JPS62501797A - ウイルス分離物に関する改良及びその使用 - Google Patents
ウイルス分離物に関する改良及びその使用Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の名称
ウィルス分離物に関する改良及びその使用本発明はレトロウィルス(retro
viruse)に対する抗体のための新規検定及びその方法においで使用するた
めの新規ウィルス分離物に関し、さらに詳細には、ヒトのリンパ迄向性ウィルス
及びその使用並びにレトロウィルス、特に後天性免疫不全症候群(エイズ)に伴
なうもの、に対する抗体の存在を確認するための血清(serum)の分析にお
ける他のレトロウィルスの使用に関するものである。
感染性の動因によって生じる後天的免疫不全症候群(エイズ)の流行は、この数
年における明白な事実である。この病気の徴候は、性的接触又は血液接触によっ
て伝達される動因を強く示唆する様式で、いくつかの明確な危険グループに限定
されている。この病気は米国において最初に発見されたけれども、ヨーロッパを
含む他の地域にも、増大しつつある流行が存在する。
この病気が広がる原因と思われるものの一つは、エイズウィルスに侵されている
供血者による輸血である。供血のプールは、エイズウィルスを保有する供血者に
よって与えられた血液を他の供血者からの血液試料と一緒にプールするときは、
その試料が多くても少なくても全部の血液及びそのプールから白米する他の製品
が汚染される可能性があることを意味する。エイズウィルスを保有する多くの供
血者が、待に感染の初期相においては、自身の感染に気付いておらず、且つ他の
感染供血者は、たとえ感染に気付いていたとしても、自分が病気を待っていると
いうこと又は高い危険グループに属しているということの何れをも、明らかにす
ることを好まないものと恩われる。それ故、輸血用の供血の試料を、エイズウィ
ルス又はエイズウィルスに対する抗体の存在について日常的に検査することがで
きる、比較的簡単であるが完全に信頼することができる試験に対する増大しつつ
ある要望が存在する。この試験で陽性を示した供血は、輸血用には却下すればよ
(、それによって、汚染した試料と共にプールすることによる他の血液試料の汚
染を避けることができる。
エイズの原因となる因子の確認と単離のための研究は、約2年にわたって活発に
行なわれているが、その正確な同定と命名に関しては、この分野の多くの研究者
の間で、なお不一致が存在する。いわゆるエイズウィルスの分離物は最初に7ラ
ンスのモンテーニュ及びその協力者によって1983年に報告されたが、彼はそ
の物質を“リンパ腺症関連ウィルス−1”(LAV−1)と名付けた。はぼ1年
後に、米国の1口及びその共同研究者は、彼らが“ヒトのリンパ趣向性ウィルス
■型”(HTLV−■)と命名した、別のいわゆるエイズウィルスの分離物の詳
細を報告した。
われわれは今や、リンパ腺腫から、HTLV−1[及びLAVに関連するヒトの
T−リンパ趨向性レトロウィルスを単離することが可能となり、それをわれわれ
はCBL−1と名付けている。われわれのCBL−1質は、宿主の細胞系統で培
養することができ且つ血清試料中のエイズウィルスへの抗体の検出のための検定
において使用することができる。
かくして、本発明は、病因学的にエイズに関連するヒトのT−リンパ趨向性レト
ロウィルスCBL−1を提供するものである。
われわれは、CCRF−CEMと命名され且つ7オーリーら、カンサー、18,
522〜529(1965)中に記されている白血病性T−細胞−系列中でCB
L−1物質を長時間にわたって保持することができることを見出しており、かく
して本発明のもう一つの特色は、われわれはCBL−1を生息させることができ
るCCRF−CEMを包含する。
確定のために、われわれは、われわれのCBL−1ウイルスを生息させるCCR
F−CEM細胞の試料を、英国SPA OJGウイルッシャー、サリスベリー、
ポートンダウン、応用微生物学及び研究に対する公衆衛生研究所サービスセンタ
ーの国立(現在はヨーロッパ)動物細胞蒐集所(NCACC)に預託した。NC
ACCは1977年のブタペスト条約下に国際保管t’i9.Rとして選定され
ている。われわれの預託は1985年1月11日に灯なわれて、保管番号aso
IB11o1を与えられた。
われわれのCBL−1物質は、エイズに伴なう免疫芳性(immunoblas
tie)リンパ腫に対する治療を受けているイギリス人の患者のリンパ腺腫生検
から培養してリンパ球から分離した。生検の断片を、T−細胞成長因子が添加し
である培養基中に保持し、約2日後、CCRF−CEM細胎を培養物に加え、そ
れを初期のリンパ球が約1ケ月の期間に消失し、一方CCRF−CEM細胞は増
殖し且っCBL−1ウイルスによって慢性的に感染するに至るような条件に保っ
た。
CBL−1ウイルスは:
(a) MFi”カチオンに対する選択性をもつ逆転写酵素活性を有することに
より;
(b) 電子顕微鏡によってi察することがでさるフィルス粒子のモルホロノー
により;
(c) エイズ患者から調製した血清によるCBL−1感染したCCRF−CE
M細胞中のウィルス性抗原に対して特異的な間接的免疫蛍光法により;
(d) 固相放射#I楳識免疫検定におけるHTLV−I[[及びLAV−1と
の比較により;
前記のHTLV−I[1の分離物と相関することが示され且つそれによってヒト
のT−細胞リンパ趨向性ウィルスを含有するレトロビリグエ(Retrovir
idae)の分類学的グループ中に包含される。
予備的なりNA配列分析は、CBL−1ウイルスの配列は、記述されている限り
の他のヒトのT−+7ンパ趨向性レトロウイルスのものと密接に関連しているけ
れども、先に記した物質の配列と同一ではなくて、種々の場所において多少の配
列の相違を表わすことを指示している。
われわれがECACCに預託した感染細胞は、少なくとも6ケ月の期間にわたっ
てウィルス及びウィルスの抗原を合成し続けることが認められている。
われhれはCCRF−CEMIM胞が、bれhれのcBL−1フイルスに対する
理想的な宿主であることを見出しているけれども、この細胞はリンパ腺腫生検を
採取した同じ患者の周辺血液かられれわれが分離した類似の細胞及びエイズ関連
ウィルスに侵された他の患者から分離した類似のウィルスを潜伏させるためにも
用いることができるということをわれわれは認めている。かくして、われわれは
、この細胞系列が、われわれのCBL−1物質のみでなく他の関連する物質の試
験管内培養に対しても有用な宿主を提供することができるということを示した。
本発明のそのほかの特色に従ってわれわれは、生物学的試料を、(1)それ自体
不活性固体担体に結合させであるグロブリンに結合させたレトロウィルス抗原か
ら成る不溶化した抗原;及び(2)レトロウィルス抗原に対する特異性抗体を含
有し且つ非放射性の顕示標識で標識付けしである免疫グロブリンと接触させ、次
いで液相を固相から分離し且つ液相又は固相の何れかに結合している顕示標識の
量を測定することから成る、レトロウィルスに対する抗体について生物学的試料
を検定するための方法を提供する。
本発明のさらに別の特色においてわれわれは、(1)それ自体不活性固体担体に
結合させであるグロブリン、に対して結合させたレトロウィルスから成る不溶化
した抗原である第一の成分、及び
(2)レトロウィルスに対する特異性抗体を含有し且つ非放射性の顕示標識で標
識付けしである免疫グロブリンである第二の成分から成る試験キットを提供する
。
前記のように、CBL−1の主な用途は、輸血用の血液がエイズウィルスに侵さ
れている患者から白米するものであるかどうかを調べる日常的な試験のための検
査系中の一成分としてである。われわれは、固相として不動化したCBL−1抗
原又はその他のレトロウィルス抗原を、且つ液相として試験血清を使用する、同
時的競争検定に基づく系を開発した。
さらに詳細には、われわれの同時的競争的検定方法は、CBL−1抗原又はその
他のレトロウィルス抗原を、配位子、たとえばグロブリン又はその他の抗体を経
て固相に結合させ且つこの不動化した抗原上の結合部位を、試験血清抗体と顕示
剤によって同定することができるエイズウィルスに対する既知の抗体の混合物に
よって競争させることによる、CBL−1抗原又はその他のレトロウィルス抗原
の不動化に基づいている。
われわれは、顕示剤がeI!素標識である場合に、もっとも満足しうる結果を達
成しうろことを認めている。放射性標識ではなく酵素標識を使用することは、放
射性の生物学的危険物質の排除という点で有利であり且つ検定免疫培養を1時間
以下に低下させることができるという予想外の結果が得られる。
また別の方法は、不動化した抗原に結合させた既知の抗体の存在を明らかとする
ための免疫蛍光法の使用である。
前記のように、われわれは抗体である配位子を通じて抗原を固相に結合させる場
合に最良の結果が得られることを見出している。一方法は、エイズウィルスによ
り無症候性に感染している者から採取した高力価のヒトの血清を使用することが
できる。理想的な血清は、正常範囲にある免疫グロブリン水準を有する患者から
白米するがエイズウィルスに対する高力価の抗体を有しているものである。別の
方法は、レトロウィルスに対して生じさせたモノクローナル抗体を使用すること
である。それを通常のようにしてマウスを用いて生じさせるときは、のちにさら
に詳細に記すように、いくつかの便宜を確保することができる。
固相材料は、多数の表面の穴又はその他の表面のくぼみをもつ管、ビーズ、ある
いは好ましくは板の形態にあるポリスチレンを使用することが便宜的である。次
いで選択した血清から調製した〃ンマーゾロプリン又はその他の抗体をポリスチ
レン上に被覆したのち、そのグロブリン被覆したポリスチレンに対して抗原を結
合させることにより、検査のための第一の成分を形成させる。この成分は、湿っ
た状態又は乾燥して、数ケ月にわたって保存することができる。
検査の第二の成分は、試験血清から分離したIEG分屑から成り、且つ顕示を酵
素標識の使用によって行なう場合には、このIgG分肩な、公知の方法によって
、たとえばわさび(horseradish)ベルオシグーゼ(HRPO)と抱
合させることができる。
本発明の試験キットは、標識付けしたIgG成分を試験血清と混合し、次いでI
gGと試験血清の混合物の不動化した抗原との接触を生じさせ、固相と液相を相
互から分離したのち、抗原に結合したrgGの程度を定量することによって、使
用することができる。同時的な競争的検定においては、液相のIgG成分が固相
に結合する程度が大きいほど、試験血清中の抗体又は抗原の量が少ない、それ故
、適当な対照値の選択によって、仮にHRPOを顕示剤として使用するとすれば
、試験試料に対する光学密度(OD)が所定の最低水準に達する場合に、試験血
清はエイズ抗体又は抗原を保有していないものとみなすことができるというよう
にして、日常的な試験が可能となる。それ故、所定の水準よりも低い光学密度値
の記録を生じさせる試験血清試料は、すべて廃棄することによって、エイズウィ
ルス又は抗体によって汚藝されている可能性のある供血による輸血を避けること
ができる。
本発明の検定方法及び診断試験キラF中のレトロウィルス抗原としてCBL−1
に代るものとして、その他のレトロウィルスを使用することができる。それらは
、たとえば、ヒトのT−リンパ趨向性レトロウィルスHTLV−1[のような病
因学的にエイズに関連する他のヒトのレトロウィルス又はたとえばヒトのT−白
血病ウィルス、HTLV−IIあるいノービスナ(Maedi −V 1sna
)あるいはウシの白血病ウィルスのような、動物のレトロウィルスとすることが
できる。
さらに詳細に後記するように、グロブリンを経由するヒトのレトロウィルス抗原
の固相への間接的結合は、確実な結果の増幅をもたらし、且つ試験7オーマツト
は、比較的未習熟で経験の少ない技術者による血液試料中の汚染の有無の、簡単
、迅速且つ正確な決定を可能とする。
区亘@晟吸
第1図は、CCRF−CEM宿主細胞の境界から発芽し且つそこに位置したCB
L−1粒子を示している、81,000倍の倍率の電子顕微鏡図である。
第2図は、抗−HTLV−IIIに対する固相ELISAの動作を示す。
図は放射線標識免疫検定によって結果が既知の、抗−HTLV−[1に対して反
応性及び非反応性のものを含む、多数の臨床血清の試験から白米する光学密度を
示している。
第3図は、類似の1段階同時的競争ELISAにおいて測定した、第2図のもの
と類似するが、しかしこの場合は抗HTLVIに対するものであるデータを示す
。
以下の実施例は本発明を例証するためのものである。
に嵐匠L
CBL−1の分離 び特 付は
後天的免疫不全症候群(エイズ)を伴なう免疫芽リンパ腫に対する治療を受けて
いる英国人の患者のリンパ腫生検から培養したリンパ球から、ウィルスCBL−
1を分離した。リンパ腫生検を小さな分層に切断して、10%のウシの胎児血清
及び10μg/m lの植物性血球凝集素で補充したRPMI−1640基礎培
地から成る培養基中に入れた。24時間の条件付けののちに、扁桃リンパ球の混
合培養物から収穫したT−細胞成長因子を加え、且つ植物性血球凝集素を除いた
。培養開始の48時間後に、インター7エロンフル7アへの抗血清を加えた。4
8時間において、CCRF−CEM細胞(以下においてはCEM細胞と°記す)
をも加えた。
CEM細胞は、7オーリーら、カンサー18:522〜9(1965)によって
記された永久的に成長する白血病T−細胞系列である。′共培養の条件下に、原
始のリンパ球は4週間の培養の過程で消失したのに対して、OEM細胞は指数関
数的に増殖した。原始リンノ(球によって生じたCBL−1ツイルスがCEM細
胞に感染し且つ培養物中で8週間後にCEM細胞はCBL−1ウイルスで慢性的
に感染された。CBL−1感染OEM細胞の保守は、T−細胞成長因子又は抗イ
ンター7エロンアルフアを必要としなかった。これらのCBL−1感染CEM細
胞を、前記のように、保管番号85011101下に、NCACCに預託した。
CBL−1ウイルスは(a)Mg2+カチオンに対する選択性をもつ逆転写#索
活性を有することにより且つ電子顕微鏡で観察することができるウィルス粒子の
モルホロジー(第1図参照)により且つΦ)エイズ患者から調製した血清による
CBL−1感染したC E M細胞中のウィルス性抗原に対してW異的な間接的
免疫蛍光により及び固相RIA中の他のエイズウィルス分離物との比較により、
前記のHTLV−1[[/LAVの分離物に関連することが示された。CEM/
CBL−1細胞は6ケ月の期間にわたってウィルス及びウィルス性抗原を合成し
続けた。
ス凰匹見
1、佐壓暑聚
粗製の凍結−融解細胞溶解質を、以下のようにして調製した。HTLV−1[[
B″CC感染たHT−H9細胞を懸濁培養物中で最高の密度まで成長させた。培
養物を4℃に冷却して、0.25%容量/容量のβ−プロピオラクトンを2時間
にわたって加えた。次いで細胞を培養液から遠心分離して、低速でペレット化し
た。細胞のベレットを蒸留水中に再懸濁させ且つ3回の凍結/融解サイクルを施
した。各サイクルにおり1て、細胞ベレットの残留物を注意深く再懸濁した。第
3のサイクル後に、抽出物をβ−プロピオラクトンによって0.25%容量/容
量とし且つ4℃で2時間保ち、次いで1時間半にわたり37℃に加温した。この
時間の間、9Hを7.4の区域に保った。粗溶解質を清澄化したのち、−20℃
で保存した。使用前に、それを0.1%のBSAと洗浄剤で補充したトリス緩衝
液中で希釈した。洗浄剤の選択とその濃度は重要であって、0.1%の濃度にお
けるツイーン(TtIleen) 20の使用が最適であることが認められ、抗
原製剤の活性を3倍又は場合によってはそれ以上に増大させた。トリスBSA/
ツイーン20中における希釈後に、抗原を37℃において30分間培養した。抗
原の増進が生じるのは、この段階の間である。
この方法による抗原の調製は、種々の規定した培養条件下にHTLV−■抗原の
発現を監視するために使用することができる。抗原性は、固[抗−HTLV−1
[[及1/、125I−抗−HTLV−In包tする、第二の試剤を使用する固
相RIA中で定量化することができる。最終分析においては、陰性の血清の存在
で1〜2%の標識結合によって10:1のP:N比を与える希釈度において抗原
を使用した(下記検定方法参照)。
細胞の上澄液中へのウィルス性抗原の変動する脱落が存在したが、相対的な意味
では、検出できる抗原の大部分が細胞ベレット中に残された。
このことは、CBL−1に対しても且つまたOEM!胞あるいはHT/H9細胞
に伴なわれるHTLV−DIの他の分離物に対しても当てはまる。
抗原純度に対する制約は存在せず(下記参照)且つ細胞中の抗原発現を最大とす
ることが適当であった。ここで使用された抗原製剤は製造が容易であり、上澄液
から調製される抗原よりも高い細胞培養物容量当りの収率をもつものと思われ且
つ一20℃で安定であると思われる。それはβ−プロピオラクトンによって容易
に不活性化することができる。ツイーン20の使用は感染性のウィルスの力価を
着るしく低下させることも予想される。
2・抜良鼠
検定のための試薬はエイズレトロウィルスに無症状的に感染している者から採取
した高力価のヒトの血清がら調製した。試薬調製のための血清の選択は重要であ
る。血清は、RIAによる高力価の抗−HTLV−■を有していたが、正常の範
囲にある免疫グロブリン水準をもつ患者からのものであった。実際には通常は上
記の基準に合致する少数の血清がら試薬を調製し且つ検定における試薬の性能を
試験することが必要である。これらの試薬を非感染性とするために出発血清を5
6℃において30分間加熱処理した。
(a) 抗−HTLV−111Bグロブリンの調製 この材料は、通常は固相H
TLV−1ffB抗原上で、その場で精製した。この方法には、かなりの有利性
があった。熱処理した血清からのグロブリンを、40%飽和硫酸アンモニウムを
用いて2回沈澱させた。これはグロブリン被覆のためのもつとも簡単な試薬であ
ったが、全血清又は精製したIgGの何れを用いることも可能であった。グロブ
リンは試薬の個々の滴定によって決定しなければならない最適の希釈度で使用し
た。固相材料は、穴をもつ形態で且つグロブリンで被覆されているポリスチレン
であり且つあまっている結合部位を次いで不活性たんばく質(この場合は0.1
%のウシの血清アルブミン(BSA)で消)!−させた。被覆し且っ消尽させた
固相を、湿ったまま4℃において数ケ月保存した。乾燥は一層安定な生成物を与
える。
固相を被覆するためには、前記のHT−H9/HTLV−1[[B11次を、ト
リス/B S A/ツイーン緩衝液中で、引続(試験において1〜2%の標識が
陰性の血清と結合することを許す希釈度まで、希釈した。被覆は、固相における
室温での2日間の抗原の汲置と、その後の使用までの4℃における湿ったままで
の保存によって、もつとも効率的に達成された。
予備的な実験は固相がその形態で数ケ月は安定であることを示した。しかしなが
ら、これは効力の者るしい低下なしに乾燥することもでき且つ数ケ月は安定に保
存することができる。
φ) グロブリンの標 寸は
上記2(a)のIgGを常法により異種官能性誘導体を用いてHRPOと抱合さ
せることによって、1:3のモル的置換比を与えた。この材料を上記2(a)の
固相と組み合わせて、体液の試料中のエイズレトロウィルスに対する抗体の検出
のための酵素免疫検定において使用した。
比較のために、IgGの別の試料を 125■によって、たんばく質μg当り1
5μCiの非活性に標識付けした。
高力価の抗−HTLV−■を含有するヒトの血清を実施例2.2において先に記
したようなグロブリンの被覆の調製のために使用した。丸い底の形態をもつポリ
スチレンの簡を、最適希釈度のグロブリンで被覆し、次いで不活性たんばく質(
この場合は0.1%BSA)消尽させた。同じ血清を免疫グロブリン源として使
用し、それを前記のようにDE52上のイオン交換クロマトグラフィーによって
精製した。1分子のIgG当りに3分子のワサビペルオキシダーゼという適当な
置換比で、IgGをワサビペルオキシダーゼと結合させた。
抱合体の動作は、あらかじめ間接的な抗体を通じてHTLVl[感染細胞から白
米するフィルス抗原によって及び未感染細胞の抗原で被覆したポリスチレン部上
での培養によって調べた。抱合体の最適希釈度は、感染細胞の抗原によって最大
の色結合を与え且つ未感染の細胞によって最低の色の発現を与えるようなものと
した。
CEM CBLI 、
持続的にCEM/CBLIウィルスに感染している細胞に非付着性攪拌培養中で
最大密度まで増殖させた。攪拌培養物を4℃に冷却したのち、β−プロピオラク
トンによって0.25%容量とした。4℃における2時間の培養後に、細胞ペレ
ットを収穫して、凍結−融解サイクルを施したのち、前記と同様に遠心分離によ
って清澄化した1組織培養物抽出物を、次いで0.25%のβ−プロピオラクト
ンと共に4℃においてさらに2時間培養処理したのち、前記のように加水分解し
た。この場合に細胞破壊及び凍結−融解サイクルのための希釈側は、0.1%の
ツイーン20で補充したりん酸塩緩衝塩水であった。抗原の製剤を次いで高力価
抗HTLVI[[グロブリンで被覆した同相上で滴定し且つ後記の条件下に1.
0〜1.2の45Or++sにおける光学密度を与える希釈度を引続く試験のだ
めの作業希釈度として用いた。
試験の最 イ及び7オーマツト
高力価のグロブリンで被覆し、次いで消尽させた筒を、CEM/CBL1抗原の
最適希釈物100μlと共に培養した。室温における終夜の培養後に抗原抽出物
を筒から洗い出し、次いで不動化したOEM/CBL1ウィルス抗原の安定性を
増進することが認められている条件下に、乾燥した。試験のために、25μlの
抗体の陽性血清と抗体陰性血清を別々の筒中に入れ、洗浄剤補充した蒸留水中の
75μ2の抱合体を各部に加えた。試験血清と抱合体の混合物を筒中で異なる条
件下に異なる時間にわたって培fi(免疫培養)シた0次いで筒を塩水−ツイー
ン(0,1%のツイーン20で補充した0、8%塩化ナトリウム溶液)で3回洗
浄した。
3回の洗浄後に筒を塩水−ツイーンで満し室温で2分間浸漬し、そののちに3回
の洗浄サイクルによる洗浄手順を繰返した。そののちに、100μlの色原体基
質、この場合には、3.3’、5.5’−テトラメチル−ベンツシン(TMB)
を加えた。室温における20分の培養後に色原体解放を50μ!の4N硫酸の添
加によって測定した6色の解放は分光学的に450nmで測定した。特定のCE
M/CBL−1抗原の作業希釈は、45℃において1時間の免疫培養として規定
された、最適条件下のELISAにおいて用いるときに、陰性の血清において確
実に1〜1.2の光学密度を与える希釈度と考えられる。
級邑
実施例2に記した面相と12SIF識付けしたIgGを用いる通常のRTAにお
いて得た結果と、この実施例において得たELISA結果の間の比較において、
二つの予想外の利点がELISAの有利性を実証した。
最初に、RIAにおいて良くも悪くもない結果を与えた次善の抗原製剤が、同じ
力価において、良好なELISA結果を生じさせることができた。第二に、表に
示すように、RIAにおいては3時間以下に培養時間を低下させることはできな
かった。輸血の環境においては、迅速な検定、即ち全体で1〜2時間、が必要で
あるが、これはELISAによってのみ可能であった。
聚
l2sI標識付けしたIgGを用いるRIAにおける時間/温度実験時間/hr
温度 対。
切り衿で
本人力水準の結合百分率
第2図において、この場合は市販及び非市販因子■濃組物で処置した血友病患者
及び同性愛者から由来する56の臨床血清のELISAによる試験結果を示して
いる6図から明らかなように、抗−CE M/CB Llに対しで反応性の血清
と非反応性の血清の間に明らかな差があった。
この特定の実施例においては、CEM/CBL−1抗体に対して反応性の16の
血清の平均光学密度0.085(0,037〜0.327)であり、この抗体に
対して非反応性の40の血清に対する平均光学密度は1.16(0,736〜1
.352)であった、血清aは末期的症状のエイズ患者からのものであって、I
F及び直接結合検定において弱度応性であった。
血清す及びCは再試験に対して非反応性であった。
英国における輸血血清の検査において用いられるものと正確に同一の7オーマツ
トを用いた。今回は供血者からの12,000を超える血清を試験した。3血清
がスクリーニング試験において反応を与えたが、しかしながら、再試験において
は一人の供血者のみが反応性であることが認められた。この血清は反復的に反応
性であり、滴定可能であり且つ免疫蛍光法にお、いて感染細胞に対しては強い反
応性を示したが、非感染細胞に対しては反応性を示さなかった。それ故、CEM
/CBLI感染に関係しない血清のランダム反応性はきわめて低かった。抗−H
TLVI[[に対して反応性の血清の滴定についての引続く実験は、CEM/C
BLI ELISAと直接検定の両方で試験するときに、力価がおおよそ同一で
あることを示した。これは−次HTLV感染に続く急性血清転化を受けている患
者から採取した血清の引続く検査によって確認された。やはり、直接結合検定又
は競争的ELISAの何れにおいても、初期反応性の水準又は時間に、はとんど
相違がなかった。同じ検定を使用して、オリゴ及びパンー反応性抗すンパ球抗体
をもつ患者からの血清及び自己免疫病をもつ患者からの血清は、競争的ELIS
Aにおいて非反応性であった0合わせて考えると、これらのデータはこの競争的
ELISAのエイズ関連レトロウィルスへの抗体に対する特異性と感度が高いこ
とをX塩四土
−HTLV Tに−する11” −ELISA血清及び試薬は、HTLVlに感
染した細胞を抗原の調製に使用し、且つHTLV Iに感染した患者からの血清
を試薬源として用いたほかは、実施例3のCEM/CBLI免疫検定に対するも
の同様に選択し且つ調製した。第3図においては、3の既知弱陽性対照を含む3
2の臨床血清によって与えられる光学密度を示している0反応性と非反応性の血
清の間には明らかな相異が生じ、この抗体に対して反応性の5血清の平均光学密
度は0.099(0,060〜0.129)であり、この抗体に対して非反応性
の24血清に対する平均光学密度は1.64(1,48〜1゜83)であった、
この試験は確実であり且つ条件は変動させることができるが、実際には45℃で
1時間の免疫培養において最適化することが決定された。これはCEM/CBL
I抗体検畠に対する条件と平行的であった。
この試験を同様なフォーマットで、1000人の非選択的なイギリス人の血液提
供者に対するスクリーニングに対して使用したが、反応性の血清は認められなか
った。それに対して、75人の77リカとカリブの現地人供血者の選択的スクリ
ーニングは、−人の血清陽性の始めての供血者を確認した。
HTLV [に感染した患者からの血清を被覆グロブリン源として及びIgG源
としそ用いる以外は上記の手順を反復した。HTLVllに感染した細胞を抗原
源として使用した。これらの試薬は抗−HTLVl[RIAに対して実施例2に
おいて先に記したものと同様にして選択し且つ調製した。
X塩四Σ
゛験キットの製゛と 用
1、ス莱
96の(ぽみを含有するポリスチレン多孔板を、少なくともくぼみの内側表面上
において、CBL−1に対しての精製し且つ熱処理したヒトの抗体によるで被覆
した。抗体はエイズレトロウィルスに感染したヒトからの熱処理した血清に由来
した。ポリスチレンを抗体で被覆したのち、あまっている結合部位を不活性たん
ばく質、この場合はウシの血清アルブミン、で消尽した。ポリスチレン板上の不
溶化に対して用いた抗原はCBL−1であった。これを先ずウィルス撲滅性ベー
タープロピオラクトンで処理し且つ不活性化したCBL−1のトリス/B S
A/ツイーン緩衝液中の懸濁液を、処理したポリスチレンと共に、室温で約2日
培養した。このようにして、CBL−1は、抗体を通じるポリスチレン担体への
間接的結合によって、不溶化された。この成分を試験キットの第一の成分とした
。
試験キットの第二の成分は、上記のようにポリスチレンを被覆するために用いた
ものと同一のヒトの抗体を標識付けることによって調製した。
抗体は通常の抱合方法を用いるワサビベルオキシグーゼ(HRPO)による抱合
によって標識付けした。このHRPO楳識付けした抗体を凍結乾燥条件下に保存
し且つ使用直前に水性希釈剤中の懸濁液を用いて還元した。
上記の2成分に加えて、試験キット中には、すべての必要な顕示剤及び対照剤が
有効となるように、補助的な試薬を包含することが望ましがった。標識としてH
RPOを用いた、このキットに対しては、酵素に対する基質として3.3’、5
.5’−テトラメチルベンジノン(TMB)を使用し且つTMBを錠剤状で、各
錠剤が96のくぼみに対して十分な基質を提供するように供給した。使用の直前
に、7M8錠剤を、くえん酸三ナトリウムと過酸化水素を含有する水溶液中に溶
解した。陽性と陰性の対照血清を用意することもまた望ましかった。陰性の対照
血清は、この試験においてCBL−1に対する抗体に対して非反応性の正常なヒ
トの血清であった。陽性の対照血清は、この試験手順においてCBL−1に対す
る抗体に対して反応性であった熱処理したヒトの血清であった。加うるに、切り
捨て対照血清として、CBL−1への抗体に対して反応性(試験における切り捨
て水準において)の、熱処理したヒトの血清且つまた食塩水と、ツイーン20か
ら成る洗浄液をも、用意することが望ましがった。
2、区墓1ヱL@使肚
使用の直前に、HRPO楳識付けした抗体を還元した。試験は1つのくぼみ当り
25μ!の血清の試料を用いて行なった。2つのくぼみに陰性の対照血清を供給
し、1つに陽性の対照血清を供給し、3つに切り捨て対照血清を供給し、残りの
くぼみには試験試料を導入した。還元したHRPO楳識付けした抗体の75ミク
ロリツトルの部分を、各(ぽみに導入し且つくぼみ板をおおったのち、45℃の
加熱ブロック上で1時間、又は20:25℃において終夜、少なくとも16時間
、培養した。培養時間の終りに、板を洗浄したのち、基質溶液の100ミクロリ
ツトルの部分を各くぼみに加えた。次いで次いで板を18〜25℃で20分間培
養したのちに、陰性の試料を含有するくぼみ中に青色が生じた0次いで各くぼみ
に2M硫酸の50ミクロリツトルの部分を加えると、青色は黄色に変った0次い
で、450r+nにおける各くぼみの吸光度を硫酸の添加の309以内に、マイ
クロウェル板リーダーを用いて測定した。
3・級玉
結果を次のようにして評価した:3つの切り捨で対照血清の平均吸光度を計算し
た0次いで平均切り捨て対照値と等しいか又はそれよりも大きい吸光度をもつ試
料を、この試験装置の限界内で、エイズレトロウィルスへの抗体に対して陰性と
みなした。平均qり捨て対照値よりも低いか又は平均切り捨て対照値よりも10
%まで高い吸光度をもつ試料を再試験した。
次いで、この試験において繰返して陽性を示した血清を、確認のために、免疫蛍
光法又はウェスターンプロッティング(Western blotting)を
用いて再試験した。
上記の手順は陰性の結果を有する1600の日常的血液銀行供血試料を用いて試
験した。しカルながら、エイズ、エイズ開運複合体又はその他の病気の臨床的診
断を有する患者からの他の臨床試料を試験するときには陽性の結果が検出され且
つほとんどすべての場合に、免疫蛍光試験及び異なる#素免疫検定によって確認
された。以下の結果を得た。
表
供血者及びエイズ、エイズ関連状態及びその他の病気をもつ患者から血清の 応
性
臨床グループ 試料数 試験キットに 確認された!ゑ伏俟隆快−−披生隆箪一
供血者 1600 0 −
エイズ 4 4 4
工イズ関連複合体 39 39 39
高度の危険グループ 7 7 7
他の病気す
感染性単核症 48 o −
B型肝炎 2532
梅@ 117 2 2
リユ一マチ性関節炎 9 〇 −
その他の感染 370
a、免疫蛍光法及びその他の#素免疫検定を包含する確認試験す、確認された陽
性試料のみ
c、 1試料は4試験の中2つに対して陽性;確認陰性d、風診(18例);微
小フィルス(9例)、巨大ウィルス(5例)、トキソプラズマ病(5例)を含む
。
ウィルス性抗原を同相に対して結合されるためにヒトの抗血清を用いることの本
質は、それ自体ヒトによってもっともよく認識されるウィルス性抗原の様式を反
映する固相を与えることである。これは、捕獲された抗原の混合物とヒトの抗体
のプロフィールの間の良好な“適合”が存在する故に、有利である。さらに、抗
原製剤に対して使用する穏和な条件は、他の固相検定によって用いられる勾配精
製され且つ崩壊した製剤においては提供されないデリケートな配座的エピトープ
の保存を可能とする。いまや、不動化させる抗原が特定の特異性のものとなるよ
うに明確な特異性のネズミの七/りa−ナル抗体で固相を被覆することによって
固相抗原の混合物を調節することが可能である。
ここに示したデータは、同相上でP2S(25にドルトンのたんばく質)と反応
する選択したモノクローナル抗体を用いるときに、試験のすぐれた本質を実証し
ている。有利な点は適当な検定に対して必要な抗原の量が比較的少ないこと(第
A表)及び行なわれる試験の感度が高いことである[個々の血清の終点希釈度、
(すなわち、低い光学密度の読み)がポリクローナル試験と比較してモノクロー
ナルにおける増大した抑制を与えることを示す8表参照】、感度の増大は、多く
の他の検定と比較するときに、早期の抗体生産の検出に対して、この試験をより
効率的なものとしている。加うるに、同相上のネズミの抗体の使用は相同性検定
における固相ヒトのIgGとヒトのIgG抱合体の間を橋かけするリューマチM
似因子の潜在的問題を回避する。実際に、ポリクローナルに基づく検定と比較し
てモノクローナルに基づく検定において、常により高度な抑制を示す僅かな血清
が固定された。この現象は明らかに相同性検定においてのみ非特異的な具合に面
相に対して抱合体を結合する、低い水準且つ低力価反応性のためである。この現
象又はMUの現象は、正常な血清の光学密度反応性の分布が、同時的に行なわれ
るポリクローナル検定におけるよりもモノクローナルに基づく検定において遥か
に密であると〜1う、別の予想外の知見をも説明する。
本質的にヒトの抗−HTLV−I[[核応答に対する競争的検定を提供するレト
ロウイルスギャグCg−g)遺伝子生成物に対するモノクローナル抗体の使用は
簡単であることがわかっているから、明確なエンプ(env)生成物に対する抗
体の使用は、選択したエンベロブ抗原に対する抗体のためのjI似の検定の発展
を可能とするものと思われる。これは、臨床的、予後判定的及び感染制御の面に
おいて重要なものとなる、異なるウィルス抗原へのヒトの応答のきわめて精密な
研究を可能とする。
亀−へ一表
ポリクローナル びモノクローナル固相 のCEM/CBLiの滴固相被覆
希釈 ポリクローナル モノクローナル陰性 切り捨て本陽性 性 切り捨て
寥10 1.34” 0.69 0.05 測定せず測定せず測定せず200第
1.14 0.君 0.03 1.85 0.86 0.1130 0.82
0.42 0.03 測定せず測定せず測定せず40 測定せず 測定せず 測
定せず1,50 0,37 0.0960 測定せず 測定せず 測定せず1.
36 0.38 0.0880 測定せず 測定せず 測定せず1,23 0.
28 0.07100 測 せず 測 せ 測 せず1.18第1オ0.27
0.07京切り捨て一弱陽性対照
■抗−CEM/CBL−Iに対する標準条件試験における450止での光学密度
111抗原製剤の“作業”力価
$B表
ポリクローナル及びモノクローナル固相上で試験した1、50%抑制的終点まで
定した19血清の希釈物の450nmにおける光 密度血清 固相被覆
ポリクローナル モノクローナル
対照 陽性 0,08 0.09
切り捨て 0,76 0.55
陰性 1.39 1.42
血友病 1 1.08 0.86
患者 2 0.95 0.77
工イズ患者 10.630.48
存続全身 1 0,84 0.62
リンパ腺M2 0.84 0.58
麻薬中毒者 1 0,50 0.44
2 0.66 0.50
健常者 1 0,50 0.41
上記の実施例において、固相に会合した標識の測定によって検定が行なわれた。
しかしながら、出発血清と会合する標識水準を測定することができるから、既知
の標識付けした血清と試験血清な固相抗原と接触したのちの放射能値または液相
と会合した酵素水準の低下及び試験血清の抗体含量の尺度として用いられる液相
の標準水準の低下を監視することもまた可能である。
同時的な競争的検定の利点は、以下の項で集約することができる。
抗原調製
実施例2は精製したHTLV−11ウイルスの使用を記したけれども、不動化し
た抗体の使用により生じる増大した結合は、抗原が何ら有用な具合には固相に対
して直接に結合しない場合に、被覆のための粗細胞溶解質製剤の使用を可能とす
る。この段階は診断試験製剤の生産のために高度に精製した抗原を必要とすると
いう制約を除去し且つその製造を容易ならしめる。これは全ヒトグロブリン被覆
物が最終の抗ヒトグロブリン標識によって避けることができない信号を与える直
接検定には適用できない有利な点である。
フォーマット
一定容量の未希釈血清の使用は、最初に希釈を行なうことの必要が作業負荷を増
大させる輸血センターに対して、大きな利益を提供する。血清と酵素標識容量の
間の比は、試験成績をほとんど変えることなく、1:1乃至1:10の範囲にわ
たって変化させることができる。しかしながら、25μlの血清と75μ!の醇
素楳識を使用する、1:3の比グ最適であって、陽性と陰性の血清の間に良好な
差を与える。検定時開はELISA法の使用によって1時間以下に短縮すること
ができる。
践−皮
エイズ抗体に対する検定の感度の一尺度は陽性を保っているエイズの末M的症状
の患者がら採取した血清の割合によって与えられる。直接検定においては、不定
数の患者が抗体反応性を失なうものと思われる。このようなことは競争的検定に
おいては生じることはなく、競争的検定の感度は現在用いられている他の検定と
同等に良好であるが又はそれよりも良いことを示唆する。
性A炸
競争的検定は、偽陽性反応性についての大トな問題を有するものとは思われない
、HTLVウィルス粒子のエンベロブの中へのリンパ球膜抗原の包含は、同相に
対して非特異的に付着するIgGの集合体が存在する場合と同様に、確実に偽反
応性をみちびく、このような現象は競争的検定においては反応性を生じさせない
、不定のたんば(質濃度の非特異的な影響は、適当な血清/標識比(1:3前記
参照)の選択によって且つ50%抑制よりも大きい切り捨ての使用によって、最
低とすることができる。内部制御血清によって与えられるものと等しいが又はそ
れよりも大きい標識結合の抑制を生じる血清はスクリーニング試験陽性とみなさ
れるが、試験は繰返すべきではない、5ooo中で1未満と予想される低い水準
の偽反応性にかんがみて、競争的ELISAにおける偽陽性反応は、直接検定に
おいて生じるものと思われるような数的に大きな問題を与えるものとは思われな
い、直接検定を対照抗原なしで行なう場合には特に問題が大きい、対照抗原の使
用は直接検定における試薬の必要を2倍とするから、輸血センターにおいては大
きな問題である。
!−往
簡単な7オーマツト、高い感度及び高い特異性は、競争的検定を、供血のスクリ
ーニングにおける使用に対して且つ診断用に対して、理想的なものとする。その
上、輸血センターが抗HTLV−IIIに対する直接検定を用いる場合に、米国
でFDAによって推薦されている、比較的やっかいで且つ感度が低いクエ入ター
ンプ・ロッティングにより血清を試験するよりはむしろ、競争的検定で再試験す
ることによって血清の反応性を確認することのほうが良好であることが確かめら
れた。
tmmm+ts+v−^”−”””OPC’r/GB861000232hut
m=a角a+^a會uta++a*we、p(τ/GB861000233AN
NEXτO”X’ii rNTERNATIONAL 5EARCHREPOR
T ON
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.生物学的試料を、 (1)それ自体が不活性担体に結合しているグロブリンに対して結合させたレト ロウイルス抗原から成る不溶化した抗原;及び(2)レトロウイル入抗原に対す る特異性抗体を含有し且つ非放射性の顕示剤で標識付けしてある免疫グロブリン との接触に持ち来たし、且つ液相を固相から分離して、液相又は固相の何れかに 結合した顕示標識の量を測定することを特徴とする、レトロウイルスに対する抗 体について生物学的試料を検定するための方法。 2.レトロウイルスはヒトのT−リンパ趨向性レトロウイルスCBL−,1であ る、請求の範囲第1項記載の方法。 3.レトロウイルスはヒトのT−リンパ趨向性レトロウイルスHTLV−iii 、ヒトのT−白血病レトロゥイルHTLV−ii又はヒトのT−白血病レトロウ イルスHTLV−Iである、請求の範囲第1項記載の方法。 4.生物学的試料はヒトの血液からの血清又は血漿である、請求の範囲第1〜3 項記載の方法。 5.レトロウイルスはヒトのT−リンパ趨向性レトロウイルスCBL−1又はヒ トのT−リンパ起向性レトロウイルスHTLV−iiiであり、且つ顕示剤で標 識付けした免疫グロブリンはエイズレトロウイルスによって無症状的に感染して いるが正常の免疫グロブリン水準を有するヒトの患者からの免疫グロブリンであ る、請求の範囲第4項記載の方法。 6.顕示標識は酵素標識である、請求の範囲第1〜5項記載の方法。 7.担体に結合させたグロブリンはレトロウイルス抗原に結合するモノクローナ ル抗体である、請求の範囲第1〜6項記載の方法。 8.(1)それ自体が不活性担体に結合しているグロブリンに対して結合させた レトロウイルス抗原から成る不溶化した抗原である第一の成分、及び (2)レトロウイルス抗原に対して特異性の抗体を含有し且つ非放射性顕示標識 で標識付けしてある第二の成分がら成ることを特徴とする、試験キット。 9.レトロウイルスはヒトのT−リンパ趨向性ウイルスCBL−1である、請求 の範囲第8項記載のキット。 10.レトロウイルスはヒトのT−リンパ趨向性ウイルスHTLV−iii、ヒ トのT−白血病ウイルスHTLV−ii又はヒトのT−白血病ウイルスHTLV −1である、請求の範囲第8項記載のキット。 11.レトロウイルスはヒトのT−リンパ趨向性レトロウイルスCBL−1又は ヒトのT−リンパ趨向性レトロウイルスHTLV−iiiであり且つ免疫グロブ リンはエイズレトロウイルスに無症状的に感染しているが正常な免疫グロブリン 水準を有しているヒトの患者からのものである、請求の範囲第8項記載のキット 。 12.顕示標識は酵素標識である、請求の範囲第8〜11項記載のキット。 13.担体に結合させたグロブリンはレトロウイルス抗原に結合するそノクロー ナル抗体である、請求の範囲第8〜12項記載のキット。14.エビトロジー的 にエイズに関連するヒトのT−リンパ趨向性レトロウイルスCBL−1。 15.ヒトのT−リンパ趨向性レトロウイルスCBL−1を生息させる白血病の T−細胞CCRF−CEM。 16.それ自体が不活性固体担体に対して結合しているグロブリンに対して結合 させた不溶化したヒトのT−リンパ趨向性レトロウイルスCBL−1抗原。 17.グロブリンは既に無症状的にエイズに感染しているが正常な免疫グロブリ ン水準を有するヒトの患者からのものである、請求の範囲第16項記載の不溶化 した抗原。 18.グロブリンはレトロウイルス抗原に結合するモノクローナル抗体である、 請求の範囲第16項記載の不溶化した抗原。 19.実質的に実施例の何れか一つに関連して既述したような請求の範囲第1項 記載の検定方法。 20.実質的に実施例の何れか一つに関連して既述したような請求の範囲第8項 記載の試験キット。 21.実質的に実施例の何れか一つに関連して既述したような請求の範囲第16 項記載の不溶化した抗原。
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