JPS6256491A - Production of high-purity methylcobalamin - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To obtain the titled compound useful as a remedy for peripheral neuropathy, etc., by methylating cyanocobalamin, adjusting the pH, bringing the resultant reaction mixture into contant with silica gel and then divinylbenzene/styrene based polymer chromatographic column one after another, eluting the adsorbed substance, concentration the eluate and crystallizing the compound. CONSTITUTION:Cyanocobalamin is methylated by a conventional method, e.g. reduction and methylation, etc., to give a reaction mixture consisting essentially of methylcobalamin. The resultant reaction mixture is then adjusted to 2.5-7.0 pH, passed through a silica gel column and adsorbed. A lower aliphatic alcohol-water mixture or aliphatic ketone-water mixture is discharged to the adsorbed substance and a lower aliphatic alcohol-water mixture is discharged to the adsorbed substance to distill away the adsorbed substance. The resultant distillate is then brought into contact with a divinylbenzene/styrene based copolymer chromatographic column. In the process, the concentration of the lower aliphatic alcohol-water, etc., is increased from the lower to the higher concentration stepwise to elute the adsorbed substance. The adsorbed substance is finally desorbed with a lower aliphatic ketone-water mixture and the distillate is then concentrated. A lower aliphatic ketone is then added thereto to crystallize the aimed compound.

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、医薬として実用に供しつる高純度のメチルコ
バラミンの製造方法に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Field of Industrial Application The present invention relates to a method for producing highly pure methylcobalamin that can be practically used as a medicine.

従来の技術 メチルコバラミンは、血液および髄液存在型の補酵素型
ＢＩ２として、神経細胞などの組織移行性に優れている
。生化学的にはメチル基転移反応に関与し、核酸・蛋白
・脂質代謝においてＢ１□同族体の中で最も優れた生体
内活性を示す。臨床的には。BACKGROUND OF THE INVENTION Methylcobalamin, as a coenzyme type BI2 present in blood and cerebrospinal fluid, has excellent migration properties into tissues such as nerve cells. Biochemically, it is involved in methyl group transfer reactions, and exhibits the highest in vivo activity among B1□ homologs in nucleic acid, protein, and lipid metabolism. Clinically.

巨歩芽球性貧血に有効であるのみならず、糖尿病性神経
障害、多発性神経炎などの末梢性神経障害治療剤として
有効である。It is effective not only for macroblastic anemia but also as a therapeutic agent for peripheral neuropathies such as diabetic neuropathy and polyneuritis.

メチルコバラミンの製法についての種々の方法が知られ
ているが９代表的な方法としては例えば出発原料として
シアノコバラミンを使用する方法がある（特公昭４５−
３８０５９）。Various methods are known for the production of methylcobalamin.9 A typical method is, for example, a method using cyanocobalamin as a starting material (Japanese Patent Publication No. 1973-
38059).

発明が解決しようとする問題点 この合成法によって得られたメチルコバラミン含有溶液
中には、微量のシアノコバラミン、ヒドロキソコバラミ
ン、更に黄色物質、塩類などが含有されている。したが
って、いかにしてこれらのメチコバール以外の挾雑成分
を除き、高純度のメチルコバラミンを得るかが問題であ
る。Problems to be Solved by the Invention The methylcobalamin-containing solution obtained by this synthesis method contains trace amounts of cyanocobalamin, hydroxocobalamin, yellow substances, salts, and the like. Therefore, the problem is how to remove these interfering components other than methicobal and obtain highly pure methylcobalamin.

これらの挾雑成分を除去する方法としては、これらの物
質は塩類を除いてその性質が近似しているため、吸着性
の差を利用した方法２例えば、イオン交換樹脂クロマト
グラフィーによる方法および水−ア七トン結晶化法など
がすでに知られている。As methods for removing these interfering components, since these substances have similar properties except for salts, there are two methods that take advantage of the difference in adsorption properties, such as a method using ion exchange resin chromatography and a water-based method. A seven-ton crystallization method is already known.

しかしながら、これらの方法は１次のような欠点を有す
る。すなわち、イ木ン交換樹脂受側クロマトグラフィー
による方法は、イオン交換樹脂が高価なため、再利用す
るための別途設備を要するという欠点を有し、また水−
ア七トン結晶化法では化学的性質が近似しているため２
　メチルコバラミンの分離精製は困難であるという欠点
を有している。However, these methods have the following drawbacks. That is, the method using ion-exchange resin receiving side chromatography has the drawback that the ion-exchange resin is expensive and requires separate equipment for reuse.
Since the chemical properties are similar in the a7ton crystallization method, 2
Methylcobalamin has the disadvantage that it is difficult to separate and purify it.

問題点を解決するための手段 そこで２本発明者等は、これらの欠点を有しない高純度
メチルコバラミンを得るため、長年にわたって研究を重
ねてきたが１次の手段により解決できることを見い出し
２本発明を完成した。すなわち。Means for Solving the ProblemsThe inventors of the present invention have conducted research for many years in order to obtain high-purity methylcobalamin that does not have these drawbacks, and have found that the problem can be solved by the following means.2The present invention has been made. completed. Namely.

シアノコバラミンを常法によりメチル化して。Methylate cyanocobalamin using a conventional method.

メチルコバラミンを主成分とする反応混合物を得。A reaction mixture containing methylcobalamin as the main component was obtained.

この反応混合物を出発物質としてこれを精製し。This reaction mixture was used as a starting material to purify it.

高純度のメチルコバラミンを得る工程において。In the process of obtaining high purity methylcobalamin.

次の５つの工程を結合することを特徴とする高純度のメ
チルコバラミンの製造法 ■　反応混合液のｐＨを約２．５〜７．０に調整する工
程。A method for producing highly pure methylcobalamin characterized by combining the following five steps. (1) A step of adjusting the pH of the reaction mixture to about 2.5 to 7.0.

■　シリカゲルに接触させ、該吸着物に低級脂肪族アル
コール−水または低級脂肪族ケトン−水を流出せしめる
工程。(2) A step of bringing into contact with silica gel and causing lower aliphatic alcohol-water or lower aliphatic ketone-water to flow out into the adsorbed material.

（■　次いで該吸着物に、低級脂肪族アルコール−水を
流出せしめ、吸着物を留出する工程。(2) Next, lower aliphatic alcohol-water is allowed to flow out into the adsorbent, and the adsorbate is distilled out.

■　該留出液をジビニルベンゼン／スチレン系共重合体
樹脂クロマトグラフィーと接触させ、その際低級脂肪族
アルコール−水または低級脂肪族ケトン−水を低濃度か
ら段階的に濃度をあげて溶出せしめる工程。(2) A step in which the distillate is brought into contact with divinylbenzene/styrene copolymer resin chromatography, and lower aliphatic alcohol-water or lower aliphatic ketone-water is eluted from a low concentration by increasing the concentration stepwise. .

■　吸着部を低級脂肪族ケトン−水を流出して吸着物を
脱着せしめ、該留出液を濃縮し、低級脂肪族ケトンを加
えて結晶化させ、結晶部より高純度のメチルコバラミン
を得る工程 出発物質として用いるメチルコバラミンを主成分とする
反応混合物とは、シアノコバラミンを常法によりメチル
化して得られるが、具体的に代表的な方法を述べれ６ば
９例えば特公昭４５−３８０５９実施例３に記載されて
いる方法であり２本法によれば、主成分としてのメチル
コバラミンのほか。■ A step of draining the lower aliphatic ketone-water from the adsorption section to desorb the adsorbate, concentrating the distillate, adding lower aliphatic ketone to crystallize it, and obtaining highly purified methylcobalamin from the crystallization section. The reaction mixture containing methylcobalamin as a main component used as a starting material is obtained by methylating cyanocobalamin by a conventional method. According to the method described and two methods, in addition to methylcobalamin as the main component.

不純物トしてシアノコバラミン、ヒドロキシコバラミ：
／、　Ｍｅ−Ｃｏｎｐ、　ＮａＣ１！などの塩類などを
含有するものである。Impurities such as cyanocobalamin and hydroxycobalamin:
/, Me-Comp, NaC1! It contains salts such as.

本発明は、これを出発物質として不純物を除去し、高純
度のメチルコバラミンを得る方法であるが、上記の工程
を更に詳細に述べれば次のとおりである。The present invention is a method for obtaining highly pure methylcobalamin by using this as a starting material and removing impurities. The above steps will be described in more detail as follows.

■の工程 反応混合物のｐＨを約２．５〜７．０に調整する工程で
あるが２通常は希塩酸水溶液、好ましくは０．０３Ｎ以
下の希塩酸を用いておこなう。ｐＨは５前後が最も好ま
しい。この範囲のｐＨに調整することによって吸着量の
増加と溶出分難に著しく効果がある。ｐＨ７，０を超え
た場合は未分離となり不利である。Step (2) This step is to adjust the pH of the reaction mixture to about 2.5 to 7.0.2 It is usually carried out using a dilute aqueous hydrochloric acid solution, preferably dilute hydrochloric acid of 0.03N or less. The pH is most preferably around 5. Adjusting the pH to within this range has a significant effect on increasing the amount of adsorption and reducing the difficulty of elution. If the pH exceeds 7.0, it will not be separated, which is disadvantageous.

（のの工程 このメチル化反応液を、シリカゲルに接触さぜる工程で
ある。シリカゲルとしては例えばシリカゲル−４０（メ
ルク社製）などを用いる。シリカゲル−４０は、比表面
積が６５０　ｍ　／　、！ｉ’で他のシリカ１ゲルに比
し大きく吸着に有利である。(This step is a step in which the methylation reaction solution is brought into contact with silica gel. For example, silica gel-40 (manufactured by Merck & Co., Ltd.) is used as the silica gel. Silica gel-40 has a specific surface area of 650 m / ! i' is much more advantageous for adsorption than other silica 1 gels.

溶出は、低級脂肪族アルコール−水または低級脂肪族ケ
トン−水、好ましくはメタノールを用い。For elution, use lower aliphatic alcohol-water or lower aliphatic ketone-water, preferably methanol.

ｓｖ　Ｏ，７でおこなうことが好結果を与える。メタノ
ールは約５９６のアセトンが好ましい。Performing with sv O,7 gives good results. Methanol is preferably about 596 acetone.

この操作により、目的物質は吸着部にあり、塩化ナトリ
ウム、ヒドロキシコバラミンなどが非吸着部分として除
かれる。By this operation, the target substance is present in the adsorption part, and sodium chloride, hydroxycobalamin, etc. are removed as non-adsorbed parts.

■の工程 目的物質であるメチルコバラミンを含む吸着物に、更に
低級脂肪族アルコール類−水を流出せしめ、吸着物を留
出する工程である。この際ｓｖは０．５〜１．０の範囲
でおこなうことが好ましい。Step (2) This is a step in which lower aliphatic alcohol-water is further allowed to flow out into the adsorbate containing methylcobalamin, which is the target substance, and the adsorbate is distilled out. At this time, it is preferable that sv is in the range of 0.5 to 1.0.

低級脂肪族アルコール類とは、メ、タノール、エタノー
ル、プロパツール、ブタノールなどがあげられるが、メ
タノールが最も好ましい。メタノールの濃度は１５９６
前後が好ましい結果を与える。Examples of lower aliphatic alcohols include methanol, ethanol, propatool, butanol, and the like, with methanol being the most preferred. The concentration of methanol is 1596
Before and after gives favorable results.

この工程により目的物質であるメチルコバラミンは非吸
着部分にあり、吸着されるのは黄色不純物である。非吸
着部分には、メチルコバラミンのほか、シアノコバラミ
ンが存在するものと考えられる。Through this process, the target substance, methylcobalamin, is present in the non-adsorbed portion, and what is adsorbed is the yellow impurity. It is thought that cyanocobalamin is present in the non-adsorbed portion in addition to methylcobalamin.

■の工程 該留出液を、ジビニルベンゼン／スチレン系共重合体樹
脂に接触させる工程である。Step (2) This is a step in which the distillate is brought into contact with a divinylbenzene/styrene copolymer resin.

ジビニルベンゼン／スチレン系共重合体はポリスチレン
系のもので、構造的には下記の構造（Ｉ）を有している
。The divinylbenzene/styrene copolymer is polystyrene-based and structurally has the following structure (I).

具体例をあげれば９例えばダイヤイオンＨＰ　−２０ま
たはダイヤイオンＨＰ　−４０などをあげることができ
る。Specific examples include Diaion HP-20 and Diaion HP-40.

溶出は、低級脂肪族アルコール−水、または低級脂肪族
ケトン−水でおこなうが、最も好ましいのは、１０％ア
セトン水溶液でＳＶは１．０程度である。Elution is carried out using lower aliphatic alcohol-water or lower aliphatic ketone-water, but most preferably a 10% acetone aqueous solution with an SV of about 1.0.

この操作により、非吸着部分にはシアノコバラミンが、
吸着部分には、目的物であるメチルコバラミンが存在す
る。Through this operation, cyanocobalamin is present in the non-adsorbed area.
The target substance, methylcobalamin, is present in the adsorption part.

■の工程 吸着部から目的物質であるメチルコバラミンを得る方法
である。Step (2) This is a method for obtaining the target substance methylcobalamin from the adsorption section.

具体的には、低級脂肪族ケトン、好ましくは２０％アセ
トン水溶液を、上記カラムにｓ　ｖ　１．０で流し。Specifically, a lower aliphatic ketone, preferably a 20% acetone aqueous solution, is passed through the above column at s v 1.0.

目的物を脱着せしめたのち、更に低級脂肪族ケトン、好
ましくはアセトンで結晶化し、常法により目的物である
メチルコバラミンを得ることができる。After the target product is desorbed, it is further crystallized with a lower aliphatic ketone, preferably acetone, and the target product, methylcobalamin, can be obtained by a conventional method.

本発明のメリットを要約すると次のとおりである。The advantages of the present invention are summarized as follows.

（１）高純度拳高収帛のメチルコバラミンを得る工業的
な方法である。(1) It is an industrial method for obtaining highly purified methylcobalamin in high yield.

（２）本性では、シリカゲルクロマトおよびジビニルベ
ンゼン／スチレン系共重合体樹脂クロマトの再精製工程
を食塩および低級アルコールおよび低級ケトンの水溶液
で、同一カラム内溶出除去をおこなうため、大幅な時間
短縮と、精製設備が不要である。(2) In the original process, the repurification process of silica gel chromatography and divinylbenzene/styrene copolymer resin chromatography is performed by elution and removal within the same column using an aqueous solution of common salt, lower alcohol, and lower ketone, which significantly shortens the time. No purification equipment is required.

次に２本発明の代表的な実施例を掲げるが２本発明がこ
れらのみに限定されることがないことはいうまでもない
。Next, two representative examples of the present invention will be listed, but it goes without saying that the present invention is not limited to these only.

実施例１ シアノコバラミンからメチルコバラミンを製造する方法
（特公昭４５−３８０５９）にしたがい、還元・メチル
化反応（シアノコバラミン８．０．９）ヲオこない２反
応溶液から残余のヨードメチルを濃縮留去し、　９５９
６メチルコバラミン含有メタノール−水溶液６００　ｃ
ｃを得た。Example 1 According to the method for producing methylcobalamin from cyanocobalamin (Japanese Patent Publication No. 45-38059), the reduction and methylation reaction (cyanocobalamin 8.0.9) was carried out. 2 The remaining iodomethyl was concentrated and distilled off from the reaction solution.
6 Methylcobalamin-containing methanol-aqueous solution 600 c
I got c.

溶液を希塩酸水溶液（０，０３Ｎ以下）にて、　　ｐＨ
５，０に調整した後、シリカゲ／ｌ／　（Ｋｉｅｓｅｌ
ｇｅｌ−４０メルり社製）５００ｃｃが充填されたカラ
ムにｓ　ｖ　Ｑ、５の流速で吸着させる。次いで、５％
メタノール水溶液５００　ｃｃを５ＶＯ９７にて溶出し
、ヒドロキソコバラミン、食塩および金属錯体塩（可溶
化物）の除去をおこなう。次いで、１５％メタノール水
溶液１５００ｃｃをｓ　ｖ　０．５で流し、　９９９６
メチルコバラミン、微量のシアノコバラミンを含有する
溶液１０００　ｍｌ、を溶出した。この溶液をジビニル
ベンゼン・スチレン共重合体樹脂（ダイヤイオンＨＰ　
−２０）　１０００ｃｃが充填されているカラムに導き
、ｓｖＯ，５で吸着せしめ。Adjust the solution to pH with dilute aqueous hydrochloric acid solution (0.03N or less).
After adjusting to 5,0, silicage/l/ (Kiesel
It is adsorbed onto a column packed with 500 cc of gel-40 (manufactured by Merli) at a flow rate of s v Q, 5. Then 5%
Elute 500 cc of methanol aqueous solution with 5VO97 to remove hydroxocobalamin, common salt, and metal complex salt (solubilized material). Next, 1500 cc of 15% methanol aqueous solution was poured at s v 0.5, and 9996
1000 ml of a solution containing methylcobalamin and trace amounts of cyanocobalamin was eluted. Add this solution to divinylbenzene/styrene copolymer resin (Diaion HP)
-20) Guided to a column packed with 1000cc and adsorbed at svO,5.

続いて１０９６ア七トン水溶液４０００　ｃｃをｓ　ｖ
　１．０で流し、シアノコバラミンを除去し、続いて２
０％ア七トン水溶液１５００ｃｃをＳｖｌ、０で流し、
メチルコバラミン１０００　ｃｃを溶出した。これを６
０℃以下で減圧。Subsequently, sv
Run at 1.0 to remove cyanocobalamin, followed by 2
Pour 1500 cc of 0% aqueous solution at Svl, 0,
1000 cc of methylcobalamin was eluted. This is 6
Depressurize below 0℃.

濃縮し、　１００ｃｃ水溶液とした。これにアセトン１
００　ｃｃ加えて、４０℃に溶解後、アセトン８００Ｃ
Ｃを徐々に滴下、結晶化をおこない、メチルコバラミン
ｑ、４ｐｃ収率９２４５％）を得た。結晶はＨＰＬＣ法
で含量測定の結果メチルコバラミン９９．９％であり。It was concentrated to make 100 cc of an aqueous solution. Add 1 part of acetone to this
Add 00 cc and dissolve at 40℃, then add acetone 800C
C was gradually added dropwise to effect crystallization to obtain methylcobalamin q (4 pc, yield 9245%). The content of the crystals was determined by HPLC and was found to be 99.9% methylcobalamin.

シアノコバラミンは検出されなかった。Cyanocobalamin was not detected.

Claims (1)

【特許請求の範囲】[Claims] （１）シアノコバラミンを常法によりメチル化して、メ
チルコバラミンを主成分とする反応混合物を得、この反
応混合物を出発物質としてこれを精製し、高純度のメチ
ルコバラミンを得る工程において、次の５つの工程を結
合することを特徴とする高純度のメチルコバラミンの製
造法 ［１］反応混合液のｐＨを約２．５〜７．０に調整する
工程、 ［２］シリカゲルに接触させ、該吸着物に低級脂肪族ア
ルコール−水または低級脂肪族ケトン−水を流出せしめ
る工程、 ［３］次いで該吸着物に、低級脂肪族アルコール−水を
流出せしめ、吸着物を留出する工程、 ［４］該留出液をジビニルベンゼン／スチレン系共重合
体樹脂クロマトグラフィーと接触させ、その際、低級脂
肪族アルコール−水または低級脂肪族ケトン−水を低濃
度から段階的に濃度をあげて溶出せしめる工程、 ［５］吸着部を、低級脂肪族ケトン−水を流出して吸着
物を脱着せしめ、該留出液を濃縮し、低級脂肪族ケトン
を加えて結晶化させ、結晶部より高純度のメチルコバラ
ミンを得る工程(1) Cyanocobalamin is methylated by a conventional method to obtain a reaction mixture containing methylcobalamin as a main component, and this reaction mixture is used as a starting material to purify it to obtain highly pure methylcobalamin. A method for producing high-purity methylcobalamin characterized by combining the following steps: [1] Adjusting the pH of the reaction mixture to about 2.5 to 7.0; [2] Bringing the reaction mixture into contact with silica gel to remove the adsorbent. a step of causing lower aliphatic alcohol-water or lower aliphatic ketone-water to flow out, [3] a step of then allowing lower aliphatic alcohol-water to flow out to the adsorbent, and distilling the adsorbent, [4] a step of distilling the adsorbent. Contacting the distillate with divinylbenzene/styrene copolymer resin chromatography, at which time lower aliphatic alcohol-water or lower aliphatic ketone-water is eluted from a low concentration by increasing the concentration stepwise; [5] The lower aliphatic ketone-water is drained from the adsorption part to desorb the adsorbed matter, the distillate is concentrated, and the lower aliphatic ketone is added to crystallize it, and highly purified methylcobalamin is extracted from the crystal part. process of obtaining