JPS62501121A - ヌクレオチド配列を検出するためのサンドイッチハイブリッド形成改良法 - Google Patents
ヌクレオチド配列を検出するためのサンドイッチハイブリッド形成改良法Info
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- JPS62501121A JPS62501121A JP61500386A JP50038685A JPS62501121A JP S62501121 A JPS62501121 A JP S62501121A JP 61500386 A JP61500386 A JP 61500386A JP 50038685 A JP50038685 A JP 50038685A JP S62501121 A JPS62501121 A JP S62501121A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ヌクレオチド め”11 るためのサンドイーチハイブリード/−゛
4駐」1
本発明はDNA配列とRNA配列の両方を含むヌクレオチド配列の検出に関する
。
1及亙又豆上3
例えば臨床的に得たサンプルまたは標本のようなサンプル中の特定のRNAまた
はDNAの存在(または不在)を検出できることは人類にとって非常に有利であ
ると思われる。しかし、既存の検出方法は極度に時間のかかる上に非常に労力を
要するものであるので。
非常に限定された規模で用いられるものであった。さらに、多くの場合に感度も
不利に低い0例えば、一般に用いられる1つの方法では、適当な制限エンドヌク
レアーゼによってサンプルを消化し1次にゲル電気泳動によるサイズ分画化を行
い、サイズ分類した両分をゲルからニトロセルロースまたはその他の適当な膜に
移し、放射能標識プローブ(通常、32P標識プローブ)とハイブリッド形成さ
せ、最後にオートラジオグラフィすることによって、複雑な混合物における特異
的なりNA配列を検出する。このような方法は固有に面倒であり、自動操作に適
していない、また、非常にしばしば、股上に移す被膜DNAまたは他のヌクレオ
チド配列の量が非常に少なく、ハイブリッド形成後に検出可能なシグナルを得る
には、高度に放射性のプローブを用いなければならない、このことは処理の見地
からち、また選択した放射能標識(すなわち、P)が比較的短い半減期であり、
ストック試薬としての使用に不適切であるという見地からも不利である。
上述の方法に替り得る方法が、Dunn A、 R,とHassellJ、 A
、がCe1l 12巻、23〜2B頁(+977)に発表したサンドイッチハイ
ブリッド形成法である。この方法では、被検ヌクレオチドを含むサンプルを膜(
例えば、ニトロセルロースフィルター)に固定した相補的フラグメントと接触さ
せて、被検配列を1次ハイブリッド形成段階でこのフラグメントとハイブリッド
形成させ、標識プローブによる二次ハイブリッド形成段階に利用する非ハイブリ
ッド化末端部を残しておく。
ヨーロッパ特許第0079139号では、上記のサンドイッチハイブリッド形成
方法をサンプル中の微生物の確認に利用することが提案されている。この提案に
よると、被検微生物からの一重鎖核酸配列を含むサンプルを問題の微生物のゲノ
ムから得た2個の−′?、鎖フラグメントと直接または組換えDNA法によって
接触させる。これらのフラグメント被検配列の異なる位置に相補的に結合しく相
互にではなく)、1つは固体キャリア(好ましくはニトロセルロースフィルター
)に固定され、他方は標識されている。放射能標識以外の標識によるラベリング
も示唆されるが、放射71標識(特に125■による標m)のみが開示されてい
る。被検−重鎖核酸配列が存在する場合には、被検配列は固定フラグメントと標
識フラグメントの両方によってハイブリッド化し、標識フラグメントがキャリヤ
に結合して、オートラジオグラフィによって検出される。このようにして、その
−重鎖配列の入手源である微生物が明確に確認されることになる。
サンドイッチハイブリッド形成法は最初に述べた方法を凌駕する利点を有するが
、特にニトロセルロースフィルターまたはその他の膜上に固定され得る核酸の量
が制限され、全く限定されるために、固有の欠点がまだ残されている。特定の場
合に、このことがこの検出法の速度と感度の両方を限定する。また、特に二次段
階におけるハイブリッド形成効率が非常に低く、この方法の感度をさらに減じて
いるように思われる。
ヨーロッパ特許第0070887号では、固定したサンプルの一重鎖ボリヌクレ
オチドとのハイブリッド形成のために光標識−重鎖ポリヌクレオチド試薬を用い
るハイプリー2ト形成診断方法が提案されている。固定したサンプルの一重鎖ポ
リヌクレオチドに対して、活性化したガラスピーズ、ポリアクリルアミド、アガ
ロースまたはセファデックスビーズおよびセルロースを含めた1種々な固体サポ
ートが示唆されている。サンプルのポリヌクレオチドをサポートに結合する方法
としては、発表されている文献を広く参照して、種々な方法が示唆されており、
例えば、Enzymology XXXIV巻、パー トB、 4Ei3〜47
5頁(1874)オヨびXLIV巻、・859〜886頁(1976)の方法が
示されているが、操作方法の特別な実施例は記載されていない、光標識したポリ
ヌクレオチド試薬とのハイブリッド形成のために必要なサンプルポリヌクレオチ
ド部分とは異なる。サンプルポリヌクレオチド部分と相補的な、固定した一次一
重鎖ボリヌクレオチド試薬とサンプルをハイブリッド形成条件下で接触させるこ
とによって、サンプルの一重鎖ポリヌクレオチドが固定されることも示唆されて
いる(いわゆるサンドイッチハイブリッド形成法)、この場合にも、この方法す
なわち一次ボリヌクl/オチド試薬を最初にサポートに付着させる方法の特別な
実施例は記載、されていない。
先九五11
本発明の1態様によると、固定した核酸フラグメントのキャリヤとしてマクロ孔
質樹脂の固体粒子またはビーズを用いることによって、サンドインチ/Xイブリ
フト形成反応の特に二次段階の速度と効率が実質的に高められ、感度が非常に改
良された、核酸フラグメンI・の検出方法を提供できることが発見された。特に
セファクリルのような、架橋したマクロ孔質樹脂の粒子またはビーズの使用がポ
リヌクレオチド試薬のサポートに対する共有結合を実質的に改良するように[、
!L+、われる。
本発明の第二態様では、異常なヒト(踵状赤血球)β−グロビン遺伝子を検出す
るための特に敏感な方法を開発した。この方法は固体の樹脂粒子またはビーズに
共有結合した固定ポリヌクレオチド試薬と正常な遺伝子の制限エンドヌクレアー
ゼ処理によって得られた、異常な遺伝子のDde 1消化物内に含まれる、異常
な(踵状赤血球)β−グロビン遺伝子に特徴的なβ−グロビン遺伝子の第六コド
ンの単一塩基変化を含む制限フラグメントの異なる部分に対して、相補的なポリ
ヌクレオチド配列から成る第二標識ポリヌクレオチド試薬とによって、異常な遺
伝子のDde X消化物をサンドイッチハイブリッド形成するものである。
従って、本発明によると、サンプル中の特定の核酸配列を検出する方法であって
、サンプルをハイブリッド形成条件下で、被検配Aの1部と相補的な配列を含む
一重鎖核酸フラグメン)・を固定した固体粒子またはヒースから成る第一試薬と
、固定されたフラグメントとは非相補的な、被検配列の異なる部分に対して相補
的な配列から成る標識−重鎖核酸フラグメントから成る第二試薬とに接触させ、
それによって両試薬とハイブリッド形成した、被検配列から成るハイブリッド形
成二重体を形成し、このハイブリッド形成二重体を残りの非結合標識から分離し
、ハイブリッド形成二重体に結合した標識の存在(もし存在する場合には)を検
出することから成る方法を提供する。
正直立1」
本発明の方法に用いる第一試薬は核酸フラグメントの反応性基(例えばアミ7基
)と固体粒子内または固体粒子上の反応性基との間の共有結合によって、固体粒
子またはビーズ上に固定された一重鎖核酸フラグメントから成るものであること
が好ましい。このために本発明の方法に用いる好ましい固体粒子は、ポリマー鎖
に結合した反応性基(例えばアミンまたはヒドロキシル基)を有する天然または
合成のポリマーから成るポリマービーズである。最も好ましいものは、商品名5
ephadexおよびCe1laxで収光されているような、セルロースポリマ
ービーズおよび特に、5epharaseおよび5ephacryl のような
マクロ孔質セルロース材料である。
このようなポリマービーズに核酸フラグメントな共有結合させる方法としては、
末端ホスフェート基を介したカルボジイミドとの結合および臭化シアンを介する
結合を含めて1種々の方法が存在し5.知られている。しかし、ポリマーマトリ
ックスに結合した芳香族アミン基のジアゾ化による結合が特に挙げられる。この
方法はNucleic Ac1d Res、(1882) 10巻、22号、1
789〜1810頁と7163〜7196頁に詳細に述べられている。
ポリマービーズは5〜50ミクロン、特に10〜20ミクロンの範囲の粒度を有
するものが好ましい。
本発明の方法に用いる第二試薬を得るための−・重鎖核酸フラグメントの標識に
関しても同様に種々な方法が存在し、知られている。 Pおよび Iのような放
射性同位体による標識についてはすでに述べたが、これらの標識は本発明に用い
ることができる。しかし、本発明によると高感度が実現されるために、これらよ
りも低放射性の同位体、特にトリチウムが標識として用いられると考えられる。
さらに、非放射性標識、例えば酵素、蛍光および化学発光による標識も適してお
り、多くの場合に好ましいと考えられる。
試薬を調製し、これらの試薬をキットとして利用することを考えるならば、本発
明の方法は特に実施が簡単になり、自動装置または半自動装置に適合しやすくな
ると思われる。被検制限フラグメントと2種類の試薬をハイプリント化すること
から成るハイブリット化゛二毛体の形成を可能にし1′)るような条件下で、2
種類の試薬とサンプルを同時にまたは連続的に混合することだけが、木質的に必
要である。ハイブリッド形成は迅速であり、ヨー口・ンパ特許第0078138
号のサンドイッチハイブリッド形成方法に比べて、第一(固定)試薬と第二(標
識)試薬の両方を単に使用量を増加させるだけで無限に過剰に用いることができ
るので、結合する標識量を最大化して、次の検出のために最大のシグナルを与え
ることができる。従って、本発明の方法は高感度であるが、この感度は実際に無
限に可能である試薬の濃度によって決定されるのではなく、サンプル中の被検配
列の濃度によって決定される。このことはヨーロッパ特許第0079139号の
方法と明らかに対照的である。このヨーロッパ特許の方法では、固定試薬の濃度
が限定されており、かなり低いために、二重体に結合する標識量ち同様に低く、
この標識量は固定試薬のψよりも通常はるかに過剰に存在するサンプル中の被検
配列の量によって決定されるのではなく、固定試薬の樋によって決定される。本
発明の方法では、サンプル中に存在する被検配列のかなり高い割合がハイブリッ
ド化され、その結果として標識されることになる。このことだけではなく、すで
に述べたように、例えばセルロースニトレートのフィルターまたは膜に対照する
ものとして、ビーズをキャリアとして用いるハイブリッド形成反応の効率が実際
に、意外に上昇する。
本発明の方法に用いるサンプルは固定すべきポリヌクレオチドフラグメント(複
数の場合も)を−重鎖型で含む精製したおよび/または分画化したサンプルであ
るが、被検゛配列をサチンブロッティング法のように、標識前にサンプルから分
離する必要がないことは、本発明の大きな利点である。従って、本発明によると
、例えばDNAまたはRNAを含む臨床サンプルのような、オリジナルサンプル
の制限エンドヌクレアーゼにより消化し、次に変性によって制限フラグメントを
一重鎖型に変えることによって得られるポリヌクレオチドの粗混合物中の特定の
ポリヌクレオチドを検出することも可能である。
ハイブリッド形成後に、標識されたハイブリッド形成二重体を支持するポリマー
ビーズまたはその他の粒子を例えば遠心分離および洗浄によって、結合していな
い過剰の標識から分離し、結合標識の存在を適当な方法で、例えば放射能標識の
場合にはシンチレーションカウンターによって、酵素標識の場合には酵素活性に
よってまたは蛍光もしくは化学発光標識の場合には光検出手段によって検出する
。
本発明の方法は、サンプル中の特定の核酸(DNAまたはRNA)配列を迅速に
確認できるために、広範囲な用途を有している。従って本発明の方法はサンプル
中の病原性微生物、遺伝子異常等の確認ならびに遺伝子地図作成の簡単化に用い
ることができる。特別な用途の実例を挙げると、鎌状赤血球疾患の検出である。
鎌状赤血球疾患はヒトβ−グロビン遺伝子の第六コドン中の単一1訂基突然異
変(A−T)によって生ずる。第六コドン中のGAGからGTGへのこの変化が
、生成するヘモグロビンの遺伝子によってコード化される性質を変え、グルタミ
ンではなくバリンが蛋白質中に挿入されるばかりでなく、β−グロビン遺伝子の
5′末端にDde IとMstl+認識部位の欠損が生ずることになる。このこ
とは、β−グロビン遺伝子の5゛末端におけるD’delとHinfI部位の制
限地図である添付図面に図示する。そのため、異常なしく組状赤血球)β−グロ
ビン遺伝子のDd’el消化によって、正常なβ−グロビン遺伝子のDde I
消化によって生ずる201bp(フラグメントβ)と180 bp (フラグメ
ントC)の2種類のフラグメントとは対照的に、単独の連続長さにフラグメン)
BとCの両方を含ム$−y381bpフラグメントが生ずる。フラグメントBま
たはフラグメン)Cのいずれかをポリマービーズに固定し、他方を標識する前述
の方法を用いると、サンプル中の異常な組状赤血球の存在を迅速に検出できる2
種類の試薬が提供される。Dde Iによる正常なβ−グロビン遺伝子の消化は
2種類のフラグメントを生ずるが、このいずれも2種類の試薬と「サンドイッチ
」を形成しない、これにダして、Dde Tによる異常な(組状赤血球)β−グ
ロビン遺伝子の消化は2種類の試薬と「サンドイッチ」を形成し得る単一のフラ
グメントを生ずる。Dde I消化物をハイブリッド形4条件下(すなわち、消
化物を変性した後に)で2種類の試薬と接触させると、異常な(組状赤血球)β
−グロビン遺伝子が標識と結合し、陽性のシグナルを発するが、正常なβ−グロ
ビン遺伝子はこれをしない。
実際の実験では、HinflによるプラスミドβF5の消化によって上述の方法
を行った。プラスミドβF5はベクターPATI53の単独Ham 81部位に
クローン化したヒトβ−グロビン遺伝子の1.9Kb Bam H1制限フラグ
メンI・を含む、 Hinf lによるプラスミドβF5の消化によって、3.
41 Kbフラグメント(フラグメントA)を生じ、これは消化産物から電気泳
動および電気溶出によって回収される。
変性後に、341 Kbフラグメントを5eed B、がNucleicAci
d Res、 10巻、17911−1810頁(1982)に述べているジア
ソ化方法を用いて、マクロ孔質セルロースポリマービーズ(Sephacryl
S 500)に固定させた。
第二操作では、プラスミドβF5をMSt IIによって消化させて、201
bpフラグメント(フラグメントB1図1参照)を生じ、同様に消化物から回収
した。
次に、フラグメントBをRegby等(+97?)がJ、 lI!of、 Bi
ol。
113巻、237〜251頁に述べている方法を用いた二・ンク・トランスレー
ションによつも1.5 XIOcpIIl 用g−1の比活性になるまで32P
で標識した。
他の2回の操作で、プラスミドβF5をDde IとHam HIによって消化
させた。Ddelによる消化では、フラグメントAとBによって「サントイ・ン
チ」/\イブリッド形成することのできない短いフラグメントが生ずるが、Ba
g Hlによる消化では「サンドイッチ」ハイブリッド形成することのできる単
一の長1.)フラグメントが生ずる。各場合に、消化の後に変性を行って、−@
fQ D N Aフラグメントを得た。
本発明の方法によってサンドイッチl\イブリッド形成を行う前に、固定したフ
ラグメントAを1m文の40 m M PIPES(p)!8.5)、1mM
EDTAo、814NaCEL、0.1%SDSと250ggm1 の音波処理
した変性サケ***DNA中で65°Cにおいて1晩、プレノーイブ1ノツト化し
た。プレ/\イブリッド形成後しこ、変性したDde IまたはBamHIβF
5消化物のいずれかを固定341 bpフラグメントAおよび標識201bρフ
ラグメントBと同緩衝液50g文中で混合し、混合物を1晩放置することによっ
て、サンドイッチ/\イブリ・ンド形成を行った2次に、ビーズを分離し、サケ
***DNAを含まない同緩衝液1mMによってそれぞれ85°Cにおいて3回、
lO分間洗節してから、計数した。この結果は表1に示す。これらの結果は、1
00 attamole(10−’モル)以上のプラスミドβF5量では、Ba
m H1消化物とDde E消化物との間に明確な区別があることを明らかに示
している。表1に記載した数値では、rサンドイッチ充填」を省略した、または
この代りに音波処理したウシ胸腺DNAを用いた場合に得られた低いバックグラ
ンド値を控除していない。
表−一ユ
他の実際の実験では、固定した341 bpフラグメントAと標識した201b
Pフラグメンl−Bを用いた上記サンドイッチハイブリッド形成法を、正常な患
者とホモ接合体鎌状赤血球患者の両方からのヒ)DNAのDde I消化物eo
atto請oleを用いてくり返した。結果は明白であった。バックグランド
(Jを控除した後に、典型的な実験は鐘状赤血球DNAに対しては441カウン
ト(10分間)を生じ、正常なりNAに対しては153カウントを生じた、この
ことは本発明の方法が鐘状赤血球DNAの存在の確認に有効であることを説明し
、立証している。
βF5のBamHIとDde I消化物を混合することによって、踵状赤血球ホ
モ接合体の場合を模倣することも可能である。このような実験では、プラスミド
D N A 100 attomoleを用いてカウント(10分間)を次のよ
うに得て:正常128、ヘテロ接合体296、ホモ接合体745、この方法かへ
テロ接合体ならびにホモ接合体の確認に用いられ得ることを示している。
要約すると、本発明の方法は先行技術を凌駕する次のような利点を有している:
1、 本発明の方法は迅速である。電気泳動、プロッティングおよびオートラジ
オグラフィは省略することができる。8時間程度でサンドイッチ/\イブリッド
形成を実施することができる。重力、遠心分離または磁気によるビーズの分離は
数秒を要し、シンチレーションカウンターでの定量は数分間を要するだけである
。実際に、血液採取してから48時間以内に結果が得られ、今後かなりの短縮が
可能であることが示唆されている。
2、 未発明の方法は自動操作することが非常に容易であり、そのために多数の
サンプルを扱うことが特に容易である。
3 本発明の方法は他のDNA標識方法に容易に適合する。
4、 本発明の方法は短い制限フラグメントによっても長いフラグメントによる
と同様に良好に作用し、オリゴヌクレオチドの使用に容易に適合する。このこと
は可能な用途数を非常に増大する。
5、膜は限られた(低い)DNA結合容量を有するが、本発明の方法では固定さ
れたDNAと標識されたDNAの川を単に増すことによって、大量のDNAを容
易に処理することができる。このことは分析の感度を高める、または比活性の低
い標識DNAを用いる可能性またはハイブリッド形成時間をさらに短縮する可能
性を提供している。
これらの利点によって、ヒト、動物および植物における。細菌、ウィルスおよび
遺伝的障害の確認と特徴化のために今後、ルーチンの検査室が組換えDNA法を
迅速に適用できるようになると考えられる。
図面の簡単な説明
間際調査報告
、=−、−11,、、、、、、、、、、++、111pc’r/cB85100
591ANNEX To THE INT口せIAτl0NAL 5EARCH
REPORT 0NINTERNATIONAL APPLICATION N
o、 PCT/GB 85100591 (SA 11720)1N表昭62−
501121 (8)
Claims (18)
- 1.ハイブリッド形成条件下でターゲットポリヌクレオチドを次の要素: (a)被検配列の第一部分と相補的であり、前記条件下で前記第一部分とハイブ リッド形成可能な一重鎖ヌクレオチド配列から成る固定ポリヌクレオチド、およ び (b)被検配列の第二の異なる部分と相補的であり、前記条件下で前記第二の異 なる部分とハイブリッド形成可能な、マーカーによって標識された一重鎖ヌクレ オチドから成る標識ポリヌクレオチドプルーブと接触させることによって、固定 ポリヌクレオチド、ターゲット、ポリヌクレオチドおよび標識ポリヌクレオチド から成る固定ハイブリッド形成二重体を形成し、固定二重体を分離し、二重体上 のマーカーの存在を検出することから成る、ターゲットポリヌクレオチド中の特 定ヌクレオチド配列の検出方法であって、前記固定ポリヌクレオチドとして架橋 したマクロ孔質樹脂の固体粒子またはビーズに共役結合した前記一重鎖の相補的 ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを用いることから成る改良方法。
- 2.ハイブリッド形成条件下でターゲットポリヌクレオチドを次の要素: (a)被検配列の第一部分と相補的であり、前記条件下で前記第一部分とハイブ リッド形成可能な一重鎖ヌクレオチド配列から成る固定ポリヌクレオチド、およ び (b)被検配列の第二の異なる部分と相補的であり、前記条件下で前記第二の異 なる部分とハイブリッド形成可能な、マーカーによって標識された一重鎖ヌクレ オチドから成る標識ポリヌクレオチドプルーブと接触させることによって、固定 ポリヌクレオチド、ターゲットポリヌクレオチドおよび標識ポリヌクレオチドか ら成る固定ハイブリッド形成二重体を形成し、固定二重体を分離し、二重体上の マーカーの存在を検出することから成る、ターゲットポリヌクレオチド中の特定 ヌクレオチド配列の検出方法であって、前記固定ポリヌクレオチドとして、架橋 したマクロ孔質セルロース材料から成り、5〜50μ範囲の粒度を有する固体粒 子またはビーズに共有結合した前記一重鎖の相補的ヌクレオチド配列を含むポリ ヌクレオチドを用いることから成る改良方法。
- 3.固定ポリヌクレオチドが樹脂上の反応性基とポリヌクレオチド上の遊離アミ ノ基との間のジアゾ化反応によって、樹脂粒子またはビーズに共有結合する請求 の範囲第2項記載の方法。
- 4.固定ポリヌクレオチドがポリヌクレオチドの5′末端におけるホスフエート 基と樹脂上の反応性基との間のカルボジイミド結合によって、樹脂粒子またはビ ーズに共有結合する請求の範囲第2項記載の方法。
- 5.ポリヌクレオチドプルーブが放射性マーカーまたは標識を含む請求の範囲第 2項記載の方法。
- 6.ポリヌクレオチドプルーブが酵素マーカーまたは標識を含む請求の範囲第2 項記載の方法。
- 7.固定ポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドプルーブが制限エンドヌクレ アーゼポリヌクレオチドフラグメントである請求の範囲第2項記載の方法。
- 8.異常なヒト(鎌状赤血球)β−グロビン遺伝子の検出方法であって、遺伝子 をDdeI制限エンドヌクレアーゼによって消化させて、異常な遺伝子の特徴で ある異常な第六コドン含有381bp制限フラグメントを1成分として含む制限 消化物を得、前記フラグメントを含む消化物をハイブリッド形成条件下で次の要 素: (a)前記フラグメントの第一部分とハイブリッド形成可能である、固体樹脂粒 子またはビーズと共役結合した固定一重鎖ポリヌクレオチド、および (b)前記フラグメントの第二部分とハイブリッド形成可能な標識一重鎖ポリヌ クレオチドプルーブ(前記一重鎖ポリヌクレオチドプルーブと前記標識一重鎖ポ リヌクレオチドの1つは前記381bpフラグメントの第一部分と相補的な、正 常なヒトβ−グロビン遺伝子のDdeI消化によって得た、または得られる18 0bpポリヌクレオチド配列である、または180bpポリヌクレオチド配列を 含むものであり、他方は前記381bpフラグメントの第二の異なる部分と相補 的な、正常β−グロビン遺伝子のDdeI消化によって得た、または得られる2 01bpフラグメントである、または201bpフラグメントを含むものである )と接触させ、固定一重鎖ポリヌクレオチド、前記制限フラグメントおよび前記 標識ポリヌクレオチドプルーブから成る、化成した固定ハイブリッド形成二重体 を分離して、固定ハイブリッド形成二重体上のマーカーの存在を検出することか ら成る方法。
- 9.前記180bpポリヌクレオチド配列が正常なヒトβ−グロビン遺伝子のH infI消化によって得た、または得られる341bpフラグメントの1部であ る請求の範囲第8項記載の方法。
- 10.場合に応じて、前記180bp配列から成る、またはこれを含むポリヌク レオチドと、前記201bpフラグメントから成るポリヌクレオチドがプラスミ ドドβF5のエンドヌクレアーゼ制限によって得られるものである請求の範囲第 8項記載の方法。
- 11.固定一重鎖ポリヌクレオチドが架橋したマクロ孔質セルロース樹脂のビー ズまたは粒子に共有結合する請求の範囲第10項記載の方法。
- 12.第一要素としての、被検ヌクレオチド配列の第一部分と相補的な一重鎖ポ リヌクレオチド配列が共役結合した、架橋マクロ孔質樹脂の固体粒子またはビー ズから成る固定ポリヌクレオチド試薬と、第二要素としての、被検ヌクレオチド 配列の第二の異なる部分と相補的で、マーカーによって標識された、一重鎖ヌク レオチド配列から成るポリヌクレオチドプルーブから成る、ターゲットポリヌク レオチド中の特定ヌクレオチド配列を検出するための診断用キット。
- 13.第一要素としての、第一の一重鎖ポリヌクレオチド配列が共有結合した固 体の樹脂粒子またはビーズから成る固定ポリヌクレオチド試薬と、第二要素とし ての、マーカーで標識した第二の一重鎖ポリヌクレオチド配列から成る、ポリヌ クレオチドプルーブから成る、異常なヒト(鎌状赤血球)β−グロビン遺伝子を 検出するための診断用キットであって、前記配列の1つが正常なヒトβ−グロビ ン遺伝子のDdeI消化によって得られた、または得られる前記180bpポリ ヌクレオチド配列である、またはこの配列を含むものであり、他方が正常なβ− グロビン遺伝子のDdeI消化によって得られた、または得られる前記201b pフラグメントである、またはこれを含むものである診断用キット。
- 14.前記180bpポリヌクレオチド配列が正常なヒトβ−グロビン遺伝子の HinfI消化によって得られた、または得られる341bpフラグメントの1 部である請求の範囲第13項記載のキット。
- 15.場合に応じて、前記180bp配列から成る、またはこれを含むポリヌク レオチドと、前記201bpフラグメントから成るポリヌクレオチドがプラスミ ドβF5のエンドヌクレアーゼ制限によって得られる請求の範囲第13項記載の キット。
- 16.前記第一の一重鎖ポリヌクレオチド配列が架橋マクロ孔質樹脂の粒子また はビーズに共役結合する請求の範囲第13項記載のキット。
- 17.ポリヌクレオチドプルーブが酵素によって標識されたものであり、さらに 第三要素として、酵素標識プルーブを検出するための前記酵素の基質から成る手 段を含む請求の範囲第12項記載のキット。
- 18.ポリヌクレオチドプルーブが酵素によって標識されたものであり、さらに 第三要素として、酵素標識プルーブを検出するための前記酵素の基質から成る手 段を含む請求の範囲第13項記載のキット。
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