JPS62502025A - DNA sequences useful for secreting peptides and proteins from yeast - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 ３４、　Ｓ、セレビシェ種のものである第３０項記載の酵母細胞。[Detailed description of the invention] 34. The yeast cell according to paragraph 30, which is of the species S. cerevisiae.

３５、酵母細胞内で機能的なプロモーター領域、酵母細胞内で機能的であり、プ ロモーター領域と機能的に蓮台しているシグナルペプチドをコードしているシグ ナル配列、および ポリペプチドをコードしており、該シグナル配列と機能的に結合しているポリペ プチド暗号領域を含有するＤＮＡ組立て物により形質転換された酵母細胞を増殖 促進培地中で増殖させることからなる酵母細胞からポリペプチドを分泌させる方 法であって、該シグナル配列および該プロモーター領域の内、少（とも一方はメ リビアーゼ遺伝子のセグメントであることを特徴とする方法。35, a promoter region that is functional in yeast cells, a promoter region that is functional in yeast cells, Sig encodes a signal peptide that is functionally connected to the promoter region. null array, and A polypeptide encoding a polypeptide and operably linked to the signal sequence. Propagating Yeast Cells Transformed with DNA Constructs Containing the Petide Coding Region A method for secreting polypeptides from yeast cells, which consists of growing them in a promoting medium. A method in which a small number of the signal sequence and the promoter region (one of which is A method characterized in that it is a segment of a lyase gene.

３６、ポリペプチドの暗号領域がメリビアーゼ以外のものをコードしている第３ ５項記載の方法。36, the third polypeptide whose coding region encodes something other than melibiase The method described in Section 5.

３７、該プロモーター領域がメリビアーゼのプロモーター領域である第３６項記 載の方法。37. Item 36, wherein the promoter region is a promoter region of melibiase. How to put it on.

３８、該シグナル配列がメリビアーゼのシグナル配列である第３７項記載の方法 。38. The method according to item 37, wherein the signal sequence is a melibiase signal sequence. .

３９、ポリペプチドの暗号領域がセルロモナス・フイミから導かれたものであり 、エンドグルカナーゼをコードしているものである第３８項記載の方法。39. The coding region of the polypeptide was derived from Cellulomonas fuimi. , encoding an endoglucanase.

に影響を及ぼす増殖培地中の条件の変化により調節される第３７項記載の方法。38. The method of paragraph 37, wherein the method is regulated by changes in conditions in the growth medium that affect the growth medium.

４１、酵母固有のメリビアーゼ遺伝子のシグナル配列。41, signal sequence of yeast-specific melibiase gene.

４２、　Ｓ、カールスベルゲンシスに固有の第４１項記載のシグナル配列。42, the signal sequence according to paragraph 41, which is unique to S. Carlsbergensis.

４３、実質上、式： ％式％ で示されるアミノ酸配列をコードしているＤＮＡ配列を有する第４２項記載のシ グナル配列。43, substantially the formula: %formula% The system according to item 42, which has a DNA sequence encoding the amino acid sequence shown in Gunar array.

４４、実質上、式： ％式％ で示されるＤＮＡ配列を有する第４３項記載のシグナル配列。44, substantially the formula: %formula% 44. The signal sequence according to item 43, having a DNA sequence represented by:

４５、ＤＮＡ組立て物であって、メリビアーゼ分泌シグナル配列を含有し、該シ グナル配列の側方に、付加的なりＮＡ成分を該組立て物に挿入するための制限部 位を規定しているＤＮＡセグメントを含んでいるＤＮＡ組立て物。45, a DNA construct containing a melibiase secretion signal sequence; Restrictions on the sides of the GNAR array for inserting additional NA components into the assembly. A DNA construct that contains DNA segments that define positions.

４６、該ＤＮＡセグメントが実質上、第４Ａ図に示されているヌクレオチド配列 を有する第４５項記載の組立て物。46, the DNA segment having a nucleotide sequence substantially as shown in FIG. 4A. 46. The assembly according to clause 45, having:

４７、酵母に固有のメリビアーゼ遺伝子のプロモーター領域。47, promoter region of yeast-specific melibiase gene.

４８、　Ｓ、カールスペルゲンシスに固有の第４７項記載のプロモーター領域。48, S. The promoter region according to paragraph 47, which is unique to S. carl spergensis.

４９、実質上、添付図面の第１図に示されているＤＮＡ配列を有する第４７項記 載のプロモーター領域。49, item 47 having a DNA sequence substantially as shown in Figure 1 of the accompanying drawings. promoter region.

５Ｑ、ＤＮＡ組立て物であって、メリビアーゼのプロモーターを含有すると共に 、該プロモーターの下流に該ベクターに付加的なりＮＡ成分を挿入するための制 限部位を規定するＤＮＡセグメントを含有している組立て物。5Q, a DNA construct containing the promoter of melibiase and , a control for inserting an additional NA component into the vector downstream of the promoter. A construct containing DNA segments that define a restriction site.

明　細　書 ペプチドおよびタンパク質を酵母から 分泌させるのに有用なりＮＡ配列 本発明は、組換えＤＮＡ技術に関するものである。Specification Peptides and proteins from yeast NA sequence useful for secretion The present invention relates to recombinant DNA technology.

さらに詳しくは、本発明は、１方では、遺伝子の発現を促進する様機能し、他方 では、発現した遺伝子にコードされでいるタンパク質の分泌を合図する様機能す るＤＮＡ配列に関するものである。この様な配列は酵母細胞を操作する上で有用 である。More specifically, the present invention functions, on the one hand, to promote gene expression; In this case, the function is to signal the secretion of the protein encoded by the expressed gene. It concerns the DNA sequence. Such sequences are useful for manipulating yeast cells It is.

発明の背景 分泌、即ち、特定の遺伝子発現産物が細胞から培地へ放出（輸出）される過程は 、生細胞における自然の性質である。外来のペプチドやタンパク質を発現する様 に遺伝的修飾を施された細胞が、それらの産物を分泌するという性質は、それら 産物が細胞外に置かれることてより部分的に精製された形で、しかも得易い状態 で生産されることになるので、望ましい性質である。Background of the invention Secretion, the process by which specific gene expression products are released (exported) from cells into the culture medium , a natural property of living cells. Appears to express foreign peptides and proteins The property of genetically modified cells to secrete these products is that they Because the product is placed outside the cell, it is in a partially purified form and is easy to obtain. This is a desirable property since it will be produced at

細胞内で生産されたタンパク質やポリペプチドは、細胞内に止まるか、細胞外に 分泌されるかは予め決まっている。これらの分類上具る２種の型のタンパク質の 運命を決める機構は、ヌクレオチド配列によってコードされでいる機能的な「シ グナル」ペプチド、即ち、既知の例の大多数の場合、実際に分泌されるべきタン パク質をコードしている遺伝子の配列に先行しで存在しでいるシグナル配列にあ ることが実験的に判明した。Proteins and polypeptides produced within cells either remain within the cell or exit outside the cell. Whether it is secreted or not is determined in advance. The two types of proteins in these classifications are The fate-determining mechanism is a functional “system” encoded by the nucleotide sequence. 'gnal' peptide, i.e., in the majority of known cases, the protein that is actually to be secreted. The signal sequence that precedes the sequence of the gene encoding the protein. It was experimentally found that.

その事実に基づ（と、相補的ヌクレオチド配列から翻訳され、分泌されるように 定められている未成熟タンパク質は、はじめから未成熟タンパク質を分泌経路へ と通過させるための細胞内の膜上の分泌路に存在するりセプター（受容体）によ って認識されるアミノ酸の前駆体様の配列、即ち「シグナル」を有しでいる。そ の様にしで結合されると、前駆体タンパク質のシグナル配列はタンパク分解的に 開裂され、構造が修飾され（例えばグリコジル化）た後細胞から分泌（放出）さ れることになる活性なタンパク質を与える。Based on that fact (and as translated and secreted from complementary nucleotide sequences) Defined immature proteins direct immature proteins to the secretory pathway from the beginning. and receptors present in the secretory channels on the intracellular membrane that allow the passage of It has a precursor-like sequence of amino acids that is recognized as a "signal." So When bound, the signal sequence of the precursor protein is proteolytically After being cleaved and structurally modified (e.g. glycosylated), it is secreted (released) from the cell. It provides the active protein that will be absorbed.

その様な特異的シグナル配列を解読し、利用することによって細胞から常時分泌 されるタンパク質を生産し得る細胞を遺伝的に工作することが可能となる。遺伝 的に操作された細胞からタンパク質を回収するには、通常は、配列から翻訳され たタンパク質に分泌される様な性質を付与するのに必要な適当なヌクレオチド配 列がベクター中に含まれていないので、操作された細胞を溶解し、所望のタンパ ク質を精製する必要がある。By decoding and utilizing such specific signal sequences, constant secretion from cells can be achieved. It becomes possible to genetically engineer cells that can produce the proteins that are produced. genetics To recover proteins from artificially engineered cells, it is usually necessary to extract the translated proteins from the sequence. the appropriate nucleotide sequences necessary to confer secreted properties on the protein. Since the column is not included in the vector, lyse the engineered cells and add the desired protein. It is necessary to refine the quality.

この工程では細胞が破壊されでしまうが、本発明方法によれば、下記の如く、所 望のタンパク質を分泌する間、充分な増殖培地を供給し続けることにより細胞を 生存状態に保つことができる。また、操作された細胞をインキュベートした栄養 ブロス（ブイヨン）から直接、既知の化学的方法によってタンパク質を連続的に 抽出することができる。Although cells are destroyed in this step, according to the method of the present invention, as described below, Keep the cells supplied with sufficient growth medium while secreting the desired protein. can be kept alive. Additionally, the engineered cells were incubated with nutrients. Continuously extract proteins by known chemical methods directly from the broth can be extracted.

既知の如く、遺伝的に修飾された発現ビヒクルから酵母内で発現された生産物の 分泌は、原則として、ビヒクルに、酵母にとって適当なシグナルペプチドをコー ドしているヌクレオチド配列と外来遺伝子とを一緒に挿入することにより確保さ れる。このシグナルペプチドは、所望の遺伝子産物を含むペプチドと接しでおり 、しかも該ペプチドのＮ末端と接していなければならない。As is known, products expressed in yeast from genetically modified expression vehicles Secretion is, in principle, coated in the vehicle with a signal peptide suitable for the yeast. This is achieved by inserting the native nucleotide sequence and the foreign gene together. It will be done. This signal peptide is in contact with a peptide containing the desired gene product. , and must be in contact with the N-terminus of the peptide.

遺伝的に操作された（遺伝子操作された）酵母内での外来タンパク質の発現であ って、発現した分子が分泌されない様な発現自体は、これまでしばしば試みらレ テきた。いくつかの例では、これらの遺伝子は酵母内で発現されたが、多くの場 合゛、それらは全く発現されないか、少くとも、必要なレベルで発現されでいな い。特定の外来遺伝子が発現されるためには、ある種の性質（特徴）を変える必 要がある。このことは、生物固有の遺伝子の部分と外来遺伝子の部分とを融合さ せ、発現されない外来遺伝子と発現される天然遺伝子との差違を減することによ り行われる。Expression of a foreign protein in genetically engineered (genetically engineered) yeast Therefore, expression itself in which the expressed molecules are not secreted has often been attempted. It's here. In some cases these genes have been expressed in yeast, but in many cases Together, they are not expressed at all, or at least not expressed at the required levels. stomach. In order for a specific foreign gene to be expressed, it is necessary to change certain properties (characteristics). There is a point. This means that the part of the gene unique to the organism and the part of the foreign gene are fused. by reducing the difference between the foreign gene that is not expressed and the native gene that is expressed. will be held.

変化させるべき特徴として最も一般的なものは、遺伝子の暗号配列の上流領域の 配列である。通常、この領域には、転写開始に必要な配列、並びに、多くの場合 、細胞内に存在する特定のタンパク質と結合した形で転写レベルを高め、そしで ／または抑制する（即ち、調節する）のに必要な配列が遺伝子の転写および翻訳 ゛に影響を及ぼす他の配列と一緒に含まれでいる。この領域は、上記の如く、転 写を促進する領域として厳密に定義される配列以外の配列をも含んでいるが、通 常、「プロモーター」と称されている。The most common feature to change is the upstream region of the gene's coding sequence. It is an array. This region normally contains sequences necessary for transcription initiation, as well as often , increases transcription levels by binding to specific proteins present in cells, and / or the sequences necessary to suppress (i.e., regulate) the transcription and translation of the gene. It is included along with other sequences that affect ``. This area is, as mentioned above, Although it includes sequences other than those strictly defined as regions that promote copying, Usually referred to as a "promoter".

特定の外来遺伝子産物を酵母から分泌させたい場合に通常付加されたり置換され るもう１つの特徴部分は、シグナル配列またはリーダー配列である。このシグナ ル配列は１通常、遺伝子の翻訳部分の始めの配列によってコードされている短か いポリペプチドである。Usually added or substituted when you want to secrete a specific foreign gene product from yeast. Another feature is the signal or leader sequence. This signa A sequence is usually a short sequence encoded by the sequence at the beginning of the translated portion of a gene. It is a polypeptide.

この様に、特定の外来遺伝子の産物が発現されて酵母から分泌されるためには、 上記のプロモーターおよび／またはシグナル配列を付加すやか、あるいは、類似 の外来性配列を酵母内で機能的な配列で置換することがよく行われる。In this way, in order for a specific foreign gene product to be expressed and secreted from yeast, Immediate addition of the above promoter and/or signal sequence or similar It is common practice to replace foreign sequences in yeast with sequences that are functional in yeast.

酵母シグナルペプチドを用いずに外来タンパク質を酵母から分泌させる試みがヒ ララマンら（Ｈｉｔｚｅｍａｎｅｓ　ａｌ、）　（１）によって行われた。興味 あるタ　ンパク質、即ちヒトインターフェロンは、その遺伝子内に、ヒト細胞内 での分泌に適した自身のシグナル配列を有しでいるが、酵母内で発現させると、 このインターフェロンは効率良く発現するが殆んど分泌されない。最近の報告で は、外来の遺伝子産物を酵母から分泌させるために酵母のシグナルペプチドを利 用することが試験されティる。エムルら（Ｅｍｒ　ｅｔ　ａｌ、）　（２）　は 、分泌された酵母ペプチド、α因子のリーダー領域をコードしでいるヌクレオチ ド配列と、通常酵母のベリプラスミンク間隙（酵母の細胞膜と細胞壁との間の領 域）に分泌される酵母タンパク質、インベルターゼをコードしているヌクレオチ ド配列との遺伝子融合を行った。Attempts to secrete foreign proteins from yeast without using yeast signal peptides have been successful. It was performed by Hitzemanes et al. (1). interest A certain protein, namely human interferon, is found in its gene within human cells. It has its own signal sequence suitable for secretion in yeast, but when expressed in yeast, Although this interferon is efficiently expressed, it is hardly secreted. In a recent report uses yeast signal peptides to secrete foreign gene products from yeast. It has been tested for use. Emr et al. (2) , a secreted yeast peptide, a nucleotide encoding the leader region of α-factor. The normal yeast veliplasmink gap (the area between the yeast cell membrane and cell wall) The nucleotide encoding invertase, a yeast protein secreted by the Gene fusion was performed with the code sequence.

この結果、インベルターゼがペリプラスミック間隙に分泌されたが、これがα因 子のリーダーによるものか否かは、融合物中のインベルターゼ遺伝子がインベル ターゼシグナルペプチド配列のセグメントを含んでいることから、明らかでない 。実際には、α因子は培地中に分泌され、インベルターゼはべりプラスミンク間 隙に分泌されるので、エムルらの実験におけるインベルターゼの局在化は、遺伝 子融合物中のインベルターゼ成分によるものかもしれない。ブレイクら（Ｂｒａ ｋｅｅｔ　ａｌ、）　（３）は、α因子のリーダー領域とヒト上皮性成長因子（ ＥＧＦ）をコードしている合成りＮＡ配列との遺伝子融合物を組立て、この融合 物が、α因子のリーダーをコードしている領域の配列の内、限られた領域をイン ビトロ突然変異誘発により変化させると、酵母から成熟ＥＧＦを有効に分泌させ ることを見出した。ビターら（Ｂｉｔｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　）　（４）はα因 子ノリーダー領域トβ−エンドルフィンおよび「コンセンサス」ヒトインターフ ェロン各タンパク質との融合物を組み立て、これらの外来タンパク質は分泌され るが、同時に、分泌現象の起こる間にタンパク分解により幾分破壊されることを 見い出した。しかしながら、インクタンパク質の少くとも９５％が無傷で回収さ れた。少なくともα因子の場合には、外来性のペプチドやタンパク質がそれらの 天然の宿主内では分泌型の遺伝子産物であろうとなかろうと、酵母の分泌シグナ ルは、それら外来性ペプチドやタンパク質の酵母からの分泌を容易ならしめる情 報を含んでいることは明白と思われる。As a result, invertase was secreted into the periplasmic space, which caused α-factor. Whether it is by the child leader or not, the invertase gene in the fusion It is not obvious, as it contains a segment of the tase signal peptide sequence. . In fact, α-factor is secreted into the medium and invertase The localization of invertase in Emul et al.'s experiment was determined by the genetic This may be due to the invertase component in the child fusion. Brake et al. keetal, ) (3) is the leader region of alpha factor and human epidermal growth factor ( A gene fusion with a synthetic NA sequence encoding EGF) is constructed, and this fusion The protein injects a limited region within the sequence of the region encoding the α-factor leader. When altered by in vitro mutagenesis, yeast effectively secrete mature EGF. I discovered that. Bitter et al. (4) is the α factor Child leader region β-endorphin and “consensus” human interface These foreign proteins are secreted by constructing fusions with each protein. However, at the same time, it is expected that it will be somewhat destroyed by proteolysis during the secretory event. I found it. However, at least 95% of the ink proteins are recovered intact. It was. At least in the case of alpha factors, exogenous peptides and proteins Yeast secretory signals, whether or not they are secreted gene products, in their natural host. The key is information that facilitates the secretion of these foreign peptides and proteins from yeast. It seems clear that it contains information.

メリピアーゼ、またはα−ガラクトシダーゼ（Ｅ、Ｃ０３、２，１，２２）は、 酵母Ｓ、カールスペルゲネシス（いくつかの菌株の増殖産物であり、天然の分泌 タンパク質である。酵母プラスミドにクローニングしで得た、これら酵母株の内 の１つに由来するＤＮＡフラグメントは、形質転換によって細胞内に導入される と、メリビアーゼー陰性酵母にメリビアーゼー陽性表現型を与えることがボスト −バイテンミラーら（Ｐｏ５ｔ　−ａｌ、。Melipiase, or α-galactosidase (E, C03, 2, 1, 22), Yeast S. carl spergenesis (a multiplication product of some strains and a naturally secreted It is a protein. Among these yeast strains obtained by cloning into yeast plasmids, A DNA fragment derived from one of the cells is introduced into the cell by transformation. and Bost, which confers a melibiase-positive phenotype to melibiase-negative yeast. - Baitenmiller et al. (Po5t-al,.

Ｂｅｉｔｔｅｎｍｉｌｌｅｒ　ｅｔ△）　（５）によって示された。Beittenmiller et Δ) (5).

本発明は、前駆体プレメリビアーゼｉよびそのプレー領域のアミノ酸配列、並び にこれら各々をコードしでいるヌクレオチド配列を提供し、さらに、このプレー 領域をコードしでいるヌクレオチド配列を含有するベクター組立て物（構築物） を提供することを目的とするものである。The present invention provides the amino acid sequence and sequence of precursor premelibiase i and its play region. provide the nucleotide sequences encoding each of these, and Vector assembly (construct) containing a nucleotide sequence encoding a region The purpose is to provide the following.

さらに、本発明は、メリビアーゼのシグナル性分泌を行い得るシグナル配列と他 の遺伝子または遺伝子の部分とを結合させ、酵母宿主細胞からこの遺伝子または 遺伝子部分によりタンパク質を分泌させるために、これらを、クローニングベク ターを介して該細胞に導入する方法を提供することを目的とするものである。Furthermore, the present invention provides a signal sequence capable of signal secretion of melibiase and other of a gene or portion of a gene, and extract this gene or gene from a yeast host cell. In order to secrete the protein by the gene parts, these are transformed into cloning vectors. The purpose of this invention is to provide a method for introducing the vector into the cell via a vector.

さらにまた本発明の目的は、サツカロマイセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃ ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ　）に固有のタンパク質 メリビアーゼをコードしでいるＤＮＡ領域の転写を促進し得る調節可能なプロモ ーター領域を提供することにある。Furthermore, it is an object of the present invention to protein unique to Charomyces carlsbergensis) A regulatable promoter capable of promoting transcription of the DNA region encoding melibiase. The goal is to provide a data center area.

さらにまた本発明は、上記のプロモーター領域と、シグナル配列およびポリペプ チド暗号領域とをクローして暗号領域にコードされでいるポリペプチドを分泌さ せることのできる方法を提供することをも目的とするものである。Furthermore, the present invention also provides the above promoter region, a signal sequence and a polypeptide. The polypeptide encoded by the coding region is secreted by cloning the coding region. It is also an object of this invention to provide a method that can be used to

即ち、本発明は、まず第１に、酵母固有のメリビアーゼ遺伝子のシグナル配列、 好ましくはサツカロマイセス・カールスベルゲンシス由来の該遺伝子の配列を提 供するものである。That is, the present invention first provides a signal sequence of a yeast-specific melibiase gene, Preferably, the sequence of the gene derived from S. carlsbergensis is provided. This is what we provide.

第２に、本発明は酵母固有の、好ましくはサツカロマイセス・カールスペルゲン シスのプレメリビアーゼ遺伝子の調節可能なプロモーター領域あるいは、合成的 または半合成的に得たそれの同等物質を提供するものである。Second, the present invention provides yeast-specific, preferably Saccharomyces karlspergen The regulatable promoter region of the cis premeribiase gene or the synthetic or semi-synthetically obtained equivalent substances.

第３に、本発明は、酵母固有のプレメリビアーゼおよびメリビアーゼをコードし でいる暗号領域、好ましくはサツカロマイセス・カールスペルゲンシスから導か れたものを提供するものである。Third, the present invention encodes yeast-specific premelibiase and melibiase. cipher region, preferably derived from Satucharomyces carlspergensis. The goal is to provide the best possible results.

第４に本発明は、酵母細胞を形質転換するのに用いられる、少くとも１個のプロ モーター領域とシグナル配列とを有するベクター組立て物を提供するものである 。好ましい形においでは、プロモーター領域とシグナル配列とがベクター組立て 物に組込まれ、形質転換される宿主酵母細胞に固有の、あるいは該細胞にとっで 外来の暗号領域と機能的（操作可能〕に連合している。さらに、Ｓ、カールスベ ルゲンシスに固有のプレメリビアーゼを起源とするプロモーター領域、シグナル 配列および暗号領域の各々から組立てられたベクター組立物は、外来宿主を形質 転換するのに使用される。Fourth, the present invention provides at least one protein used to transform yeast cells. A vector assembly having a motor region and a signal sequence is provided. . In a preferred form, the promoter region and signal sequence are specific to or suitable for the host yeast cell to be transformed. It is functionally (operably) associated with a foreign cryptographic domain. Promoter region and signal originating from premelibiase specific to S. rugensis Vector constructs assembled from each of the sequences and coding regions can be used to transform a foreign host. Used to convert.

図面の簡単な説明 第１図はプラスミドＰＭＰ５５０のＨｉｎｄｌ［部位から最初のＢａｍＨ■　部 位までの部分のヌクレオチド配列（プロモーターを含むプレメリビアーゼ遺伝子 の５′フランク領域、およびプレメリビアーゼ遺伝子配列を含む）を示しでいる 。プレメリビアーゼのアミノ酸配列は下方に、対応するヌクレオチド配列は上方 に示すと共に、最初のＢａｍＨ工　制限部位までの３′　非翻訳配列に至る配列 を示しである。Brief description of the drawing Figure 1 shows the first BamH part from the Hindl site of plasmid PMP550. The nucleotide sequence of the premelibiase gene including the promoter (including the 5' flank region and premelibiase gene sequence) . The amino acid sequence of premelibiase is at the bottom and the corresponding nucleotide sequence is at the top. and the sequence leading to the 3' untranslated sequence up to the first BamH restriction site. is shown.

第２図は、第１図に示したＤＮＡセグメントの区分を模式的に示した図である。FIG. 2 is a diagram schematically showing the division of the DNA segments shown in FIG. 1.

第２ａ図は、第２図に示した天然のメリビアーゼの分泌シグナルのヌクレオチド 配列を示した図である。Figure 2a shows the nucleotides of the secretion signal of the natural melibiase shown in Figure 2. It is a figure showing an arrangement.

第２ｂ図は、第２ａ図に示した天然のメリビアーゼ分泌シグナル配列が合成リン カ−配列と結合している、修飾されたメリビアーゼ分泌シグナルのヌクレオチド 配列を示す図である。FIG. 2b shows that the natural melibiase secretion signal sequence shown in FIG. A modified melibiase secretion signal nucleotide linked to a car sequence. It is a figure showing an array.

第３図は、プラスミド地図により示した、プラスミドＰ４の組立で模式図である 。Figure 3 is a schematic representation of the assembly of plasmid P4, shown by a plasmid map. .

第４図は、プラスミド地図により示したプラスミドＰ５の組立て模式図である。FIG. 4 is a schematic diagram of the assembly of plasmid P5 shown by a plasmid map.

第４ａ図は、第４図に示したプラスミドＰ５の１つのセグメントのヌクレオチド 配列を示す図である。Figure 4a shows the nucleotides of one segment of plasmid P5 shown in Figure 4. It is a figure showing an array.

第５図は、プラスミド地図により示した、プラスミドＰ６およびプラスミドＰ７ の組立で模式図である。FIG. 5 shows plasmid P6 and plasmid P7 shown by plasmid map. This is a schematic diagram of the assembly.

本発明において好ましいシグナル配列はメリビアーゼの分泌におけるシグナル配 列としで作用し、後述する方法でＳ、カールスベルゲンシスから得られたもので ある。このシグナル配列によってコードされでいる特定のアミノ酸配列は下記の 如（模式的に示される。In the present invention, a preferred signal sequence is a signal sequence for secretion of melibiase. It is obtained from S. Carlsbergensis by the method described below. be. The specific amino acid sequence encoded by this signal sequence is shown below. (Schematically shown.

ｍｅ　ｔ−ｐｈｅ−ａ　ｌ　ａ−ｐｈｅ−ｔ　ｙｒ−ｐｈｅ−１ｅｕ−ｔ　ｈｒ −ａ　１　ａ−ｃ　ｙｓ　−ｉ　ｌ　ｅ−ｓｅｒ−１ｅｕ−１ｙｓ−ｇｌ　ｙ− ｖａｌ−ｐｈｅ−ｇｌｙ同様に、上記のアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配 列は、下記の如く表わされる。me t-phe-a l a-phe-t yr-phe-1eu-t hr -a 1 a-c ys -i l e-ser-1eu-1ys-gl y- Similarly to val-phe-gly, the nucleotide sequence corresponding to the above amino acid sequence The columns are represented as follows.

５’　ＡＴＧ　ｍ　Ｃ；ＣＴ　ＴＴＣＴＡＣｍ　ＣＴＣＡｅＣＧＣＡ　ＴＧＣＡ ＴＣＴｒ ＡＧＴ　ＴＴＣＡＡＧ　ＧＧＣＧＴＴ　α℃３’△ 第１図における参照第号□□□から３′側の最初の６個のヌクレオチドはｐＭＰ ５５０のＨｉｎｄｌ［部位を表わしでいる。参照番号２５はＨｊｎｃｔ［［部位 ３０の下流にある最初のＢａｍＨ工部位である。この５’　Ｈｉ　ｎｄ　ｌ［− Ｂａｍ　Ｈ工３’　領域には、メリビアーゼ遺伝子のプロモーター領域およびシ グナル配列、並びにメリビアーゼ暗号領域が存在している。プレメリビアーゼ暗 号領域列に示されでいる。対応するヌクレオチド配列は、この、特定のアミノ酸 配列を示す列の上方に示されている。第１図においで、３はアデニンヌクレオチ ドを表わし、ｔはチミンヌクレオチドを表わし、ｇはグアニンヌクレオチドを表 わし、Ｃはシトシンヌクレオチドを表わす。各コドンに対応するアミノ酸は、通 常の３文字による省略形を用いて示されている。プレメリビーゼの開始メチオニ ンに相当するａｔｇ　コドンから始であって、ｔｇａ　翻訳終止配列の直前で終 結しでいる。5' ATG m C; CT TTCTACm CTCAeCGCA TGCA TCTr AGT TTCAAG GGCGTT α℃3’△ The first six nucleotides 3' from the reference number □□□ in Figure 1 are pMP. 550 Hindl [sites are shown. Reference number 25 is Hjnct[[site This is the first BamH site downstream of BamH. This 5' Hi nd l[- The Bam H engineering 3' region contains the promoter region of the melibiase gene and the gnal sequence as well as the melibiase coding region. premelibiase dark It is shown in the number area column. The corresponding nucleotide sequence is this specific amino acid It is shown above the column indicating the array. In Figure 1, 3 is the adenine nucleotide. t represents a thymine nucleotide and g represents a guanine nucleotide. , C represents a cytosine nucleotide. The amino acid that corresponds to each codon is They are indicated using the usual three letter abbreviations. Premeribise starting methionine Starts from the atg codon corresponding to the tga translation termination sequence and ends immediately before the tga translation termination sequence. I'm tied up.

この配列は、第１図に示す如く、１．４１３ヌクレオチドから成る。参照番号１ ０より以前でも、また参照番号１２を越えてもアミノ酸の翻訳は起らない。なお 、−木の列はヌクレオチド配列を示す。天然に存在する物質の場合、ａｔｇ　開 始コドン１６の前には、プロモーターＤＮＡ配列（参照番号２０から１０の間の 配列に含まれる）があり、それについては後に参照する。This sequence consists of 1.413 nucleotides as shown in FIG. Reference number 1 Translation of amino acids does not occur before 0 or beyond reference number 12. In addition , - Tree rows indicate nucleotide sequences. For naturally occurring substances, atg open The start codon 16 is preceded by a promoter DNA sequence (between reference numbers 20 and 10). ), which we will refer to later.

プレメリビアーゼについてのヌクレオチド配列内に含まれでいる、分泌されたメ リビアーゼをコードしでいるヌクレオチド配列は、第１図においで、参照番号１ ４の、分泌されたメリビアーゼのＮ末端のバリンに相当するｇｔｇ　から始まり 、１２のセリンに相当するｔｃｔコドンで終っている。この配列の長さは１．３ ５９　ヌクレオチドである。第１図に示した全タンパク質の分子第１図に示され でいる参照番号１０−１４のヌクレオチド配列はプレメリビアーゼのプレ領域、 即ちシグナのプレメリビアーゼの開始メチオニン１６に相当スルａｔｇ　コドン から始まり、分泌されたメリビアーゼの始点に隣接しているグリシン残基１８に 相当する参照ヌクレオチドから成る。The secreted protein contained within the nucleotide sequence for premelibiase. The nucleotide sequence encoding lyvase is shown in Figure 1 with reference number 1. 4, starting from gtg, which corresponds to the N-terminal valine of secreted melibiase. , ending in a tct codon corresponding to serine 12. The length of this array is 1.3 It is 59 nucleotides. The molecules of the total protein shown in Figure 1 are shown in Figure 1. The nucleotide sequence with reference numbers 10-14 is the pre-region of premelibiase, That is, the atg codon corresponds to the starting methionine 16 of Signa's premeribiase. starting at glycine residue 18, which is adjacent to the start of the secreted melibiase. Consists of corresponding reference nucleotides.

このメリビアーゼのシグナル配列は、このＭＥＬ配列と連合した領域によってコ ードされている遺伝子産物の酵母細胞からの分泌を指令することにおいて、予想 外に大きい能力を有しでいることが分った。本発明はなんらかの特定の理論また は操作方法により制限されたり、境界を設けられるべく意図したものではないが 、ＭＥＬ　シグナルは、その影響の下に生産された遺伝子産物を、より優れた分 泌経路に導いたり、あるいは、他の効率の良い操作能力を有しでいると予測され る。This melibiase signal sequence is co-coordinated by a region associated with this MEL sequence. The predicted role in directing secretion from yeast cells of coded gene products It turned out that he had great outside abilities. The present invention is not limited to any particular theory or is not intended to be limited or bounded by its method of operation. , MEL signals can better differentiate the gene products produced under its influence. It is predicted that it will lead to the secretory pathway or have other efficient manipulation capabilities. Ru.

上記のシグナル配列と関連した、あるいは別個の、好ましいプロモーターは、調 節可能な方法で、Ｓ、カールスベルゲンシスに固有のプレメリビアーゼ遺伝子の 転写を促進し得るプロモーターである。プロモーター領域は、本明細書に記載の 方法により、この酵母内で同定された酵母由来のものが好ましいが、この天然に 存在するものと類似のヌクレオチド配列を合成してもよい。Preferred promoters, associated with or separate from the above signal sequences, are of the premelibiase gene unique to S. carlsbergensis in a separable manner. A promoter that can promote transcription. The promoter region is defined herein as Preferably, those derived from yeast identified in this yeast according to the method; Nucleotide sequences similar to those that exist may be synthesized.

ベクター組立で物の１構成々分としで、この特定のプロモーターを選択すること は明らかに有益である。Selecting this particular promoter as a component in vector construction is clearly beneficial.

乙のプレメリビアーゼのプロモーター領域は、ある種のタンパク質（ＧＡＬ４遺 伝子やＧＡＬ８０遺伝子の産物を含む）に応答して転写を調節する。特に、この プロモーター領域を有する宿主内でのＧＡＬ４遺伝子の発現レベルが上ると、こ のプロモーター領域は、該プロモーターがその転写−促進機能を発揮する場合以 上に構造遺伝子の発現レベルを高めることが示されでいる。また、このプロモー ター領域を含む宿主内で正常なＧＡＬ８０産物の生産が破壊されると、このプロ モーター領域に連合している遺伝子の発現が促進され、さらには、ＧＡＬ８Ｑタ ンパク質の存在する場合とは異なり、この様な遺伝子の発現はもはや培地中のガ ラクトースの存在と無関係になることがわかった。The promoter region of premelibiase (B) contains a certain protein (GAL4 gene). GAL80 gene and the product of the GAL80 gene). Especially this When the expression level of the GAL4 gene increases in a host that has a promoter region, this The promoter region of It has been shown to increase the expression level of structural genes. Also, this promotion When normal GAL80 product production is disrupted in the host containing the target region, this protein The expression of genes associated with the motor region is promoted, and the GAL8Q protein is Unlike in the presence of proteins, expression of such genes is no longer possible in the presence of bacteria in the medium. It was found to be independent of the presence of lactose.

このプロモーター配列は第１図の参照番号２０から１０の間に示されている。This promoter sequence is shown in FIG. 1 between reference numbers 20 and 10.

ル配列およびプロモーター領域の完全で完壁な配列についての知見に基づき、こ れらの配列の全部または一部を酵母細胞から同定し、それを単離すること、そし で／またはそれを合成的手法で生産することができる。Based on knowledge of the complete and complete sequence of the promoter and promoter regions, this identifying and isolating all or part of these sequences from yeast cells; and/or it can be produced by synthetic means.

次いで、例えば１発現のみを望む場合には、このプロモーター領域をベクターに 組み込んでポリペプチド暗号領域自体と機能的に結合させるか、あるいは、分泌 のためには、ベクターに組み込んでシグナル配列と結合させ、次いで、このシグ ナル配列を、所望のタンパク質をコードしでいる暗号領域と同じリーディング・ フレーム内で機能的に、該暗号領域と結合させる。Then, for example, if you want only one expression, insert this promoter region into a vector. be incorporated and functionally linked to the polypeptide coding region itself, or secreted. In order to place the null sequence in the same leading sequence as the coding region encoding the desired protein. It is functionally combined with the cryptographic region within the frame.

後者の組立でにおいでは、シグナル配列としで、本明細書で記述したものが特に 好ましい。In the latter assembly, the signal sequences and those described herein are particularly useful. preferable.

本発明方法に使用し得る宿主細胞の例には、Ｓ、カールスベルゲンシス、Ｓ、セ レビシェ、サツカロマイコブシスやリポリテイカ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐ ｓｉｓｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ　）　［カンジダ・リポリテイカ（Ｃａｎｄｉｄａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ　）　またはヤロウイア・リポリテイカ（Ｙａｒｒｏｗｉ ａ　１ｉｐｏｌｙｌｉｃａ　）としても知られでいる〕等が含まれる。Ｓ、カー ルス・ベルゲンシスはＳ、ウバルムとしても知られていることは理解されよう。Examples of host cells that can be used in the method of the invention include S. carlsbergensis, S. Levische, Saccharomycobsis and Lipolyteica sislipolytica) [Candida lipolytica lipolytica) or Yarrowia lipolytica (Yarrowi Also known as a1ipolylica). S, car It will be appreciated that Lus bergensis is also known as S. ubarum.

本発明の組立て物に用いられる遺伝子は、上記の酵母類にとって異種の遺伝子で あり、それには、インターフェロン、インシュリン、ホルモン、成長因子、酵素 等のヒトタンパク質やヒトペプチド、セルラーゼの如き細菌や菌類のタンパク質 、植物タンパク質類、ペプチドフレーバーやペプチドエンハンサ−並びに抗原等 のヒト、動物および細菌の遺伝子等が含まれる。The gene used in the construct of the present invention is a gene that is heterologous to the above yeast species. Yes, these include interferon, insulin, hormones, growth factors, and enzymes. human proteins and peptides such as, bacterial and fungal proteins such as cellulases. , plant proteins, peptide flavors, peptide enhancers, antigens, etc. This includes human, animal, and bacterial genes.

本発明の組立物を導入するのに適した発現ビヒクルまたはプラスミドは、選択さ れた酵母および大腸菌内でそれらを維持し、選択するのに適した遺伝子またはそ の一部；強力な酵母のプロモーターの如く、挿入されたヌクレオチド配列が効率 良く転写されることを確実にするための、挿入された外来配列を発現させるのに 適した酵母の配列；並びに転写の終止を確実にするための、挿入体から下流に位 置する酵母の配列、を含むものである。その様なビヒクルの特定の例は知られで おり、市販品から購入できる〔参照例（６）を参考〕。Expression vehicles or plasmids suitable for introducing the constructs of the invention are suitable genes or genes to maintain and select them in yeast and E. coli. part of; like a strong yeast promoter, the inserted nucleotide sequence to express the inserted foreign sequences to ensure that they are well transcribed. Suitable yeast sequences; as well as locations downstream from the insert to ensure termination of transcription. It contains the sequence of the yeast that is located in the yeast. No specific examples of such vehicles are known. It can be purchased commercially [see Reference Example (6)].

さらに、本明細書に記載のプロモーターおよびシグナル配列以外の、生産物の発 現に適した配列には、転写終止配列、並びに所望の組立で物を機能的な形に形成 するのに必要な修飾物などが含まれる。Additionally, other than the promoters and signal sequences described herein, Currently suitable sequences include transcription termination sequences as well as the desired assembly to form the object into a functional form. This includes the modifications necessary to do so.

らを宿主細胞に導入する方法は既知であり、当該技術分野における通常の技術で ある。Methods of introducing these into host cells are known and can be accomplished using conventional techniques in the art. be.

本発明の実施態様を、以下の実施例により詳しく説明する。Embodiments of the invention are illustrated in more detail by the following examples.

実施例１　メリビアーゼおよびプレメリビアーゼのボスト−バイテンミラーら（ ５）によって報告された様に、酵母ＤＮＡの付加的フラグメントを含んでいるプ ラスミドＹｅｐ２４（７および２６）であるプラスミドｐＭＰ５５０は、それを 形質転換によりメリビアーゼ陰性の酵母に導入すると、それらの酵母にメリビア ーゼ陽性の表現型を付与する。このことは、メリビアーゼー陽性酵母由来の約２ ．９キロ塩基のＥＣりＲ１ｗ　ＢａｍＨｌフラグメントである。ｐＭＰ５５０に 含まれているＤＮＡ挿入体がプレメリビアーゼの構造遺伝子を含有していること を示すものである。ペンシルバニア州立大学のＪ、Ｅ、ホッパー（Ｊ、Ｅ、Ｈｏ ｐｐｅｒ　）氏から入手したプラスミドｐＭＰ５５０を、そのＤＮＡ挿入体の配 列決定のために以下の如くに調製した◎ｐＭＰ５５０２μｇとファージＭ１３ｍ ｐ１８　の複製可能型（ＲＦ）（ノランダーら（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ　ｅｔ　ａ ｌ、　）、８〕の各々をＥｃＯＲｌ　およびＢａｍＨＩにューイングランド壷バ イオラボｘ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　）　）で消化し、１ ％（ｖ／ｖ）の低融点アガロースで電気泳動した。約２．９キロ塩基のｐＭＰ　 ５５０フラグメントと約７．２キロ塩基のＭ１３ｍｐ１８フラグメントを含むゲ ル切片を６５℃に加温してＤＮＡを放出させ、各々の数μｌを混合しｒ７０ｍＭ ）リス、’ＨＣ！バッファー（ＰＩ−１７，５）　、　７ｍＭ　ＭｇＣ／　、７ ０．ＩＪＭ　ＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡ　リガ−ゼ０．９単位を含む２０μｊ中で １２℃において３時間ライゲートさせた。このライゲートしたＤＮＡを用い、バ ナーニア　（Ｈａｎａｈｎ　）の方法（１０）で予めコンピテント化しでおいた 大腸菌ＪＭ１０９株（９）を形質転換した。形質転換により生じた６個のプラー クを選択し、ＤＮＡを単離し、ｐＭＰ　５５０　ＤＮＡフラグメントの存在をチ ェックした。全て、適当な構造を有しでいた。その１つを、以下の如くにしで行 う配列決定のために選択した。選択したファージでトランスフェクトとした大腸 菌ＪＭ１０９からＲＦＤＮＡを調製し、Ｅ、ｏＲＩとｐｓｔＩにューイングラン ド・バイオラボス）により、２０μｇを完全に消化し、エタノール沈殿して０． ６６　ｍＭ　ＭｇＣ１１を含んだ６６ｍＭ）リスＨＣ／　バッファー（ｐＨ８， ０）　に溶かした。ヘニコッ７　（Ｈｅｎ１ｋｏｆｆ　）　（１１）の方法を正 確に踏襲し、ＤＮＡをエキソヌクレアーゼｌ［（ＰＬ−ファルマシア（ＰＬ−ｐ ｈａｒｍａｃｉａ　）　）で消化し、間隔をあけて標本をとり、ヌクレアーゼ５ ｌ（ＢＲＬ）大腸菌り、ＮＡボリメラーゼエ（フレノウフラグメント）［ベーリ ンガー・マンハイＡ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）　）および Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー・マンハイム）で処理し、Ｍ１３ｍＰ１８配 列と隣接しているｐＭＰ５５０挿入体のサイズの減少した、一連の環状ＤＮＡ分 子を生成させた。Example 1 Melibiase and premelibiase Bost-Bitenmiller et al. 5), a protein containing additional fragments of yeast DNA. Plasmid pMP550, the lasmid Yep24 (7 and 26), makes it When introduced into melibiase-negative yeast by transformation, melibiase is introduced into those yeasts. confers a positive phenotype. This means that approximately 2 ．． This is a 9 kilobase EC R1w BamHl fragment. to pMP550 The included DNA insert contains the structural gene for premelibiase. This shows that. J, E, Ho of Pennsylvania State University The plasmid pMP550 obtained from Mr. For sequence determination, ◎pMP5502μg and phage M13m prepared as follows. The replicable form (RF) of p18 (Norander et al. 1), 8] to EcORl and BamHI in a New England jar. Digest with Iolabo x (New England Biolabs)), 1 % (v/v) of low melting point agarose. pMP of approximately 2.9 kilobases 550 fragment and the approximately 7.2 kilobase M13mp18 fragment. Warm the sections to 65°C to release the DNA, mix a few μl of each and add 70mM ) Squirrel, 'HC! Buffer (PI-17,5), 7mM MgC/, 7 0. IJM in 20 μj containing ATP and 0.9 units of T4 DNA ligase Ligation was allowed for 3 hours at 12°C. Using this ligated DNA, a The cells were made competent in advance using Hanahn's method (10). Escherichia coli JM109 strain (9) was transformed. 6 plaques generated by transformation Select a block, isolate the DNA, and check for the presence of the pMP550 DNA fragment. I checked. All had appropriate structure. Run one of them as follows: selected for sequencing. Colon transfected with selected phages RF DNA was prepared from fungus JM109, and E, oRI and pstI were injected with 20 μg was completely digested using BioLabos) and ethanol precipitated to give 0.0 μg. 66mM) squirrel HC/buffer (pH 8, containing 66mM MgC11) 0). Hen1koff (Hen1koff) Correct the method of (11) Following the exact procedure, the DNA was digested with exonuclease l [(PL-Pharmacia (PL-p hermacia)), take specimens at intervals, and incubate with nuclease 5. (BRL) Escherichia coli, NA bolimerase (Flenow fragment) [Berry Boehringer Mannheim A) and Treated with T4 DNA ligase (Boehringer Mannheim), the M13mP18 sequence was A series of circular DNA sections of decreasing size of the pMP550 insert adjacent to the column. generated a child.

大腸ｔｌ　Ｍ　１０９　のトランスフェクションによってライゲートしたＤＮＡ を回収した後、各々に残存しているｐＭＰ５５Ｑ　ＤＮＡの大きさを電気泳動的 に分析し、使用説明書（１３）記載のジデオキシ法（１２）により配列決定した 。得られた配列をラーンンおよびメッシング（Ｌａｒｓｏｎ　およびＭｅｓｓｉ ｎｇ）の示したプログラムαのに従って連結し、さらに、デベルユーら（Ｄｅｖ ｅｒｅｕｘｅｔ　ａｚ、）のプログラム（１５）を用いで解析した。最初にｐＭ Ｐ５５０から得た、Ｅ５：ｐ、Ｒ工〜ＢａｍＨ工の全７ラグメントに含まれる２ ８６４　ヌクレオチドの配列を決定した。第１図に、完全なＥｃｏ、Ｒｉ部位（ ２８）から完全なりａｍＨ１部位（２５）に延びるこの配列を示す。DNA ligated by transfection of large intestine TL M 109 After collecting the pMP55Q DNA, the size of the remaining pMP55Q DNA was determined by electrophoresis. and sequenced by the dideoxy method (12) described in the instructions for use (13). . The resulting sequences were subjected to learning and meshing (Larson and Messi ng), and further concatenated according to the program α shown by Dev. The analysis was performed using the program (15) of ereuxet az, ). First pM 2 contained in all 7 fragments of E5:p, R-K-BamH, obtained from P550. The sequence of 864 nucleotides was determined. Figure 1 shows the complete Eco, Ri sites ( This sequence is shown extending from (28) to the complete amH1 site (25).

また、第１図には、長いオープン・リーディング・フレームの翻訳に基づくプレ メリビアーゼの推定のアミノ酸配列をも示す。ヌクレオチド配列から算出された プレメリビアーゼの分子量は５２．１０１である。分泌されたメリビアーゼの既 知のＮ末端アミノ酸配列（実施例２参照）に基づくと、参照番号１６で示される メチオニンから、参照番号１８で示されるグリシンまでのアミノ酸はメリビアー ゼのシグナルペプチドである。Figure 1 also shows a translation based on a long open reading frame. The deduced amino acid sequence of melibiase is also shown. calculated from the nucleotide sequence The molecular weight of premelibiase is 52.101. secreted melibiase Based on the known N-terminal amino acid sequence (see Example 2), it is designated by reference number 16. Amino acids from methionine to glycine shown with reference number 18 are melivia This is the signal peptide of ZE.

従って、分泌されたメリビアーゼの分子量の計算値は５０．１０４となる。この 値は、プラスミドｐＭＰ５５０で形質転換された酵母の培養上清から精製しく実 施例３）、脱グリコジル化されたメリビアーゼの分子量、即ち、約ｓｏ、ｏｏｏ と合致する。Therefore, the calculated molecular weight of secreted melibiase is 50.104. this The values are obtained by purifying the culture supernatant of yeast transformed with plasmid pMP550. Example 3), molecular weight of deglycosylated melibiase, i.e. approximately so, ooo matches.

Ｓ、カールスベルゲンシスの両側の残余配列を以下の如くに決定した。２μｇの ｐＭｊ５５０と２μｇのＭ１３ｍＰ１Ｂ　とをそれぞれＸｍａ　ｌおよび５ｐｈ ｌＣニユーイングランド・バイオラボス）で消化し、０．８ＸＷ／ｖ　低融点ア ガロース中で電気泳動する。約１．８キロ塩基のｐＭＰ５５０フラグメントと約 ７．２キロ塩基のＭ１’３ｍｐ１８フラグメントを含むゲル切片を融解し、数μ ｌづつを混合し、ライゲートして実質上、上記と同様にしてＪＭ１０９の形質転 換に用いた。所望の挿入体の存在を証明した後、以後の実験のために１つのプラ ークを選択した。The remaining sequences on both sides of S. carlsbergensis were determined as follows. 2μg pMj550 and 2μg of M13mP1B were added to Xma1 and 5ph, respectively. Digested with 1C New England Biolabs), 0.8XW/v low melting point a Electrophorese in garose. The approximately 1.8 kilobase pMP550 fragment and the approximately The gel section containing the 7.2 kilobase M1'3mp18 fragment was melted and a few microbases 1 of each were mixed, ligated, and transformed into JM109 in substantially the same manner as above. It was used as a replacement. After proving the presence of the desired insert, one plas- ty was prepared for further experiments. selected.

実質上、ゾールら（Ｄａｌｅ　ｅｔ　ａｌ、　）（１９８５）　Ｏ方法に従い、 挿入体を通って延びる一連の欠失クローンを作った。簡単に述べると、−重鎖Ｄ ＮＡ５μｇをプライマー（ＲＤ２９）とハイブリダイズした後、５０℃においで 、−夜、Ｂｉｎｄ［で消化した。−重鎖ＤＮＡの３１　末端を、Ｔ４ＤＮＡポリ メラーゼにュー・イングランド・バイオラボス）により様々な程度に欠失させ、 ターミナル・トランスフェラーゼ（Ｉｎ　Ｉ）およびｄＡＴＰ　（シグマ）でテ ール化し、ＲＤ２９　プライマーとアニールし、ライゲートした。ＪＭ１０９　 のトランスフェクションの後、幾つかのファージクローン中に残っているｐＭＰ ５５Ｑ　ＤＮＡのサイズを電気泳動法により分析した後、上記の如く、−重鎖Ｄ ＮＡを調製し、配列決定した。この方法でＰＭＰ５５０の配列の９２９ヌクレオ チドがさらに決定された。従って、この２方法により、完全なＰＭＰ５５０中の Ｓ、力−ルスベルゲンシスー誘導配列が得られた。Substantially following the method of Dale et al. (1985) A series of deletion clones were created extending through the insert. Briefly, - heavy chain D After hybridizing 5 μg of NA with the primer (RD29), the mixture was incubated at 50°C. , - Digested with Bind [at night. - The 31 end of the heavy chain DNA was merase to various extents by New England Biolabs), Terminal transferase (InI) and dATP (Sigma) The mixture was cured, annealed with RD29 primer, and ligated. JM109 pMP remaining in some phage clones after transfection of After analyzing the size of 55Q DNA by electrophoresis, -heavy chain D NA was prepared and sequenced. Using this method, 929 nucleotides of the sequence of PMP550 Chido was further determined. Therefore, by these two methods, the complete PMP550 S, force-Rusbergensis induced sequences were obtained.

２６１　メリビアーゼの精製 ２、　ｉ、　１．　メリビアーゼを分泌する酵母の調製イトウら（Ｉｔｏ　ｅｔ 　ａｌ　）　（１６）　ｆ）記載した方法に従い、形質転換によって、プラスミ ドＰＭＰ５５０を、Ｊ、Ｅ、ホッパー（Ｊ、Ｅ、Ｈｏｐｐｅｒ　）　（ペンシル バニア州立大学）から供給されたメリビアーゼ陰性の酵母株Ｓ。261 Purification of melibiase 2, i, 1. Preparation of yeast that secretes melibiase Ito et al. al) (16) f) Transform the plasmid according to the method described. PMP550, J, E, Hopper (J, E, Hopper) (Pencil Melibiase-negative yeast strain S supplied by Vanier State University).

した細胞を、外因性のウラシルに依存せずに増殖する細胞を選択するための寒天 平板上に広げ、３０’Ｃで２〜３日間インキュベートした。選択培地■と称する この培地の組成は、ｌｌ中に、グルコース２０ｇ、寒天１７ｇ、アミノ酸不含の 酵母窒素塩基６．７ｇ、コハク酸５．８ｇ、りん酸水素二カリウム８．７ｇ％並 びにアデニン、アルギニン、ヒスチジン、インロイシン、ロイシン、メチオニン 、トリプトファンおよびチロシン各０．０２ｇ、リシン０．０３ｇ、フェニルア ラニン０．０５ｇ１スレオニン０．１０　ｇおよびバリン０．１５ｇを含有し、 ｐ　Ｉ−１は４．６〜４．８であった。選択培地１上に現われたコロニーを新ら しい選択培地工に移し、３０’Ｃで増殖させた後、選択培地■（乳酸２０　ｇ／ Ｌ、グリセロール３０ｇ／Ｌ、およびグルコース２０ｇ／Ｌの代りにガラクトー ス２０　ｇ／Ｌを含む選択培地工）を含んだ寒天平板に移した。かくしで、ガラ クトースによりメリビアーゼ合成が誘導された（５）。次いで、このコロニーを 用い、寒天不含の選択培地■からなる液体培地に接種した。３０℃で細″胞増殖 させた後、以下の方法で分泌されたメリビアーゼを分析した。培養物５００μｊ を遠心して細胞をペレット化し、次いで、上清液１０μｌを、１２．５ｍＭＰ− ニトロフェニルα−ローガラクトジッド（ｐ−Ｎｐｃ　：シグマ・ケミカルＣｏ 、　）を含んだｐＨ４バツフアー（３Ｑ　ｍＭクエン酸、３８ｍＭ二塩基性リン 酸ナトリウム）１９０μｌリウム８００μｌを加え、その黄色を４０７　ｎｍに おいで分光光度法により測定した。試験した、ウラシル−非依存型形質転換体の 全てがメリビアーゼを産生じていたが、Ｓ、セレビシェ株２８４自身は分泌され るメリビアーゼを産生じていなかった。ｐＭＰ　５５Ｑ　、　Ｓｃゼの精製のた めに選択した。agar to select cells that proliferate independently of exogenous uracil. It was spread on a plate and incubated at 30'C for 2-3 days. It is called selective medium. The composition of this medium is 20g of glucose, 17g of agar, and no amino acids. Yeast nitrogen base 6.7g, succinic acid 5.8g, dipotassium hydrogen phosphate 8.7g% and adenine, arginine, histidine, inleucine, leucine, methionine , tryptophan and tyrosine each 0.02g, lysine 0.03g, phenyla Contains 0.05 g of ranine, 0.10 g of threonine and 0.15 g of valine, pI-1 was 4.6-4.8. Renew the colonies that appeared on selective medium 1. Transfer to a new selective medium and grow at 30'C, then add selective medium (lactic acid 20 g/ L, glycerol 30g/L, and galactose instead of glucose 20g/L The cells were transferred to an agar plate containing a selective medium containing 20 g/L of water. Hidden, Gala Coutose induced melibiase synthesis (5). Next, this colony It was used to inoculate a liquid medium consisting of selective medium (■) without agar. Cell growth at 30℃ After that, the secreted melibiase was analyzed using the following method. Culture 500 μj The cells were pelleted by centrifugation, and then 10 μl of the supernatant was diluted with 12.5 mM Nitrophenyl α-logalactodide (p-Npc: Sigma Chemical Co , ) containing pH 4 buffer (3Q mM citric acid, 38 mM dibasic phosphorus) Add 190 μl of sodium chloride and 800 μl of sodium to change the yellow color to 407 nm. It was measured by spectrophotometry. The uracil-independent transformants tested All produced melibiase, but S. cerevisiae strain 284 itself did not. No melibiase was produced. pMP 55Q, for purification of Scase I chose it for this purpose.

２、１．２−メリビアーゼの精製 寒天不含の選択培地Ｉｆ　ＩＯＬに酵母形質転換体ｐＭＰ５５０、ＳＣ２８４， １を接種し、６６０　ｎｍにおける最大光学的密度に達するまで、３０℃におい で振数下、インキュベートした。培養物を３，０００Ｘｇで遠心して細胞を除き 、ＰＭ−ＩＱ　メンプランを装備したアミコン（Δｍ１ｃｏｎ）限外沖過ユニッ ト中で上清液を１００−に濃縮した。この濃縮液を４０，０００　Ｘｇで３０分 間遠心し、清溶化した。次いで、この物質を５　Ｑ　ｍＭトリスＨＣ／　バッフ ァー（ｐＩ−１７，５）　（バッファー）２５−中に溶かし、バッファー（３変 更、１変更に２゜５Ｌづつ）に対して透析した。この物質を０．４　ｓ　ミクロ ン膜で沖過し、タンパク質１６．６１９とメリビアーゼ３５３４単位を含む溶液 を得た（１７）。次いで、モノ（Ｍｏｎｏ）Ｑ陰イオン交換カラム（ＨＲ５１５ ）を備えた７　７／Ｌ／７　’ｉ７　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）　ＦＰＬＣシス テム上で他の一部のタンパク質からメリビアーゼ活性を分離した。2,1.2-Melibiase purification Agar-free selective medium If IOL containing yeast transformants pMP550, SC284, 1 and incubated at 30°C until maximum optical density at 660 nm was reached. The cells were incubated under shaking. Centrifuge the culture at 3,000×g to remove cells. , Amicon (Δm1con) limit offshore passage unit equipped with PM-IQ Menplan. The supernatant was concentrated to 100% in a vacuum chamber. This concentrated solution was heated at 40,000×g for 30 minutes. The mixture was centrifuged for a while to clarify the solution. This material was then diluted with 5Q mM Tris HC/buffer. Dissolve in buffer (pI-17,5) (buffer) 25- Furthermore, dialysis was performed against 2.5 L per change). This substance was heated for 0.4 s micro A solution containing 16.619 protein and 3534 melibiase units was obtained (17). Next, a Mono Q anion exchange column (HR515 ) 7/L/7'i7 (Pharmacia) FPLC system The melibiase activity was separated from some other proteins on the system.

カラムに結合したまま止まっているメリビアーゼを、塩化ナトリウムの線状グラ ディエンド（バッファー中１２５〜２４５　ｍＭ　）を適用して溶離した。１ｆ ｎｌフラクシヨンを集め、分析して活性なフラクションをプールした。タンパク ！７．６１■（メリビアーゼ３４３７単位を含有）を回収した。この物質を凍結 乾燥し、バッファー６．８−に溶かし、２部分に分けてバイオゲル（Ｂｉｏｇｅ ｌ　）　Ａ　−’　１．５　Ｍカラム（１，５Ｘ　９０．０Ｑｌ）でクロマトグ ラフした。最も高いメリビアーゼ活性を含むフラクションをプールしたが、これ は、タンパク質３．８■とメリビアーゼ２３０２単位を含んでいた。Melibiase, which remains bound to the column, is removed by a linear gradient of sodium chloride. Diendo (125-245 mM in buffer) was applied to elute. 1f The nl fractions were collected, analyzed and the active fractions were pooled. protein ! 7.61■ (containing 3437 units of melibiase) was recovered. Freeze this substance Dry, dissolve in buffer 6.8-, divide into two parts, and mix with Biogel. l) A-' Chromatograph with 1.5 M column (1,5X 90.0Ql) It was rough. The fractions containing the highest melibiase activity were pooled; contained 3.8 μ protein and 2302 units of melibiase.

ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌ　ｉ　）　（１８）の方法に従い、ＳＤＳアクリルアミ ドゲル中で電気泳動すると、この物質は。SDS acrylamide according to the method of Laemml (18) When electrophoresed in a dog gel, this substance.

タンパク質の９８％を表わす２個のバンドを含有していた。１つのバンドは拡散 し、７５〜１００キロダルトンのサイズ域（中心点は８２キロダルトン）を包含 しでおり、第２のバンドは鋭く、その分子量の計算値は７０キロダルトンであっ た。メリビアーゼポリペプチド鎖の分子量を決定し、また、それが純粋であるか 否かを決定するために、Ｓ、カールスベルゲンシスから分泌されたメリビアーゼ の一部であることが知られでいる共有結合的に結合しでいる炭水化物〔ラゾら（ Ｌａｚｏ　ｅｔ　ａｌ）　ｌ　９　：ラゾら、２０〕を以下の如くにしてエンド −β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼＨ（ｅｎｄｏ　Ｈ（エンドＨ））を用い 、試料から酸素的に除去した。タンパク質４０μｇを、０．０．５　Ｍクエン酸 と０．１Ｍりん酸二水素ナトリウムとを含んだ４０μｌの反応液中、３７℃にお いて２５時間、エンドＨ（べ一リンガー・マンハイム、カナダ）５ミリ単位と一 緒にインキュベートした。次いで、この試料を凍結乾燥し、５ＤＳ−ポリアクリ ルアミドゲル電気泳動で分析した。分子量の計算値５０キロダルトンの、単一の タンパク質バンドが認められた。It contained two bands representing 98% of the protein. one band is diffuse and includes a size range of 75 to 100 kilodaltons (centered at 82 kilodaltons) The second band is sharp, and its calculated molecular weight is 70 kilodaltons. Ta. Determine the molecular weight of the melibiase polypeptide chain and also whether it is pure To determine whether melibiase secreted from S. carlsbergensis Covalently bound carbohydrates that are known to be part of [Lazo et al. Lazo et al) l 9: Lazo et al., 20] and end it as follows: - Using β-N-acetylglucosaminidase H (endo H) , was oxygenally removed from the sample. 40μg of protein, 0.0.5M citric acid and 0.1 M sodium dihydrogen phosphate at 37°C in 40 μl of reaction solution. for 25 hours, Endo H (Behringer Mannheim, Canada) in 5 mm increments and one incubated together. This sample was then lyophilized and 5DS-polyacrylic The results were analyzed using Lumid gel electrophoresis. A single compound with a calculated molecular weight of 50 kilodaltons A protein band was observed.

２．２　アミノ酸配列の決定 炭水化物側鎖の除去を目的とするエントドＩ処理が行われでいない純粋なメリビ アーゼをフェニルチオヒダントインによる誘導体化（デリバティゼーション）に より、最初の１０アミノ酸の配列決定に付した。トロント大学の生化学部（Ｄｅ ｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。2.2 Determination of amino acid sequence Pure melibi without Entodo I treatment to remove carbohydrate side chains. Derivatization of Aase with phenylthiohydantoin Therefore, the first 10 amino acids were sequenced. Department of Biochemistry, University of Toronto part of Biochemistry.

Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｔｏｒｏｎｔｏ　）　のアミノ酸の配列決定装置 により決定された配列は式： ％式％ 最初の２残基が不明瞭である理由は分らない。それにもかかわらず、プラスミド ｐＭＰ５５０　中のＤＮＡ挿入体のヌクレオチド配列（第１図）から予測される 残り８残基の配列の同定により、分泌されたノリ１アーゼのアミノ酸配列は、以 下のＮ末端がら始まるとの結論に達した。University of Toronto) amino acid sequencing device The array determined by the formula: %formula% We do not know why the first two residues are unclear. Nevertheless, the plasmid Predicted from the nucleotide sequence of the DNA insert in pMP550 (Figure 1) By identifying the remaining 8 residues, the amino acid sequence of secreted Nori-1ase was determined as follows. The conclusion was reached that it starts from the lower N-terminus.

ｖａｌ−ｓｅｒ−ｐｒｏ−ｓｅｒ−ｔｙｒ−ａｓｎ−ｇｌｙ−１ｅｕ−ｇｌｙ− １ｅｕ　＋＋＋２．３　メリビアーゼのシグナル配列の構造分泌されたメリビア ーゼのＮ末端のアミノ酸配列およびプレメリビアーゼのヌクレオチド配列から予 測され、るアミノ酸配列に基づき、Ｎ末端から始まるメリビアーゼのシグナル配 列は、式： ％式％ で示されると決定された。val-ser-pro-ser-tyr-asn-gly-1eu-gly- 1eu +++2.3 Structure of melibiase signal sequence Secreted melibiase The prediction was made from the N-terminal amino acid sequence of the enzyme and the nucleotide sequence of the premelibiase. Based on the measured amino acid sequence, the signal sequence of melibiase starting from the N-terminus is determined. Column formula: %formula% It was decided that it would be indicated by

発現カセットの使用 この発現カセットを模式的に第２図に示した。その基本的な要素は、（１）両側 の制限部位（この例ではＢａｍ　ＩＩ　工）であって、適当な大腸菌／Ｓ、セレ ビシェシャトルベクターへの挿入を容易にする部位、（Ｉｔ）メ上流の活性化配 列を含む）およびメリビアーゼシグナルペプチド３６のＤＮＡ配列であって、メ リビアーゼ以外のものの暗号配列（３８に示す様に）を、これらと機能的（操作 可能）に連合させで配することができる形のＤＮＡ配列。本実施例では、このこ とは、メリビアーゼのシグナルペプチドをコードしている配列に隣接して、Ｂｇ ｌ　■部位を作り出すことにより達成された。このことにより、シグナルペプチ ドを特定するコドンと新規なタンパク質を特定するコドンとの間の融合が可能と なる。従って、機能的な連合は、プロモーター：シグナルペプチドのコドン：新 規なタンパク質のコドンからなる。第２図において３４で示したセグメントは、 転写、終止、開裂およびポリアデニル化を特定する様な付加的な配列を含有して いる。この発現カセットは１通常の組換えＤＮＡ技術を用い、以下に記載した様 にしで、第３図に示す如くに組立てられた。Use of expression cassettes This expression cassette is schematically shown in FIG. The basic elements are (1) both sides restriction site (in this example, Bam II engineering) and a suitable E. coli/S, S. A site that facilitates insertion into the Viche Shuttle vector, an activation sequence upstream of (It). ) and the DNA sequence of melibiase signal peptide 36, The coding sequences of substances other than revivase (as shown in 38) can be combined with these in functional (operational) A DNA sequence in a form that can be arranged in association (possible). In this example, this means that Bg is adjacent to the sequence encoding the signal peptide of melibiase. This was achieved by creating a l■ site. This allows the signal peptide to It is possible to create a fusion between a codon that specifies a protein and a codon that specifies a new protein. Become. Therefore, the functional association is promoter: signal peptide codon: new Consists of regular protein codons. The segment indicated by 34 in FIG. Contains additional sequences to specify transcription, termination, cleavage and polyadenylation There is. This expression cassette was prepared using standard recombinant DNA techniques, as described below. It was then assembled as shown in Figure 3.

プラスミドＰＭＰ５５０（第３図）は、メリビアーゼ遺伝子とその両側のＤＮＡ 配列〔ポスト・パイテンミラーら（Ｐｏ５ｔ、Ｂｅｉｔｔｅｎｍｉｌｌｅｒ　ｅ ｔ　ａｌ　）、５およびサムナースミスら（Ｓａｍｎｅｒ　−Ｓｍ１ｔｈ　ｅｔ 　ａｌ　）　、２３　）を含む４．３キロ塩基のＤＮＡフラグメン）　４０を含 むプラスミドＰＢＲ２２（ポリバーら（Ｂｏｌｉｖｅｒ　ｅｔ　ａｌ　）、２２ 〕である。フラグメント４ｏのヌクレオチド配列は第１図に示されており、Ｈｉ ｎｄｌ［［部位３ｏとＲａｍＨ１部位２５を境界としでいる。最初の３４６ヌク レスミドｐ　Ｂ　Ｒ３２２から導かれたことに注目すべきである。これは、クロ ーニング法を用いたことに起因しでおり、４．３キロ塩基のＤＮＡフラグメント から導かれた発現カセットの機能に付随しでいる。プラスミドＰＭＰ５５０をＨ ｉｎｄ−１［およびＢａｍＨＩ　で制限し、４．３キロ塩基のフラグメント４ｏ をプラスミドＰ［Ｊｃ８〔ビエイラ（Ｖｉｅｉｒａ　）およびメッシング（Ｍｅ ｓｓｉｎｇ）　：２４〕のＨｉｎｄｌ［とＢａｍＨ工部位の間にクローンした。Plasmid PMP550 (Figure 3) contains the melibiase gene and the DNA on both sides of it. Sequence [Po5t, Beittenmiller et al. t al), 5 and Sumner-Sm1th et al. 4.3 kilobase DNA fragment containing 40) Plasmid PBR22 (Boliver et al., 22 ]. The nucleotide sequence of fragment 4o is shown in FIG. ndl [[ site 3o and RamH1 site 25 are the boundaries. first 346 nuku It should be noted that Resmid pB was derived from R322. This is This is due to the fact that a DNA fragment of 4.3 kilobases was used. The function of the expression cassette derived from Plasmid PMP550 ind-1 [and BamHI], the 4.3 kilobase fragment 4o was added to plasmid P [Jc8 [Vieira] and Messing (Me ssing):24] between the Hindl[ and BamH sites.

得られたプラスミドＰ１をＨｉｎｄｌ［で制限し、そのＤＮＡ末端を大腸菌ＤＮ Ａポリメラーゼエのフレノウフラグメントを用いてフィリング−インしく埋め） で修復した後、ラテら（Ｌａｔｈｅ　ｅｔ　ａｌ　）の方法に従って式： ５’　ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＣ，３’ ３’　（、ＣＣＣＴＡＧＧＣＣ５’ で示される合成オリゴヌクレオチド４２にライゲートこのライゲーション産物で あるプラスミドＰ２は、Ｂａｍ１目部位で両側を限られているＰＭＰ５５０　由 来の４．３キロ塩基フラグメント４０を含有するｐＵｃ８で構成されでいる。プ ラスミドＰ２を、メリビアーゼのシグナル配列をコードしでいるＤＮ’Ａ配列内 で特異的に切断する５ｐｈｌで制限した。次いで、この線状化プラスミドを、式 ： で示される配列の合成オリゴヌクレオチド４２に、ラテら（２５）の方法によっ てライゲートさせた。挿入したオリゴヌクレオチドの位置を横切って（越えて） 組換えプラスミドの配列決定を行い、第２図に示す方向性でこのオリゴヌクレオ チドを含有しでいるプラスミ　、ドＰ３を選択した。次いで、プラスミドＰ３を ＢａｍＨｌで制限し、４，３ｋｂ　フラグメントをシャトルプラスミドＹｅｐ　 ２４　（２６）のＢａｍＨ１部位ニクローンシテフラスミドＰ　を生成させた。The resulting plasmid P1 was restricted with Hindl, and the DNA end was inserted into E. coli DNA. Filling-in using the Flenow fragment of A polymerase Following the method of Lathe et al., the formula: 5' CCGGATCCGC, 3' 3' (,CCCTAGGCC5' This ligation product is ligated to the synthetic oligonucleotide 42 shown in One plasmid, P2, contains PMP550, which is restricted on both sides at the Bam1 site. pUc8 contains the original 4.3 kilobase fragment 40. P lasmid P2 within the DNA sequence encoding the melibiase signal sequence. It was restricted with 5phl, which specifically cuts with . This linearized plasmid was then transformed into the formula : Synthetic oligonucleotide 42 with the sequence shown was added by the method of Latte et al. (25). I made Reigate. Across (beyond) the position of the inserted oligonucleotide The recombinant plasmid was sequenced and this oligonucleotide was sequenced in the orientation shown in Figure 2. A plasmid containing P3 was selected. Next, plasmid P3 Restrict with BamHl and transform the 4.3 kb fragment into shuttle plasmid Yep 24 (26)'s BamH1 site Niclonite plasmid P was generated.

プラスミドＰ　はｐ　Ｍ　Ｐ２Ｓ５　起源の４．３キロ塩基フラグメントを含有 しているが、この時点で、メリビアーゼのシグナルペプチドをコードしているＩ ）ＮＡ配列は、第２図に示した様に修飾されでいる。Ｐ４（第３図）内の４．３ キロ塩基のＢａｍＨＩフラグメント４０は、本発明の好ましい態様の一例である 発現カセットを構成している。Plasmid P contains a 4.3 kilobase fragment of pM P2S5 origin However, at this point, I, which encodes the melibiase signal peptide, ) The NA sequence has been modified as shown in FIG. 4.3 in P4 (Figure 3) The kilobase BamHI fragment 40 is an example of a preferred embodiment of the invention. It constitutes an expression cassette.

産を操作するための発現カセットの使用ルカナーゼまたは１、エンド−１，４− β−Ｄ−グルカナーゼ、ＥＣ３，２，１，４）　をコードしていることが既知の ＤＮＡ配列を用い、発現カセットのサツカロマイセス・セレビシェ中での利用性 を証明した。第４図に示されでいる様に、このエンドグルカナーゼの暗号領域は 、ブリティッシュ・コロンビア大学のＤｒ、ロバートＣ，ミラー（Ｄｒ、Ｒｏｂ ｅｒｔ　Ｃ，Ｍｉｌｌｅｒ　）供給のプラスミドｐＥ０２．２（第４図、スキッ パ−ら；　２７）由来のＢａｍＨＩフラグメント４６に含まれでいる。この暗号 領域は、３１アミノ酸の細菌性シグナルペプチド（２８）を含む、細菌性タンパ ク質の最初の７６７ミノ末端アミノ酸に関するコドンを失っていることが分つで いる。以前に行われた実験によると、ＰＥＣ２，２由来の２．４キロ塩基のＢ　 ａｍ　Ｉ−Ｉ　Ｉフラグメントを、酵母のアルコールデヒロゲナーゼ１プロモー ターと機能的に連合させて含有しでいるプラスミドで形質転換されたサツカロマ イセス・セレビシェは、極めテ低レベルの細胞外エンドグルカナーゼ活性を産生 じたにすぎないことが示された〔スキッパ−ら（５ｋｉｐｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ　 ）　；２７〕。酵母プレプロトキシンタンパク質のアミノ末端に特異的なコドン を機能的なシグナルペプチドに付加すると細胞外エンドグルカナーゼ活性のレベ ルが著しく高められた（スキッパ−ら：２７）。Use of Expression Cassettes to Manipulate Production of Lucanase or 1, Endo-1,4- Known to encode β-D-glucanase, EC3,2,1,4) Utilization of expression cassettes in S. cerevisiae using DNA sequences proved. As shown in Figure 4, the coding region of this endoglucanase is , Dr. Rob C. Miller, University of British Columbia Plasmid pE02.2 (Figure 4, ski It is included in BamHI fragment 46 derived from Per et al.; 27). This cipher The region contains bacterial proteins, including a 31 amino acid bacterial signal peptide (28). It was found that the codon for the first 767 amino-terminal amino acids of the protein was lost. There is. According to previously conducted experiments, the 2.4 kilobase B derived from PEC2,2 The am I-II fragment was inserted into the yeast alcohol dehydrogenase 1 promoter. Satsuka Roma transformed with a plasmid containing in functional association with the tar Ises cerevisiae produces extremely low levels of extracellular endoglucanase activity. [5kipper et al. ) ;27]. Codon specific for the amino terminus of the yeast preprotoxin protein addition to a functional signal peptide increases the level of extracellular endoglucanase activity. (Skipper et al.: 27).

ｐＥＣ２，２由来の２．４キロ塩基Ｂａｍ　ＨＩ　７５グメントを、プラスミド ｐ４　（第４図）のＢｇｌ　■　部位との粘着末端ライゲーションにより、該プ ラスミドに挿入した。このエンドグルカナーゼ挿入体を含有しでいる組換えプラ スミドをＢｇｌ　ｆｌで制限して挿入体を適切な方向性で含有しているものを同 定し、それらの内、幾つかをメリビアーゼ／エンドグルカナーゼ連結部を越えて 配列決定し、予想される遺伝子融合を含むものを同定した。更に分析するために 、１つのプラスミドＰ５を選択した。それは、適正な翻訳解読枠（リーディング フレーム）内でメリビアーゼのシグナル配列と融合しでいるエンドグルカナーゼ の暗号配列を含有しでいた（第４ａ図参照）。組立て図（第５図）から予想され る様に、メリビアーゼのシグナルペプチドの末端コドン（ＧＧＧグリシン）とエ ンドグルカナーゼの第７７番目のコドン（ＡＴＣ、インロイシン）との間に余分 なコドン（ＡＡＧ、リジン）が存在しでいる。４．３キロ塩基の発現カセットと ２．４キロ塩基のエンドグルカナーゼ暗号配列を含有しているＰ５　の６．７キ ロ塩基の１３ａｍＩ−１１フラグメント４８は、第４ａ図に示す様に、機能的な メリビアーゼ：エンドグルカナーゼ遺伝子融合物を含んでいる。The 2.4 kilobase Bam HI 75 component derived from pEC2.2 was added to the plasmid. By sticky end ligation with the Bgl ■ site of p4 (Figure 4), the protein is inserted into the lasmid. Recombinant plastic containing this endoglucanase insert The same is true for those containing inserts in the appropriate orientation by restricting the sumid with Bgl fl. some of them across the melibiase/endoglucanase junction. were sequenced and those containing the predicted gene fusion were identified. for further analysis , one plasmid P5 was selected. It is the correct translation reading frame (leading Endoglucanase fused with the signal sequence of melibiase in frame) (See Figure 4a). As expected from the assembly drawing (Figure 5) As shown, the terminal codon (GGG glycine) of the signal peptide of melibiase and the There is an extra link between the 77th codon (ATC, inleucine) of ndoglucanase. codons (AAG, lysine) are present. 4.3 kilobase expression cassette and 6.7 kilobases of P5 containing a 2.4 kilobase endoglucanase coding sequence. The 13amI-11 fragment 48 of the lower base has a functional Melibiase: Contains an endoglucanase gene fusion.

プラスミドＰ５はメリビアーゼ：エンドグルカナーゼ遺伝子融合物を含むＹｅｐ ２４である。Ｙｅｐ２４はることができる。メリビアーゼ要素からのエンドグル カナーゼの発現を評価する目的で受容体サツカロマイセス・セレビシェ株の範囲 を拡張するために、Ｐ５由に２個のシャトルベクター、Ｙｅｐ２１およびＹｅｐ 　２４　。Plasmid P5 contains the Yep melibiase:endoglucanase gene fusion. It is 24. Yep24 can be heard. Endoglue from melibiase elements A range of receptor Satucharomyces cerevisiae strains for the purpose of evaluating the expression of canases. To expand P5, two shuttle vectors, Yep21 and Yep 24.

Ｐ６およびＰ７を得た（第５図）。プラスミドＹｅｐミドＹｅｐ　２４　（２６ ）とＹｅｐ　（２６）　から組立てられた。P6 and P7 were obtained (Figure 5). Plasmid Yep Mid Yep 24 (26 ) and Yep (26).

のに有用である。It is useful for

酵母中でのエンドグルカナーゼの発現をテストするためにサツカロマイセス・セ レビシェ株２０Ｂ１２（α、ｔｒｐ　１　ｐｅｐ　４．３　；ジョーンズ（Ｊｏ ｎｅｓ　）　２９　）をプラスミドＰ７でトリプ、トファンー非依存性に形質転 換し、細胞外エンドグルカナーゼ活性を調べた。２種の測定法を用いた：形質転 換≠噂が増殖した寒天平板（基質カルボキシメチルセルロースを含む）の直接染 色による定性分析、および還元糖と等価の、カルボキシメチルセルロース氷解物 量の測定に基づ（定性分析法。平板測定法では、’Ｃト！Ｊブトファン培地（３ ０）　。to test the expression of endoglucanase in yeast. Rebiche strain 20B12 (α, trp 1 pep 4.3; Jones (Jo nes) 29) was transformed with plasmid P7 in a tryp- and tophane-independent manner. The extracellular endoglucanase activity was examined. Two assay methods were used: transformation Direct staining of agar plates (containing the substrate carboxymethylcellulose), which has been rumored Qualitative analysis by color and equivalent to reducing sugars, carboxymethyl cellulose ice melt Based on the determination of the amount (qualitative analysis method). 0).

１、２％寒天、０．９％カルボキシメチルセルロース（高粘度、シグマ・ケミカ ルＣｏ、）、’２％グルコース、および５９ｍＭりん酸ナトリウムバッファーを 含む、最終ｐＨ６，８〜７．０の寒天平板上、３０℃で形質転換体を増殖させた 。酵母コロニーを水で洗い流し、次いで、平板ヲコンゴ、　レツＦ　（Ｃｏｎｇ ｏ　Ｒｅｄ　）　（２”９／ｍＯにより数分間染色した後、１Ｍ塩化ナトリウム ですすいだ。1, 2% agar, 0.9% carboxymethyl cellulose (high viscosity, Sigma Chemica Le Co,), 2% glucose, and 59mM sodium phosphate buffer. Transformants were grown at 30°C on agar plates with a final pH of 6.8-7.0. . Rinse the yeast colony with water, then wash it on a flat plate, Cong o Red) (After staining with 2"9/mO for several minutes, 1M sodium chloride I rinsed it off.

これらの条件下、７またはそれ以下のグルコース残基から成るβ−１，４グルカ ン類がコンゴ・レッドと結合しない〔ウッド（Ｗｏｏｄ）　、３１　）ことから 、エンドグルカナーゼ活性は着色しでいない領域で示される。Under these conditions, β-1,4 glucans consisting of 7 or fewer glucose residues This is because Congo Red does not combine with Congo Red (Wood, 31). , endoglucanase activity is indicated by uncolored areas.

この測定において、全ての形質転換体が細胞外エンドグルカナーゼを生産してい た。定量分析法では、形質転換体を２％グルコースと５ＱｍＭりん酸ナトリウム （ｐＨ６，８〜７．０）を含んだ８トリプトフアン培地中で増殖させた。この培 養物を遠心して細胞を除き、上清液を水に対して透析し、透析液を凍結乾燥した 。水中で再構成した後、試料を、ミラーら（Ｍｉｌｌｅｒ　ｅｔａｌ　）　（３ ２）の方法に従い、スキッパ−ら（２７）の記載の如くにしてカルボキシメチル セルロース（低粘性、シグマ・ケミカルＣ００）からの還元糖等傷物の生産に関 して測定した。この測定によると、全ての形質転換体が細胞外エンドグルカナー ゼを産生じでいた。通常の形質転換体は培養物１−当り６．４単位のエンドグル グルカナーゼを産生じた（１単位は、３７℃においで、１分間に１μモルの還元 糖を産生ずる）。In this assay, all transformants produced extracellular endoglucanases. Ta. For quantitative analysis, transformants were grown in 2% glucose and 5QmM sodium phosphate. (pH 6.8-7.0). This culture The cells were removed by centrifugation, the supernatant was dialyzed against water, and the dialysate was lyophilized. . After reconstitution in water, the sample was prepared as described by Miller et al. 2) and carboxymethyl as described by Skipper et al. (27). Regarding the production of reducing sugars and other damaged substances from cellulose (low viscosity, Sigma Chemical C00) It was measured by According to this measurement, all transformants contained extracellular endoglucana. It was producing ze. A typical transformant contains 6.4 units of endoglucan per culture. Glucanase was produced (1 unit is 1 μmol reduced per minute at 37°C). produce sugar).

ＣＡＬ７　およびＧＡＬＩＱと共通しで、ＭＥＬ　−１（メリビアーゼ）遺伝子 の発現はガラクトースにより誘導され、グルコースにより抑制される。この炭素 源による作用は、ガラクトースの不存在下でＤＮＡの作用部位生産物の結合は阻 害され、全ての遺伝子が発現する。In common with CAL7 and GALIQ, the MEL-1 (melibiase) gene expression is induced by galactose and repressed by glucose. this carbon In the absence of galactose, binding of the DNA action site product is inhibited. damaged and all genes are expressed.

ＣＡＬ４　生産物の結合部位は各標的遺伝子の５′−フランキング領域内であり 、それはＵＡＳまたは上流活性化配列と呼ばれている〔サムナーースミスら（Ｓ ｕｒｎｎｅｒ＋　Ｓｍ１ｔｈ　ｅｔ　ａｌ　；　２３の簡単な総説参照〕。従っ て、ＣＡＬ　４およびＧＡＬ１３Ｑ　遺伝子を操作することによす、メリビアー ゼプロモーター依存性のタンパク質発現（本明細書では、例として細胞外エンド グルカナーゼを用いている）の調節を改良できることが予測される。The binding site of the CAL4 product is within the 5'-flanking region of each target gene. , it is called UAS or upstream activation sequence [Sumner-Smith et al. urnner+　Sm1th　et al　;　see brief review in 23]. follow By manipulating the CAL4 and GAL13Q genes, promoter-dependent protein expression (herein used as an example It is anticipated that the regulation of the use of glucanases (using glucanases) could be improved.

３種のサツカロマイセス・セレビシェの菌株、５ｃ２８４、Ｓｃ　２９５および Ｓｃ　３００　（表１）を、機能的なメリビアーゼを含むプラスミドからのエン ドグルカナーゼの発現に対するＣＡＬ４およびＧＡＬ８０修飾の影響を調べるの に用いた。これらの菌株はペンシルバニア州立大学のＤｒ、Ｊ、Ｅ、ホッパーか ら入手した。Three Saccharomyces cerevisiae strains, 5c284, Sc295 and Sc300 (Table 1) was extracted from a plasmid containing functional melibiase. To examine the effects of CAL4 and GAL80 modification on doglucanase expression. It was used for. These strains were developed by Dr. J. E. Hopper of Pennsylvania State University. Obtained from.

でいるので、メリビアーゼプロモーターを完全に発現させるのにガラクトースを 必要としない。５Ｃ３００菌株（ｌｃｕ　２−３　、ｌｅｕ　２−１１２１１ａ ｄｅ　ｌ、ｇａｌ　１８０１：ｃＡＬ４）はＣＡＬ３Ｑ　を欠いており、加えで 、メリビアーゼプロモーターに対するＧＡＬ４タンパク質の活性を増加する意図 から、２種の修飾が施されて遺伝子群が欠失されでいる。第２に、酵母のアルコ ールデヒロゲナーゼｌ遺伝子の強力なプロモーターからきであり、このことは、 正常な一本鎖の染色体性ＧＡＬタンパク質の合成を増大すると予測される。メリ ビアーゼプロモーター機能に関する菌株５ｃ３００の表現型生産物の増大された 能力に起因する、高められた最大機能、の両者を有することが理に適って予測さ れる。Therefore, galactose is required to fully express the melibiase promoter. do not need. 5C300 strain (lcu 2-3, leu 2-11211a del, gal 1801: cAL4) lacks CAL3Q, and in addition , intended to increase the activity of GAL4 protein on the melibiase promoter Since then, two types of modifications have been made and gene groups have been deleted. Second, yeast alco This is due to the strong promoter of the alcohol dehydrogenase l gene; It is predicted to increase the synthesis of normal single chain chromosomal GAL protein. Meri Increased phenotypic production of strain 5c300 regarding biase promoter function It is reasonably expected to have both increased maximal function due to It will be done.

３種の酵母菌株各々を、形質転換体の選択に適した、大腸菌／　Ｓ−セレビシェ シャトルベクター中に含まれ　。Each of the three yeast strains was incubated with Escherichia coli/S-cerevisiae suitable for selection of transformants. Included in the shuttle vector.

でいる機能的（操作可能）な発現カセット／エンドグルカナーゼ融合物で形質転 換した（表１）。次いで、形質転換体を、正常なＧＡＬ１４、ＧＡＬ　８Ｑ菌株 内でメリビアーゼプロモーターに対しで非−誘導的、誘導的または抑制的のいず れかの炭素供給源を含んだ液体培質中で増殖させた後、細胞外エンドグルカナー ゼ活性を測定した。結果を表１に示すと共に、以下で論する。Transformation with a functional (operable) expression cassette/endoglucanase fusion in (Table 1). Next, the transformants were transformed into normal GAL14 and GAL8Q strains. within the melibiase promoter, whether non-inducible, inducible or repressive. After growth in liquid medium containing either carbon source, extracellular endoglucan activity was measured. The results are shown in Table 1 and discussed below.

この形質転換体によって産生された細胞外エンドグルカナーゼの絶対量は低く、 種々の組合わせによる炭素源の調節効果を何らかの正確さで評価することが困難 であった。しかしながら、炭素供給源に対するエン答ニガラクトースによる誘導 、グルコースによる抑制、と一致しでいた。The absolute amount of extracellular endoglucanase produced by this transformant is low; It is difficult to evaluate with any degree of accuracy the effect of adjusting carbon sources in various combinations. Met. However, the induction by nigalactose in response to the carbon source , consistent with inhibition by glucose.

ガラクトースの不在下でエンドグルカナーゼ発現は致しでおり、また、２％グル コースによって著しく減少され、これは、正常なグルコース抑制と一致していた 。ガラクトースの存在下、実際に部分的なエンドグルカナーゼ合成が抑制される という効果も細胞外メリビアーゼを発現するＧＡＬ８ｏ　欠失株にみられた（未 発表の観察結果）。Endoglucanase expression was still observed in the absence of galactose, and 2% glucose was significantly reduced by the course, which was consistent with normal glucose suppression. . In the presence of galactose, endoglucanase synthesis is actually partially inhibited. This effect was also observed in the GAL8o deletion strain that expresses extracellular melibiase (not yet Observations of the presentation).

この菌株でのエンドグルカナーゼ発現は、全酵母受容体中で観察されたものの内 、最高であった。意外にも、エンドグルカナーゼの発現を最大にするのにガラク トースを必要とし、また、この合成におけるリプレッサーとしてのグルコースの 効果は部分的なものであ生産物の利用性の増大に起因すると思われる。Endoglucanase expression in this strain is among those observed in all yeast receptors. , it was the best. Surprisingly, galacinyl chloride helps maximize endoglucanase expression. requires tosose and also uses glucose as a repressor in this synthesis. The effect is likely to be partial and due to increased availability of the product.

これらの実験は、メリビアーゼプロモーターの機能に影響を及ぼすことが既知で ある遺伝子を操作することによって細胞外エンドグルカナーゼの発現が左右され ることを明らかに示しでおり、この様に、ｓ、セレビシェ内で、この、あるいは 他の新規なタンパク質を産生させる場合における発現カセットの利用性を証明す る証拠をさら罠提示するものである。These experiments are known to affect the function of the melibiase promoter. The expression of extracellular endoglucanases can be influenced by manipulating a certain gene. In this way, in s, cereviche, this or Demonstrate the utility of the expression cassette in producing other novel proteins. It provides further evidence of this.

以下のプラスミドをこの出願日以前、即ち、１９８５年１２月１６日に、ＡＴＣ Ｃに寄託した。これらは下記の略号で表わされでおり、以下に示す寄託番号を与 えられた。これらは全て、適当な大腸菌宿主に含有されている。ATC Deposited in C. These are represented by the following abbreviations and given the deposit numbers shown below. I got it. All of these are contained in a suitable E. coli host.

Ｐ’　ＮＡＳ−１５３３６０ ｐ５　ＮＡＳ−２５３３６１ ｐ　ａ　ＮＡＳ−３５３３６２ ｐ７　ＮＡＳ−４５３３６３ これらの組立で物を含む培養物も、現在、アレリツクス、（Ａｌ　ｌｅｌ　ｉｘ 　）　Ｉｎｃ、　５８５　Ｑ　ボアウェイ・ドライブ（Ｇｏｒｅｗａｙ　Ｄｒｉ ｖｅ　）、ミツシンーガ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ　）、オンタリオ、カナダの 研究室に、永久に生存し得る状態に維持されでおり、ここに示した略号によって 同定される。P' NAS-153360 p5 NAS-253361 pa NAS-353362 p7 NAS-453363 Cultures containing these assemblies are also currently available in allelics, (Alyleix) ) Inc, 585 Q Boreway Drive ve), Mississauga, Ontario, Canada It is maintained in a permanently viable state in the laboratory and is designated by the abbreviation shown here. Identified.

・・　Ｉ　ｊｌ！）Ｊ ＋　ｎ　’６　”！　偲　ｅ　ユ Ｋ　全　−Ｌ６＋−＋　。厳　−ｐ　４１　＼　着　Ｓ４！　陣　る　足 ｎ　凌　−（′１　ｅ　と　べ　ｐ 六へ　Ｆ５と碗合１ト ＼＋　−−ｖ−’−ｘ口の 凍−−一ロ、−，１゜ を八　ａｍＡｍ＋８（’ 貴　＆　１）　玉 明細書中に記載された参照例の表 １）ヒララマン、ラング、ベリー、コール、レビン、ゲラデル（’Ｈｉｔｚｅｍ ａｎ、　ＲｌＡ、、　Ｌｅｕｎｇ、　Ｊ、Ｗ、、　Ｐｅｒｒｙ。... I jl! )J ＋n’6”! K total -L6+-+. Gen -p 41 ＼ Arrival S4! Encampment of feet n Ling - ('1 e and be p To 6th F5 and 1 bowl \+　--v-'-xmouth Frozen - Ichiro, -, 1゜ 8 amAm+8(' Takashi & 1) Ball Table of reference examples included in the specification 1) Hilaraman, Lang, Berry, Cole, Levin, Geladel ('Hitzem) an, RlA, Leung, J, W, Perry.

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Ｒ，Ｃ，、Ｗａｒｒｅｎ、　Ａ、、　Ｗｏｎｇ、　Ｒ，）　（１９８５）ｏ’サ イエンス（５ｃｉｅｎｃｅ　）　２３０　、９５８−９６０゜２８）　ミ５−お よびウオ７　（ＲｌＣ，Ｍｉｌｌｅｒ　ａｎｄ　ＲｏＷｏｎｇ　）　。R, C, Warren, A, Wong, R,) (1985) 5science) 230, 958-960゜28) Mi5-o and RoWong (RlC, Miller and RoWong).

ブリティッシュ・コロンビア大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆＢｒｉｔｉｓｈ 　Ｃｏｌｕｍｂｉａ　）からの私信。University of British Columbia Personal letter from Columbia).

２９）ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ、　Ｅ、）　（１９７８）。シエネティツクス（ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　）　８５　、２３−３３゜３０）″Ｃトリプトファン培地は 、ｌｌ中に、酵母窒素塩基６．７ｇ；アデニン、アルギニン、インロイシン、チ ロシン、ウラシルおよびロイシン各０．０２ｇ；リジン０．０３ｙ；フェニルア ラニンｏ、ｏｓｙ；スレオニン０．１０　ｆ　：　バリア　０．１５　ｙ　；　 Ｎａ２ＨＰＯ４３、０９；　ＫＨ２ＰＯ４３，Ｏｆ　；　ＫＨ２ＰＯ４１，５Ｆ を含む。29) Jones, E. (1978). Syenetics ( Genetics) 85, 23-33゜30)''C tryptophan medium is , 6.7 g of yeast nitrogen base; adenine, arginine, inleucine, Rosine, uracil and leucine each 0.02g; lysine 0.03y; phenyla Lanin o, osy; Threonine 0.10 f: Barrier 0.15 y; Na2HPO43,09; KH2PO43,Of; KH2PO41,5F including.

３１）ウッド（Ｗｏｏｄ、　Ｐ、Ｊ、　）　（１９８０）炭水化物リサーチ（Ｃ ａｒｂｏｂｙｄｒａｔｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　）　８５　、２７１−２８７゜３ ２）　ミ５、プラム、ブレノン、バート７　（Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｇ、Ｌ、。31) Wood (1980) Carbohydrate Research (C arbobydrate Re5search) 85, 271-287゜3 2) Mi5, Plumb, Brennon, Bart 7 (Miller, G, L,.

Ｂｌｕｍ、Ｒ，、Ｇｌｅｎｎｏｎ、Ｗ、Ｅ、、Ｂｕｔｔｏｎ、Ａ、Ｌ、　）　（ １９５Ｑ）アナリテイカル・バイオケミストリイ（Ａｎａｌ。Blum, R., Glennon, W. E., Button, A. L.) ( 195Q) Analytical Biochemistry (Anal.

Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　２．１２７−１３２゜３３）”ウラシル培地はｌｌ中に、 酵母窒素塩基６．７ｇ、アデニン、アルギニン、インロイシン、チロシン、トリ プトファン、およびロイシン各０．０２ｒ；リジンＯ，ｏ：ｌｌｐ；フェニルア ラニン０．０５ｇ；スレオニン０．１０９：バリ７０．１５　ｙ　；　Ｎａ２Ｈ ＰＯ４３、□　ｙ　；　ＫＨ２ＰＯ４１，５Ｖを含む。Biochem, ) 2.127-132゜33)" Uracil medium in 1 l, Yeast nitrogen base 6.7g, adenine, arginine, inleucine, tyrosine, tri Ptophan, and 0.02r each of leucine; lysine O, o:llp; phenyla Ranine 0.05g; Threonine 0.109: Bali 70.15y; Na2H PO43, □y; Contains KH2PO41,5V.

３４）舛ロイシン培地はｌｌ中に、酵母窒素塩基６．７１！；アデニン、アルギ ニン、イソロイシン、チロシン、トリプトファン、およびウラシル各０．０２ｇ ！；リシン０．０３Ｐ；フェニルアラニン０．０５Ｐ；スレオニン０．１０ｒ； バリン０．１５　ｙ　；　Ｎａ２ＨＰ０４ａ。Ｏｆ　；　ＫＨ２ＰＯ４１，５９ を含む。34) Leucine medium contains 6.71 yeast nitrogen bases per liter! ;adenine, algi 0.02g each of nin, isoleucine, tyrosine, tryptophan, and uracil ! ; lysine 0.03P; phenylalanine 0.05P; threonine 0.10r; Valine 0.15y; Na2HP04a. Of　;　KH2PO41,59 including.

８９１　Ｉ＋ −１ｉｎｄｌ１１ 国際調査報告 ０発　明　者　サムナー−スミス、マーチン　カナダ国ｓワイドへつ ０発　明　者　ボザット、リチャード・ポール　カナダ国；ン、シャト ０発　明　者　ディビス、ロジャー・ウニイン　カナダ国ニス、アーノ１ エル・０・ピートエイ・０　オンタリオ、ポルトン、ホット・クレセント３３旙 エム・９・ビー５・ケイ・９　オンタリオ、アイスリントドウプルツク・ドライ ブ３旙 エル・Ｏ・ピートエイチ・Ｏオンタリオ、ライムバウル・アール　ナンバー１番891 I+ -1indl11 international search report 0 shots clear Sumner-Smith, Martin Canada's wide bottom 0 shots by Bozat, Richard Paul, Canada; N, Chat 0 shots: Davis, Roger Uniin, Canada, Nis, Arno 1 L.0.Pete.0 33rd Hot Crescent, Porton, Ontario M.9.B.5.K.9 Ontario, Eislind Doprtsk Dry 3am L. O. Pete H. O. Ontario, Limebaur R. No. 1

Claims (50)

【特許請求の範囲】[Claims] １．ＤＮＡ組立て物であって、それによって形質転換された酵母内で発現可能で あり、 メリビアーゼ遺伝子のプロモーター領域、およびそれと機能的に迎合しているポ リペプチドの暗号領域 を含んでいる組立て物。1. a DNA construct expressible in transformed yeast can be, The promoter region of the melibiase gene and the points that are functionally compatible with it. Cryptographic region of lipeptides An assembly containing. ２．ポリペプチドの暗号領域がメリビアーゼ以外のものをコードしている第１項 記載の組立て物。2. The first term in which the coding region of the polypeptide encodes something other than melibiase Assembly as described. ３．ポリペプチドの暗号領域がセルロモナス．フイミのエンドグルカナーゼ遺伝 子から導かれたものである第２項記載の組立て物。3. The coding region of the polypeptide is Cellulomonas. Fuimi's endoglucanase genetics The assembly according to paragraph 2, which is derived from a child. ４．暗号領域に転写終止領域が後続しており、これらが機能的に連合している第 ２項記載の組立て物。4. The coding region is followed by a transcription termination region, and these regions are functionally associated. The assembly described in Section 2. ５．プロモーター領域がＳ．カールベルゲンシスから導かれたものである第２項 記載の組立て物。5. The promoter region is S. The second term is derived from Carl Bergensis. Assembly as described. ６．プロモーター領域のＤＮＡ配列が実質上、添付図面の第１図に示されている ものである第２項記載の組立て物。6. The DNA sequence of the promoter region is substantially as shown in Figure 1 of the accompanying drawings. The assembly according to paragraph 2, which is a product. ７．酵母細胞の発現特性を改変する方法であって、ポリペプチドの暗号領域と機 能的に結合しているメリビアーゼ遺伝子のプロモーター領域を含むＤＮＡセグメ ントを該酵母細胞に導入することからなる方法。7. A method for modifying the expression characteristics of yeast cells, the method comprising: A DNA segment containing the promoter region of the melibiase gene that is operably linked to the melibiase gene. A method comprising introducing an agent into said yeast cells. ８．ＤＮＡセグメントのポリペプチド暗号領域がメリビァーゼ以外のものをコー ドしている第７項記載の方法。8. The polypeptide coding region of the DNA segment encodes something other than melibiase. The method described in paragraph 7. ９．酵母細胞がＳ．セレビシエおよびＳ．カールスペルゲンシスから選択された ものである第８項記載の方法。9. Yeast cells are S. cerevisiae and S. cerevisiae. selected from Carlspergensis 9. The method according to item 8. １０．プロモーター領域が。実質上、添付図面の第１図に示されているヌクレオ チド配列を有する第８項記載の方法。10. promoter region. Nucleo substantially as shown in Figure 1 of the accompanying drawings. 9. The method according to item 8, having a tide sequence. １１．ポリペプチドの暗号領域がセルロモナス・フイミのエンドグルカナーゼ遺 伝子から導かれたものである第９項記載の方法。11. The coding region of the polypeptide is the endoglucanase residue of Cellulomonas fuimi. The method according to item 9, which is derived from a gene. １２．メリビアーゼ以外のポリペプチドをコードしている暗号領域と機能的に連 合しており、この暗号領域の転写をコントロールする作用を有するメリビアーゼ 遺伝子のプロモーター領域を含有している酵母細胞。12. Functionally linked to coding regions encoding polypeptides other than melibiase melibiase, which has the effect of controlling the transcription of this coding region. A yeast cell containing the promoter region of a gene. １３．サッカロマィセス・セレビシエおよびサツカロマイセス′カールスペルゲ ンシス種から選択される第１２項記載の酵母細胞。13. Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces 'Karlsperge' 13. The yeast cell according to clause 12, which is selected from P. chinensis sp. １４．ポリペプチドの暗号領域がセルロモナス・フイミのエンドグルカナーゼ遺 伝子から導かれたものである第１２項記載の酵母細胞。14. The coding region of the polypeptide is the endoglucanase residue of Cellulomonas fuimi. 13. The yeast cell according to item 12, which is derived from a gene. １５．酵母細胞内で機能的なプロモーター領域、酵母細胞内で機能的なシグナル ペプチドをコードしているシグナル配列であって、プロモーター領域と機能的に 連合している配列、および 該シグナル配列と機能的に結合しているポリペプチドの暗号領域を含むＤＮＡ組 立て物であって、該シグナル配列および該プロモーター領域の少なくとも一方は メリビァーゼ遺伝子セグメントである組立て物。15. Functional promoter region in yeast cells, functional signals in yeast cells A signal sequence that encodes a peptide and is functionally connected to the promoter region. a federated array, and A DNA set comprising a coding region of a polypeptide operably linked to the signal sequence. at least one of the signal sequence and the promoter region Construct that is a melibiase gene segment. １６．該シグナル配列がメリビアーゼのシグナル配列である第１５項記載の組立 て物。16. The assembly according to paragraph 15, wherein the signal sequence is a melibiase signal sequence. Things. １７．シグナル配列が、実質上、式： （Ｎ末端）【配列があります】 で示されるアミノ酸配列を有する第１６項記載の組立て物。17. The signal sequence is effectively the formula: (N-terminus) [Sequence available] 17. The construct according to claim 16, having the amino acid sequence shown in １８．シグナル配列が実質上、式： （５′）【配列があります】 （３′） で示されるヌクレオチド配列を有する第１６項記載の組立て物。18. The signal sequence is effectively the formula: (5') [There is an array] (3') 17. The construct according to claim 16, having a nucleotide sequence of: １９．シグナル配列がＳ．カールスベルゲンシスから導かれたものである第１６ 項記載の組立て物。19. The signal sequence is S. No. 16 derived from Carlsbergensis Assemblies described in section. ２０．プロモーター領域がメリビアーゼのプロモーター領域である第１５項記載 の組立て物。20. Item 15, wherein the promoter region is a promoter region of melibiase. assembly. ２１．プロモーター領域が、実質上、添付図面の第１図に示されているヌクレオ チド配列を有する第２０項記載の組立て物。21. The promoter region comprises a nucleonucleotide substantially as shown in Figure 1 of the accompanying drawings. 21. The assembly according to claim 20, having a tide sequence. ２２．プロモーター領域がメリビアーゼのプロモーター領域である第１６項記載 の組立て物。22. Item 16, wherein the promoter region is a promoter region of melibiase. assembly. ２３．ポリペプチドの暗号領域がメリビアーゼ以外のポリペプチドをコードして いる第２２項記載の組立て物。23. The coding region of the polypeptide encodes a polypeptide other than melibiase. 23. The assembly according to paragraph 22. ２４．ポリペプチドの暗号領域がセルロモナス・フイミから導かれたものである 第２３項記載の組立て物。24. The coding region of the polypeptide was derived from Cellulomonas fuimi Assembly according to paragraph 23. ２５．プロモーター領域がメリビアーゼのプロモーター領域であり、実質上、添 付図面の第１図に記載のヌクレオチド配列を有するものである第１６項記載の組 立て物。25. The promoter region is the promoter region of melibiase, and is essentially the promoter region of melibiase. The set according to item 16, which has the nucleotide sequence shown in Figure 1 of the accompanying drawings. A structure. ２６．ポリペプチドの暗号領域に転写終止領域が後続しており、これらが機能的 に連合している第１５項記載の組立て物。26. The coding region of the polypeptide is followed by a transcription termination region, and these are functional An assembly according to paragraph 15 associated with. ２７．第１５〜第２６項のいずれかに記載の組立て物を該酵母細胞に導入するこ とからなる酵母細胞の発現特性および分泌特性を改変する方法であって、該プロ モーター領域と該シグナル配列が共にメリビアーゼ遺伝子のセグメントである場 合には、ポリペプチドの暗号領域がメリビァーゼ以外のものをコードしているか 、あるいは、該組立て物が酵母細胞にとって外来性のものであることを特徴とす る方法。27. introducing the construct according to any one of paragraphs 15 to 26 into the yeast cell; A method for modifying the expression and secretion properties of a yeast cell, comprising: If the motor region and the signal sequence are both segments of the melibiase gene, If so, do the coding regions of the polypeptide encode something other than melibiase? , or characterized in that the construct is foreign to the yeast cell. How to do it. ２８．酵母細胞がサッカロマィセス・セレビシエ種である第２７項記載の方法。28. 28. The method of paragraph 27, wherein the yeast cell is Saccharomyces cerevisiae. ２９．酵母細胞がサツカロマイセス・カールスベルゲンシス種である第２７項記 載の方法。29. Item 27, wherein the yeast cell is Satucharomyces Carlsbergensis sp. How to put it on. ３０．メリビアーゼ以外のものをコードしているポリペプチド暗号領域と機能的 に結合しているメリビアーゼのシグナル配列を含有している酵母細胞。30. Polypeptide coding region and functional coding for something other than melibiase A yeast cell containing a melibiase signal sequence bound to a yeast cell. ３１．プロモーター領域がメリビァーゼのプロモーター領域である第３０項記載 の酵母細胞。31. Item 30, wherein the promoter region is the promoter region of melibiase. yeast cells. ３２．ポリペプチドの暗号領域がセルロモナス・フイミから導かれたものである 第３１項記載の酵母細胞。32. The coding region of the polypeptide was derived from Cellulomonas fuimi Yeast cell according to paragraph 31. ３３．Ｓ．カールスベルゲンシス種のものである第３０項記載の酵母細胞。33. S. 31. The yeast cell according to paragraph 30, which is of the species Carlsbergensis. ３４．Ｓ．セレビシェ種のものである第３０項記載の酵母細胞。34. S. 31. A yeast cell according to paragraph 30, which is of the species S. cerevisiae. ３５．酵母細胞内で機能的なプロモーター領域、酵母細胞内で機能的であり、プ ロモーター領域と機能的に連合しているシグナルペプチドをコードしているシグ ナル配列、および ポリペプチドをコードしており、該シグナル配列と機能的に結合しているポリペ プチド暗号領域を含有するＤＮＡ組立て物により形質転換された酵母細胞を増殖 促進培地中で増殖させることからなる酵母細胞からポリペプチドを分泌させる方 法であって、該シグナル配列および該プロモーター領域の内、少くとも一方はメ リビアーゼ遺伝子のセグメントであることを特徴とする方法。35. A promoter region that is functional in yeast cells, a promoter region that is functional in yeast cells, Sig encodes a signal peptide that is functionally associated with the promoter region. null array, and A polypeptide encoding a polypeptide and operably linked to the signal sequence. Propagating Yeast Cells Transformed with DNA Constructs Containing the Petide Coding Region A method for secreting polypeptides from yeast cells, which consists of growing them in a promoting medium. at least one of the signal sequence and the promoter region is A method characterized in that it is a segment of a lyase gene. ３６．ポリペプチドの暗号領域がメリビアーゼ以外のものをコードしている第３ ５項記載の方法。36. The third polypeptide whose coding region encodes something other than melibiase The method described in Section 5. ３７．該プロモーター領域がメリビアーゼのプロモーター領域である第３６項記 載の方法。37. Item 36, wherein the promoter region is a promoter region of melibiase. How to put it on. ３８．該シグナル配列がメリビアーゼのシグナル配列である第３７項記載の方法 。38. The method according to paragraph 37, wherein the signal sequence is a melibiase signal sequence. . ３９．ポリペプチドの暗号領域がセルロモナス・フィミから導かれたものであり 、エンドグルカナーゼをコードしているものである第３８項記載の方法。39. The coding region of the polypeptide was derived from Cellulomonas fimi , encoding an endoglucanase. ４０．シグナル配列および暗号領域の転写が、ＧＡＬ４および／またはＧＡＬ８ ０遺伝子およびその生産物の活性に影響を及ぼす増殖培地中の条件の変化により 調節される第３７項記載の方法。40. Transcription of the signal sequence and coding region occurs in GAL4 and/or GAL8. 0 by changing conditions in the growth medium that affect the activity of the 0 gene and its products. 38. The method of paragraph 37, wherein the method is regulated. ４１．酵母固有のメリビアーゼ遺伝子のシグナル配列。41. Signal sequence of yeast-specific melibiase gene. ４２．Ｓ．カールスベルゲンシスに固有の第４１項記載のシグナル配列。42. S. 42. The signal sequence according to paragraph 41, which is specific to Carlsbergensis. ４３．実質上、式： （Ｎ末端）【配列があります】 で示されるアミノ酸配列をコードしているＤＮＡ配列を有する第４２項記載のシ グナル配列。43. In effect, the formula: (N-terminus) [Sequence available] The system according to item 42, which has a DNA sequence encoding the amino acid sequence shown in Gunar array. ４４．実質上、式： （５′）【配列があります】 （３′） で示されるＤＮＡ配列を有する第４３項記載のシグナル配列。44. In effect, the formula: (5') [There is an array] (3') 44. The signal sequence according to item 43, having a DNA sequence represented by: ４５．ＤＮＡ組立て物であって、メリビアーゼ分泌シグナル配列を含有し、該シ グナル配列の側方に、付加的なＤＮＡ成分を該組立て物に挿入するための制限部 位を規定しているＤＮＡセグメントを含んでいるＤＮＡ組立て物。45. A DNA construct containing a melibiase secretion signal sequence and comprising a melibiase secretion signal sequence. Restrictions flanking the signal sequence for inserting additional DNA components into the construct. A DNA construct that contains DNA segments that define positions. ４６．該ＤＮＡセグメントが実質上、第４Ａ図に示されているヌクレオチド配列 を有する第４５項記載の組立て物。46. The DNA segment has a nucleotide sequence substantially as shown in FIG. 4A. 46. The assembly according to clause 45, having: ４７．酵母に固有のメリビアーゼ遺伝子のプロモーター領域。47. Promoter region of yeast-specific melibiase gene. ４８．Ｓ．カールスベルゲンシスに固有の第４７項記載のプロモーター領域。48. S. 48. The promoter region according to paragraph 47, which is specific to Carlsbergensis. ４９．実質上、添付図面の第１図に示されているＤＮＡ配列を有する第４７項記 載のプロモーター領域。49. Item 47 having a DNA sequence substantially as shown in Figure 1 of the accompanying drawings. promoter region. ５０．ＤＮＡ組立て物であって、メリビアーゼのプロモーターを含有すると共に 、該プロモーターの下流に該ベクターに付加的なＤＮＡ成分を挿入するための制 限部位を規定するＤＮＡセグメントを含有している組立て物。50. A DNA construct containing a melibiase promoter and , a control for inserting additional DNA components into the vector downstream of the promoter. A construct containing DNA segments that define a restriction site.