JPS62500656A - ヒト白血球インタ−フェロンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト白血Ｌインターフェロンの製造方法性発明の分野 本発明は生物工業の分野に、さらに詳細にはヒト血液の白血球からのインターフ ェロンの製造方法に関する。

デキストランを用いた全血の赤血球の凝集による白血球の回収、白血球含有血漿 の分離、遠心分離による血漿の細胞画分の沈殿、塩化アンモニウムを用いた残存 の赤血球の溶血、普通培地中への白血球沈殿の再懸濁、インターフェロンの生合 成および所望生成物の回収を含むヒト白血球インターフェロンの製造方法が当業 者に知られている〔ソロ・ヴイエフ・ブイ−。ディ＋＋、（ｓｏｌｏ　ｖｉｅｖ 　Ｖ、Ｄ、）　、ベクテミロフ・ジー。

ニー、（Ｂｅｋｔｅｍｉｒｏｖ　Ｇ、Ａ、）　ｒインターフェロン・イン・メデ ィカル・セオリー・アンド・プラクティス（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　ｉｎＭｅｄ ｉｃａｌ　Ｔｈｅｏｒｙ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　）　Ｊ　、モスクワ、１ ９７０年参照〕この従来技術の方法によって得られる所望生成物の収率は高いも のではなく、処理血液１２当りｌＸｌ０６１Ｕ以下である。これは白血球の回収 に用いられる方法の結果として白血球の活力が低下することに関連していると考 えられる。さらに、白血球の分離後に形成される血漿は一層の処理に使用するこ とができない。なぜならば、その血漿はデキストランを含んでいるからである。

血液の遠心、白血球の分離、インターフェロンの生合成および所望生成物の回収 によるヒト白血球インターフェロンの製造方法も当業者に知られている〔カラピ ネン・エイチ、−ニー、（Ｋａｕｐｐｉｎｅｎ　Ｈ，−ＩＪ、　）　、ミリレ・ ジー（Ｍｙｌｌｙｌｉ　Ｇ、）「ヒユーマン・インターフェロン（Ｉｌｕｍａｎ 　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）　Ｊ、６．１９７８年、１〜１３頁〕。

この従来技術の方法によって得られる所望生成物の収率は上記した方法によって 得られる収率より高く、処理血液の単位容積当り４Ｘ１０６１０に達する。さら に、白血球の分離後に得られる血漿は一層の処理にまたは代用血液として患者へ の輸血に用いることができる。

それにもかかわらず、この従来技術の方法によって得られる所望生成物の収率は 十分に高いものではない。なぜならば、供血者の血液の遠心分離後に「バラライ コート」採取によるインターフェロン生産性細胞の回収に用いられる方法におけ るインターフェロン生産性細胞の数は供血者の血液中に含まれていた白血球の数 の１５％以下を構成するからである。

ユニ優冊丞 本発明は、ヒト白血球性インターフェロンの製造方法において、より高収率の所 望生成物を生ずるような白血球の単離方法を提供しようとするものである。

この目的は、血液の遠心、白血球の分離、インターフェロンの生合成および所望 生成物の回収を含むヒト白血球性インターフェロンの製造方法において、本発明 に従って血液遠心を１　、５００〜５．０００　ｇで行なうことおよび白血球の 分離について白血球含有赤血球塊の上部容積の１５〜７５％を集めることによっ て達成される。

遠心から得られる白血球含有赤血球塊において、白血球は全容積内に分布してお り、単位容積中の白血球の含有量はバラライコートからの距離が増せば増す程減 少する。この理由のため、本発明に係る白血球の分離方法は供血者の血液中に含 まれている白血球の回収部分をかなり増大させることが可能であり、このように してインターフェロンの生合成において高収率のインターフェロンの生産が可能 である。

白血球含有赤血球塊の集められる上部の容積は、遠心に使われる加速度値の関数 としての容積内の白血球濃度の分布の特性に依存している。

収集容積が約１，５００ｇの加速度値における白血球含有赤血球塊の上部の７５ ％を越える場合には、溶血する赤血球の量が急激に増加して結局、所望生成物の 収率が減少する。

収集容積が約５，０００ｇの加速度値における白血球含有赤血球塊の上部の１５ ％より少ない場合には、白血球の収率は激しく低下し、従って所望生成物の収率 が低下する。

１．５００ｇより小さい加速度での供加、者の血液の遠心は、赤血球塊の上部に 高濃度の白血球を得るために遠心時間のかなりの延長を必要とし、その結果所望 生成物の収率が低下する。

供り者の血液が５．０００　ｇより大きい加速度で遠心に付される場合には、白 血球が破壊され、この結果同様に所望生成物の収率が低下する。

光凱血失將するための最良の態様 本発明に係るヒト白血球インターフェロンの製造方法は以下のように実施する。

供、如−者の血液を、安定剤を含有する容器内に集める。収集後直ちに、血液を 遠心して赤血球塊から血漿を分離する。血漿を除去した後、赤血球塊の上部１５ 〜７５％の容積を集めそして、これを塩化アンモニウムの溶液中に再懸濁して赤 血球の溶血を行なう。この混合物を遠心して白血球の残渣を分離する。得られた 白血球残渣を、ヒト血清含有普通培地中に再懸濁する。

次いで、普通培地中に再懸濁した白血球を少量のヒト白血球インターフェロンで 処理する。得られた白血球の“懸濁液に誘導源であるニューカッスル病ウィルス またはセンダイウィルスを添加してインキュベーションを行なう。インキュベー ション期間の終了後、この）懸濁液にヒト血清を含有する新たな普通培地を添加 しインキュベーションを継続する。インターフェロンの生合成のために、必須成 分としてヒト血清を含む任意の合成普通培地を用いることができる〔イーグルＭ ＥＭ、ＲＰＭＪ　１６４０　、マツコイ（ＭｃＣｏｙ）培地等〕。

インキュベーション期間の終了後、遠心によってインターフェロンの生産者であ る細胞から培養液を分離する。細胞の沈殿を分離し、そして培養液を酸性媒体中 に保って誘導者であるウィルスを不活性化した後、この液体を用いてインターフ ェロンの力価の測定を行なう。

本発明を説明するいくつかの特定の実施例を以下に与える。

実施例１ 供血者の血液を、安定剤を含有するプラスチック類のバッグ中に集める。収集後 直ちに、この血液を４°Ｃの温度において３，０００ｇで遠心して赤血球塊から 血漿を分離する。血漿を除去した後、赤血球塊の上部７５％を集め３容積の０． ８３％Ｎｌ＋４．Ｃ６中に再懸濁する。この混合物を５００ｇで遠心してその沈 殿を分離する。得られた細胞沈殿を１０容積の０．８３％Ｎｌｌ、Ｃ６中に再懸 濁し１５０ｇで遠心する。

このようにして得られた白血球の沈殿を、４％のヒト血清を含有するイーグルＭ ＨＩ’ｌ普通培地に１０’細胞／ｍｌｌの最終２３度に再懸濁する。白血球の収 率は血液１１当り５．ＯＸ　１０９細胞、すなわち全血中のその含有量の８０％ である。

イーグル肛門普通培地中に再懸濁した白血球を３７°Ｃの温度で２時間２００ｒ Ｕ／ｍＪのヒト白血球インターフェロンで処理する。次いで、この白血球の懸濁 液に誘導源であるニューカッスル病ウィルスを１ｍ７！当り２０血球凝集単位の 量で添加して、３７℃の温度でさらに１時間インキュベーションを行なう。この 期間の終了後、細胞に吸着されていないウィルスを６００ｇの遠心によって分離 する。得られた細胞沈殿を５．５ＸＬＯ６細胞／　ｍ　１の最終濃度にイーグル 肛門普通培地中に再懸濁する。この普通培地は４％のヒト血清を含んでいる。こ の細胞のＱ？ａ液を３７℃の温度で撹拌下に２０時間インキユヘーションする。

このインキュベーションの終了後、１，５００ｇの遠心によって生産者である細 胞から培養液を分離する。この細胞残渣を除去し、培養液を４　’ｃの温度で酸 性媒体中に３日間維持して誘導者であるウィルスを不活性化した後、これをイン ターフェロンの力価の測定に用いる。

血液１β当りのインターフェロンの収率ば８Ｘ１０’　ＩＵ供血者の血液を、安 定剤を含有するプラスチック製バッグ中に集める。収集後直ちに、この血液を４ ℃の温度において２．０００ｇで遠心して赤肌球塊から血漿を分離する。血漿の 除去後、赤肌球塊の上部７５％を集め２５容積の０．８３％Ｎ１１４Ｃｆｆ中に 再）懸濁する。この混合物を２５０ｇで遠心する。得られた細胞残渣を３容積の ０．８３％ＮｌＩ４Ｃｌ中に再）懸濁し１５０　ｇで遠心する。

得られた白血球の沈殿を４％のヒト血清を含有するイーグル肝Ｍ普通培地中に１ ０７細胞／ｍβの最終濃度に再！！！濁する。白血球の収率は血液１１当り５Ｘ ＩＯ９細胞、すなわち全血中のその含有量の８０％である。

インターフェロンの８Ａ　！および生合成は前記実施例１に記載の如（に実施す る。

インターフェロンの収率は血）夜１１当り　１．２Ｘ　１０’　Ｉ　Ｕである。

去Ｊ１津１ 供血者の血液を、安定剤を含有するプラスチック製バッグ中に集める。収集後直 ちに、この血液を４°Ｃの温度において２．０００ｇで遠心して、赤肌球塊から 血漿を分離する。血漿の分離後、赤肌球塊の上部７５％を集め５０容積の０．８ ０％ＮＨ，（Ｊ！中に再懸濁する。この混合物を４°Ｃの温度に１０分間維持し そして１５０ｇで遠心する。

得られた細胞沈殿を、４％のヒト血清を含有するイーグル≠ＭＥＭ９ｉｆｆｌ培 地に１０７細胞／ｍβの最終濃度に再）懸濁する。

白血球の収率は血液ＩＡ当り４Ｘ１０９細胞、すなわち全血中のその含有量の８ ０％に等しい。

誘導および生合成の操作は実施例１に記載したと同様に実施する。

インターフェロンの収率は血液１１当り８Ｘ１０’　ＩＵである。

実画１州土 供血者の血液を、安定剤を含有するプラスチック製バッグ中に集める。収集後直 ちに、この血液を４°Ｃの温度において１．５００ｇで遠心して赤肌球塊から血 漿を分離する。血ツタ除去後、赤肌球塊の上部７５％を集め３容積の０．８４％ ＮＨ，ＣＪ中に再懸濁し２，５００ｇで遠心する。得られた白血球の沈殿を２０ 容積の０．８４％Ｎｌｌ、Ｃ４中に再懸濁し１５０ｇで遠心する。

得られた白血球の沈殿を、４％のヒト血清を含有するイーグルＭＥＭ普通培地中 に１０７細胞／ｍｌの最終濃度に再懸濁する。白血球の収率は血液１１当り３Ｘ １０９細胞、すなわち全血中のその総合有量の５０％である。

誘導および生合成の操作は前記実施例１に記載した。と同様にして実施する。

インターフェロンの収率は血液１１当り６Ｘ１０６１Ｕに等しい。

実施例テ 供血者の血液を、安定剤を含有するプラスチック製バッグ中に集める。収集後直 ちに、この血液を４°Ｃの温度において５．０００ｇで遠心して赤肌球塊から血 漿を分離する。血漿の除去後、赤肌球塊の上部１５％を集め３容積の０．８０％ Ｎ）１．（ｊ２中に再懸濁する。この混合物を２５０ｇで遠心する。得られた細 胞の沈澱を１０容積の０．８３％ＮＨ４Ｃｆ中に再懸濁し１５０ｇで遠心する。

得られた白血球の沈殿を、４％のヒト血清を含有するイーグル９通培地中に１０ ７細胞／ｍｆｆの最終濃度に再懸濁する。

白血球の収率は血液１β当り５Ｘ１０’細胞、すなわち全血中のその含有量の８ ０％に等しい。

インターフェロンの誘導および生合成の操作は前記実施例１に記載の如くに実施 する。

インターフェロンの収率は血液１β当り６Ｘ１０’　ＩＵである。

一４′Ｆ例６　（比較例） 供血者の血液を、安定剤を含有するプラスチック製バッグ中に集める。収集後直 ちに、血液を４℃の温度において２，０００ｇの加速度で遠心して赤肌球塊から 血漿を分離する。血漿の除去後、ハソフィ：１−トを集め、安定剤を含有する試 験管内に移す。この混合物を１６０　ｇで遠心して白血球の沈殿を分離する。こ の沈殿を、１０％のヒト血清を含有するイーグル肛門普通培地１０ｍ１中に再懸 濁する。得られた）Ｕ濁液に安定剤を添加して、この懸濁）夜を８容積の０．８ ３％ＮＩ１．Ｃβと混合して赤血球の溶血を行なう。数分後、この混合物を１０ ０　ｇで遠心する。

得られた白血球の沈殿を、新たなイーグ／Ｌ／ＭＥＭ普通培地中に１０７細胞／ ｍｌの最終濃度に再懸濁する。白血球の最終収率は血液１！当り０゜９Ｘ１０９ 細胞、すなわち供血者の血液中の白血球の含有量の１５％に等しい。

インターフェロンの誘導および生合成の操作は前記実施例１に記載したと同様に 実施する。

インターフェロンの収率は血液ＩＡ当り４Ｘ］、０６１Ｕに等しい。

従って本発明に係る方法はインターフェロンの収率をかなり増大させ得るもので ある。

産業上の利用可能性 本発明は医薬工業において最も好都合に用いることができる。

宝　昨　ｊ　査　磐　告

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １．血液の遠心、白血球の分離、インターフェロンの生合成および所望生成物の 単離を含むヒト白血球インターフェロンの製造方法であって、前記血液遠心を１ ，５００〜５，０００ｇの加速度で実施することおよび白血球の分離について白 血球含有赤血球塊の上部容積の１５〜７５％を採取することを特徴とする方法。