JPS6263525A - モノクロ−ナル抗体 - Google Patents
モノクロ−ナル抗体Info
- Publication number
- JPS6263525A JPS6263525A JP60203934A JP20393485A JPS6263525A JP S6263525 A JPS6263525 A JP S6263525A JP 60203934 A JP60203934 A JP 60203934A JP 20393485 A JP20393485 A JP 20393485A JP S6263525 A JPS6263525 A JP S6263525A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- antibody
- tetanus
- monoclonal antibody
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- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、ヒトモノクローナル抗体に関する。
さらに詳しくは、破傷風毒素のフラグメントを認識する
モノクローナル抗体に関する。
モノクローナル抗体に関する。
本発明に係る破傷風毒素に対するモノクローナル抗体は
、その産生に用いる細胞系がヒト由来のものであること
から、産生される抗体は抗原性に関する問題がない点に
おいて臨床治療上大きな効果をもたらす発明である。
、その産生に用いる細胞系がヒト由来のものであること
から、産生される抗体は抗原性に関する問題がない点に
おいて臨床治療上大きな効果をもたらす発明である。
破傷風抗体は破傷風菌による感染を受けた人に投与する
ことにより、破傷風の発症を防止する効果のあることが
判っている。また、破傷風発症の防止と共に破傷風抗体
の投与により感染を未然に防ぐことも次第に明らかにな
っており、医学的に貢献度の高いものとして期待されて
いる。
ことにより、破傷風の発症を防止する効果のあることが
判っている。また、破傷風発症の防止と共に破傷風抗体
の投与により感染を未然に防ぐことも次第に明らかにな
っており、医学的に貢献度の高いものとして期待されて
いる。
ところで、一般に抗体にはポリクローナル抗体とモノク
ローナル抗体の二種類があるが、最近は増殖性を有する
癌化リンパ様細胞系を用いてモノクローナル抗体を製造
する技術が注目を集めている。このモノクローナル抗体
は、−個の抗原決定基に対してのみ反応する単一の抗体
であるが、その生産方法としては、現在、細胞融合法と
形質転換法がある。どちらも増殖性と抗体産生能を同時
に兼ね備えた細胞を調製するもので、前者は免疫された
供給者のＢ細胞を骨ＶＡ腫細胞とｉｎ ｖｉｔｒ。
ローナル抗体の二種類があるが、最近は増殖性を有する
癌化リンパ様細胞系を用いてモノクローナル抗体を製造
する技術が注目を集めている。このモノクローナル抗体
は、−個の抗原決定基に対してのみ反応する単一の抗体
であるが、その生産方法としては、現在、細胞融合法と
形質転換法がある。どちらも増殖性と抗体産生能を同時
に兼ね備えた細胞を調製するもので、前者は免疫された
供給者のＢ細胞を骨ＶＡ腫細胞とｉｎ ｖｉｔｒ。
で融合させる方法であり、後者は免疫した供給者のＢ細
胞をＥ Ｂ （Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ）ウィルス等
の向リンパ性ウィルスに感染させて増殖可能な形に変換
させる方法である。
胞をＥ Ｂ （Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒ）ウィルス等
の向リンパ性ウィルスに感染させて増殖可能な形に変換
させる方法である。
これらの製造方法は未だ未熟であり、その抗体産生量の
改善、毒素である抗原を使用することに対する安全対策
、夾雑抗原の精製の困難性の克服などの未解決の問題点
も多く、実用化には多くの困難がある。即ち、細胞融合
法を用いた場合は、融合効率の低さと、全リンパ球の中
に存在する抗破傷風抗体産生細胞の割合の低さにより、
満足のいく抗体産生ハイブリドーマは得られていない。
改善、毒素である抗原を使用することに対する安全対策
、夾雑抗原の精製の困難性の克服などの未解決の問題点
も多く、実用化には多くの困難がある。即ち、細胞融合
法を用いた場合は、融合効率の低さと、全リンパ球の中
に存在する抗破傷風抗体産生細胞の割合の低さにより、
満足のいく抗体産生ハイブリドーマは得られていない。
また、形質転換法を用いる場合、非常に高い確率で株化
細胞は得られるが、クローニング効率が数％と非常に低
いのが弱点である。
細胞は得られるが、クローニング効率が数％と非常に低
いのが弱点である。
また、生産される抗体の抗原性についての問題は、ヒト
と免疫反応を起こさない動物の細胞系を用いることによ
って解決されるが、一般的にはヒト由来の細胞系を用い
ることにより安全性が保た−れることが判っている。し
かし、この場合も抗体産生能および増殖性について必ず
しも満足な結果が得られるまでには至っていない。
と免疫反応を起こさない動物の細胞系を用いることによ
って解決されるが、一般的にはヒト由来の細胞系を用い
ることにより安全性が保た−れることが判っている。し
かし、この場合も抗体産生能および増殖性について必ず
しも満足な結果が得られるまでには至っていない。
本発明は、破傷風の予防、治療用として有用なヒトのモ
ノクローナル抗体を提供することを目的とするものであ
り、破傷風毒素に対して感作されたヒトのＢａ１ｌ胞を
向リンパ性ウィルスにより形質転換させることにより、
破傷風毒素のフラグメントに対して特異的に反応するモ
ノクローナル抗体を調製することに成功し、本発明を完
成した。
ノクローナル抗体を提供することを目的とするものであ
り、破傷風毒素に対して感作されたヒトのＢａ１ｌ胞を
向リンパ性ウィルスにより形質転換させることにより、
破傷風毒素のフラグメントに対して特異的に反応するモ
ノクローナル抗体を調製することに成功し、本発明を完
成した。
叩ち、本発明は、破傷風毒素のフラグメントを認識する
ヒトモノクローナル抗体である。
ヒトモノクローナル抗体である。
本発明において、抗体産生性細胞として向リンパ性ウィ
ルスによって形質転換されたヒト由来抗破傷風抗体産生
性ＢＩＩ［Ｉ胞を用いる。
ルスによって形質転換されたヒト由来抗破傷風抗体産生
性ＢＩＩ［Ｉ胞を用いる。
当該Ｂ細胞自体は既知の手段によって調製され、その調
製法としては、例えば次の如き方法が例示される。
製法としては、例えば次の如き方法が例示される。
当該Ｂ細胞を得るために使用される破傷風抗原としては
、破傷風菌が生成する分子量約１５万、等電点５．１の
蛋白毒素、菌体外毒素であり、通常、市販の無毒化トキ
ソイド、破傷風菌を培＃後、培養液を精製したもの等が
用いられる。こうして得られる破傷風抗原の抗原性を高
めておくために、蛋白変性剤の存在下、加熱処理を施す
ことも可能である。抗原はさらに免疫用に高度に精製し
ておくことが望ましい。
、破傷風菌が生成する分子量約１５万、等電点５．１の
蛋白毒素、菌体外毒素であり、通常、市販の無毒化トキ
ソイド、破傷風菌を培＃後、培養液を精製したもの等が
用いられる。こうして得られる破傷風抗原の抗原性を高
めておくために、蛋白変性剤の存在下、加熱処理を施す
ことも可能である。抗原はさらに免疫用に高度に精製し
ておくことが望ましい。
上記破傷風抗原によるＢ細胞の抗体産生の刺激は、ｉｎ
ｖｉｖｏあるいはｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。１ｎ
ｖｉｖｏの場合は、公知の方法を用いればよく、例えば
破傷風抗原（含水酸化アルミ）をヒトの皮肉に２〜３回
接種し、最終免疫の数日後、採血を行い、得られた血液
からＢ細胞を回収、精製することにより、所望のヒト由
来破傷風抗体産生性Ｂ細抱が得られる。また、ｉｎν１
ｔｒｏの場合は、Ｂ細胞を先にヒト生体外に取り出し、
そのまま、あるいは培養した後、破傷風抗原で刺激する
ことによって行われる。破傷風抗原による生体外での刺
激は、例えば精製抗原のｉ！！量と８８１）１胞とを３
０〜４０℃で、１０〜５０時間接触させることによって
行われ、一般的には培地中で行われる。Ｂ細胞の分離は
、好適にはファイコール・コンレイの比重遠心法によっ
て行われる。
ｖｉｖｏあるいはｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。１ｎ
ｖｉｖｏの場合は、公知の方法を用いればよく、例えば
破傷風抗原（含水酸化アルミ）をヒトの皮肉に２〜３回
接種し、最終免疫の数日後、採血を行い、得られた血液
からＢ細胞を回収、精製することにより、所望のヒト由
来破傷風抗体産生性Ｂ細抱が得られる。また、ｉｎν１
ｔｒｏの場合は、Ｂ細胞を先にヒト生体外に取り出し、
そのまま、あるいは培養した後、破傷風抗原で刺激する
ことによって行われる。破傷風抗原による生体外での刺
激は、例えば精製抗原のｉ！！量と８８１）１胞とを３
０〜４０℃で、１０〜５０時間接触させることによって
行われ、一般的には培地中で行われる。Ｂ細胞の分離は
、好適にはファイコール・コンレイの比重遠心法によっ
て行われる。
当該Ｂ細胞はまた、破傷風毒素に対する血中抗体価の高
いドナーの末梢血から分離して得ることもできる。
いドナーの末梢血から分離して得ることもできる。
かくして得られたＢ細胞は、向リンパ性ウィルスによっ
て増殖型に形質転換される。
て増殖型に形質転換される。
形質転換には、向リンパ性ウィルス、たとえばＥＢウィ
ルスが用いられる。当該ウィルスは正常細胞を増殖型の
細胞に形質転換させるウィルスとして知られる〔ネーチ
ャー（Ｎａｔｕｒｅ）２！Ｕ、４２０〜４２２ （１９
７７））。Ｂ９５−８由来ＥＢウイルス（マイコプラズ
マフリー Ｂ９５−８培地上清としてうる）を用い、予
め細胞転換可能量のウィルスを調製する。かくして調製
されたウィルスをＢ１）４＋胞の培養系培地に適量滴下
し、好ましくは３７℃において５〜２０日間接触させる
。ＢＩＩｌ胞の培養は、たとえば３７℃、５％ＣＯ２下
でＲＰＭ１）６４０＋１０〜２０％牛脂児血清中で行う
。
ルスが用いられる。当該ウィルスは正常細胞を増殖型の
細胞に形質転換させるウィルスとして知られる〔ネーチ
ャー（Ｎａｔｕｒｅ）２！Ｕ、４２０〜４２２ （１９
７７））。Ｂ９５−８由来ＥＢウイルス（マイコプラズ
マフリー Ｂ９５−８培地上清としてうる）を用い、予
め細胞転換可能量のウィルスを調製する。かくして調製
されたウィルスをＢ１）４＋胞の培養系培地に適量滴下
し、好ましくは３７℃において５〜２０日間接触させる
。ＢＩＩｌ胞の培養は、たとえば３７℃、５％ＣＯ２下
でＲＰＭ１）６４０＋１０〜２０％牛脂児血清中で行う
。
こうして形質転換により得られた増殖型Ｂ細胞を継代培
養し、この細胞から破傷風抗原に対する抗体を産生ずる
細胞を選別、濃縮する。
養し、この細胞から破傷風抗原に対する抗体を産生ずる
細胞を選別、濃縮する。
抗破傷風抗体を産生ずる細胞は、例えばＰＨＡ法、ＥＩ
Ａ法、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法等により追跡される。
Ａ法、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法等により追跡される。
この細胞をクローン化するには、例えば限界希釈法、軟
寒天法などを用いる。
寒天法などを用いる。
かくして、クローニングされたモノクローナル抗体産生
細胞株を、例えば０．５％生血清アルブミン含無血清培
地中で増殖させ、培地中に抗体を産生させる。
細胞株を、例えば０．５％生血清アルブミン含無血清培
地中で増殖させ、培地中に抗体を産生させる。
産生じたモノクローナル抗体の回収は、例えば免疫原で
固定化した担体を用いて行う。しかし、これに■られる
ものではなく、その他にも免疫グロブリンの回収、精製
法として知られるものも利用できる。例えばＤＥＡＥ−
イオン交換クロマトグラフィー、硫安分画法、ポリエチ
レングリコー−ル分画法、透析法、遠心分離法、アフィ
ニティクロマトグラフィー、ゲル濾過法などが挙げられ
る。
固定化した担体を用いて行う。しかし、これに■られる
ものではなく、その他にも免疫グロブリンの回収、精製
法として知られるものも利用できる。例えばＤＥＡＥ−
イオン交換クロマトグラフィー、硫安分画法、ポリエチ
レングリコー−ル分画法、透析法、遠心分離法、アフィ
ニティクロマトグラフィー、ゲル濾過法などが挙げられ
る。
また、これらを適宜組み合わせて用いることも可能であ
る。
る。
精製抗体は、水溶液中に濃度調製後、適当な安定剤、賦
形剤を添加させ、要すれば除菌濾過を行い、凍結乾燥を
行い、常法に従って製剤化することができる。
形剤を添加させ、要すれば除菌濾過を行い、凍結乾燥を
行い、常法に従って製剤化することができる。
か（して得られたモノクローナル抗体は、ＩｇＧλであ
り、破傷風形ｆのＢフラグメントのα鎖を特異的に認識
する。また、同様の方法で得たモノクローナル抗体は、
ＩｇＭλであって、ガングリオシドとの結合に関与して
いるβ鎖を認識する。
り、破傷風形ｆのＢフラグメントのα鎖を特異的に認識
する。また、同様の方法で得たモノクローナル抗体は、
ＩｇＭλであって、ガングリオシドとの結合に関与して
いるβ鎖を認識する。
このように、フラグメントに対するモノクローナル抗体
は、破傷風毒素に対する異なる抗原決定基を認識する抗
体を提供可能とし、これらの複数利用によって、治療薬
としてのモノクローナル抗体の効果の上昇が期待される
。
は、破傷風毒素に対する異なる抗原決定基を認識する抗
体を提供可能とし、これらの複数利用によって、治療薬
としてのモノクローナル抗体の効果の上昇が期待される
。
以下に本発明を実施例によって説明するが、本発明はこ
れらに限定されない。
れらに限定されない。
実施例１
１、ドナー スクリーニング
効率よく抗体産生細胞を樹立するために、まず破傷風ト
キソイド（ＴＴ）に対する皿中抗体価の高いドナーのス
クリーニングを行った。数十名のボランティアを対象に
、ＴＴをコートしたヒツジ赤血球（ＴＴ−３ＲＢＣ）を
用いる受身赤血球凝集反応（ＰＨＡ）で抗体価を測定し
た。この時用いたＴＴ−３ＲＢＣは、市販の抗破傷風ヒ
ト抗体［テクノプリン■Ｊ（２５０単位／バイアル、株
式会社ミドリ十字盟）の約２０万倍希釈サンプルを陽性
と判定することができる。このようなＴＴ−３ＲＢＣを
用いて測定した結果、はとんどのボランティアが１：８
以下の抗体を示した中で、１：２０４Ｂを示した１人を
ドナーとして選び出し、末梢血２００ｍ１を採血した。
キソイド（ＴＴ）に対する皿中抗体価の高いドナーのス
クリーニングを行った。数十名のボランティアを対象に
、ＴＴをコートしたヒツジ赤血球（ＴＴ−３ＲＢＣ）を
用いる受身赤血球凝集反応（ＰＨＡ）で抗体価を測定し
た。この時用いたＴＴ−３ＲＢＣは、市販の抗破傷風ヒ
ト抗体［テクノプリン■Ｊ（２５０単位／バイアル、株
式会社ミドリ十字盟）の約２０万倍希釈サンプルを陽性
と判定することができる。このようなＴＴ−３ＲＢＣを
用いて測定した結果、はとんどのボランティアが１：８
以下の抗体を示した中で、１：２０４Ｂを示した１人を
ドナーとして選び出し、末梢血２００ｍ１を採血した。
この末梢血から、Ｅロゼツト陰性、プラスチックシャー
レ非付着細胞を分離し、ＥＢウィルス（Ｅ Ｂ Ｖ）の
感染標的細胞として用いた。
レ非付着細胞を分離し、ＥＢウィルス（Ｅ Ｂ Ｖ）の
感染標的細胞として用いた。
２．２ＢＶトランスフオーメーシヨンによる抗ＴＴ抗体
産生細胞の樹立 分離した標的細胞は、細胞濃度が１０６．１０Ｓ、１０
４．１０３ｃｅｌｌｓ ／ｍｌとなるように、それぞれ
培地（ＲＰＭｌ １６４０ ＋ １０％牛脂児血清）
に浮遊させた。これらの細胞浮遊液に、ＥＢＶとして０
．４５μメンブランフィルタ−を通したＢ９５−８細胞
の７日間培養上清を１／１０量加え、９６ウエルマイク
ロプレートにウェル当りの細胞数が１０５．１０４．１
０３．１０２１［！ｉｔとなるようにそれぞれウェルに
分注し、３７°ｃ、５％ＣＯ２で培養した。週２回の培
地半量交換を行い培養を続けると、ウェル当り１０５個
の場合２週目より細胞の増殖が見られ、１０４．１０３
個の場合５週目に増殖細胞が確認できた。最終的にこの
実験で細胞の増殖が認められたのは、１０５個で１２０
ウエル中９４ウエル、同様に１０４個で２５つ亘ル、１
０３個で６ウエルであった。又、これらウェルの培養上
清の抗ＴＴ抗体活性をエンザイムーリンクト イムノソ
ルベント アッセイ （Ｅｎｚｙｍｅ−［，１ｎｋｅｄ
Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓ５ａｙ （Ｅ Ｌ
Ｉ Ｓ Ａ） ）法で調べた結果、１０５個の場合９
４ウエル中１３ウエル、１０４個の場合２５ウエル中４
ウエルが陽性で、しかもほとんどの場合ＩｇＭ抗体で、
■ｇＧ抗体のみは全部で３ウエルであった。
産生細胞の樹立 分離した標的細胞は、細胞濃度が１０６．１０Ｓ、１０
４．１０３ｃｅｌｌｓ ／ｍｌとなるように、それぞれ
培地（ＲＰＭｌ １６４０ ＋ １０％牛脂児血清）
に浮遊させた。これらの細胞浮遊液に、ＥＢＶとして０
．４５μメンブランフィルタ−を通したＢ９５−８細胞
の７日間培養上清を１／１０量加え、９６ウエルマイク
ロプレートにウェル当りの細胞数が１０５．１０４．１
０３．１０２１［！ｉｔとなるようにそれぞれウェルに
分注し、３７°ｃ、５％ＣＯ２で培養した。週２回の培
地半量交換を行い培養を続けると、ウェル当り１０５個
の場合２週目より細胞の増殖が見られ、１０４．１０３
個の場合５週目に増殖細胞が確認できた。最終的にこの
実験で細胞の増殖が認められたのは、１０５個で１２０
ウエル中９４ウエル、同様に１０４個で２５つ亘ル、１
０３個で６ウエルであった。又、これらウェルの培養上
清の抗ＴＴ抗体活性をエンザイムーリンクト イムノソ
ルベント アッセイ （Ｅｎｚｙｍｅ−［，１ｎｋｅｄ
Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓ５ａｙ （Ｅ Ｌ
Ｉ Ｓ Ａ） ）法で調べた結果、１０５個の場合９
４ウエル中１３ウエル、１０４個の場合２５ウエル中４
ウエルが陽性で、しかもほとんどの場合ＩｇＭ抗体で、
■ｇＧ抗体のみは全部で３ウエルであった。
３、抗体産生細胞のクローニング
ウェル当り１０４（囚でトランスフォーメーションを行
い、得られた４ウエルの抗ＴＴ抗体陽性ウェルは、他に
比べ比較的高い活性を示した。これらの中からＩｇＧ産
生を示したウェルの細胞（ＧＣ１０４−２４）をスケー
ルアンプし、クローニングを行った。当初、９６ウエル
マイクロプレートを用い、ウェル当り５個または１（固
となるように細胞を播種し、クローニングを試みたが、
細胞の増殖はまったく見られなかった。そこで、クロー
ニングに用いるマイクロプレートとして、Ｕ底プレート
、１／２エリアプレート（底面積が通常の平底プレート
の１／２）の使用や、フィーダー細胞の導入などクロー
ニング条件の改善を試みた。
い、得られた４ウエルの抗ＴＴ抗体陽性ウェルは、他に
比べ比較的高い活性を示した。これらの中からＩｇＧ産
生を示したウェルの細胞（ＧＣ１０４−２４）をスケー
ルアンプし、クローニングを行った。当初、９６ウエル
マイクロプレートを用い、ウェル当り５個または１（固
となるように細胞を播種し、クローニングを試みたが、
細胞の増殖はまったく見られなかった。そこで、クロー
ニングに用いるマイクロプレートとして、Ｕ底プレート
、１／２エリアプレート（底面積が通常の平底プレート
の１／２）の使用や、フィーダー細胞の導入などクロー
ニング条件の改善を試みた。
フィーダー細胞としては、ヒト胎児肺線維芽細胞（ＨＥ
Ｌ） 、ヒトさい帯静脈内皮細胞（ＨＵ Ｖ −ＥＣ）
、そしてマウス腹腔細胞（ＭＰＣ）を用い、これらの効
果を調べた。結果は、これら３種の細胞の中ではＨＥＬ
がフィーダー細胞として最も適していた。一方、ＨＵＶ
−ＥＣは、ＧＣ１０４−２４細胞のクローニングにはま
ったく効果がなかった。
Ｌ） 、ヒトさい帯静脈内皮細胞（ＨＵ Ｖ −ＥＣ）
、そしてマウス腹腔細胞（ＭＰＣ）を用い、これらの効
果を調べた。結果は、これら３種の細胞の中ではＨＥＬ
がフィーダー細胞として最も適していた。一方、ＨＵＶ
−ＥＣは、ＧＣ１０４−２４細胞のクローニングにはま
ったく効果がなかった。
用いたマイクロプレートの中では、１／２エリアプレー
トが最も有効であった。そこで、１／２エリアプレート
を用い、ＨＥＬをフィーダー細胞とした条件で、ウェル
当りの細胞数が１個となるようにしてクローニングを行
った。この方法を数回続けて行うことにより、安定に抗
体産生を続ける細胞（ＧＣ１０４−２４−ｃ８＞を得た
。この細胞の抗体産生能は、２年近く維持されている。
トが最も有効であった。そこで、１／２エリアプレート
を用い、ＨＥＬをフィーダー細胞とした条件で、ウェル
当りの細胞数が１個となるようにしてクローニングを行
った。この方法を数回続けて行うことにより、安定に抗
体産生を続ける細胞（ＧＣ１０４−２４−ｃ８＞を得た
。この細胞の抗体産生能は、２年近く維持されている。
一方、クローニングを行わなかった細胞は、およそ２ケ
月で抗体活性を消失した。
月で抗体活性を消失した。
４、ＧＣ１０クー２４−Ｃ８細胞の無血清培養無血清培
養の利点は、血清添加培地において経験されるロット差
の問題がなく、更に血清を用いないために精製が非常に
簡略化できることである。
養の利点は、血清添加培地において経験されるロット差
の問題がなく、更に血清を用いないために精製が非常に
簡略化できることである。
このような理由から、ＧＣ１０４−２４−Ｃａｘ胞の無
血清培養をＲＩＴＣ５５−９＋０．５％ヒト血清アルブ
ミン（Ｈ３Ａ）培地を用いて行った。
血清培養をＲＩＴＣ５５−９＋０．５％ヒト血清アルブ
ミン（Ｈ３Ａ）培地を用いて行った。
ＧＣＩ Ｏ４−２４−Ｃ８細胞の増殖と産生された抗Ｔ
Ｔ抗体の力価を、ＲＰＭＩ １６４０ ＋１０％生胎
児血清（Ｆｅ２）、Ｒ［ＴＣ５５−９＋０．５％Ｈ３Ａ
の両培地で比較した結果は、ＲＩＴＣ５５−９＋０．５
％Ｈ３Ａ培地では、最大細胞濃度がＲＰＭＩ １６４
０ ＋１０％ＦＣ３での約６０％と低いものであったが
、反対に培養上清中の抗体力価は数倍高いものであった
。
Ｔ抗体の力価を、ＲＰＭＩ １６４０ ＋１０％生胎
児血清（Ｆｅ２）、Ｒ［ＴＣ５５−９＋０．５％Ｈ３Ａ
の両培地で比較した結果は、ＲＩＴＣ５５−９＋０．５
％Ｈ３Ａ培地では、最大細胞濃度がＲＰＭＩ １６４
０ ＋１０％ＦＣ３での約６０％と低いものであったが
、反対に培養上清中の抗体力価は数倍高いものであった
。
５、ＧＣＩ Ｏ４−２４−Ｃ８細胞が産生ずる抗体の性
状 ＧＣＩ ０４−２４−０８ｍ胞が産生ずる抗体（ＧＣＩ
０４−２４−Ｃ８抗体）がＩｇＧであることはすでに
示したが、抗ヒトλやに抗体を用いるＥＬＩＳＡ法によ
り、ＩｇＧλであることを確認した。また、産生量は、
ヒトＩｇＧを標準品としてＥＬｒＳＡ法で測定すると、
４日間培養で細胞１０６個当り約０．５μｇであった。
状 ＧＣＩ ０４−２４−０８ｍ胞が産生ずる抗体（ＧＣＩ
０４−２４−Ｃ８抗体）がＩｇＧであることはすでに
示したが、抗ヒトλやに抗体を用いるＥＬＩＳＡ法によ
り、ＩｇＧλであることを確認した。また、産生量は、
ヒトＩｇＧを標準品としてＥＬｒＳＡ法で測定すると、
４日間培養で細胞１０６個当り約０．５μｇであった。
このＧＣＩＯ４−２４−ＣＢ抗体は、トランスフォーメ
ーション、クローニングしＴＴを用いてアッセイされて
きたので、破傷風毒素（ＴＴｘ）に対する反応性の有無
は不明であった。そこで、市販のＴＴｘ（カルビオ ケ
ム（Ｃｈａｌｂｉｏ Ｃｈｅｍ）社製〕を用い、ＥＬＩ
ＳＡ法とウェスタン ブロッティング法で反応性を調べ
た。ウェスタン ブロッティングを行う時のポリアクリ
ルアミド電気泳動は、ＳＤＳ非存非存在庁った。その結
果、ＧＣＩ ０４−２４−Ｃ８抗体は、ＴＴに対するの
と同様にＴＴｘに対して高い抗体活性を示し、しかも、
ＴＴｘをパパイン消化した場合に得られるＢフラグメン
トを認識していた。
ーション、クローニングしＴＴを用いてアッセイされて
きたので、破傷風毒素（ＴＴｘ）に対する反応性の有無
は不明であった。そこで、市販のＴＴｘ（カルビオ ケ
ム（Ｃｈａｌｂｉｏ Ｃｈｅｍ）社製〕を用い、ＥＬＩ
ＳＡ法とウェスタン ブロッティング法で反応性を調べ
た。ウェスタン ブロッティングを行う時のポリアクリ
ルアミド電気泳動は、ＳＤＳ非存非存在庁った。その結
果、ＧＣＩ ０４−２４−Ｃ８抗体は、ＴＴに対するの
と同様にＴＴｘに対して高い抗体活性を示し、しかも、
ＴＴｘをパパイン消化した場合に得られるＢフラグメン
トを認識していた。
又、ＴＴｘはガングリオシド０丁ノロ及びＧ Ｏ＃。
に親和性を示すことが知られており、ＧＣ１０４−２４
−Ｃ８抗体がＴＴｘとガングリオシドと“の結合にどの
ような影響を及ぼすかをＥＬＩＳＡ法を用いて調べた。
−Ｃ８抗体がＴＴｘとガングリオシドと“の結合にどの
ような影響を及ぼすかをＥＬＩＳＡ法を用いて調べた。
まず、ＥＬ Ｉ ＳＡ用の９６ウエルマイクロプレート
の各ウェルをガングリオシドでコーティングし、コーテ
ィングされなかった部分は１％ゼラチンＰ Ｂ Ｓ （
−）でブロッキングした。
の各ウェルをガングリオシドでコーティングし、コーテ
ィングされなかった部分は１％ゼラチンＰ Ｂ Ｓ （
−）でブロッキングした。
このようなウェルにＴＴｘまたは抗体処理ＴＴｘを入れ
反応させ、その後、抗破傷風ヒト抗体テクノプリン（Ｉ
ｇＧ画分）、酵素標識抗ヒトＩｇＧ抗体、そして反応基
質と順次反応させた。その結果、抗破傷風ヒト抗体処理
ＴＴｘでは、反応基質の発色がほとんど見られず、この
抗体がＴＴｘとガングリオシドとの結合を完全に阻害し
た。しかし、ＧＣＩ ０４−２４−Ｃ８抗体処理ＴＴｘ
では、反応基質の発色が非処理ＴＴｘの場合とほぼ同じ
ミー、す、ＴＴｘとガングリオシドとの結合に影響は認
められなかった。また、これとは反対に、ＴＴｘとガン
グリオシドの結合により、ＧＣ１０４−２４−Ｃ８抗体
のＴＴｘへの結合が阻害されるかどうかを調べたが、ま
ったく影響を受けず、この抗体は、非結合ＴＴｘと同様
にガングリオシド結合ＴＴｘに結合した。
反応させ、その後、抗破傷風ヒト抗体テクノプリン（Ｉ
ｇＧ画分）、酵素標識抗ヒトＩｇＧ抗体、そして反応基
質と順次反応させた。その結果、抗破傷風ヒト抗体処理
ＴＴｘでは、反応基質の発色がほとんど見られず、この
抗体がＴＴｘとガングリオシドとの結合を完全に阻害し
た。しかし、ＧＣＩ ０４−２４−Ｃ８抗体処理ＴＴｘ
では、反応基質の発色が非処理ＴＴｘの場合とほぼ同じ
ミー、す、ＴＴｘとガングリオシドとの結合に影響は認
められなかった。また、これとは反対に、ＴＴｘとガン
グリオシドの結合により、ＧＣ１０４−２４−Ｃ８抗体
のＴＴｘへの結合が阻害されるかどうかを調べたが、ま
ったく影響を受けず、この抗体は、非結合ＴＴｘと同様
にガングリオシド結合ＴＴｘに結合した。
これらの結果から１．ｍ（７）ＧＣＩＯ４−２４−Ｃ８
抗体が認識するＴＴｘ上の部位はガングリオシドとの結
合に関与しないα鎖であると判断された。
抗体が認識するＴＴｘ上の部位はガングリオシドとの結
合に関与しないα鎖であると判断された。
実施例２
実施例１で開示したＧＣＩ Ｏ’ −２４−Ｃ８細胞の
作製方法を繰り返し、ガングリオシドとの結合に関与し
ているβ鎖を認識する抗体（Ｉ ｇＭλ）産生細胞ＧＣ
Ｉ ０４−３−Ｃ６を得た。
作製方法を繰り返し、ガングリオシドとの結合に関与し
ているβ鎖を認識する抗体（Ｉ ｇＭλ）産生細胞ＧＣ
Ｉ ０４−３−Ｃ６を得た。
Claims (4)
- （１）破傷風毒素のフラグメントを認識するヒトモノク
ローナル抗体。 - （２）モノクローナル抗体が以下の特性を有する特許請
求の範囲第（１）項記載の抗体。 Ｉｇクラス：ＩｇＧλ 反応性：破傷風毒素のＢフラグメント のα鎖を認識する。 - （３）モノクローナル抗体が以下の特性を有する特許請
求の範囲第（１）項記載の抗体。 Ｉｇクラス：ＩｇＭλ 反応性：ガングリオシドとの結合に関与しているβ鎖を
認識する。 - （４）モノクローナル抗体が、ヒト由来抗破傷風抗体産
生性Ｂ細胞を向リンパ性ウィルスで形質転換することに
よって産生される特許請求の範囲第（１）、（２）また
は（３）項記載の抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60203934A JPS6263525A (ja) | 1985-09-13 | 1985-09-13 | モノクロ−ナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60203934A JPS6263525A (ja) | 1985-09-13 | 1985-09-13 | モノクロ−ナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6263525A true JPS6263525A (ja) | 1987-03-20 |
Family
ID=16482107
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60203934A Pending JPS6263525A (ja) | 1985-09-13 | 1985-09-13 | モノクロ−ナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6263525A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0257195A (ja) * | 1988-08-19 | 1990-02-26 | Morinaga & Co Ltd | 抗破傷風毒素ヒト型モノクローナル抗体、それを利用した破傷風毒素中和剤及びヒト型モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ |
| JP2014518080A (ja) * | 2011-06-27 | 2014-07-28 | バルネバ | 細胞のスクリーニング方法 |
-
1985
- 1985-09-13 JP JP60203934A patent/JPS6263525A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0257195A (ja) * | 1988-08-19 | 1990-02-26 | Morinaga & Co Ltd | 抗破傷風毒素ヒト型モノクローナル抗体、それを利用した破傷風毒素中和剤及びヒト型モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ |
| JP2014518080A (ja) * | 2011-06-27 | 2014-07-28 | バルネバ | 細胞のスクリーニング方法 |
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