位置させるように
設計されている小形カラム（０，５ｃｍ×８３）中にス
ラリー状で充填させた。

Ｃ０二価抗体簿素コンジュゲートを使用するジゴキシン
−ＢＳＡ−セファデックス樹脂とウアバイン−ＢＳＡ−
セファデックス樹脂の比較 同一条件下に両樹脂ロットを比較した。前記（Ａ）で合
成されたＦ　（ａｂす２−β−ガラクト７ダーゼ（２０
０μ℃のバッファー中２．６ピコモル）を種々の量のジ
ゴキシン（０、Ｑ、５．１，５．３．５および５、０　
ｎＰ　７ｍｌ　　）を含有する正常人血清標準液２００
戒に加えた。１０分間Ｄ２５℃における培養時間の後、
全抗体−試料混合物を自動的にａｃａ［Ｆ］独立臨床ア
ナライザーテストパックに注入し、そしてパック通水管
中のカラムと通して溶出させた。試料につづいて２ｒｎ
ｔのＱ、１５モル燐酸ナトリウムｐＨ７，８ｋ流した。

カラム流速は３４Ａし秒であった。次いで針位置２（カ
ラムバイノξス）においてノぞツクに更に２．６−の水
を充填した。

０ＮＰＧは約３．５分後にブレーカ−／ミキサー■から
放出された。酵素活性は４０５　ｎｍで、基質添加後２
９および４６秒で測定された。

第１図および表■によシバツクグラウンドおよび傾斜感
度（第１図）および精度（表■）に関して２つの至適化
させたジゴキシン−ＢＳＡ　−セファデックスおよびウ
アバイン−ＢＳＡ−セファデックス樹脂の性能を比較す
る。

両樹脂ロットはＦ（ａｂす２−β−ガラクトシダーゼコ
ンジュゲートに関して直線状薬景感応と可能にするが、
ウアバイン−樹脂はより低いバックグラウンド（３２％
低い）およびより大きな傾斜感度（４７チ大きい）の両
方と示した。より低いバックグラウンドおよびより高い
傾斜感度はよシ良好な検定性能および精度にとって好ま
しいものである。更に検定精度はジゴキシン樹脂に対す
るよシもウアバイン樹脂に対して顕著でより良好であっ
た（表■）。個々の・ξツク検定は前記と全く同様にし
て２つのジゴキシン濃度、０．５ｎｆ／−および１．５
ｎＰ／−で実施された。

各薬剤１１度に対して少くとも１２の・ξツクが操作さ
れた。そして平均値（Ｘ）、標準偏差（Ｓ、Ｄ、　）お
よび変動係数／％）（Ｃ！、Ｖ、）が：測淀された。

表　　■ 精度に対する、ウアバイン樹脂とジゴキシン樹脂の比較
Ｘ（ｎｙ鷹）　　　　　　　０．４７　　　　　　０．
４５Ｓ、Ｄ、　（ｎＰ／ｍｌ）　　　　　０．０４　　
　　　　０．０７ｃ、Ｖ、（％）（ｎｒ／＊）　　　　
ｅ、、１１４．２Ｘ（ｎ５Ｊ／ｍｇ）　　　　　　　１
．５２　　　　　　１．５４Ｓ、Ｄ、（ｎ７廁）　　　
　　Ｑ、０５　　　　　　　０．２０Ｃ，Ｖ、５）（１
’／＊）　　　　３［１３，１

【図面の簡単な説明】

添付図面はジゴキシンカラムとウアバインカラムを用い
た場合の傾斜感度を表わすグラフである。 ジゴキシンＣｎ？／ｍｌ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （ａ）標識抗ジゴキシン抗体、 （ｂ）それに結合させたウアバインを有する固体相、お
   よび （ｃ）後記キットの使用指示 からなる液体試料中のジゴキシン量を測定するためのテ
   ストキット。