JPS62502444A - Highly repeatable antigen of Plasmodium falciparum - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 プラズモジウム・ファルシパルムの高い反復性を有する抗原 本発明は、プラズモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃ ｉｐａｒｕｍ　）の高い反復性を有する抗原の同定および生産、並びにこれらの 抗原をコードしでいる塩基配列の全部または一部に実質上対応しでいる。[Detailed description of the invention] Highly repeatable antigen of Plasmodium falciparum The present invention relates to Plasmodium falciparum (Plasmodium falciparum). identification and production of antigens with high repeatability of It substantially corresponds to all or part of the base sequence encoding the antigen.

人工的に組立てられたポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子に関するものであ る。It pertains to DNA molecules containing artificially assembled polynucleotide sequences. Ru.

最も重篤な形のヒトマラリアを引き起こす原生動物。protozoan that causes the most severe form of human malaria.

プラズモジウム・ファルシパルムに対する免疫は、長年の広範な暴露の後にのみ 獲得される。ヒトでの天然の免疫原とじで多数のＰ、ファルシパルム・　ポリペ プチドがあるが、その内、どれだけのものが防御免疫においで重要性を有するか は、全く明らかでない。多くの抗原がその様な役割を持たず、実際、それらは集 団的に免疫系に過剰に負荷されるので、その内のいくつかは、反生産的（カウン タープロダクティブ）に作用しでいる可能性がある。多くのＰ、ファルシパルム 抗原に株特異性のあることが明らかにされでおり、異なる寄生虫株間での抗原の 多様性が免疫回避に一役を担っているのかもしれない。Immunity to Plasmodium falciparum only develops after years of extensive exposure be acquired. Numerous P, falciparum polype in humans due to natural immunogen binding However, how many of them are important in protective immunity? is not at all clear. Many antigens have no such role; in fact, they are Collectively, the immune system is overburdened, some of which becomes counterproductive (counterproductive). terproductive). Many P, falciparum It has been shown that antigens are strain-specific, and antigens can be expressed between different parasite strains. Diversity may play a role in immune evasion.

この複雑な混合物中の個々の抗原の役割に関する研究は、近年、クローンされた 配列を発現する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　）を免疫学的にス クリーニングすすことによりＰ、ファルシパルム抗原を同定する方法（１，２） 　が開発された結果、容易になった。意外なことに、これまでに研究されたプラ ズモジウム抗原は全て、オリゴペプチド類の複数のタンデム反復を含有しでいる ことが分った。これらの分子の幾つかにおける反復にみられる著しい特徴は１分 子のアミノ酸レベルで正確に反復されていることである。各抗原内においで、反 復部分は荷電アミノ酸に富む領域と境界を接しでいる（３．４）。これまで報告 された抗原は全て寄生虫の外部にある。Studies on the role of individual antigens in this complex mixture have recently been cloned. Escherichia coli expressing the sequence was immunologically isolated. Method for identifying P. falciparum antigen by cleaning rinse (1, 2) As a result of the development of , it has become easier. Surprisingly, the plastics that have been studied so far All Zumodium antigens contain multiple tandem repeats of oligopeptides. I found out. A striking feature of the repeats in some of these molecules is the 1 minute It is precisely repeated at the amino acid level of the child. Within each antigen, The reverse portion borders a region rich in charged amino acids (3.4). Reported so far All antigens detected are external to the parasite.

本発明は、それ以後におけるｐ、ファルシパルム由来の抗原類の発見に基づくも のであり、それらは、本明ｍｌＦ中ではヒスチジン−アラニン豊富−小タンパク 質（Ｓｍａｌｌ　Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ　−Ａｌａｎｉｎｅ　Ｒｉｃｈ　Ｐｒｏｔ ｅｉｎ　。The present invention is based on the subsequent discovery of antigens derived from P. falciparum. and they are histidine-alanine rich-small protein in the present mlF. Quality (Small Histidine - Alanine Rich Prot ein.

５ＨＡＲＰ　）Ｃ以前には２１に一ヒスチジン豊富タンパク質（２１に−ＨＲＰ 　）と呼称〕、アスパラギン豊富タンパク質（Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ　−Ｒｉｃ ｈ　Ｐｒｏｔｅｉｎ、　ＡＲＰ　）および成熟寄成虫感染赤血球の表面抗原（Ｍ ａｔｕｒｅ　−ｐａｒａｓｉｔｅ　−１ｎｆｅｃｔｅｄ　Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔ ｅ　ＳｕｒｆａｃｅＡｎｔｉｇｅｎ　、　ＭＥＳＡ　）　（以前にはグルタミン 酸豊富タンパク質（ＧＡＲＰ　）と呼称〕とそれぞれ命名された抗原であって、 いずれも単一のアミノ酸の含有量が相対的に高いことを特徴とする。5HARP ), asparagine-rich protein (Asparagine-Ric h Protein, ARP) and the surface antigen of mature parasite-infected red blood cells (M ature -parasite -1nfected Erythrocyt e Surface Antigen, MESA) (previously Glutamine Acid-rich protein (GARP)] Both are characterized by a relatively high content of a single amino acid.

大腸菌内でこれらの抗原の部分を発現するｃＤＮＡり、　ローンは、イン・ジツ のコロニー・アッセイにおいで。cDNA clones expressing portions of these antigens in E. coli can be prepared in situ. in a colony assay.

Ｐ、ファルシパルムが風土病である地方の人の血清と反応した。５ＨＡＲＰ　ｃ ＤＮＡ　クローンの固定化リゼイトによりアフイニテイ精製されたヒト抗体を用 いで対応する寄生虫抗原（Ｐ、ファルシパルム単離体Ｆ　ＣＱ３２７／ＰＮＧ中 ）が分子量約２９．０００のポリペプチドであることが同定された。また、アフ イニテイ精製されたＡＲＰクローンに対するヒト抗体は、イムノプロット法で分 子量約２２０．０００および１６０．　ＯＯＯの抗原を含む幾つかの寄生虫ポリ ペプチドと反応した。さらに、ＭＥＳＡ　ｃＤＮＡクローンの固定化リゼイトに よりアフイニテイ精製されたヒト抗体により、対応する寄生虫抗原が分子量約２ ５０．０００　のポリペプチドであると同定された。It reacted with serum from people in areas where P. falciparum is endemic. 5HARP c Using human antibodies affinity-purified using immobilized lysates of DNA clones. corresponding parasite antigen (P, falciparum isolate F in CQ327/PNG) ) was identified as a polypeptide with a molecular weight of approximately 29,000. Also, Human antibodies against initially purified ARP clones were isolated by immunoplotting. Molecular weight approximately 220.000 and 160.000. Several parasitic polysaccharides containing OOO antigens Reacted with peptide. Furthermore, in the immobilized lysate of MESA cDNA clone, A more affinity-purified human antibody allows the corresponding parasite antigen to be reduced to a molecular weight of approximately 2. 50,000 polypeptides were identified.

本発明は、Ｐ、ファルシパルムのヒスチジン−アラニン豊富小タンパク質（５Ｈ ＡＲＰ　）、アスパラギン豊富タンパク質（ＡＲＰ　）、または成熟寄生虫感染 赤血球表面抗原（ＭＥＳＡ　）　をコードしでいる塩基配列の全て、または一部 と実質上対応しでいるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を提供するものである 。更に詳しくは５本発明は、第２図、第８図または第１１図に示されている塩基 配列の全てまたは一部を、少くともその一部として含有しでいることを特徴とす るヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を提供するものである。The present invention relates to the histidine-alanine-rich small protein (5H) of P. falciparum. ARP), asparagine-rich protein (ARP), or mature parasite infection All or part of the base sequence encoding red blood cell surface antigen (MESA) provides a DNA molecule comprising a nucleotide sequence substantially corresponding to . More specifically, the present invention relates to the bases shown in FIG. 2, FIG. 8, or FIG. 11. characterized in that it contains all or part of the sequence as at least a part thereof. A DNA molecule comprising a nucleotide sequence is provided.

その様なヌクレオチド配列は、５ＨＡＲＲ，ＡＲＰまたはＭＥＳＡ　のアミノ酸 配列の少くとも一部を含むポリペプチドをコードしでいる。Such nucleotide sequences include the amino acids 5HARR, ARP or MESA. encodes a polypeptide comprising at least a portion of the sequence.

本発明はまた、５ＨＡＲＰ、ＡＲＰまたはＭＥＳＡ　の全てまたは一部の抗原性 を表わす合成ペプチドあるいは合成ポリペプチド、並びに、５ＨＡＲＰ、ＡＲＰ 　またはＭＥＳＡ　の全でまたは一部の抗原性を表わす合成ポリペプチドの少く とも１種と、薬学的に許容し得る担体とを含有しでなる。＠乳類においで５ＨＡ ＲＰ　、ＡＲＰまたはＭ　Ｅ　Ｓ　Ａ　に対する免疫応答を刺激するための組成 物をも提供するものである。本発明のかかる合成ペプチドまたは合成ポリペプチ ドは、広範囲にわたって上に述べたヌクレオチド配列を含有しでいる１発現コン トロール配列と機能的（操作可能）に結合しでいる組換えＤＮＡ分子、あるいは その様な組換えＤＮＡ分子を含有しでいる組換えＤＮＡクローニングビヒクル、 またはベクターを含む宿主細胞内で発現させることにより調製される。この様に しで発現した合成ペプチドまたは合成ポリペプチドは、５ＨＡＲＰ、ＡＲＰ　ま たはＭＥＳＡ　の全てまた°は一部の抗原性を表わす部分と、組換えＤＮＡ分子 のＤＮＡによってコードされでいる付加的なポリペプチドからなる上台ポリペプ チドであっても良い。別法として、この合成ペプチドまたはポリペプチドは、メ リフィールド（Ｍｅｒｒｉ　ｆｉｅｌｄ　）固相合成法等の周知の化学的手段に より、製造することもできる。The present invention also relates to the antigenicity of all or part of 5HARP, ARP or MESA. Synthetic peptides or synthetic polypeptides representing 5HARP, ARP or a small number of synthetic polypeptides expressing all or part of the antigenicity of MESA It contains one kind of each and a pharmaceutically acceptable carrier. @5HA in milk Composition for stimulating an immune response to RP, ARP or MESA It also provides goods. Such synthetic peptides or synthetic polypeptides of the invention The code is an expression construct containing a wide range of the nucleotide sequences described above. a recombinant DNA molecule operably linked to a troll sequence, or a recombinant DNA cloning vehicle containing such a recombinant DNA molecule; Alternatively, it is prepared by expressing it in a host cell containing the vector. like this Synthetic peptides or synthetic polypeptides expressed in All or part of the antigenic part of MESA or MESA and the recombinant DNA molecule. The upper polypeptide consists of an additional polypeptide encoded by the DNA of It may be chido. Alternatively, the synthetic peptide or polypeptide Well-known chemical means such as Merrifield solid phase synthesis method It can also be manufactured from

本発明の詳細は、以下の記載、並びに添付図面により、さらに明らかになるであ ろう。図面πついて以下に説明する。Details of the invention will become clearer from the following description and the accompanying drawings. Dew. Drawing π will be explained below.

パルムポリペプチドの検出を示す図である。クローンＡｇ５７　の音波処理抽出 物中のタンパク質ＣＮＢｒ−活性化セファロースと共役（コンジュゲート）させ た。FIG. 2 shows the detection of palm polypeptide. Sonication extraction of clone Ag57 The protein CNBr in the product is conjugated with activated Sepharose. Ta.

得られたコンジュゲート（共役物）を、パプアニューギニア、マダン（Ｍａｄａ ｎｇ　）　の住民から採取したヒト血清のプールから抗Ａｇ５７　をアフイニテ イ精製するための吸収剤として用いた。Ｐ、ファルシパルム単離体Ｎ　Ｆ　７　 （１）、Ｋ　１　（２）　、　Ｆｅ２７　（３）％Ｖｌ（４）、並びにＦｅ１２ からクローンされで導かれた系統ＤＩＯ（５）の培養物のタンパク抽出物を１０ ％ポリアクリルアミド−５ＤＳ−ゲル上で分画した。ゲルから得たタンパク質を 電気泳動的にニトロセルロース上に移し、アフィニテイ精製した抗体、次いで１ ２５ニープロテインＡと反応させた後、オートラジオグラフィーにかけで検出し た。各単離体中に１分子量域２９．０００〜３４．０００の、クローンＡｇ５７ 　に対応する抗原が存在しでいた。抗体は、Ｆｅ１２　から導かれた、クローン した系統であるＤＩＯには含まれていない、大きい抗原（分子量約ｓ　ｏ、　ｏ 　ｏ　ｏ〜６０，０００）と交差反応を示した。The resulting conjugate was transferred to Mada, Papua New Guinea. Anti-Ag57 was affinized from a pool of human serum collected from residents of It was used as an absorbent for purification. P, Falciparum isolate N F 7 (1), K1 (2), Fe27 (3)%Vl (4), and Fe12 A protein extract of a culture of strain DIO (5) cloned from and derived from 10 % polyacrylamide-5DS-gel. Protein obtained from gel Electrophoretically transferred onto nitrocellulose and affinity purified antibody, then 1 After reacting with 25-nee protein A, it was detected by autoradiography. Ta. Clone Ag57 with one molecular weight range 29.000-34.000 in each isolate. There was an antigen corresponding to . The antibody was derived from Fe12, a clone Large antigens (molecular weight approximately so, o o~60,000) showed cross-reactivity.

第２図はＡ、ｇ５７のＤＮＡ配列および推定のアミノ酸配列を示す図である。配 列決定にはジデオキシ鎖末端法（９）を用シ）た。Ａｇ５７挿入体と、Ａｈａｆ ｆｌおよびＲｓａＩ消化で生じたフラグメントをＭ１３ｍｐ８　およびＭ１３ｍ ｐ９にクローンした。特定のオリゴヌクレオチド上、適当な箇所でＭ２Ｓ「ユニ バーサル（普遍）」プライマーを用い１両方の方向性で完全な配列決定を行った 。提案される開始部位および反復配列に下線Ｄｉａｇｏｎ　）　Ｊ　プログラム （１０）を用いで作成した５ＨＡＲＰ配列の対角線的比較図である。FIG. 2 shows the DNA sequence and deduced amino acid sequence of A, g57. Distribution The dideoxy chain end method (9) was used to determine the sequence. Ag57 insert and Ahaf The fragments generated by fl and RsaI digestion were combined with M13mp8 and M13m. Cloned into p9. M2S “union” at appropriate locations on specific oligonucleotides. Complete sequencing was performed in both directions using ``Versal'' primers. . Underline the proposed start site and repeat sequences Diagon) J program (10) A diagonal comparison diagram of 5HARP sequences prepared using (10).

Ａ、Ａｇ５７　の暗号領域とそれ自身とを対角線的に比較することにより、５Ｈ ＡＲＰ内のホモローガス（同質）な反復配列を示すものである。By diagonally comparing the cryptographic region of A, Ag57 with itself, 5H This shows homologous (same quality) repeat sequences within ARP.

Ｂ、５ＨＡＲＰ　内のヒスチジン−豊富配列トＰ−口７ラエ（Ｐ、　Ｉｏｐｈｕ ｒａｅ　）の２１に−ＨＲＰ　とのホモロジイを示しでいる。B, Histidine-rich sequence within 5HARP 21 of rae) shows homology with -HRP.

検出を示す図である。ヒト抗体を、ＮＦ７の発現ライブラリィから導かれた配列 した１０３の抗原陽性クローンと反応させた。FIG. 3 is a diagram showing detection. A human antibody was prepared using a sequence derived from an NF7 expression library. 103 antigen-positive clones obtained.

Ａ、軽くグルタルアルデヒドと結合させ、風乾したメロゾイト製剤の単分子層か らのヒト抗体の溶離像を示す。A. Monomolecular layer of merozoite preparation lightly combined with glutaraldehyde and air-dried. The elution image of the human antibody is shown.

Ｂ、クローンＡｇ３１９の全細胞リゼイトによるヒト抗体のアフイニテイ精製を 示す。この配列中に、Ａｇ３１９配列を発現するクローンが、さらに３２個検出 された。B, Affinity purification of human antibodies using whole cell lysate of clone Ag319. show. In this sequence, 32 additional clones expressing the Ag319 sequence were detected. It was done.

第５図は感染赤血球のサポニン溶解上清を、Ａｇ３１９で精製したヒト抗体によ るイムノプロット法に適用した結果を示す像である。図中、レーン１＝ＮＦ７． レーン２冨に１、レーン３＝ＦＣ２７を表わす。Figure 5 shows saponin lysed supernatant of infected red blood cells treated with human antibody purified with Ag319. This is an image showing the results of applying the immunoplot method. In the figure, lane 1 = NF7. Lane 2 represents 1, lane 3 = FC27.

Ａ、寄生虫感染赤血球のアセトン−メタノール固定化塗末標本（スメア）を、ア フイニテイ精製した、Ａｇ３１９　に対するヒト抗血清と反応させた後、ヒツジ の抗−ヒトイムノグロブリンと反応させ、さらに、プロピジウム・ヨーダイトで 対比染色し、螢光顕微鏡下、螢光（左側のパネル）とプロピジウム（右側のパネ ル）を観察した結果を示す図である。遊離のメロゾイトと抗血清との反応が認め られる。A. An acetone-methanol fixed smear of parasite-infected red blood cells was After reacting with Infinity-purified human antiserum against Ag319, sheep of anti-human immunoglobulin, and further reacted with propidium iodite. Counterstain and under a fluorescence microscope show fluorescence (left panel) and propidium (right panel). FIG. 3 is a diagram showing the results of observation of Reaction between free merozoites and antiserum was observed. It will be done.

Ｂ、寄生虫感染した赤血球の塗末標本を、Ａｇ３１９に対するつ′サギ抗血清と 反応させた後、螢光化したヒツジの抗−ウサギイムノグロブリンと反応させ、次 いで、プロピオジウム・ヨーダイトで対比染色し、螢光顕微鏡下で螢光−染色（ 左パネル）とプロピジウム（右パネル）を観察した結果を示す図である。シゾン トが明瞭に認められる。B. A smear of parasite-infected red blood cells was treated with a heron antiserum against Ag319. After the reaction, it was reacted with fluorescent sheep anti-rabbit immunoglobulin, and then Then, counterstain with propiodium iodite and perform fluorescence-staining ( FIG. 3 is a diagram showing the results of observing propidium (left panel) and propidium (right panel). Shizon This is clearly recognized.

Ｃ０軽くグルタルアルデヒドで固定した寄生虫感染赤血球とアフイニテイ精製Ａ ｇ３１９に対するヒト抗体とを反応させた後、螢光化したヒツジの抗−ヒトイム ノグロブリンと反応させ、次いで、プロピジウム・ヨーダイトで対比染色した結 果を示す図である。C0 Parasite-infected red blood cells lightly fixed with glutaraldehyde and affinity purified A After reaction with human antibody against g319, fluorescent sheep anti-human immunofluorescence The results were reacted with noglobulin and then counterstained with propidium iodite. FIG.

その配列を決定する方法を示す図である。反復は塗りつぶした三角形で示されで いる。下方の矢印は、ＡｈａＩＩＩ（Ａと省略）、Ｒｓａ　Ｉ部位、並びにリン カ−から出る配列の程度を示す。星印を付した矢印は、Ａｇ３１９の７１４〜７ ３５位と相補的な配列に対応する合成プライマーを用いで得られた配列を示しで いる。FIG. 2 is a diagram showing a method for determining the sequence. Repetitions are indicated by filled triangles. There is. The downward arrow indicates the AhaIII (abbreviated as A), RsaI site, and phosphorus Shows the degree of alignment coming out of the car. The arrow with a star indicates 714-7 of Ag319. Show the sequence obtained using a synthetic primer corresponding to the sequence complementary to position 35. There is.

アミノ酸覧を示す図である。It is a figure showing a list of amino acids.

れたタンパク質の「ジアゴン」を示す図である。Ａｇ３１９　の推定のタンパク 質配列とそれ自身と比較した。FIG. Estimated protein of Ag319 compared with the quality array and itself.

オクタペプチド反復配列が、内部に点在する（ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ　）　 アスパラギンに富むテトラペプチドに起因する多くの内部ホモロジイと共に明瞭 に示されでいる。Octapeptide repeat sequences are interspersed distinct with many internal homologies due to asparagine-rich tetrapeptides. It is shown in

第１０図は、マラリアにさらされた人から得た血清プールのアフイニティ精製に より得たヒト抗体を用いで行ったイムノプロット法の結果を示す図である。Figure 10 shows the affinity purification of serum pools obtained from individuals exposed to malaria. FIG. 2 is a diagram showing the results of immunoplotting performed using human antibodies obtained from the above.

Ａ、同調成長期にあるＦｅ１２を含有しでいる寄生虫感染赤血球を、１つの増殖 サイクルの特定の時期に培養から等しい数だけ収穫した。遠心して寄生虫を集め 、血清不含培地中で洗浄した。０．５　Ｘ　トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ　）　Ｘ　 １００とプロテアーゼ阻害剤（ＰＭＳＦ。A, One proliferating parasite-infected red blood cell containing Fe12 in the synchronous growth phase. Equal numbers of cultures were harvested at specific times of the cycle. Centrifuge to collect parasites , washed in serum-free medium. 0.5 X Triton (Triton) X 100 and protease inhibitor (PMSF.

５ｍＭ：　ＴＰＣＫ、１ｍＫ：　ＥＤＴＡ、２．５ｍＭおよびヨードアセトアミ ド、２ｍＭ）を含有するＰＢＳ中で可□溶化した。上清を、２ＭＥ含有試料バッ ファー中で１：４に希釈して２分間煮沸した。ポリペプチドをＰＡＧＥで分画し 、ニトロセルロース上に電気的にプロットし、抗Ａｇ７　抗体、次いで１２５ニ ブロチインＡでプローブした。トラック１は非感染赤血球、トラック２はリング 、トラック３はトロホゾイト、トラック４はシゾント、トラック５はメロゾイト を含有しでいる。5mM: TPCK, 1mK: EDTA, 2.5mM and iodoacetamide Solubilized in PBS containing 2mM). Transfer the supernatant to a sample bag containing 2ME. It was diluted 1:4 in fur and boiled for 2 minutes. Fractionate polypeptides by PAGE , electrically plotted on nitrocellulose, anti-Ag7 antibody, then 125 days Probed with brotiin A. Track 1 is uninfected red blood cells, track 2 is ring , track 3 is trophozoite, track 4 is schizont, track 5 is merozoite Contains.

８、　４種の異なる単離体の非同調培養物を遠心しで集め、２ＭＥ含有試料バッ ファーに直接溶かし、　ＰＡＧＥで分画して上記の如くにしてポリペプチドを検 出した結果を示す図である。単離体は、１、ＮＦ７　：　２．　Ｋｌ　：３、Ｆ ｅ１２：４、Ｖｌである。オートラジオグラフィーを４時間行ったつ Ｃ，オートラジオグラフィーが２日間である以外はＢと同様にしで得た結果を示 すものである。8. Asynchronous cultures of 4 different isolates were collected by centrifugation and placed in a sample bag containing 2ME. Dissolve directly in fur, fractionate by PAGE, and detect polypeptides as described above. FIG. 3 is a diagram showing the results obtained. The isolates are 1, NF7:2. Kl: 3, F e12:4, Vl. Autoradiography was performed for 4 hours. C. Shows the results obtained in the same manner as B, except that the autoradiography was carried out for 2 days. It is something.

第１１図はＡｇ　７のヌクレオチド配列および推定のアミノ酸配列を示す図で、 ある。ヌクレオチド配列をジデオキシ鎖−末端法（９）で決定し、スターデンの ＤＢＵＴＩＬプログラム（１０）を用いて翻訳した。反復を垂直方向の線で示す と共に、Ａｇ６５２およびＡｇ６５３の開始点と終了点を矢印で示す。反復の外 側の、開運配列の短い領域を含む範囲に下線を施して示す。FIG. 11 is a diagram showing the nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of Ag7, be. The nucleotide sequence was determined by the dideoxy chain-end method (9) and Staden's Translation was performed using the DBUTIL program (10). Indicate repeats with vertical lines In addition, the start and end points of Ag652 and Ag653 are indicated by arrows. outside of repetition On the other hand, the range that includes the short area of the good luck array is underlined.

第１２図はＡｇ７ｃＤＮＡと、Ｐ、ファルシパルムの制限フラグメント、および Ｐ、ファルシパルム染色体とのハイブリダイゼーションの結果を示す図である。Figure 12 shows Ag7 cDNA, P. falciparum restriction fragment, and FIG. 3 shows the results of hybridization with P. falciparum chromosome.

Ａ、Ｐ、ファルシパルムの３種の単離体から得たＤＮＡをＥｃｏＲＩ（トラック １〜３）またはＨｉｎｄ　Ｉ［［（トラック４〜６）で開裂し、１％アガロース ゲル電気泳動にかけて分画し、ニトロセルロース上にプロットし、３２ｐ−ラベ ルＡｇ７ｃＤＮＡとハイブリダイズさせ、オートラジオグラフで得た結果を示す 。単離体はパプアニューギニア由来のＦｅ１２　（）ラック１および４）、タイ ランド由来のに１（トラック２および６）、並びにガーナ由来のＮＦ７（トラッ ク３およびを文献記載（１１）の如く、パルスフィールド、グラディエンド・ゲ ル電気泳動で分画し、上記の如くにニトロセルロース上にプロットし、ハイブリ ダイズさせで得た結果を示す図である。単離体は、クローンＥ１２であって、Ｆ ｅ１２（）ラック１）、ＮＦ７（トラック２）およびに１（トラック３）から誘 導された。DNA obtained from three isolates of A, P, and falciparum was incubated with EcoRI (track 1-3) or Hind I[[(tracks 4-6), 1% agarose Fractionated by gel electrophoresis, plotted on nitrocellulose, and 32p-labeled. The results obtained using autoradiographs are shown. . The isolates are Fe12 () Lac 1 and 4) from Papua New Guinea, Thailand 1 (tracks 2 and 6) from Rand, and NF7 (tracks 2 and 6) from Ghana. 3 and 3 as described in the literature (11), pulse field, gradient end gear. fractionated by electrophoresis, plotted on nitrocellulose as above, and hybridized. It is a figure showing the result obtained by soybean. The isolate is clone E12, F e12 () rack 1), NF7 (track 2) and ni1 (track 3). guided.

第１３図はＰ、ファルシパルムの無性血液段階におけるものとＡｇ６５１に対す るヒト抗体とを反応させることからなる間接的な免疫螢光法の結果を示す図であ る。単離体Ｖｌ（パネルＡ）またはＦｅ１２　（パネルＢ）のアセトン−固定化 塗末標本中のリング（Ｒ）期およびトロホゾイト（Ｔ）期の螢光染色が示されで いる。挿入体は成熟シゾントから得られた。Figure 13 shows P. falciparum in the asexual blood stage and Ag651. FIG. Ru. Acetone-immobilization of isolate Vl (panel A) or Fe12 (panel B) Fluorescent staining of the ring (R) and trophozoite (T) stages in the smear specimen is not shown. There is. Inserts were obtained from mature schizonts.

第１４図はヒト抗Ａｇ７　と反応させた成熟期のＰ。Figure 14 shows mature P reacted with human anti-Ag7.

ファルシパルム寄生虫に感染した赤血球の切片の免疫電子顕微鏡写真である。倍 率はｘ３５，６００である。1 is an immunoelectron micrograph of a section of red blood cells infected with Falciparum parasites. times The rate is x35,600.

Ｐ、ファルシパルム単離体ＦＣＱ　２７／ＰＮＧ　（Ｆｅ１２）は、パプア・ニ ューギニアの医学研究所（Ｐａｐｕａ　Ｎｅｗ　Ｇｕｉｎｅａ　Ｉｎ５ｔｉｔｕ ｔｅ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）の協力により得られた。ガー ナ起源のＮＦ７とタイ起源のに１はニシンバラ大学のウオリカー氏（Ｄ。P. falciparum isolate FCQ 27/PNG (Fe12) Papua New Guinea In5titu Obtained with the cooperation of te of Medical Re5search). Gar NF7 of Na origin and Ni 1 of Thai origin are by Dr. Walker (D) of Nishinburgh University.

Ｗａｌｌｉｋｅｒ）　から提供を受けた。ドラッガー（Ｔｒａｇｅｒ　）　およ びジエンセン（Ｊｅｎｓｅｎ　）　（１２）の記載に従い、寄生虫を非同調性培 養に維持した。６時間以内に成熟化が広がる成長の同調化は、ンルビトール処理 （１３）を２回行うことで達成された。１つの増殖サイクルの期間中、第２のソ ルビトール処理後４．２６および３８時間後に寄生虫感染赤血球を集め、リング 段階（〉９９％）、トロホゾイト（〉９７％）およびシゾン）　（＞９　ｓ％） の各製品を得た。２時間にわたつで天然に放出されたメロゾイトをムレマ（Ｍｒ ｅｍａ　）らの記載（１４）の如くにして培養上清から精製した。Provided by Walliker). Trager and Parasites were cultured in asynchronous culture as described by Jensen (12). It was well maintained. Synchronization of growth that spreads maturation within 6 hours is caused by nlubitol treatment. This was achieved by performing (13) twice. During one propagation cycle, the second 4.26 and 38 hours after Lubitol treatment, parasite-infected red blood cells were collected and ringed. stage (>99%), trophozoites (>97%) and schizon) (>9 s%) Each product was obtained. Merozoites naturally released over a period of 2 hours were collected by Murema (Mr. It was purified from the culture supernatant as described by Emma et al. (14).

λｇｔ／１１Ａｍｐ３（Ａｍ３）　中でクローンする。ＦＣ２７ｍＲＮＡからの Ｐ、ファルシパルムｃＤＮＡクローンの組立ては報告されでいる（１）。Clone in λgt/11Amp3 (Am3). From FC27 mRNA The construction of a P. falciparum cDNA clone has been reported (1).

血清 血清は、アルパース博士（Ｄｒ、Ｍ、　Ｐ−Ａｌｐｅｒｓ　）およびその協力者 〔パプアニューギニアの医学研究所〕を介し、パプア・ニューギニア、マダン住 民の同意の下で得られた。serum The serum was produced by Dr. M. P-Alpers and his collaborators. [Medical Research Institute of Papua New Guinea] It was obtained with the consent of the people.

コロニーイムノアッセイ 抗原陽性クローンのレプリカを３０℃で一夜増殖させ、４２℃で誘導し、溶解し た（１）。抗−大腸菌反応性を除去するために、血清を吸収させ、３％ウシ血清 アルブミン含有トリス食塩水ｐＨ９，６で１　：　５００に希釈し、最後に、ス タフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ 　）　由来の　ニブロチインＡと一緒にインキュベートした後、−夜オートラジ オグラフした。colony immunoassay Replicas of antigen-positive clones were grown overnight at 30°C, induced at 42°C, and lysed. It was (1). To remove anti-E. coli reactivity, serum was absorbed and added with 3% bovine serum. Dilute to 1:500 with albumin-containing Tris saline pH 9.6, and finally rinse. Staphylococcus aureus ) After incubation with nibrotiin A from - night autoradiation Ographed.

λＡｍｐ　３抗原陽性クローンのリゼイト上でのヒト抗既述の如くにして（１７ ）抗原陽性クローンの誘導培養（５０ｍｌ）を調製した。ベレット化された細菌 を音波処理した後、可溶性の細菌タンパク質をＣＮＢｒ活性化セファロース（フ ァルマシア、スエーデン）トコンジュゲートさせた。パプア・ニューギニアの住 民から得たヒト血清のプール由来の抗体を記載の如＜（８）にして固定化抗原上 でアフイニテイ精製したつ赤血球を含まないメロゾイトを、同調成長させたＦＣ ２７寄生虫から２時間かけで収穫し、トリエタノールアミンバッファー中で２回 洗浄した後、１％（Ｗ／Ｖ）グらをニトロセルロース・フィルター上に吸収させ て固定化し、３％ウシ血清アルブミン含有トリス−食塩中で抗体と一緒にインキ ュベートした。非結合物質を洗い流した後、特異的に結合した抗体を０．２Ｍグ リシン−ＨＣ／　ｐＨ２，８，で溶離した。λAmp 3 antigen-positive clones were incubated with human antibodies on lysates as previously described (17 ) An induced culture (50 ml) of antigen-positive clones was prepared. pelleted bacteria After sonication, the soluble bacterial proteins were transferred to CNBr-activated sepharose. Pharmacia, Sweden) was conjugated. Living in Papua New Guinea Antibodies derived from a pool of human sera obtained from the public were transferred onto immobilized antigens as described in (8). Affinity-purified red blood cell-free merozoites were grown in a synchronized manner using FC. 27 parasites were harvested over 2 hours and incubated twice in triethanolamine buffer. After washing, 1% (w/v) Gura was absorbed onto the nitrocellulose filter. The antibody was immobilized and inked together with the antibody in Tris-saline containing 3% bovine serum albumin. It was incubated. After washing away unbound material, specifically bound antibodies were added to 0.2 M Elution was performed with lysine-HC/pH 2.8.

イムノプロット法 ％ポリアクリルアミド／　ＮａＤｏ　ｄ　Ｓ　０４ゲル上で分画した。ゲルから 得たタンパク質を電気泳動的にニトロセルロース上に移行させ、５％脱脂粉乳含 有Ｐｉ／ＮａＣ１中でインキュベートした後、アフィニティー精製したヒト抗血 清と反応させた。フィルターを１２５工でラベルしたプロティンＡとインキュベ ートし、オートラジオグラフ処理に付した。Immunoplot method % polyacrylamide/NaDo dS 04 gel. from gel The obtained protein was electrophoretically transferred onto nitrocellulose, and the protein was transferred onto nitrocellulose containing 5% skim milk powder. After incubation in Pi/NaC1, affinity purified human anti-blood Reacted with Kiyoshi. Protein A and incubator labeled with 125 filters and subjected to autoradiographic processing.

間接免疫螢光法 Ｐ、ファルシパルムの非同調培養物由来の寄生虫感染赤血球から得た薄い血液フ ィルムを９０％アセトン／１０％メタノール中で固定化し、アフイニテイ精製し たヒト抗体と反応させた。第２の抗体として螢光とコンジュゲートしたヒツジの 抗−ヒト１ｇ抗血清を用いた。プロピジウムヨーダイドで寄生虫の核を対比染色 し、スライドにｐ−フェニレンジアミン含有９ＯＮグリセリン／１０％ＰＢＳを 載せ、　Ｕ、Ｖ、照射下で観察した。Indirect immunofluorescence Thin blood flasks obtained from parasite-infected erythrocytes from asynchronous cultures of P. falciparum. The film was fixed in 90% acetone/10% methanol and affinity purified. The cells were reacted with human antibodies. of sheep conjugated with fluorescence as a second antibody. Anti-human 1g antiserum was used. Counterstaining of parasite nuclei with propidium iodide Then, apply 9ON glycerin/10% PBS containing p-phenylenediamine to the slide. The specimen was mounted and observed under U, V, and irradiation.

ハイブリダイゼーション実験 ファージＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、１％の低融点アガロースゲルでサイズ分 画した。フェノール抽出によって挿入体（Ｓ）を回収した後、ｐＵＣ−９にサブ クローンしで１ｆｆｔ、、ニックトランスレーションに付シた。ハイブリダイゼ ーションは、０．７５　Ｍ　ＮａＣ１７０，７５Ｍ　クエン酸ナトリウム１５０ ％ホルムアミド／（５０ｐｇ　／ｍＱ　）の鮭***ＤＮＡ／（１０μｇ／ｍＱ） 　のポリ（Ｃ）　／　ｏ、　０２％　フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ　）１０．２％ 　ポリビニルピロリドン／　０．２％ＢＳＡ中、４２℃で行われた。Hybridization experiment Phage DNA was digested with EcoRI and divided into sizes on a 1% low melting point agarose gel. I drew it. After recovering the insert (S) by phenol extraction, subtract it into pUC-9. 1 fft was cloned and subjected to nick translation. hybridize The solution is 0.75M NaC170, 75M sodium citrate 150 % formamide/(50pg/mQ) of salmon sperm DNA/(10μg/mQ) Poly(C)/o, 02% Ficoll 10.2% It was carried out at 42°C in polyvinylpyrrolidone/0.2% BSA.

ヌクレオチド配列の決定 配列決定にはジデオキシ鎖末端法（９）を用いた。挿入体と、適当な制限エンド ヌクレアーゼによる消化で挿入体から生じたフラグメントをＭ１４ｍｐ８および ９にクローンした（１５）。Nucleotide sequence determination The dideoxy chain termination method (9) was used for sequencing. Insert and suitable restriction end The fragment generated from the insert upon nuclease digestion was divided into M14mp8 and 9 (15).

ＰＦＧ電気泳動 ＰＦＧ電気泳動は実質上、ケンプ（Ｋｅｍｐ　）　らの記載に従って行われた（ １１）。PFG electrophoresis PFG electrophoresis was performed essentially as described by Kemp et al. 11).

する寄生虫抗原の同定 単離体ＦＣＱ２７／ＰＮＧ（Ｆｅ１２）　から導かれたｃＤＮＡをベクターλｇ ｔ　１１　Ａｍｐ　３にクローニングすることによる発現ライブラリィの組立て は既に報告されでいる（１）。パプア・ニューギニア、マダンのマラリア風土病 地方の住民から得たアフィニティ精製したヒト血清との反応性に基づき７８の抗 原陽性コロニーを単離した（１７）。ｃＤＮＡ挿入体とのハイブリダイゼーショ ン、並びにウサギ抗血清とＡｇ５７　と命名されたクローン由来の冶金ポリペプ チドに対する反応（１７）によるシブリング（Ｓｉｂｌ　ｉｎｇ　）　分析の結 果、反応はこれらの内で唯一回しか起こらず、実に、試験された３００以上の抗 原陽性クローンの内でも唯一回しか起こらないことが示された（１７．１９）。Identification of parasite antigens The cDNA derived from the isolate FCQ27/PNG (Fe12) was inserted into the vector λg Assembly of expression library by cloning into t11 Amp3 has already been reported (1). Malaria endemic in Madang, Papua New Guinea 78 antibodies were identified based on reactivity with affinity-purified human serum obtained from local residents. Original positive colonies were isolated (17). Hybridization with cDNA insert as well as a rabbit antiserum and a metallurgical polypeptide derived from a clone designated Ag57. Results of Sibling analysis by reaction (17) to Tide As a result, the reaction occurred only once among these, and in fact, of the more than 300 antibodies tested. It was shown to occur only once among the original positive clones (17.19).

Ａｇ５７は分子量１４５．０００　のβ−ガラクトシダーゼ融合ポリペプチドを 多量に産生ずる。Ａｇ５７　の誘導培養のリゼイトをＣＮＢｒ−活性化セファロ ースと結合させ％Ａｇ５７に対するヒト抗体をパプア・ニューギニアから得たヒ ト血清のプールから、アフィニティクロマトグラフィーにより精製した。これら のアフィニティ精製ヒト抗体をイムノプロット法に用い、様々なＰ、ファルシパ ルム単離体から得た抽出物中の、対応する抗原を同定した。第１図に示されでい る様に、この抗体は、単離体Ｆｅ１２中の、Ｍｒ２９，０００のバンドと反応し た。Ag57 is a β-galactosidase fusion polypeptide with a molecular weight of 145.000. Produced in large quantities. The lysate of the induced culture of Ag57 was transferred to a CNBr-activated cephalogram. human antibodies against %Ag57 obtained from Papua New Guinea. purified by affinity chromatography from a pool of human serum. these affinity-purified human antibodies were used for immunoplotting to detect various P. The corresponding antigens were identified in extracts obtained from Lum isolates. It is not shown in Figure 1. As shown, this antibody reacts with the Mr29,000 band in isolate Fe12. Ta.

他の単離体中の対応する抗原の見掛けの分子量が約２９、０００から約３４，０ ００の範囲に及ぶことから、この抗原のサイズにおける多形性は明白である。The apparent molecular weight of the corresponding antigen in other isolates ranges from about 29,000 to about 34,000 Polymorphism in the size of this antigen is evident as it ranges from 0.00 to 0.000.

鎖末端法（９）によりＡｇ５７　の完全な配列が決定さ。The complete sequence of Ag57 was determined by the chain end method (9).

れた。Ａｇ５７　は１１６５ｂｐの挿入体を含有しでおり、β−ガラクトシダー ゼと同−相内にオープンリーディングフレームを有する。第２図に記載されでい るリーディングフレームは、Ａｇ５７が大きい融合ポリペプチドを産生ずること から、正確である。しかも、他の可能なリーディングフレームは全て複数の終止 コドンにより中断されでいる。Ａｇ５７のオープンリーディングフレームは２位 から６９８位に至り、その下流には長い３′非翻訳領域とポリＡ−テールとが続 く。It was. Ag57 contains a 1165 bp insert and is It has an open reading frame in the same phase as Z. Not listed in Figure 2 The reading frame of Ag57 produces a large fusion polypeptide. Therefore, it is accurate. Moreover, all other possible reading frames have multiple stops. Interrupted by codons. Ag57 open reading frame ranks second to position 698, followed by a long 3' untranslated region and a poly A-tail downstream. Ku.

３５位のＡＴＧコドンの下流には５′側をリジン残基、３′側をアスパラギン酸 残基により囲まれた、疎水性残基の多い（１３）配列がある（５９位〜９７位） 。この配列はシグナルペプチドに典型的な配列であることから、３５位のＡＴＧ は固有タンパク質の開始コドンであると思われる。この開始コドン上流の配列は 、多分、暗号配列ではないが、同一フレーム内に非−センスコドンが含有されで いないことから、大腸菌内で融合ポリペプチドとして翻訳される。しかも、この ＡＴＧは、Ｐ、ファルシパルムの暗号領域の開始に典型的な変化である。ＡＴが ９０％であるその５′側領域から、ＡＴが６７％であるシグナルペプチド領域へ の塩基組成の変化を表示しでいる。Downstream of the ATG codon at position 35, there is a lysine residue on the 5' side and an aspartic acid residue on the 3' side. There is a sequence with many hydrophobic residues (13) surrounded by residues (positions 59 to 97) . Since this sequence is typical of a signal peptide, ATG at position 35 appears to be the start codon of a unique protein. The sequence upstream of this start codon is , probably not the coding sequence, but may contain non-sense codons in the same frame. Therefore, it is translated as a fusion polypeptide in E. coli. Moreover, this ATG is a typical change at the beginning of the P. falciparum cryptoregion. A.T. From its 5' region, which is 90%, to the signal peptide region, which is 67% AT. It shows the change in the base composition of .

この推定のアミノ酸配列は大多数の暗号領域を占める。−列に並んで反復される オリゴヌクレオチドからなる２ブロツクを含有しでいる。第１の反復ブロックは ２０３位の、３トリペプチド（Ａｌａ　−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ）から始まり、Ａｌａ 　−Ｈｉｓ　−Ｈｉｓ　−Ａｌａ　−Ａｈａ　−Ａｓｎで構成される１４のへキ サペプチドが後続するものである。この反復はアミノ酸レベルにおいでは高い保 存性を有するが、３反復の２番目のコドンの第３塩基にサイレント変異（Ｔ−４ Ｃ）が起きる。このブロックのＡｓｎがＡｓｐ　により置換されでおり、この下 流に該ブロックの最後の、そして高い扁重度のへキサペプチド反復が続いている ことが分る。はぼ中間の１個のＨｉｓ−Ｈｉｓ−Ａｌａ　配列を含む２３残基配 列の後に、反復の第２ブロツクが開始されでいる。それは、Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ａ ｓｐ　−Ｇｌｙ　−Ａｌａ　のコンセンサス配列を有するペンタペプチドからな る。このブロックの反復１および反復３では、第４コドンにおいで、２番目（Ａ −４Ｇ）と３番目（Ｔ−Ａ）のヌクレオチドに変異があり、そのためにＧｌｙが Ａｓｐ　で置換されている。ペンタペプチド反復１〜４を囲む２つの型のデカペ プチドが区別できる。このブロックの第８番目で最後の反復も縮重性を有し、そ の１９塩基対下流に終止コドンがある。This deduced amino acid sequence occupies the majority of the coding region. - repeated in sequence It contains two blocks of oligonucleotides. The first iterative block is Starting from the 3 tripeptide (Ala-His-His) at position 203, Ala -His -His -Ala -Aha -Asn It is followed by a subpeptide. This repeat is highly conservative at the amino acid level. However, a silent mutation (T-4 C) occurs. Asn in this block has been replaced by Asp, and below this followed by the last and highly polarized hexapeptide repeat of the block. I understand. A 23-residue sequence including one His-His-Ala sequence in the middle. After the column, the second block of iterations is started. It is His-His-A A pentapeptide with a consensus sequence of sp-Gly-Ala. Ru. In repeats 1 and 3 of this block, the second (A -4G) and the third nucleotide (T-A), which causes Gly to Replaced with Asp. Two types of decapades surrounding pentapeptide repeats 1-4 Petide can be distinguished. The eighth and last iteration of this block is also degenerate; There is a stop codon 19 base pairs downstream of.

Ａｇ５７　にコードされており、ＡＵＧから始まる天然のＰ、ファルシパルムタ ンパク質の分子量計算値は２１、１０８　であり、これは、イムノプロット法に よりめた見掛けの分子量よりもかなり低い（第１図参照）。提案通りシグナルペ プチドが除去されたなら、実際の不一致はよ、り大きくなるであろう。この不一 致は。A natural P, falciparumta, which is encoded by Ag57 and starts with AUG. The calculated molecular weight of the protein is 21,108, which is determined by the immunoplot method. It is considerably lower than the apparent molecular weight after twisting (see Figure 1). Signalpe as suggested If the putide were removed, the actual discrepancy would be even greater. This discord The result is.

この分子の広範囲に及ぶ反復部分がＳＤＳに異常な結合を行うことに起因しでい ると考えられる。Ａｇ５７の配列からめたＡｈａ　ＩＩＩ　部位間の距離が、ゲ ノムＤＮＡとのハイブリダイゼーションにおいで観察されたＡｈａ■フラグメン トのサイズと一致することから、この不一致は、大腸菌内での反復の組換えによ るものではないといえる（データーは示されでいない）。Ａｇ５７は３０％のヒ スチジンと２９％のアラニンとを含有するタンパク質をコードしでいる。スタテ ンのプロティン・ジアゴン・プログラム（１０）を用いて行った５ＨＡＲＰのア ミノ酸配列間の内部ホモロジイに関する分析の結果、これら２つの反復ブロック は互いに高度に関連しでいることが分った（第３Ａ図）。Ｐ、ファルシパルムの ５ＨＡＲＰとＰ、ロフラエの２１に−ＨＲＰ（２０）とを比較すると、異なる寄 生上棟から得られたこれら２種のタンパク質も高いホモロジイを有することが示 された（第３Ｂ図）。This may be due to the aberrant binding of the extensive repeats of this molecule to SDS. It is thought that The distance between the Aha III sites based on the Ag57 sequence is Aha fragment observed in hybridization with Nomu DNA This discrepancy is likely due to repeated recombination within E. coli. (data not shown). Ag57 has 30% It encodes a protein containing stidine and 29% alanine. state 5HARP treatment using the protein diagonal program (10) Analysis of internal homology between the amino acid sequences revealed that these two repeat blocks were found to be highly related to each other (Figure 3A). P. falciparum Comparing 5HARP and P and Lofrae's 21-HRP (20), different contributions are found. These two proteins obtained from fresh ridges were also shown to have high homology. (Figure 3B).

本発明者らは、先に、発現ライブラリィの血清学的スクリーニングによって多く のｃＤＮＡ　クローンを単離した（１）。長さ０．６〜２、ＯｋｂのｃＤＮＡ配 列を含有するライブラリィをＰ、ファルシパルムＦＣＱ　２７／ＰＮＧ（Ｆｅ２ ７　）のパプアニューギニア単離体から導かれたベクターλｇｔ　１１　Ａｍｐ ３　（λＡｍｐ　３　）にクローンした。この試みにおいで新規な抗原が発見さ れる機会を最大にするために、いくつかの小さいが重要な変更を行った。まず、 Ｐ、ファルシパルムの別の単離体、即ち、ガーナ（Ｇｈａｎａｉａｎ　）　単離 体ＮＦ７から新らしいｃＤＮＡライブラリィを組立でた。第２に、Ｐ、ファルシ パルムの多くの抗ばが比較的大きいポリペプチドであることから、＞２．０ｋｂ の長いｃ　ＤＮＡ　分子をλＡｍｐ　３にクローンするために選択した。第３に １弱い陽性のクローンを検出するために、無作為に選択したクローンを三重化（ トリプリケート）して幾可学的に規則的な配列にした後、免疫学的なスクリーニ ングに付した。第４に、従来の様にアフィニティ精製した免疫ヒト血清（１，１ ７）や単一の免疫ヒト血清（１９）を用いる代りにＰＮＧ成人由来の１０個の免 疫ヒト血清のプールをスクリーンした。−次の非選択配列としで得られた計３． ５００　の組換え体の内、１０３個がこ　゛の血清プールとのコロニーイムノア ッセイにおいで陽性反応を示した。これら１０３のコロニーを再度取り上！ｆ、 １個のニトロセルロースフィルター上に、　−列に並べてトリプリケートさせた （ＮＦ７　配列と命名）。The present inventors previously demonstrated that a large number of A cDNA clone of was isolated (1). cDNA sequence of Okb, length 0.6-2. P, falciparum FCQ 27/PNG (Fe2 7) Vector λgt 11 Amp derived from the Papua New Guinea isolate 3 (λAmp 3). A new antigen was discovered in this attempt. We've made some small but important changes to maximize your chances of success. first, Another isolate of P. falciparum, namely the Ghanaian isolate A new cDNA library was assembled from the body NF7. Second, P. falci Since many of the proteins in Parmum are relatively large polypeptides, >2.0 kb A long cDNA molecule was selected for cloning into λAmp3. Thirdly 1. To detect weakly positive clones, randomly selected clones were tested in triplicate ( (in triplicate) to form a geometrically regular array, and then subjected to an immunological screen. I attached it to Ng. Fourth, use conventional affinity-purified immune human serum (1,1 7) or a single immune human serum (19), using 10 immune cells from PNG adults. A pool of infectious human sera was screened. - A total of 3. Out of 500 recombinants, 103 were colonized with this serum pool. The test showed a positive reaction. Let's take a look at these 103 colonies again! f, Arranged in triplicate in rows on one nitrocellulose filter (Named NF7 sequence).

ＰＮＧ血清のプールから得たヒト抗体を、グルタルアルデヒドで固定化しでおい たメロゾイトと結合させることにより精製し、不動化した。次いで、固定化メロ ゾイトと結合した抗体を溶離し、上記の配列させた抗原発現性コロニー、並びに 無作為に選択したコロニーと反応させた。ＮＦ７配列中の１つのコロニー（Ａｇ ３１９　と命名、第４Ａ図）が他のどれよりも、はるかに強くこれらの精製抗体 と結合した。Ａｇ３１９が以前に単離された抗原陽性クローンのいずれかと類縁 であるか、または新規な抗原であるかを決定するために。Human antibodies obtained from a pool of PNG sera were immobilized with glutaraldehyde. It was purified and immobilized by binding to merozoites. Next, the fixed melody Antibodies bound to zoites are eluted, and the above arrayed antigen-expressing colonies and Reactions were made with randomly selected colonies. One colony in the NF7 sequence (Ag 319 (Fig. 4A) were much more strongly associated with these purified antibodies than any other combined with. Ag319 is related to any of the previously isolated antigen-positive clones. or a novel antigen.

Ａｇ３１９由来のタンパク抽出物を（ＮＢｒ−活性化セファロース上に固定し、 これを、他の記載（８）の如く、ＰＮＧ血清から得たヒト抗体によるアフィニテ ィ精製の基質に用シ）た。次いで、これらの精製抗体を１０３コロニーの配列と 反応させた。Ａｇ　３１９上で精製した抗体はこの配列の３２クローンと反応し た（第４Ｂ図参照）。驚ろくべきことに、これらの抗体は、既述の７８クローン （１７）を含む配列および１３３クローン（１９）を含む配列の各配列とは反応 しなかった（データーは記載せず）。従って、Ａｇ３１９は、末だ単離されてい ない抗原特異性を示すものと結論された。この結果、並びに他の研究（データー は記載せず）から。Protein extract from Ag319 (fixed on NBr-activated Sepharose, This was followed by affinity detection using human antibodies obtained from PNG serum as described elsewhere (8). It was used as a substrate for purification. These purified antibodies were then sequenced with 103 colonies. Made it react. Antibodies purified on Ag 319 reacted with 32 clones of this sequence. (See Figure 4B). Surprisingly, these antibodies are similar to the previously described 78 clones. The sequence containing (17) and the sequence containing 133 clone (19) react with each other. No (data not included). Therefore, Ag319 has not yet been isolated. It was concluded that the protein showed no antigen specificity. This result, as well as other studies (data (not listed).

ＮＦ７由来の１０４個のクローン配列；ま、事実上、やや異なった抗原群である ことが証明された。104 clone sequences derived from NF7; in fact, they are a somewhat different antigen group. This has been proven.

ＡＲＰの同定および局在 Ａｇ３１９　と称されるＰ、ファルシパルムポリペプチドを同定するためて、上 記の如く、固定化したＡｇ３１９　抽出物上で精製したヒト抗体を用いて幾つか の異なる方法でＰ、ファルシパルムから抽出したポリペプチドのイムノプロット をプローブした。コロニーイムノアッセイにおいで、これらの抗体は特異性を有 する様て思われたにもかかわらず、サポニンで溶解した感染赤血球の上清または イムノプロットでは、これらの抗体はＭｒ２２０，０００程度のサイズまでの多 くの不明確なバンドと反応した（第５図参照）。これらの結果は、ＡＲＰがこれ らの抽出物中で分解および／またはプロセスされる大きい（）２００　ｋＤａ／ 、キロダルトン）ポリペプチドであることを示唆するものであるが、それ以上群 しいことは不明である。Identification and localization of ARP In order to identify the P. falciparum polypeptide designated Ag319, As described above, several studies using human antibodies purified on immobilized Ag319 extracts were performed. Immunoplot of polypeptides extracted from P. falciparum by different methods of probed. In colony immunoassays, these antibodies have specificity. However, supernatants of infected red blood cells lysed with saponin or In immunoplots, these antibodies showed a large number of molecules up to a size of around Mr220,000. It reacted with many unclear bands (see Figure 5). These results indicate that ARP is The large (200 kDa/) degraded and/or processed in extracts of , kilodalton) polypeptides, but larger groups What is true is unknown.

Ａｇ３１９　上で精製されたヒト抗体、並びにＡｇ３１９から得た純化融合ポリ ペプチドに対して惹起されたウサギ抗血清を、いずれも、アセトン−固定化塗床 標本上、およびグルタルアルデヒドで弱く固定化し、風乾も同じ結果を与えた。Human antibodies purified on Ag319 as well as purified fusion polypeptides obtained from Ag319 Rabbit antisera raised against the peptides were incubated with acetone-immobilized coatings. On-specimen and weak fixation with glutaraldehyde and air drying gave the same results.

ＡＲＰは、アセトン−メタノール固定化細胞内寄生虫、および遊離の寄生虫の両 方で、Ｉ　ＦＡＴ　により検出し得た。それはまたグルタルアルデヒドで固定化 した後の遊離の寄生虫（メロゾイト）上にも検出することができた（第６Ｂ図） 。ARP was detected in both acetone-methanol fixed intracellular parasites and free parasites. However, it could be detected by IFAT. It is also immobilized with glutaraldehyde It could also be detected on free parasites (merozoites) after treatment (Figure 6B). .

ＡＲＰのヌクレオチドおよびアミノ酸配列Ａｇ３１９の１．６　ｋｂ　ｃＤＮＡ 挿入体およびそれをＡｈａ■またはＲｓａＩ　で消化して生じたフラグメント類 をベタター類、Ｍ１３．ｍｐ８およびｍｐ９　にサブクローンし、ジデオキシ鎖 末端法で配列決定した（第７図）。1.6 kb cDNA of ARP nucleotide and amino acid sequence Ag319 Insert and fragments generated by digesting it with Aha or RsaI Betatars, M13. subcloned into mp8 and mp9, dideoxy chain The sequence was determined by the end method (Figure 7).

第８図に翻訳されで示されでいるＡｇ３１９の配列にはｃ　ＤＮＡ　を通しで広 がる単一のオープン・リーディング・フレームが存在する。この配列は、暗号鎖 中のＡ　、Ｔ含有量が、アデニン（５０％）とチミジン（２７％）Ａｇ３１９　 挿入体は比較的親水性のポリペプチドをコードしでいる。驚ろくべきことに、Ａ ｇ３１９ポリペプチドの４０％がアスパラギンで構成されており、メチオニンも 異常に多い（７，６％）。ｃ　ＤＮＡ　クローンの中間には、８０３位から開始 する。３つのテトラペプチド（Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ　）　反復と４ つのオクタペプチド（Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｓｎ　−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ａ ｓｎ−Ｍｅｔ）　とが存在する。この配列には、さらに５つのＡｓｎ　−Ａｓｎ 　−Ａｓｎ　−Ｍｅ　を反復が点在している。The sequence of Ag319, translated and shown in Figure 8, has been spread through cDNA. There is a single open reading frame that This sequence is the cipher chain The A and T contents are adenine (50%) and thymidine (27%)Ag319 The insert encodes a relatively hydrophilic polypeptide. Surprisingly, A. 40% of the g319 polypeptide is composed of asparagine and methionine. Abnormally common (7.6%). c DNA starting from position 803 in the middle of the clone do. 3 tetrapeptides (Asn-Asn-Asn-Met) repeats and 4 octapeptide (Asn-Asn-Asn-Met-Asn-His-A sn-Met) exists. This sequence has five more Asn-Asn -Asn-Me are interspersed with repetitions.

さらに、ＡＳｎ−ＡＳｎ−ＡＳｎ　と、第４番目のアミノ酸としで、Ｉ　１ｅ（ ３ｘ）、　Ｇｌｕ（３ｘ）　、　Ｔｈｒ　（２ｘ）　＊　Ｌｙｓ（２ｘ）、Ａｓ ｐ　（２ｘ）、Ａｓｎ（２ｘ）Ｔｙｒ（２ｘ）＊Ｇｌｙ（ｌｘ）　およびＰｈｅ 　（ｌｘ）　を含む１６のテトラペプチド単位が存在する。共通点としで、全て アスパラギン含有率の高い計２９個のテトラペプチド反復と５個のオクタペプチ ド反復とが、やや任意に区別できる。さらて、本発明者らは、１３７〜１５４位 と２０９〜２２６位にＡｓｎまたは（Ａｓｐ）　−Ｍｅｔ　−Ａｓｎ　−Ａｓｎ 　−５ｅｒ　−Ａｓｎ　からなるヘキサペプチドが２単位存在しでいるのに気付 いた。スタチン（１０）のジアゴンプログラムを用いでＡｇ３１９のタンパク配 列をコンピューター分析した結果は、反復ブロック、並びに他のテトラペプチド 単位との高度のホモロジイを明確に示しでいる（第９図）。Furthermore, with ASn-ASn-ASn and the fourth amino acid, I1e ( 3x), Glu (3x), Thr (2x) *Lys (2x), As p (2x), Asn (2x) Tyr (2x) * Gly (lx) and Phe There are 16 tetrapeptide units containing (lx). All have one thing in common A total of 29 tetrapeptide repeats and 5 octapeptides with high asparagine content can be somewhat arbitrarily distinguished from de-repetition. Furthermore, the present inventors ranked 137th to 154th and Asn or (Asp) -Met -Asn -Asn at positions 209-226 I noticed that there were 2 units of hexapeptide consisting of -5er -Asn. there was. The protein configuration of Ag319 was determined using the Diagon program for statins (10). Computer analysis of the sequence revealed repeat blocks as well as other tetrapeptides. The high degree of homology with the unit is clearly shown (Figure 9).

５種類のＰ、ファルシパルム単離体（パプア・ニュおよびＭＡＤ７１　と、ガー ナ起源のＮＦ７）由来のＤＮＡをＡｈａ　ｆｆＩ　およびＲｓａ　Ｉ　で開裂し 、１％旋−スでサイズ分画し、ニトロセルロースにプロット形成させた後％Ａｇ ３１９プローブとハイブリダイズさせた。結果（データーは記載せず）は、ＡＲ Ｐ　が、多くの他の、クローンしたＰ、ファルシパルム抗原π認められた様な制 限フラグメントの多形性を表わさないことを示しでいた。　Ａｇ３１９プローブ は、Ａｇ３１９　の制限地図（第７図）と一致しで、０．７５ｋｂのＡｈａＮフ ラグメント並びに３．５ｋｂおよび１．４ｋｂのＲｓａ　Ｉフラグメントとハイ ブリダイズした（第７図）。Ａｇ３１９挿入体はＭ１３内で不安定なために１． ５ｋｂに及ぶ欠失があることから、これらの結果は１例え欠失があったとしでも 、Ａｇ３１９　の反復配列には殆んど欠失のないことを示唆するものである。３ 個のテトラペプチド反復と４個のオクタペプチド反復のブロックは、サザーンブ ロッティングにより測定した染色体フラグメントのサイズに近似した。６８０　 ｂｐＡｈａｌｌＩ　フラグメント内に位　置しでいる。この発見は、Ｐ、ファル シパルム単離体ＦＣ２７のＳ抗原をコードしでいる染色体性クローンから約１０ ０個の反復が欠失されたという報告（２１）との関係で１重要である。Five types of P, falciparum isolates (Papua nu and MAD71 and Gar) NF7)-derived DNA was cleaved with Aha ffI and RsaI. , after size fractionation with 1% swirl and plot formation on nitrocellulose. 319 probe. The results (data not shown) are AR However, many other cloned P, falciparum antigens, such as It was shown that the polymorphism of the limited fragments was not expressed. Ag319 probe is consistent with the restriction map of Ag319 (Fig. 7) and has a 0.75 kb AhaN file. fragment and the 3.5 kb and 1.4 kb Rsa I fragments and high It was bridized (Fig. 7). 1. Ag319 insert is unstable in M13. Since there is a deletion of up to 5 kb, these results do not apply even if there is one deletion. , suggesting that there is almost no deletion in the repeat sequence of Ag319. 3 A block of 4 tetrapeptide repeats and 4 octapeptide repeats This approximated the size of the chromosome fragments determined by rotting. 680 It is located within the bpAhallI fragment. This discovery was made by P. Fal. Approximately 10 chromosomal clones encoding the S antigen of Cypalum isolate FC27 This is of interest in relation to the report (21) that 0 repeats were deleted.

■　結果−ＭＥＳＡ いる。■ Results - MESA There is.

本発明者らは、前に、プラズモジウム・ファルシパルム抗原を発現する大腸菌ク ローンの単離法についで述べた（１）。音波処理した寄生虫（１７）由来のタン パク質への吸着によりアフイニテイ精製したヒト抗体でスクリーニングすること により７８の抗原陽性クローンを選択した。ここでは、さらに特性化を行うため に選択した１つのクローン（Ａｇ７と命名）についで記述する。Ａｇ７に対して 溶原性の細菌を液体培地中で増殖させ１発現を最大にするために熱誘導し、溶解 してリゼイト由来のタンパク質を臭化シアン活性化セファロース（８）と結合さ せた。この試薬を用い、ヒト血清由来のＡｇ　７と特異的に反応する抗体をアフ イニテイ精製した。その様な抗体を、インビトロでの培養によって誘導し、同調 成長させたＰ、ファルシパルム寄生中から得たリゼイトのイムノプロットと反応 させた（第１０Ａ図）。これらの抗体により成熟トロホゾイトおよびシゾント中 から検出される主なポリペプチドのサイズは、この特定の範囲には正確なマーカ ーはないが、見掛は上２５０キロダルトン以上であった。約８６　ｋｄ　および 約８２　ｋｄのサイズの２つの小さいポリペプチドも検出された。メロゾイトに は２５０ｋｄのバンドの存在は認められなかったが、１２５ｋｄおよび１１５ｋ ｄに著しいダブレットを示す、小サイズのバンドの複合体（コンプレックス）が 認められた。リング段階においでは、事実上、反応性物質は検出されなかった。The present inventors previously demonstrated that E. coli strains expressing Plasmodium falciparum antigens. Next, I described the loan isolation method (1). Tan from sonicated parasites (17) Screening with affinity-purified human antibodies by adsorption to proteins 78 antigen-positive clones were selected. Here, to further characterize One clone (named Ag7) selected in this section will be described next. against Ag7 Lysogenic bacteria were grown in liquid media, heat-induced to maximize expression, and lysed. The lysate-derived proteins were combined with cyanogen bromide-activated sepharose (8). I set it. Using this reagent, antibodies that specifically react with Ag7 derived from human serum were affixed. Purified by Initei. Such antibodies can be induced and synchronized by in vitro culture. Immunoplot and reaction of lysate obtained from grown P. falciparum infestation (Figure 10A). These antibodies inhibit mature trophozoites and schizonts. The size of the main polypeptide detected in this particular range is an accurate marker. Although the weight was not high, it appeared to be over 250 kilodaltons. Approximately 86 kd and Two smaller polypeptides of approximately 82 kd in size were also detected. to merozoites The presence of the 250kd band was not recognized, but the presence of the 125kd and 115kd band was not observed. A complex of small bands showing a marked doublet in d Admitted. Virtually no reactive substances were detected in the ring stage.

本発明者らは、ＭＥＳＡは成熟段階の寄生虫内に高分子量の前駆体としで存在し ており、この前駆体は、メロゾイト内で数個の生産物にプロセッシングされ、リ ング段階で分解されるという結論に達した。同調増殖物の上清を検査した結果、 これらプロセスされたフラグメントがシゾント崩壊時に存在していることが示さ れた（データーは記載されず）。We found that MESA exists as a high molecular weight precursor within the adult stage of the parasite. This precursor is processed into several products within the merozoite and then remodeled. The conclusion was reached that the decomposition occurs during the processing stage. Examination of the supernatant of synchronous growth revealed that These processed fragments were shown to be present during schizont decay. (data not included).

Ａｇ７はクーマツシーブルー染色で検出される様な融合ポリペプチドを多量に産 生ずることはない（１７）。Ag7 produces a large amount of fusion polypeptide as detected by Coomassie blue staining. It never occurs (17).

Ａｇ７挿入体を分画化し、再クローニングすることにより多量の融合ポリペプチ ドを発現するクローンを得た。クローンＡｇ７から精製ｃＤＮＡ　を調製すると 、このライブリイの他の幾つかのクローンにも見出された様に、２つの挿入体の 存在が認められた（１７）。すなわち１発現する挿入体の同定は、各挿入体を別 々にＡｍｐ３に再クローニングし、アフイニテイ精製した抗−Ａｇ７抗体ヲ用い てコロニーイムノアッセイし、発現を検出することにより行われた。この挿入体 を音波処理してランダムに分画化し、得られたフラグメント類にＥｃｏＲエ　リ ンカ−を加え、ライゲーションによっでλＡｍｐ　３　に再クローンした。生じ たクローンを、コロニーイムノアッセイにおいで、抗−Ａｇ　７　抗体により発 現に関しでスクリーニングした。反応性の程度の相違に基づいでＡｇ６５１、Ａ ｇ６５２　およびＡｇ６５３と命名された３クローンを選択し、ヒト抗体の精製 におけるアフイニテイ試薬の調製に用いた。コロニーイムノアッセイにおけるこ れら３種の抗体製剤の反応性を表１に示す。全ての抗体が親であるクローンＡｇ ７と反応したが、クローン６５１および６５３についで調製された抗体は有意な 交差反応を示さず、Ａｇ７が２つの異なる決定基を包含しでいることが証明され た。A large amount of fusion polypeptide can be obtained by fractionating and recloning the Ag7 insert. A clone expressing the gene was obtained. Preparing purified cDNA from clone Ag7 , two inserts, as also found in several other clones of this library. The existence of this virus was confirmed (17). In other words, the identification of inserts that express 1 Using an anti-Ag7 antibody that was individually recloned into Amp3 and affinity purified. The expression was detected by colony immunoassay. This insert was randomly fractionated by sonication, and the obtained fragments were subjected to EcoR Eri. A linker was added and recloned into λAmp3 by ligation. arising The clones were detected using anti-Ag7 antibody in colony immunoassay. Screened based on the current situation. Based on the difference in the degree of reactivity, Ag651, A Three clones named g652 and Ag653 were selected and human antibodies purified. It was used in the preparation of affinity reagents. This in colony immunoassay Table 1 shows the reactivity of these three antibody preparations. Clone Ag for which all antibodies are the parent 7, but antibodies prepared subsequently to clones 651 and 653 showed no significant No cross-reactivity was shown, demonstrating that Ag7 encompasses two different determinants. Ta.

表１　クローンのアフイニテイ吸収体に対しで精製された抗体 Ａｇ７　Ａｇ６５１　Ａｇ６５２　Ａｇ６５３コロニーイムノ　Ａｇ７　＋　＋ 　十　＋アッセイにおけ　Ａｇ６５１　＋　＋　＋　−る標的クローン　Ａｇ６ ５２　＋　十　十　十との反応　Ａｇ６５３　＋　＋　＋ サブクローンＡｇ６５１に対しで調製された抗体を用いて非同調的に増殖させた Ｐ、ファルシパルムタンパク質のリゼイトのイムノプロットをプローブした（第 １０Ｂ図）。単離体ＦＣ２７およびＮＦ７には２５０およびに１単離体に対する 反応性は、はるかに弱かった。強度における差異と同様、これら大きいポリペプ チドのサイズも僅かに異なっている。サブクローンＡｇ６５３に対しで調製され た抗体を用いで重複するイムノプロットをプローブすると、上記の如く強度の異 なる１本の２５０ｋｄバンドが認められた。しかしながら、各単離体中においで 、１組（セット）の小さいフラグメント類が同一の強度で反応した。この様に。Table 1 Antibodies purified against clone affinity absorbers Ag7 Ag651 Ag652 Ag653 Colony Immuno Ag7 + + Target clone Ag6 52 + 10 Reaction with 10 Ag653 + + + were grown asynchronously using antibodies prepared against subclone Ag651. P, immunoplot of lysates of falciparum proteins probed (section 1). Figure 10B). Isolates FC27 and NF7 have 250 and 1 isolates for Reactivity was much weaker. These larger polypeps as well as differences in strength The size of the chido also differs slightly. prepared against subclone Ag653 When overlapping immunoplots were probed using the same antibody, differences in intensity were observed as shown above. One 250 kd band was recognized. However, in each isolate , a set of small fragments reacted with the same intensity. Like this.

Ａｇ７によってコードされでいる１つの決定基は少くとも２種類の区別し得る抗 原性の形をとって存在しでいる。その他、数個の大きいポリペプチドも反応した ことから、Ａｇ６５３の決定基は、幾つかの他のタンパク質によって共有されで いる可能性がある。そうであれば、この交差反応性は、Ａｇ６５１　によってコ ードされでいる決定基による支配的な反応により精彩を失うことになろう。One determinant encoded by Ag7 has at least two distinct types of antibodies. It exists in an original form. Several other large polypeptides also reacted. This suggests that the Ag653 determinant may be shared by several other proteins. There is a possibility that there are. If so, this cross-reactivity could be suppressed by Ag651. The dominant reaction due to the coded determinants will lead to lackluster results.

上記の概要の如くにしでＡｇ７を発現するｃ　ＤＮＡセグメントを選択しで精製 し１Ｍ１３ベクターにサブクローンした。６８１　ヌクレオチドからなる配列に はヌクレオチド３から始まる。切断されでいないオープンリデイングフレームが 含まれでいる（第１１図）。Select and purify cDNA segments expressing Ag7 as outlined above. and subcloned into the 1M13 vector. A sequence consisting of 681 nucleotides starts at nucleotide 3. An uncut open reddening frame (Figure 11).

しかしながら、このフレームはβ−ガラクトシダーゼを伴なう相の外側にあり、 大きい融合ポリペプチドの合成を妨げる。反復されるヘキサペプチドＧｌｕ　Ｔ ｈｒＧｌｙ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓをコードしでいる１Ｂ量体ＧＡＡＡＣＴ　 ＧＧＴ　ＧＡＡ　ＴＣＴ　ＡＡＧ　のコピーが丁度１７個ある。この反復領域の ３′末端側と境界を接しでいる残る１２４アミノ酸は、６３（５２％）個の荷電 した残基を含有しでいる。このセグメントに点在しでいるのはＧｌｕ　Ｇｌｕジ ペプチドを中心にした関連配列の短かい（エンドポイント）を決定した（第１１ 図）。株特異的で優勢なエピトープをコードしているＡｇ６５１は全体が正確に 反復されるヘキサペプチドで構成されでいる。式： ％式％ で示される配列の２反復で構成される合成オリゴヌクレオチドがラジオイムノア ッセイにおいてヒト抗体と反応したことから、決定基がとの反復配列で構成され でいることが確認された。Ａｇ６５３によってコードされでいる決定基をマツピ ングすることは、このクローンが、高度に荷電しでいるフランキング領域の全１ ２４アミノ酸と重複しでいるために不可能である。However, this frame is outside the phase with β-galactosidase; Prevents synthesis of large fusion polypeptides. Repeated hexapeptide GluT 1B mer GAAAACT encoding hrGly Glu Ser Lys There are exactly 17 copies of GGT GAA TCT AAG. of this repetitive region The remaining 124 amino acids bordering the 3' end have 63 (52%) charges. It contains residues that are This segment is dotted with Glu Short (end points) of related sequences centered on peptides were determined (11th figure). Ag651, which encodes a strain-specific and predominant epitope, is precisely It is composed of repeated hexapeptides. formula: %formula% A synthetic oligonucleotide consisting of two repeats of the sequence shown is radioimmunoas Because it reacted with human antibodies in the assay, it was found that the determinant was composed of a repeating sequence It was confirmed that it is. The determinant encoded by Ag653 is This means that this clone covers all of the highly charged flanking regions. This is not possible because it overlaps with 24 amino acids.

表　２ Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　３２１−３３８Ｔｈｒ　Ｇ ｌｕ　Ｇ１．ｕ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　３８４−４０１Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｇ ｌｕ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　４６５−４８２Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｈ ｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　６０６−６２３Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　４９５ −５０６．６３３−６４４Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　６３０−６４１Ｇ ｌｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　３６９−３７７、５２２−５３０Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｓｅ ｒ　４３２−４４０，４４１−４４９．５４６−５５４ＦＣ２７，ＫｌおよびＮ Ｆ７のゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩ　またはＨｉｎｄｌ［のいずれかで制限処理し 。Table 2 Tyr　Glu　Glu　Thr　Lys　Tyr　321-338Thr　G lu　G1. u Ser　Lys　Asp　384-401Ser　Glu　G lu Thr Lys Lys 465-482Ser Glu Glu Th r Lys Asp 606-623 Glu Glu Asn Glu 495 -506.633-644Glu Glu Asn Glu 630-641G lu　Glu　Val　369-377, 522-530Glu　Asn　Se r 432-440, 441-449.546-554FC27, Kl and N F7 genomic DNA was restricted with either EcoRI or Hindl. .

アガロースゲル電気泳動にかけてサイズ分画し、ニトロセルロース上に移した。Size fractionation was performed by agarose gel electrophoresis and transfer onto nitrocellulose.

標識したＡｇ７ＣＤＮＡと／）イブリダイズさせて中程度のストリンジエンシイ （緊めうした（第１２図）。バンドのサイズはかなり変動しでいるが、ハイブリ ダイゼーションの強さはＦｅ１２とに１で同様であり（第１２図）、■とも同様 である（データーは記載せず）。このことは、全ての株に反復が存在しでいるこ とを示唆するものである。hybridized with labeled Ag7CDNA/) to moderate stringency. (I was nervous (Fig. 12). The size of the band fluctuates considerably, but the hybrid The strength of diization is the same for Fe12 and 1 (Fig. 12), and it is also the same for ■. (data not shown). This means that there are repeats in all strains. This suggests that

本発明者らは前にＡｇ７ＥｃｏＲＩフラグメントのサイズにおける差異を株のマ ーカーとしで用い得ることを示唆した（１８）。４種類の別個の酵素で調べたと き、全ての単離体て同数であるが、そのサイズにおいではやや異なっているバン ドが観察されるということは。We previously demonstrated differences in the size of Ag7EcoRI fragments between strains. suggested that it could be used as a marker (18). When tested with four different enzymes, All isolates have the same number of isolates, but bands that differ slightly in size. The fact that de is observed.

この相当に多形性の遺伝子に関して全ての単離体がホモ接合性であることを示唆 するものであり、従って、Ｐ、ファルシパルムのゲノムは血液中段階においで半 数体であると結論される（１８）。パルス処理したフィールドグラデイエント電 気泳動法により、Ｐ、ファルシパルムの染色体を直接観察することができるので （１６）。suggesting that all isolates are homozygous for this highly polymorphic gene. Therefore, the genome of P. falciparum is half-distributed at the blood stage. It is concluded that it is a number field (18). Pulsed field gradient electron Using pneumophoresis, it is possible to directly observe the chromosomes of P. falciparum. (16).

これにより、Ａｇ７　を５および６と命名される２本の染色体にマツピングする ことができた（第１２図）。This maps Ag7 to two chromosomes named 5 and 6. (Figure 12).

このことは、例え、それらがホモ接合体の様に見えたとしでも、保存性のフラン キング領域を伴なった２種のＡｇ７の正確なコピーが存在することを示唆するも のである。幾つかの他のプローブによってこの逆説的な結果が得られたことから 、染色体５および６は、互いの、不完全であるが正確なコピーであると考えられ る（１１）。This means that even if they appear to be homozygous, conserved flan This suggests that there are two exact copies of Ag7 with a king region. It is. This paradoxical result has been obtained with several other probes. , chromosomes 5 and 6 are considered to be imperfect but exact copies of each other. (11).

Ａｇ７の局在性 インビトロでの同調培養物から得たＦｅ１２　および■１寄生虫を顕微鏡用のス ライドにアセトンで固定し、間接的な免疫螢光法により調べた。他のタンパク質 との交差反応の影響を最小にするためにヒト抗−Ａｇ６５１抗体を用いた。免疫 螢光法で反応させるのに必要な抗−Ａｇ６５１　接体の最も高い希釈率は、ｖｌ と比較したとき、Ｆｅ１２においで約１０倍も大きい値である（データーは記載 されず）。しかしながら、これらの両車離体の細胞内寄生虫内での反応型は同じ であった。Localization of Ag7 Fe12 and ■1 parasites obtained from in vitro synchronized cultures were The cells were fixed in acetone and examined by indirect immunofluorescence. other proteins A human anti-Ag651 antibody was used to minimize the effects of cross-reactivity. immunity The highest dilution of anti-Ag651 complex required for the fluorescence reaction is vl The value is about 10 times larger for Fe12 (data not shown). not). However, the reaction type within the intracellular parasites of these two carcasses is the same. Met.

感染赤血球内での寄生虫そのものの染色度は、後期リング段階からトロホゾイト を経てシゾントへと次第に増加した（第１３図）。全赤血球の拡散染色は、色素 を含有する寄生虫と関係しでいるので、特定の抗体希釈度ではＦｅ１２内でより 強くなっていた。The staining intensity of the parasite itself within infected red blood cells varies from the late ring stage to the trophozoite stage. After that, it gradually increased to schizont (Fig. 13). Diffuse staining of whole red blood cells is a dye At certain antibody dilutions, the Fe12 I was getting stronger.

また、Ａｇ７の局在性をプロティンＡ免疫電子顕微鏡を用いで調べた。非同調培 養から得たＦＣ２７寄生虫を抗−Ａｇ、７抗体を用いで調べた。Ａｇ７はトロホ ゾイトおよびシゾントの、いずれによって感染した赤血球についてもその膜上、 並びに赤血球細胞質の膜に沿って並ぶ小胞中に検出された（第１４図）。また、 Ａｇ７は、赤面球内寄生虫の制限膜（リミッティング・メンプラン）と関連する 幾つかの切片からも検出された（データーは記載されず）。これに対して、リン グ感染赤血球は標識されず、また、リング段階の寄生虫自身も標識されなかった 。リング段階によって感染された赤血球に関連する抗原（リング感染赤血球表面 抗原、ＲＥＳＡ）についでは既に報告されでいる。赤血球表面の、ＲＥＳＡが見 い出されたと同様の位置に存在するが、より成熟した段階の寄生虫で感染された 赤血球中に見い出されるこの抗原の名称としで、本発明者らは成熟寄生虫感染赤 血球表面抗原（Ｍａｔｕｒｅ　−ｐａｒａｓｉｔｅ　−１ｎｆｅｃｔｅｄ　−Ｅ ｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ　５ｕｒｆａｃｅ　Ａｎｔｉｇｅｎ）（ＭＥＳＡ）を用い ることとした。In addition, the localization of Ag7 was investigated using protein A immunoelectron microscopy. non-synchronized cultivation FC27 parasites obtained from the culture were examined using anti-Ag, 7 antibody. Ag7 is Troho On the membrane of red blood cells infected by both zoites and schizonts, It was also detected in vesicles arranged along the membrane of the red blood cell cytoplasm (Fig. 14). Also, Ag7 is associated with the limiting membrane of intrabulbar parasites. It was also detected in some sections (data not shown). On the other hand, phosphorus The ring-infected red blood cells were not labeled, nor were the ring-stage parasites themselves. . Antigens associated with red blood cells infected by the ring stage (ring-infected red blood cell surface Antigen, RESA) has already been reported. RESA on the surface of red blood cells is detected. infected with a more mature stage of the parasite By naming this antigen found in red blood cells, we Blood cell surface antigen (Mature-parasite-1nfected-E Using rythrocyte 5 surface Antigen (MESA) I decided to do so.

組換えＤＮＡ分子の調製、並びに組換えＤＮＡクローニングビヒクルおよびベク ターの調製、宿主細胞とクローニングビヒクルとの組合わせ、さらＫは宿主細胞 によるポリペプチドの発現に関する全記述は国際特許明細書、Ｎｏ、　ＰＣＴ／ ＡＵ８４１０００１６　Ｋ包含されテいる。この明細書では、ＤＮＡ分子、およ びそれによっで発現されたポリペプチドの、血清学的診断法における利用法や、 プラズモジウム属に対する防御抗体を刺激するための、単価または多価ワクチン の調製における利用方法に関しでも述べられでいる。この記載は本発明にも等し く適用でき、それを本明細書で引用する。Preparation of recombinant DNA molecules and recombinant DNA cloning vehicles and vectors preparation of the host cell, combination of the host cell and cloning vehicle, and K is the host cell A complete description of the expression of polypeptides according to the International Patent Specification, No. PCT/ AU84100016 K is included. In this specification, DNA molecules and and the use of polypeptides expressed thereby in serological diagnostic methods, Monovalent or multivalent vaccines to stimulate protective antibodies against Plasmodium spp. The method for its use in the preparation of is also described. This description is also equivalent to the present invention. It can be applied in many ways and is hereby incorporated by reference.

以下に１本明細書で引用した文献を示す。One of the documents cited in this specification is shown below.

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ジャーナル・オブ・バラジトール（Ｊ、Ｐａｒａｓｉｔｏｌ・）　６５　、４１ ８−　。Journal of Parasitol (J, Parasitol) 65, 41 8-.

１４、ムレマら（Ｍｒｅｍａ、　Ｊ、Ｅ、　Ｋ、　、　ｅｔ、　ａｌ　、　）　 、　（１９８２）。14. Mrema et al. , (1982).

エキスペリメンタル・バラジトール（Ｅｘｐ。Experimental Valaditor (Exp.

１５、メツカンタ（Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、）およびビエイラ（２６９−２７６ ゜ １６、シバルツ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ、　Ｄ、　Ｃ，）およびカンタ−（Ｃａｎｔ ｏｒ、　Ｌ、　Ｒ，）　（１９８４）　。セル３７．６７−７５゜１７、アンダ ースら（Ａｎｄｅｒｓ、　Ｒ，Ｆ、　、　ｅｔ、　ａｌ、　）　。15, Metzcanta (Messing, J.) and Vieira (269-276 ゜ 16, Schwartz, D, C, and Cant. or, L, R,) (1984). Cell 37.67-75°17, under Anders et al.

（１９８４）。モレキュラー・バイオロジカル・メジソ１８、コペルら（Ｃｏｐ ｐｅｌ　、　Ｒ，Ｌ、　、　ｅｔ、　ａｌ　、　）　、　（１９８５）。(1984). Molecular Biological Method 18, Copel et al. pel, R, L, et, al, ), (1985).

エキスペリメンタル・バラジトール（Ｅｘｐ。Experimental Valaditor (Exp.

１９、スタールら（５ｔａｈｌ、　Ｈ−Ｄ　、　、　ｅｔ　ａｌ、）、（１９８ ４）プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイエン スイズ、ＵＳＡ　８１゜２４５６−２４６０゜ 加、　ラベツチら（Ｒａｖｅｔｃｈ、　Ｊ、Ｖ、　、　ｅｔ　ａｌ、　）＋　（ １９８４，）ネイチャー３１２．６１６−６２０゜ ２１．カラマンら（Ｃｏｗｍａｎ、　Ａ、　Ｆ、　、　ｅｔ　ａｌ、　）　、　 （１９８５）セル　４０　、７７５−７８３゜ ／’７に、　ＪＡ。19, Stahl et al. (5tahl, H-D, et al.), (198 4) Proceedings of the National Academy of Sciences Suiz, USA 81°2456-2460° Ravetch, J, V, et al. + ( 1984,) Nature 312.616-620° 21. Cowman, A, F, et al. (1985) Cell 40, 775-783° /'7, JA.

λ 〜≧ “へ ７４７Ｇ、８Ａ。λ ~≧ "fart 747G, 8A.

ＦｔＧ、８Ｂ。FtG, 8B.

Ｆ／Ｇ、９ 国際調査報告 ｍ−１−１，、−１ａ−３，−１，−，１０，ＰＣＴ／ＡＵ　８６１０００９２ ＋町−−−−−ｕ　ａ＊ｅ悸＝−Ｎ−、ＰＣＴ／ＡＩＪ　８６１０００９２ＡＮ ＮＥＸ　Ｔｏ　ＴＨＥ　ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　５ＥＡＲＣＨＲＥＰＯＲ Ｔ　０ＮＷＯ８３０４３７０ＡＵ１６０６７／８３　０Ｅ　３２２１８８１　Ｅ Ｆ　９６４２２F/G, 9 international search report m-1-1,,-1a-3,-1,-,10,PCT/AU　86100092 + Town---u a*e palpitation=-N-, PCT/AIJ 86100092AN NEX To THE INTERNATIONAL 5EARCHREPOR T　0NWO8304370AU16067/83　0E　3221881　E F　96422

Claims (22)

【特許請求の範囲】[Claims] １．小さいヒスチジン−アラニン豊富タンパク質（ＳＨＡＲＰ）、アスパラギン 豊富タンパク質（ＡＲＰ）、成熟寄生虫感染赤血球表面抗原（ＭＥＳＡ）並びに それらと交差反応し得るＰ・フアルシパルムの他の抗原群からなる群から選択さ れるＰ．フアルシパルムの抗原をコードしている塩基配列の全てまたは一部と実 質上対応するヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子。1. small histidine-alanine rich protein (SHARP), asparagine abundant protein (ARP), mature parasite-infected erythrocyte surface antigen (MESA) and selected from the group consisting of other antigens of P. falciparum with which they may cross-react. P. All or part of the nucleotide sequence encoding the antigen of Falciparum DNA molecules containing qualitatively corresponding nucleotide sequences. ２．該ヌクレオチド配列がＰ．フアルシパルムのＳＨＡＲＰ抗原と実質上対応す るＰ．フアルシパルムのポリペプチドをコードしているものである第１項記載の ＤＮＡ分子。2. The nucleotide sequence is P. substantially corresponds to the SHARP antigen of Falciparum. P. falciparum polypeptide according to item 1; DNA molecule. ３．該ヌクレオチド配列がＰ．フアルシパルムのＡＲＰ抗原と実質上対応するＰ ．フアルシパルムのポリペプチドをコードしているものである第１項記載のＤＮ Ａ分子。3. The nucleotide sequence is P. P which substantially corresponds to the ARP antigen of M. falciparum ．． DN according to item 1, which encodes a polypeptide of P. falciparum A molecule. ４．該ヌクレオチド配列がＰ．フアルシパルムのＭＥＳＡ抗原と実質上対応する Ｐ．フアルシパルムのポリペプチドをコードしているものである第１項記載のＤ ＮＡ分子。4. The nucleotide sequence is P. substantially corresponds to the MESA antigen of M. falciparum P. D according to item 1, which encodes a polypeptide of P. falciparum. NA molecule. ５．該ヌクレオチド配列が、少くともその一部として、実質上第２図に記載の塩 基配列を含有することを特徴とするものである第１項記載のＤＮＡ分子。5. The nucleotide sequence comprises, at least in part, a salt substantially as described in FIG. 2. The DNA molecule according to item 1, which is characterized by containing a base sequence. ６．該ヌクレオチド配列が、少くともその一部として、実質上第８図に記載の塩 基配列を含有することを特徴とするものである第１項記載のＤＮＡ分子。6. The nucleotide sequence comprises, at least in part, a salt substantially as described in FIG. 2. The DNA molecule according to item 1, which is characterized by containing a base sequence. ７．該ヌクレオチド配列が、少くともその一部として、実質上第１１図に記載の 塩基配列を含有することを特徴とするものである第１項記載のＤＮＡ分子。7. The nucleotide sequence is, at least in part, substantially as set forth in FIG. 2. The DNA molecule according to item 1, which is characterized by containing a base sequence. ８．ＳＨＡＲＰ抗原、ＡＲＰ抗原、ＭＥＳＡ抗原およびこれらと交差反応し得る Ｐ．フアルシパルムの他の抗原からなる群から選択されるＰ．フアルシパルム抗 原の抗原性を示す少くとも１種のポリペプチドを発現することのできるヌクレオ チド配列を含有するＤＮＡ分子。8. SHARP antigen, ARP antigen, MESA antigen and can cross-react with these P. P. falciparum selected from the group consisting of other antigens of P. falciparum. falciparum anti a nucleosome capable of expressing at least one polypeptide exhibiting original antigenicity; A DNA molecule containing a sequence. ９．発現コントロール配列と機能的に結合している第１項〜第８項のいずれかに 記載のヌクレオチド配列を含有する組換えＤＮＡ分子。9. Any one of paragraphs 1 to 8 that is functionally linked to the expression control sequence A recombinant DNA molecule containing the described nucleotide sequence. １０．少くとも１個のＰ．フアルシパルムのポリペプチドまたはタンパク質の全 てまたは一部を発現し得ると共に、第１項〜第８項のいずれかに記載のヌクレオ チド配列であつて、発現コントロール配列と機能的に結合している配列が挿入さ れている組換えＤＮＡクローニングビヒクルまたは組換えＤＮＡクローニングベ クター。10. At least one P. All of the polypeptides or proteins of falciparum The nucleonucleotide according to any one of paragraphs 1 to 8, A sequence that is a sequence that is functionally linked to an expression control sequence is inserted. recombinant DNA cloning vehicle or recombinant DNA cloning vector ctor. １１．該ヌクレオチド配列および該発現コントロール配列がバクテリオフアージ に挿入されていることを特徴とする第１０項記載の組換えＤＮＡクローニングビ ヒクルまたはベクター。11. The nucleotide sequence and the expression control sequence are The recombinant DNA cloning vector according to item 10, characterized in that the recombinant DNA cloning vector is inserted into Hickle or vector. １２．該バクテリオフアージがバクテリオフアージＡｍｐ３であることを特徴と する第１１項記載の組換えＤＮＡクローニングビヒクルまたはベクター。12. The bacteriophage is bacteriophage Amp3. 12. The recombinant DNA cloning vehicle or vector according to paragraph 11. １３．第９項記載の組換えＤＮＡ分子または第１０項記載の組換えＤＮＡクロー ニングビヒクルまたはベクターを含有している宿主細胞。13. A recombinant DNA molecule according to paragraph 9 or a recombinant DNA clone according to paragraph 10. host cell containing the ning vehicle or vector. １４．ＳＨＡＲＰ抗原、ＡＲＰ抗原、ＭＥＳＡ抗原およびこれらと交差反応し得 るＰ．フアルシパルムの他の抗原からなる群から選択されるＰ．フアルシパルム の全てまたは一部の抗原性を示す合成ペプチドまたはポリペプチド。14. SHARP antigen, ARP antigen, MESA antigen and those that may cross-react with P. P. falciparum selected from the group consisting of other antigens of P. falciparum. falciparum Synthetic peptides or polypeptides exhibiting all or part of the antigenicity of. １５．Ｐ．フアルシパルムのＳＨＡＲＰ抗原の全てまたは一部の抗原性を示すこ とを特徴とする第１４項記載の合成ペプチドまたはポリペプチド。15. P. Showing antigenicity of all or part of the SHARP antigen of M.falciparum 15. The synthetic peptide or polypeptide according to item 14, characterized in that: １６．Ｐ．フアルシパルムのＡＲＰ抗原の全てまたは一部の抗原性を示すことを 特徴とする第１４項記載の合成ペプチドまたはポリペプチド。16. P. exhibiting antigenicity of all or part of the ARP antigen of M. falciparum Synthetic peptide or polypeptide according to item 14, characterized in that: １７．Ｐ．フアルシパルムのＭＥＳＡ抗原の全てまたは一部の抗原性を示すこと を特徴とする第１４項記載の合成ペプチドまたはポリペプチド。17. P. Showing the antigenicity of all or part of the MESA antigen of M.falciparum 15. The synthetic peptide or polypeptide according to item 14, characterized in that １８．Ｃ末端配列としての、ＳＨＡＲＰ抗原、ＡＲＰ抗原、ＭＥＳＡ抗原および それらと交差反応し得るＰ．フアルシパルムの他の抗原からなる群から選択され るＰ．フアルシパルムの抗原の抗原性を示すポリペプチド配列と、該配列に融合 したＮ末端配列としての付加的なポリペプチドとを含む融合ポリペプチド。18. SHARP antigen, ARP antigen, MESA antigen and as C-terminal sequence P. which can cross-react with them. selected from the group consisting of other antigens of P. falciparum P. A polypeptide sequence exhibiting the antigenicity of a P. falciparum antigen and fused to the sequence. and an additional polypeptide as an N-terminal sequence. １９．付加的なポリペプチドが組換えＤＮＡクローニングビヒクルまたはベクタ ーによつてコードされているポリペプチドである第１８項記載の融合ポリペプチ ド。19. The additional polypeptide is present in a recombinant DNA cloning vehicle or vector. 19. The fusion polypeptide according to paragraph 18, which is a polypeptide encoded by Do. ２０．ＳＨＡＲＰ抗原、ＡＲＰ抗原、ＭＥＳＡ抗原およびこれらと交差反応性の Ｐ．フアルシパルムの他の抗原からなる群から選択されるＰ．フアルシパルムの 抗原の抗原性を表わす少くとも１種のポリペプチドと、薬学的に許容し得る担体 とを含有してなる、哺乳類でＰ．フアルシパルム抗原に対する免疫応答を刺激す るための組成物。20. SHARP antigen, ARP antigen, MESA antigen and their cross-reactivity P. P. falciparum selected from the group consisting of other antigens of P. falciparum. of falciparum at least one polypeptide representing the antigenicity of the antigen and a pharmaceutically acceptable carrier A mammal containing P. stimulates the immune response to falciparum antigens composition for ２１．さらにアジユバントをも含有する第２０項記載の組成物。21. 21. The composition of claim 20, further comprising an adjuvant. ２２．第２０項または第２１項記載の組成物を哺乳類に投与することからなる、 哺乳類でＰ．フアルシパルムに対する免疫応答を刺激する方法。22. comprising administering to a mammal the composition according to paragraph 20 or paragraph 21; In mammals, P. A method of stimulating an immune response to falciparum.