JPS6249258A - 液体試料中の各種抗体の免疫定量方法 - Google Patents
液体試料中の各種抗体の免疫定量方法Info
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- JPS6249258A JPS6249258A JP61013598A JP1359886A JPS6249258A JP S6249258 A JPS6249258 A JP S6249258A JP 61013598 A JP61013598 A JP 61013598A JP 1359886 A JP1359886 A JP 1359886A JP S6249258 A JPS6249258 A JP S6249258A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野一
本発明は単数又は複数の抗原に対する各種の型の抗体の
免疫学的定量方法に関する。更に詳細には本発明はIg
M抗体、IgG抗体及び恐らくその他の型例えばIgA
、 ign 、 IgEを含有する液体試料例えば生
物学的・流体の中のIgM抗体の免疫学的定量方法に関
する。
免疫学的定量方法に関する。更に詳細には本発明はIg
M抗体、IgG抗体及び恐らくその他の型例えばIgA
、 ign 、 IgEを含有する液体試料例えば生
物学的・流体の中のIgM抗体の免疫学的定量方法に関
する。
頓才α皮街−幻ll穎県
ヒトがバクテリア又はウィルスに感染し7た場合には該
病原i戒生物の殺滅のために−・般には各種の型の抗体
を産生ずる。
病原i戒生物の殺滅のために−・般には各種の型の抗体
を産生ずる。
木質的に抗体は主としてIgM型抗体であるがやがてI
F、、Gが優勢となり多年にわたり存続する。抗体の
存在をji″Lに測定することば感染の有無の診断にと
って有用でないことが屡々であるけれどもヒトが免疫性
を有するか否か、又は残る特別な型の感染に対して抵抗
性を有するか否かの測定に+9いてかなり価値あるもの
である。しかり、なから最初に形成された抗体即ちIg
)Iが検出され、i、(cに比較された相対的濃度が測
定されるならば、感染が最近起ったものなのか又L71
′古い時期に起ったものなのかを知り得るのである。か
ような測定は例えば各種のバクテリア、プロ1−シア及
びウィルスによる感染が胎児にまで及んだ場合の〒朋妊
娠時において極めて重要である。
F、、Gが優勢となり多年にわたり存続する。抗体の
存在をji″Lに測定することば感染の有無の診断にと
って有用でないことが屡々であるけれどもヒトが免疫性
を有するか否か、又は残る特別な型の感染に対して抵抗
性を有するか否かの測定に+9いてかなり価値あるもの
である。しかり、なから最初に形成された抗体即ちIg
)Iが検出され、i、(cに比較された相対的濃度が測
定されるならば、感染が最近起ったものなのか又L71
′古い時期に起ったものなのかを知り得るのである。か
ような測定は例えば各種のバクテリア、プロ1−シア及
びウィルスによる感染が胎児にまで及んだ場合の〒朋妊
娠時において極めて重要である。
該測定に伴・う困難性はIgGとIgMとの濃度の相違
にある。分子?農度に関してはヒ1〜血清中のIgGは
IgHの例えば10倍以上で存在することが予期される
。Ig)1又はIgGの通常2%以下のIgH抗体又は
IgG抗体の比率が期待され、これは双方の免疫グロブ
リンにとって同様であろう。
にある。分子?農度に関してはヒ1〜血清中のIgGは
IgHの例えば10倍以上で存在することが予期される
。Ig)1又はIgGの通常2%以下のIgH抗体又は
IgG抗体の比率が期待され、これは双方の免疫グロブ
リンにとって同様であろう。
IgGからIgM抗体を区別する多くの方法が文献に記
載されている(参考書: Chantler and
Diment。
載されている(参考書: Chantler and
Diment。
Current 5tatus of 5pecifi
c IgM antibody assays(198
1) 1417+ in Immuno−assays
forthe 80 ’s、 M、 T、 P、 P
ress Lim1ted、 Lancaster。
c IgM antibody assays(198
1) 1417+ in Immuno−assays
forthe 80 ’s、 M、 T、 P、 P
ress Lim1ted、 Lancaster。
Il、 K、 )。
赤血球凝望法(Coombs et at、: Lan
cet (1968)2.1115)を除くすべての方
法は選択された抗体を選択的に吸着するためのi故量滴
定板(microtit、ration plate)
の管又は凹井(wel+)の壁に付着(結合)した抗原
又は抗体に依存する。該管又は門外を洗って望ましから
ぬ免疫グロブリン又は他の存在可能な妨害物を除去しζ
からIBM(又はIgG )抗体を標識する方法を適用
し、かようにして被検抗体量を測定する〔例えば記載文
献(Organon Teknika、 Oss、 H
o1land、 of their“Toxor+0s
tika IgH and T((G Microel
isa″system)を参照されたい)。該方法は゛
多くの手作業I!nち非結合抗体からの結合抗体の物理
的分別、洗浄及び長期間の恒温保持を必要とする。最も
多くの試験法における主な妨害物は“リウマチ因イ(r
heuma−toid factor)”又は”RF″
とよばれる抗体である。該RFは多価抗原と反応したI
P、G又は物理的もしくは化学的過程により凝集したI
gGと結合したIgMであってすべての被検試料中で大
比率に存在する。更に多くの試験法は半定量的であるに
過ぎず即ち試験結果は重量であられされ得ない。
cet (1968)2.1115)を除くすべての方
法は選択された抗体を選択的に吸着するためのi故量滴
定板(microtit、ration plate)
の管又は凹井(wel+)の壁に付着(結合)した抗原
又は抗体に依存する。該管又は門外を洗って望ましから
ぬ免疫グロブリン又は他の存在可能な妨害物を除去しζ
からIBM(又はIgG )抗体を標識する方法を適用
し、かようにして被検抗体量を測定する〔例えば記載文
献(Organon Teknika、 Oss、 H
o1land、 of their“Toxor+0s
tika IgH and T((G Microel
isa″system)を参照されたい)。該方法は゛
多くの手作業I!nち非結合抗体からの結合抗体の物理
的分別、洗浄及び長期間の恒温保持を必要とする。最も
多くの試験法における主な妨害物は“リウマチ因イ(r
heuma−toid factor)”又は”RF″
とよばれる抗体である。該RFは多価抗原と反応したI
P、G又は物理的もしくは化学的過程により凝集したI
gGと結合したIgMであってすべての被検試料中で大
比率に存在する。更に多くの試験法は半定量的であるに
過ぎず即ち試験結果は重量であられされ得ない。
−灸■9月−吟
従って本発明の[1的は従来既知の定量法におldる上
記の諸欠点を改善すると共に少くともひとっ(7)Jj
’i:原に対し、rIXM 、IgG Jj’ff体を
含有すルノ2iならず恐らく他の型の抗体例えばI、、
It 、 1g+1 、1g1シをも含有する液体試料
例えば生物学的流体中のII′りI抗体を著しく迅速に
、60分間以上を要−りすに定量的に測定する免疫試験
法を提供するに在る。
記の諸欠点を改善すると共に少くともひとっ(7)Jj
’i:原に対し、rIXM 、IgG Jj’ff体を
含有すルノ2iならず恐らく他の型の抗体例えばI、、
It 、 1g+1 、1g1シをも含有する液体試料
例えば生物学的流体中のII′りI抗体を著しく迅速に
、60分間以上を要−りすに定量的に測定する免疫試験
法を提供するに在る。
本発明方法はMtl+定に当りTHG抗体から、又は血
清から、又は体内の流体からの【gM抗体の物理的分別
を全く必要とし2(い。更に本方法は例えばIgM抗体
及び他の型の抗体を含む液体試料中の11′−IgH抗
体の量的測定を可能とする。他方法とは異り本発明方法
ば又完全に自動化され得る。
清から、又は体内の流体からの【gM抗体の物理的分別
を全く必要とし2(い。更に本方法は例えばIgM抗体
及び他の型の抗体を含む液体試料中の11′−IgH抗
体の量的測定を可能とする。他方法とは異り本発明方法
ば又完全に自動化され得る。
一定−IjJJ (7)−開−示
本発明に従い上記目的達成のために、抗原の少くともひ
とつに対するIgM 、IBG抗体を含むと共に他の型
のもの例えばT、、A 、 T、D 、 I8Fをも含
む可能+<+のある液体試料をfGに対する抗体と反応
させ、該試料が該抗原のひとつに対するIgA抗体を含
む場合(IgD抗体及びIgR抗体は一般に無視され得
る量で含まれる)にはIgAに対する抗体と反応させる
。微細粒子群例えばラテックス粒子群又は赤血球細胞群
と結合する該抗原及び結合抗原と同型の遊離抗原を主文
において得られた反応生成物に対しyで加え、該微細粒
子群の凝集度又は非凝集度を測定する。IgM抗体量ば
該非凝集微細粒子群量に反比例する。
とつに対するIgM 、IBG抗体を含むと共に他の型
のもの例えばT、、A 、 T、D 、 I8Fをも含
む可能+<+のある液体試料をfGに対する抗体と反応
させ、該試料が該抗原のひとつに対するIgA抗体を含
む場合(IgD抗体及びIgR抗体は一般に無視され得
る量で含まれる)にはIgAに対する抗体と反応させる
。微細粒子群例えばラテックス粒子群又は赤血球細胞群
と結合する該抗原及び結合抗原と同型の遊離抗原を主文
において得られた反応生成物に対しyで加え、該微細粒
子群の凝集度又は非凝集度を測定する。IgM抗体量ば
該非凝集微細粒子群量に反比例する。
本発明の特別態様に従うと、IgGに対する抗体及びT
gAに対する抗体であり得る抗体を加えた後に、及びそ
の結果得られた溶液を恒温保持しまた後に、リウマチ因
子による影響を中和するために、及び抗−rgG抗体及
び遊離抗原により完全には中和されなかったIP、G抗
体にもとづく凝集の強化を阻止するために、凝集したI
gGを添加する。
gAに対する抗体であり得る抗体を加えた後に、及びそ
の結果得られた溶液を恒温保持しまた後に、リウマチ因
子による影響を中和するために、及び抗−rgG抗体及
び遊離抗原により完全には中和されなかったIP、G抗
体にもとづく凝集の強化を阻止するために、凝集したI
gGを添加する。
本発明の特別態様に従えば、生成されたサスペンシコン
中の凝集−又は非凝集−=微細粒子」Y量を、比濁法或
は濁度法(nephelometric or tur
bidi−metric effect)によるか又は
凝集−或は非凝集−粒子故旧算法によって測定する。
中の凝集−又は非凝集−=微細粒子」Y量を、比濁法或
は濁度法(nephelometric or tur
bidi−metric effect)によるか又は
凝集−或は非凝集−粒子故旧算法によって測定する。
本発明は又IgH抗体、IgG抗体及びTgA抗体を含
む液体試料例えば生物学的流体の中のIgG抗体プラス
1.A抗体の免疫定量法に関するものであり、この定量
法によれば該液体試料中のrgM抗体量を一、!=記方
法によって先ず第一に測定し、次に該IgA抗体量を1
.M抗体プラスIgG抗体プラス1(HA抗体の総量か
ら差引き、かようにしてIgG抗体プラスIgA抗体量
を得る。全抗体活性量は例えば抗原被覆ラテックスを抗
体によって凝集さ一ヒる方法にもとづくか又は多くの文
献〔例えばMasson et al、:t”arti
cle Counting Immuno As5
ay(r’AcIA) inMethods in
Enzymology (1981) 、 74゜
106Δcademic Press )の記載のごと
き凝集粒子数計算法にもとづくものである。
む液体試料例えば生物学的流体の中のIgG抗体プラス
1.A抗体の免疫定量法に関するものであり、この定量
法によれば該液体試料中のrgM抗体量を一、!=記方
法によって先ず第一に測定し、次に該IgA抗体量を1
.M抗体プラスIgG抗体プラス1(HA抗体の総量か
ら差引き、かようにしてIgG抗体プラスIgA抗体量
を得る。全抗体活性量は例えば抗原被覆ラテックスを抗
体によって凝集さ一ヒる方法にもとづくか又は多くの文
献〔例えばMasson et al、:t”arti
cle Counting Immuno As5
ay(r’AcIA) inMethods in
Enzymology (1981) 、 74゜
106Δcademic Press )の記載のごと
き凝集粒子数計算法にもとづくものである。
本発明方法の特徴的態様はrgM抗体の凝集活性の制限
にあり、その結果として他の抗体即ちIP、G及び恐ら
(IgAの存在下のIgM抗体の存在■を正確に測定す
る確立された凝集技術の使用にある。
にあり、その結果として他の抗体即ちIP、G及び恐ら
(IgAの存在下のIgM抗体の存在■を正確に測定す
る確立された凝集技術の使用にある。
周知の通りラテックス“Lx”を抗原“AP、” (こ
の抗原は例えば病原性バクテリア又は病原性ウィルスか
らみちびかれ抗体生成へみちびく)で被覆し該L x
A gを細胞44数器へ通過さ□l!ると申−・のl、
xAg粒子群の濃度と正比例するピークを醪える。7g
Mクラス(IgMah)の抗体をLxAgと接触さ・υ
ると該抗体はLxAg凝集を起して遊離のL x A
g粒子数を減するので該LxAgの濃度を減する。この
減少度は被検試料中の全抗体量(IgGAb及びIgA
計及び多分子gAAb)に直接的に正比例する。
の抗原は例えば病原性バクテリア又は病原性ウィルスか
らみちびかれ抗体生成へみちびく)で被覆し該L x
A gを細胞44数器へ通過さ□l!ると申−・のl、
xAg粒子群の濃度と正比例するピークを醪える。7g
Mクラス(IgMah)の抗体をLxAgと接触さ・υ
ると該抗体はLxAg凝集を起して遊離のL x A
g粒子数を減するので該LxAgの濃度を減する。この
減少度は被検試料中の全抗体量(IgGAb及びIgA
計及び多分子gAAb)に直接的に正比例する。
IgGAbを凝集させる物質の添加によってIgGAb
の反応を省略すること、従ってラテックスとの反応から
除去すること、そして単に1.MAhとの反応を残すこ
とが可能であることはギスベン等の記載CG15pen
et al、: C11n、 Pxp、Immuno
logy [1975)22.321)又はシュミツ等
の記載(Schm i tzat al、 : J、
Cl1n、旧croblo1. (1975) 1
゜132〕のように理論的であると思われる。
の反応を省略すること、従ってラテックスとの反応から
除去すること、そして単に1.MAhとの反応を残すこ
とが可能であることはギスベン等の記載CG15pen
et al、: C11n、 Pxp、Immuno
logy [1975)22.321)又はシュミツ等
の記載(Schm i tzat al、 : J、
Cl1n、旧croblo1. (1975) 1
゜132〕のように理論的であると思われる。
IgA (IgAAb)抗体をも又含有する被検液の場
合には該抗体を凝集させる物質の添加によってラテック
スとの反応物から該抗体をも分離し得る。本発明に従い
IgGの全部を分離する特異的試薬としてヤギからの抗
血清を選択する。該抗血清はヒトのIgGのいわゆるF
c域(抗−Pc)は対して指向されていてヒ1〜のIg
G抗体をi!択的に64集するものとして公知である。
合には該抗体を凝集させる物質の添加によってラテック
スとの反応物から該抗体をも分離し得る。本発明に従い
IgGの全部を分離する特異的試薬としてヤギからの抗
血清を選択する。該抗血清はヒトのIgGのいわゆるF
c域(抗−Pc)は対して指向されていてヒ1〜のIg
G抗体をi!択的に64集するものとして公知である。
ジチオスレイトール(D T T)はIgG抗体を破壊
しないがこのrlTTとの処理によ−2て全IgH抗体
を不活性化すると1、xAg(711凝集が達成される
が但U7その程度はより少い。IgG抗体を凝集さ・0
゛るために該ザスベンシ9ンに対し抗−Fc抗体を添加
してもちはや1.、x A Bの凝集は認められない。
しないがこのrlTTとの処理によ−2て全IgH抗体
を不活性化すると1、xAg(711凝集が達成される
が但U7その程度はより少い。IgG抗体を凝集さ・0
゛るために該ザスベンシ9ンに対し抗−Fc抗体を添加
してもちはや1.、x A Bの凝集は認められない。
従ってIgG抗体によるラテックスの凝集ばIgGに対
する抗体に3Lって阻害されると考えられる。思いがし
Jないこととして該LxAg凝集物は、゛′抗−FC抗
体によって凝集された1、GAh ”に対して公知の比
較的高潤度のIgHAb (1) I) T処理・已ず
)を添加したときに、予期以トに弱い。このことばラテ
ックス上のAg抗原はIgGAb−抗−Pc、複合体に
よってマスク(被包)されていると推測される。
する抗体に3Lって阻害されると考えられる。思いがし
Jないこととして該LxAg凝集物は、゛′抗−FC抗
体によって凝集された1、GAh ”に対して公知の比
較的高潤度のIgHAb (1) I) T処理・已ず
)を添加したときに、予期以トに弱い。このことばラテ
ックス上のAg抗原はIgGAb−抗−Pc、複合体に
よってマスク(被包)されていると推測される。
次にTHG抗体とLxAH抗体との反応をブロック(阻
1ト)するためにこの・す“スペンションに対して遊A
1[抗原“AP、”を加える。該抗原はI(HM抗体(
ラテックスをtJi隼さ一1!得る()T、体)をも又
ブI7ソクするであろ・うと考えられるかも1−2れな
い。とごろが驚くべきことに遊離抗原濃度が過度で4(
れれば該ブ1−1、ッキングは起らない。全IgG抗体
を凝集さ・lするために遊離抗原AP、と抗−Pc抗体
とを共用することにより遊離粒子群濃度はIgM抗体の
みによる凝集の場合と明らかに同じである。、−の)1
1実の発1.!、はぞの効果の点で驚異に(lffする
&−1れどもこれし、1双方の抗体の既知の特性と一1
iすることなのである。
1ト)するためにこの・す“スペンションに対して遊A
1[抗原“AP、”を加える。該抗原はI(HM抗体(
ラテックスをtJi隼さ一1!得る()T、体)をも又
ブI7ソクするであろ・うと考えられるかも1−2れな
い。とごろが驚くべきことに遊離抗原濃度が過度で4(
れれば該ブ1−1、ッキングは起らない。全IgG抗体
を凝集さ・lするために遊離抗原AP、と抗−Pc抗体
とを共用することにより遊離粒子群濃度はIgM抗体の
みによる凝集の場合と明らかに同じである。、−の)1
1実の発1.!、はぞの効果の点で驚異に(lffする
&−1れどもこれし、1双方の抗体の既知の特性と一1
iすることなのである。
T g M A bはIgGAbよりも弱い親和力を有
する、−とが普通である。けれどもその多結合価(10
結合価)にもとづき、IgMΔ1〕は繰返しの抗I串決
定Wを有する抗原と優先的に反応する。ラテックスに対
するAgのカップリングは八gを反復性のものとするの
で従ってIgMAbとの反応性を高めど)。従って低温
度の遊離抗原はIgG抗体の全結合能を飽和させるがこ
れに対してμ;だしく高濃度のi!lγ離AH((11
1,これは繰返し2の抗原決定基をイ1していない)番
、1、I P、M抗体を飽和させることを必要とずろで
あろう。
する、−とが普通である。けれどもその多結合価(10
結合価)にもとづき、IgMΔ1〕は繰返しの抗I串決
定Wを有する抗原と優先的に反応する。ラテックスに対
するAgのカップリングは八gを反復性のものとするの
で従ってIgMAbとの反応性を高めど)。従って低温
度の遊離抗原はIgG抗体の全結合能を飽和させるがこ
れに対してμ;だしく高濃度のi!lγ離AH((11
1,これは繰返し2の抗原決定基をイ1していない)番
、1、I P、M抗体を飽和させることを必要とずろで
あろう。
結論とし一ζ本発明方法+11、例えばTAG に対す
る抗−Pc抗体の使用により、及び被検液体試才″1が
7F、A抗体、“既j4夕の通り無視可能の量で一般に
存在するIgD抗体°及びIgn抗体を含む場合には明
らかにIgllに対する抗体の使用により、IgH抗体
活性の測定を可能にする。該IgG抗体は事実遊離抗原
と結合し、該抗原点の結合はIgG抗体及び恐らくはI
gA抗体の不活性化を達成する。
る抗−Pc抗体の使用により、及び被検液体試才″1が
7F、A抗体、“既j4夕の通り無視可能の量で一般に
存在するIgD抗体°及びIgn抗体を含む場合には明
らかにIgllに対する抗体の使用により、IgH抗体
活性の測定を可能にする。該IgG抗体は事実遊離抗原
と結合し、該抗原点の結合はIgG抗体及び恐らくはI
gA抗体の不活性化を達成する。
本発明方法は既述の通りrgM抗体、IgG抗体及びI
gA抗体含有液体試料中のIgG抗体プラスTgA抗体
の定量を可能とするものであって該方法に従うと被検液
体試料中のIBM抗体量を−1−述の方法によって先ず
測定し、次に該1gM抗体量をIgM抗体+iHG抗体
+fA抗体の全量から差引き、かようにしてIgG抗体
+IgA抗体量を得る。IgG抗体量の測定のためには
反応混合物に対して抗−TgA抗体を加えることで充分
であることが明かであり、同様にしてTgA抗体量を定
めるためには反応混合物に対し抗−IgG抗体を加える
ことで充分であることが明かである。
gA抗体含有液体試料中のIgG抗体プラスTgA抗体
の定量を可能とするものであって該方法に従うと被検液
体試料中のIBM抗体量を−1−述の方法によって先ず
測定し、次に該1gM抗体量をIgM抗体+iHG抗体
+fA抗体の全量から差引き、かようにしてIgG抗体
+IgA抗体量を得る。IgG抗体量の測定のためには
反応混合物に対して抗−TgA抗体を加えることで充分
であることが明かであり、同様にしてTgA抗体量を定
めるためには反応混合物に対し抗−IgG抗体を加える
ことで充分であることが明かである。
従前技術の多くの方法を誤った陽性の結果にみちび(ひ
とつの問題はりウマチ因子(RF)によって起るf渉(
妨害)であった。RF If大部分のI g G A
b −Δg複合体と結合しているIgH抗体である。
とつの問題はりウマチ因子(RF)によって起るf渉(
妨害)であった。RF If大部分のI g G A
b −Δg複合体と結合しているIgH抗体である。
本発明によれば該リウマチ因子の影響は凝集したIgG
の添力lによって中和される。この中和工程の結果はI
gGに対する抗体及び“TgAに対する抗体であり得る
抗体”の添加の後に“著しく高濃度のりウマチ因子を含
むがIgMAbを欠如する血清”を添加し、かようにし
て得られた混合物を恒温保持することにより試験された
。実質I−異る結果を得た場合はなかった。
の添力lによって中和される。この中和工程の結果はI
gGに対する抗体及び“TgAに対する抗体であり得る
抗体”の添加の後に“著しく高濃度のりウマチ因子を含
むがIgMAbを欠如する血清”を添加し、かようにし
て得られた混合物を恒温保持することにより試験された
。実質I−異る結果を得た場合はなかった。
rgMAbの特異的測定のためのラテックス凝集試験に
ついて記載された最近の報告(J、S、Remingt
onet al、: Detection of rm
munoglobulin M antihoiesw
ith antigen tagged 1at
ex pasticles in animmu
nosorbent asSay、 J、 ClIn、
Microbiology(1983) Vol、 1
7. m、5.939)に注意すべきである。はとんど
すべての既往の試験における通りヒトのIgH抗体に対
する抗体は微量滴定板の開弁(wel+>の壁に結合す
る。血清を加えると全Ig+1の一部(IgM抗体を含
む)が壁に付着する。
ついて記載された最近の報告(J、S、Remingt
onet al、: Detection of rm
munoglobulin M antihoiesw
ith antigen tagged 1at
ex pasticles in animmu
nosorbent asSay、 J、 ClIn、
Microbiology(1983) Vol、 1
7. m、5.939)に注意すべきである。はとんど
すべての既往の試験における通りヒトのIgH抗体に対
する抗体は微量滴定板の開弁(wel+>の壁に結合す
る。血清を加えると全Ig+1の一部(IgM抗体を含
む)が壁に付着する。
この反応の完結の後に抗原被覆ラテックス粒]薯IYを
加える。数1lli、 1jil後己こ微B+滴定板に
結合したううソクス量を測定し2、既知流度のIF、M
抗体使用611 J、り得られた結果と札中16 L、
かようにU2て抗体0着¥をa(測する。この方法t、
l: ”1′定量的測定のみに限られる。この測定法4
J1.M抗体のみを測イ)ものであり、恒温保持に長時
間を要し、妨害物の洗去を要し、作業は集約的である6
更に患者のIgM免疫グ11プリンが高量であるならば
結合1gMAhの比率は減少し、従−3て感作能を減じ
、陽性結果を誤り得る危険をもたらす。
加える。数1lli、 1jil後己こ微B+滴定板に
結合したううソクス量を測定し2、既知流度のIF、M
抗体使用611 J、り得られた結果と札中16 L、
かようにU2て抗体0着¥をa(測する。この方法t、
l: ”1′定量的測定のみに限られる。この測定法4
J1.M抗体のみを測イ)ものであり、恒温保持に長時
間を要し、妨害物の洗去を要し、作業は集約的である6
更に患者のIgM免疫グ11プリンが高量であるならば
結合1gMAhの比率は減少し、従−3て感作能を減じ
、陽性結果を誤り得る危険をもたらす。
このLl的のために本発明方法で使用される恒温保持時
間は短いことに注目されねばなr)ない。従ってIf!
Gに対する抗体及び“I P、、 Aに対する抗体であ
り得る抗体”の添加後に、得られた溶液を約1〜15分
間、温度約37℃において攪拌Fに恒温保持する。他方
において、riik細粒子結合抗原及び遊離抗原を加え
た後に、((Iられたサスペンションをも又約1〜15
分間、)話度約37℃において攪拌下に恒温保持する。
間は短いことに注目されねばなr)ない。従ってIf!
Gに対する抗体及び“I P、、 Aに対する抗体であ
り得る抗体”の添加後に、得られた溶液を約1〜15分
間、温度約37℃において攪拌Fに恒温保持する。他方
において、riik細粒子結合抗原及び遊離抗原を加え
た後に、((Iられたサスペンションをも又約1〜15
分間、)話度約37℃において攪拌下に恒温保持する。
この同(〉恒温保持時間は、リウマチ因子による影響の
中和に使用される凝隼したIgGの可能な添5.n+の
後0こ必要であると思われる。
中和に使用される凝隼したIgGの可能な添5.n+の
後0こ必要であると思われる。
実施セ11
本発明方法はいかなる感染症例えばトキソプラズマ症、
勺イトメガロウイルス、庖疹、風疹型及び類似型の感染
症に対して適用され/j)るけれどもF文において、−
力ではブルセラ了ボルタス(Brueella abo
rtus)、他方では1−キソブラスマ、ゴンジイ (
Toxoplasma gondii) Lニ一対する
IgG抗体及びIgM抗体の測定について記載される。
勺イトメガロウイルス、庖疹、風疹型及び類似型の感染
症に対して適用され/j)るけれどもF文において、−
力ではブルセラ了ボルタス(Brueella abo
rtus)、他方では1−キソブラスマ、ゴンジイ (
Toxoplasma gondii) Lニ一対する
IgG抗体及びIgM抗体の測定について記載される。
ブラセラ抗原はりボボリザソカライF (I−、、P
S)であった。
S)であった。
3#1−
一!2−即jq世製
ウェスlファル等の方法(Westphal et a
l、 :Method in Corbohydrat
e Chemist、ry+ Vol、 5(19
65) + p、 83. Academic I
’ressz N、Y、)の水−フコ。ノール操作法(
こ従ってブルセラLPSを抽出した。次にモレノ等の記
載(Moreno et al、:J、 Racte
riology (1979) 、 361. 13
8゜It、 2 )の通りにし゛ζフェノール相を3容
)Ji(7)″メタノール試薬”により沈殿させNal
中のジメチルスルフォキザイド(5ザイクル)で処理し
た。次に該リボポリ4ノソカライド(I、I)S)を脱
イオン水に対して透析し°ζから凍結乾燥させた。
l、 :Method in Corbohydrat
e Chemist、ry+ Vol、 5(19
65) + p、 83. Academic I
’ressz N、Y、)の水−フコ。ノール操作法(
こ従ってブルセラLPSを抽出した。次にモレノ等の記
載(Moreno et al、:J、 Racte
riology (1979) 、 361. 13
8゜It、 2 )の通りにし゛ζフェノール相を3容
)Ji(7)″メタノール試薬”により沈殿させNal
中のジメチルスルフォキザイド(5ザイクル)で処理し
た。次に該リボポリ4ノソカライド(I、I)S)を脱
イオン水に対して透析し°ζから凍結乾燥させた。
ラーテッー久−不ニー抗原−(1,に1.、−r”−!
5)−(ト)町竪5倍希釈GBS (dGBs) [
但しCBSはpl+9.2のグリシン緩衝食塩溶液であ
る〕の0.4 m l!中にとかされたSOpgのr、
p sに対し50μpのラテックス(10% w/
v) (K 109 、 Rhone−Poulen
ce、 Courbevoie、 France)を添
加してからこの混合物を1分間30ワットにおいて音波
処理(sorricate3(Model B125o
nifler、 Rranson。
5)−(ト)町竪5倍希釈GBS (dGBs) [
但しCBSはpl+9.2のグリシン緩衝食塩溶液であ
る〕の0.4 m l!中にとかされたSOpgのr、
p sに対し50μpのラテックス(10% w/
v) (K 109 、 Rhone−Poulen
ce、 Courbevoie、 France)を添
加してからこの混合物を1分間30ワットにおいて音波
処理(sorricate3(Model B125o
nifler、 Rranson。
Danhury、 CT、 06810) シた。1
0分間後にGBSの中の100 tt gのヒI・血清
アルブミン(H3A。
0分間後にGBSの中の100 tt gのヒI・血清
アルブミン(H3A。
Rehringwerke、 Marbury/Lah
n、 F RG)を加えてからこのサスペンションを再
び音波処理した。室温下の恒温保持20分間及び遠心回
転器(SS 34rotor of a 5orval
l R5CD centrifuge)中での1000
0 rev/minにおける10分間の処理の後に該ラ
テックスを1m7!の水性Fデシル硫酸す1−リウム中
に再懸濁化し、音波処理1.てから37℃で1時間恒温
保持した。該ラテックスを1m7!のGBSで2回洗浄
してから1 m eのE]’l”l’A(エチレンジア
ミンテトラ耐酸)−GBS〜T3 S A(ウシ血清ア
ルブミン)中に再懸濁化させた。温度−20℃に冷凍貯
蔵又は凍結乾燥した該ラテ・ノクスは少くとも6力月間
にわたり安定であることが見出された。L x L P
Sを凍結乾燥t、2だ後に融解させ又は再懸濁化させ
てから30ワットにおいて15秒間音波処理した。使用
後に1.x L P SをIEDTA−GBS−BSA
中で100倍に希釈しノζ。
n、 F RG)を加えてからこのサスペンションを再
び音波処理した。室温下の恒温保持20分間及び遠心回
転器(SS 34rotor of a 5orval
l R5CD centrifuge)中での1000
0 rev/minにおける10分間の処理の後に該ラ
テックスを1m7!の水性Fデシル硫酸す1−リウム中
に再懸濁化し、音波処理1.てから37℃で1時間恒温
保持した。該ラテックスを1m7!のGBSで2回洗浄
してから1 m eのE]’l”l’A(エチレンジア
ミンテトラ耐酸)−GBS〜T3 S A(ウシ血清ア
ルブミン)中に再懸濁化させた。温度−20℃に冷凍貯
蔵又は凍結乾燥した該ラテ・ノクスは少くとも6力月間
にわたり安定であることが見出された。L x L P
Sを凍結乾燥t、2だ後に融解させ又は再懸濁化させ
てから30ワットにおいて15秒間音波処理した。使用
後に1.x L P SをIEDTA−GBS−BSA
中で100倍に希釈しノζ。
抗−7−、pc抗体
セロチニ等(Cerot、j、ini et at、:
J 、Tmn+t+nology(1968)101
.433)の方法に従いパパイン消化によりヒトIgG
のFcフラグメントを羽製し、た。フロイントの完全ア
ジュバント中の100μgのヒトのFcを3週間毎にヤ
ギに皮肉注射した。
J 、Tmn+t+nology(1968)101
.433)の方法に従いパパイン消化によりヒトIgG
のFcフラグメントを羽製し、た。フロイントの完全ア
ジュバント中の100μgのヒトのFcを3週間毎にヤ
ギに皮肉注射した。
最終注射から15日後に血清を集め免疫グロプリンを抽
出しその抗−Fc特異性を検査した後にCBS中で希釈
(1■/m#)L、た状態で使用した。
出しその抗−Fc特異性を検査した後にCBS中で希釈
(1■/m#)L、た状態で使用した。
操−ゴt
CBSで50=1に希釈されたヒト血清の50μpに対
し25 p eの抗−PCを添加した。この混合物を渦
動下に2分間37℃に恒温保持した。次に25μβの凝
集したヒトIgG免疫グロブリンを濃度25+ng/m
ffで加え、この混合物を更に10分間37℃で恒温保
持した。最後にこの混合物に対し、遊離抗原(LPS)
と濃度5pg/meにおいて混合された2511ρの1
.xLPSを加えてから更に10分間37℃で恒温保持
を継続した。2m7!のG B Sの添加によってこの
反応を停止させてから得られた混合物を光学的細胞計数
器へ通過さ・Uて非凝集I X L PSの濃度を測定
した。IgM抗体の濃度は遊離ラテックス粒子群濃度と
逆比例する。
し25 p eの抗−PCを添加した。この混合物を渦
動下に2分間37℃に恒温保持した。次に25μβの凝
集したヒトIgG免疫グロブリンを濃度25+ng/m
ffで加え、この混合物を更に10分間37℃で恒温保
持した。最後にこの混合物に対し、遊離抗原(LPS)
と濃度5pg/meにおいて混合された2511ρの1
.xLPSを加えてから更に10分間37℃で恒温保持
を継続した。2m7!のG B Sの添加によってこの
反応を停止させてから得られた混合物を光学的細胞計数
器へ通過さ・Uて非凝集I X L PSの濃度を測定
した。IgM抗体の濃度は遊離ラテックス粒子群濃度と
逆比例する。
凝集1.x L P Sの量を直接計測することも可能
であり、光学的手段と異る他方法例えば電気抵抗器を粒
子群の計測に使用することも可能であることは明かであ
る。T[1M抗体の過剰濃度にもとづく過誤を避げるた
め乙こ1.00/1及び200/1希釈血清を用いてこ
の操作をくり返す。
であり、光学的手段と異る他方法例えば電気抵抗器を粒
子群の計測に使用することも可能であることは明かであ
る。T[1M抗体の過剰濃度にもとづく過誤を避げるた
め乙こ1.00/1及び200/1希釈血清を用いてこ
の操作をくり返す。
本発明における他の変法に従うとIBM抗体及びIgG
抗体の濃度が比較的高い場合に濁度計によりラテックス
の凝集度を測定し得る。CBS中の同量のヒト血清及び
抗−Fcを渦動下に2分間37℃で恒温保持した。次に
上記濃度乙こおける25μpの凝集したし)IBGを加
えてからこの混合物を1時間恒温保持し、その後に濃度
0.02%において30pρの1、x t、P Sを加
えた。この混合物を短時間渦動下に保ち、その後に62
0nm及び405n111において濁度を測定した。6
20nmの波長は基線を構成する。次にこの混合物を2
時間恒温保持した後に上記の2種の波長において該混合
物の濁度を再測定した。620nmと405nmとにお
ける最初の測定値と2時間恒温保持後の測定値との間の
差の減少は残留遊離粒子群に逆比例する。得られたサス
ペンションの中の凝集又は非凝集の微細粒子量を濁度計
以外の光学的密度測定器例えば比濁計によって計測する
ことも又可能である。
抗体の濃度が比較的高い場合に濁度計によりラテックス
の凝集度を測定し得る。CBS中の同量のヒト血清及び
抗−Fcを渦動下に2分間37℃で恒温保持した。次に
上記濃度乙こおける25μpの凝集したし)IBGを加
えてからこの混合物を1時間恒温保持し、その後に濃度
0.02%において30pρの1、x t、P Sを加
えた。この混合物を短時間渦動下に保ち、その後に62
0nm及び405n111において濁度を測定した。6
20nmの波長は基線を構成する。次にこの混合物を2
時間恒温保持した後に上記の2種の波長において該混合
物の濁度を再測定した。620nmと405nmとにお
ける最初の測定値と2時間恒温保持後の測定値との間の
差の減少は残留遊離粒子群に逆比例する。得られたサス
ペンションの中の凝集又は非凝集の微細粒子量を濁度計
以外の光学的密度測定器例えば比濁計によって計測する
ことも又可能である。
全抗体活性即ちIBM抗体+IgG抗体(例えば−ヒ文
中に例示されたrg^抗体不含有の血清)の活性の定量
法に関し、抗−Fc抗体の代りにCl5S緩衝液のみを
使用し、LxLr’S +L P 30代りにL x
1.、P Sを使用する。IgG抗体?a度のみの測定
のためには、試料のIgH抗体が試料のジチオスレイト
ール(口TT)による予備処理の際に破壊される事実を
除外して、全抗体活性の測定に同じ操作を使用する。
中に例示されたrg^抗体不含有の血清)の活性の定量
法に関し、抗−Fc抗体の代りにCl5S緩衝液のみを
使用し、LxLr’S +L P 30代りにL x
1.、P Sを使用する。IgG抗体?a度のみの測定
のためには、試料のIgH抗体が試料のジチオスレイト
ール(口TT)による予備処理の際に破壊される事実を
除外して、全抗体活性の測定に同じ操作を使用する。
CBSによる希釈の以前の50 tllの血清に対し、
CBS中50ミリモル濃度のpl+9.2を有する1
70ttl)のEDTAを加えた。この混合物に対し水
中10■/mβの濃度における15μpのDTTを加え
てから全混合物を30分間37℃に恒温保持し、その後
に15μlの0.2%過酸化水素溶液の添加によってD
TTの反応を停止させた。
CBS中50ミリモル濃度のpl+9.2を有する1
70ttl)のEDTAを加えた。この混合物に対し水
中10■/mβの濃度における15μpのDTTを加え
てから全混合物を30分間37℃に恒温保持し、その後
に15μlの0.2%過酸化水素溶液の添加によってD
TTの反応を停止させた。
次に既述のように操作してから得られた溶液を1/10
.1/20及び1/40に希釈して」二記の定量操作に
供した。
.1/20及び1/40に希釈して」二記の定量操作に
供した。
添付図面の第1図はブルセラアボルクスに感染した患者
の血清(上文中に用いられた血清と同じ血清)のIgM
抗体濃度を示し、該濃度は約1年間にわたり(1分間当
り計測値における)放射免疫測定法(RI A)により
得られ、及び(観測凝集単位における)本発明方法によ
り得られた。
の血清(上文中に用いられた血清と同じ血清)のIgM
抗体濃度を示し、該濃度は約1年間にわたり(1分間当
り計測値における)放射免疫測定法(RI A)により
得られ、及び(観測凝集単位における)本発明方法によ
り得られた。
該両者の曲線は類似しており、これは本発明の定量方法
が信頼され得ることの証明であることが理解され得る。
が信頼され得ることの証明であることが理解され得る。
例−一?。
一1gG−及Uj−−」ゴ1゛右ズヌ−チ−ンん抗一体
Δ測定−し;−/ 7”う不jメク人抗11く一上−±
又杭原y−Φ−調−製T、ゴンジイの胞子土類に予め3
日間感染させたマウスの腹膜浸出物からトキソブラスモ
シス抗原を調製した。腹膜腔を3〜5mj!の滅菌生理
的食塩水で2〜3回洗浄して洗浄物を貯留させた。
Δ測定−し;−/ 7”う不jメク人抗11く一上−±
又杭原y−Φ−調−製T、ゴンジイの胞子土類に予め3
日間感染させたマウスの腹膜浸出物からトキソブラスモ
シス抗原を調製した。腹膜腔を3〜5mj!の滅菌生理
的食塩水で2〜3回洗浄して洗浄物を貯留させた。
このサスペンションの1mnに対し0.05mnの抗生
物質ペントレキシル(Pen trexy l)及び1
0jp位のヘパリンを加えこれを円錐形底部をもつ管の
中で1/2時間室温に保持した。次に該管を600rp
mで4分間遠心処理し、と澄を除き、ペレットを食塩水
中に再懸濁化させ4℃において4000rpmで1/2
時間再び遠心処理した。ベレ・7トにt=IU、 2
m /!のIM Nil、lを加えて赤血球を?’8
111L処理してから4℃において=1. OOOrp
mで再び遠心処理し、食塩水を用いてペレットを3回洗
浄してから4℃C14000rpで1/2時間再び遠心
処理した。
物質ペントレキシル(Pen trexy l)及び1
0jp位のヘパリンを加えこれを円錐形底部をもつ管の
中で1/2時間室温に保持した。次に該管を600rp
mで4分間遠心処理し、と澄を除き、ペレットを食塩水
中に再懸濁化させ4℃において4000rpmで1/2
時間再び遠心処理した。ベレ・7トにt=IU、 2
m /!のIM Nil、lを加えて赤血球を?’8
111L処理してから4℃において=1. OOOrp
mで再び遠心処理し、食塩水を用いてペレットを3回洗
浄してから4℃C14000rpで1/2時間再び遠心
処理した。
該ベレットを2m7!の蒸留水の中に再3脈濁化させて
からドライアイスアセトンを用いて凍結と融解とをくり
返し、その都度該溶液を超音波混合処理に付した。10
分間300 Orpmで遠心処理した後に上澄を採りP
B S −NaCI (L M)で平衡化されたウ
ルI・ロゲル(tlltroRel) 3−4のコラム
を通過させた。各フラクションについてこれらをラテ・
2クス−F(ab’)2抗−1−キソプスモシスに対し
て試験し、ラテックスを凝集さ−Vたフラクションを貯
留し、?農縮し、−20℃に貯蔵した。
からドライアイスアセトンを用いて凍結と融解とをくり
返し、その都度該溶液を超音波混合処理に付した。10
分間300 Orpmで遠心処理した後に上澄を採りP
B S −NaCI (L M)で平衡化されたウ
ルI・ロゲル(tlltroRel) 3−4のコラム
を通過させた。各フラクションについてこれらをラテ・
2クス−F(ab’)2抗−1−キソプスモシスに対し
て試験し、ラテックスを凝集さ−Vたフラクションを貯
留し、?農縮し、−20℃に貯蔵した。
ラテン外友二Th;、’za1mりび↓9靭)−Φ−班
製力ルボキシ化ラうンクス(1,0% W / V )
(1,に)の250 p eに対し2rn (!のハル
ビト−ル緩衝化食塩水(DBS)(0,02M、pH8
,1)を加え110000rpで10分間遠心処理した
。−14澄をとり250 メ1ρBBSを加えて4℃に
冷却した。次(こ25mgのカルボジイミド(CI)I
)を含有するBBSの2507z7!を加えて10呵の
C[IT/100μ1.Lxの混合物を仕成さ・I!、
この溶液を新たに調製して4 ’cに保ち、4℃におい
て渦動下に1時間恒温保持した。
製力ルボキシ化ラうンクス(1,0% W / V )
(1,に)の250 p eに対し2rn (!のハル
ビト−ル緩衝化食塩水(DBS)(0,02M、pH8
,1)を加え110000rpで10分間遠心処理した
。−14澄をとり250 メ1ρBBSを加えて4℃に
冷却した。次(こ25mgのカルボジイミド(CI)I
)を含有するBBSの2507z7!を加えて10呵の
C[IT/100μ1.Lxの混合物を仕成さ・I!、
この溶液を新たに調製して4 ’cに保ち、4℃におい
て渦動下に1時間恒温保持した。
遠心処理を1. OO00rpmにおいて4℃で10間
行った後にQ、 5 m eの冷BBSを力11えた。
行った後にQ、 5 m eの冷BBSを力11えた。
この混合物を水浴中に保持したまま超音波振動にかけて
から4 ’cにおいてBBS (容積(0,5m 1り
中の1−キソ抗原の溶液(1,5■)に対して添加した
。
から4 ’cにおいてBBS (容積(0,5m 1り
中の1−キソ抗原の溶液(1,5■)に対して添加した
。
次にこの溶液を4℃で渦動下に2〜4時間又は回転器−
1−で16時間恒温保持した。
1−で16時間恒温保持した。
該ラテックスサスペンションを1%CB Sを用いて3
回洗浄し、その都度3回遠心処理した後に超音波により
混合した。
回洗浄し、その都度3回遠心処理した後に超音波により
混合した。
貯蔵1/20希釈、冷凍又は凍結乾燥。
抗二VI九一体−
リA
ヒ1〜IP、Gθ汗CフラグメンI・をセロチニ等の方
法(J、 Tmmunology (1968310
1,433)に従いパパイン消化により調製した。完全
フロインI・アジュバント中の100μgのヒトPcを
3週間毎にヤギに列し皮内汁1・Jシた。最後の注射か
ら15日後に血清を集めて免疫グI−7プリンを抽出し
その抗−Pc特異性を検査した後に0.9%食塩水中(
12■/ m 1 )で使用した。
法(J、 Tmmunology (1968310
1,433)に従いパパイン消化により調製した。完全
フロインI・アジュバント中の100μgのヒトPcを
3週間毎にヤギに列し皮内汁1・Jシた。最後の注射か
ら15日後に血清を集めて免疫グI−7プリンを抽出し
その抗−Pc特異性を検査した後に0.9%食塩水中(
12■/ m 1 )で使用した。
1」−作
GBS/I%+3SA中で50/](又は25/1)に
希釈されたヒト血清の50 p (lの試料に対し25
μβの抗−Fc溶液(0,9%食塩水中12■/ m
n )を加えてから37℃に10分間恒温保持した。次
にこの混合物に対し0.9%食塩水中10■/ m e
の濃度の凝集ヒトIgGの溶液(IgGを63℃で3分
O間加熱することによる)の25μβを加えてから37
℃に10分間再び恒温保持した。
希釈されたヒト血清の50 p (lの試料に対し25
μβの抗−Fc溶液(0,9%食塩水中12■/ m
n )を加えてから37℃に10分間恒温保持した。次
にこの混合物に対し0.9%食塩水中10■/ m e
の濃度の凝集ヒトIgGの溶液(IgGを63℃で3分
O間加熱することによる)の25μβを加えてから37
℃に10分間再び恒温保持した。
最後に濃度0.1μg / m 7!で遊離トキソプラ
スモシス抗原を含有するLxtoxoの50 tt 1
を加えた。
スモシス抗原を含有するLxtoxoの50 tt 1
を加えた。
37℃で30分間更に恒温保持を続けてから2.0m1
4のCBSの添加により反応を停止させた。得られた混
合物を光学的細胞計数器へjm過させて非凝集ラテック
ス粒子群のみを数えた。その濃度ばIgM抗体に逆比例
する。
4のCBSの添加により反応を停止させた。得られた混
合物を光学的細胞計数器へjm過させて非凝集ラテック
ス粒子群のみを数えた。その濃度ばIgM抗体に逆比例
する。
別法として遊離ラテックス粒子群濃度を濁度計により計
測し得る。この場合にT g M A b 濃度又はI
gGAb濃度は比較的高い。
測し得る。この場合にT g M A b 濃度又はI
gGAb濃度は比較的高い。
CBS中のヒト血清、抗−Fc、の同量を渦動下に37
゛Cで2分間恒温保持した。次に上記?農度の凝集し)
IgGの25771を添加し2てこの混合物を1時間
恒温保持し、その後に濃度0,02%のL x T o
x oの30 p Aを加えた。この混合物を短時間
渦動下に保持してから620μm及び405μmにおけ
る濁度を測定した。620μmが基線を構成した。
゛Cで2分間恒温保持した。次に上記?農度の凝集し)
IgGの25771を添加し2てこの混合物を1時間
恒温保持し、その後に濃度0,02%のL x T o
x oの30 p Aを加えた。この混合物を短時間
渦動下に保持してから620μm及び405μmにおけ
る濁度を測定した。620μmが基線を構成した。
次にこの混合物を2時間恒温保持し、その後に該混合物
について上記2種の波長におりる読みを再び測定した。
について上記2種の波長におりる読みを再び測定した。
605μm及び405μmにおける始めと終りについて
の測定値間の差の減少は遊離粒子群残留数に逆比例する
。
の測定値間の差の減少は遊離粒子群残留数に逆比例する
。
全抗体活性の測定のために抗−Pc0代りにruns緩
衝液のみを用い、遊離1〜1−ソ抗原を使用せずにLy
toxoを使用した。
衝液のみを用い、遊離1〜1−ソ抗原を使用せずにLy
toxoを使用した。
IgG抗体のみの測定のために、ジチ;(スレイト−ル
(r)TT)を用いる試料の予備処理による試1’l中
の1.Mの破壊を除き、全抗体のために同じ操作を用い
た。
(r)TT)を用いる試料の予備処理による試1’l中
の1.Mの破壊を除き、全抗体のために同じ操作を用い
た。
CB Sによって希釈する以前の血清の50 、fl
#に対しG B S ’l’ Y農度50ミリモル、p
l+9.2のEIITAの170μlを加えた。この混
合物に対し濃度10nv/mpのD T T水?容液の
15μpを力11え、次に全混合物を37℃に30分間
恒温保持し2、その後に15μpの0.2%過酸化水素
溶液の添加によってD T Tの反応を停止させた。次
に既述の通りに操作して得られた溶液を上記の定量操作
のために1/10.1/20及び1/40に希釈し7だ
。
#に対しG B S ’l’ Y農度50ミリモル、p
l+9.2のEIITAの170μlを加えた。この混
合物に対し濃度10nv/mpのD T T水?容液の
15μpを力11え、次に全混合物を37℃に30分間
恒温保持し2、その後に15μpの0.2%過酸化水素
溶液の添加によってD T Tの反応を停止させた。次
に既述の通りに操作して得られた溶液を上記の定量操作
のために1/10.1/20及び1/40に希釈し7だ
。
第2図番才血清希釈の関数としてT[GAh及びI 、
、M A +1の2種血清(1/25希釈)中の相対濃
度即ち全抗体(曲線1 ) 、IgGAb(曲線2)I
gM八[)(曲線3)に関する相対濃度を示すと共に最
後にD T T (IgM抗体に対する)及び抗−Fc
ljC体(IP、G抗体に対する)の添加(こより阻害
された全抗体活1!1(曲線4)茫示す。
、M A +1の2種血清(1/25希釈)中の相対濃
度即ち全抗体(曲線1 ) 、IgGAb(曲線2)I
gM八[)(曲線3)に関する相対濃度を示すと共に最
後にD T T (IgM抗体に対する)及び抗−Fc
ljC体(IP、G抗体に対する)の添加(こより阻害
された全抗体活1!1(曲線4)茫示す。
第3121はr:LTsAザン1′イ・ノチ試験及びF
L I Sへ捕穫試験から得られた成績と比Φ合L7た
IMl’ACT (登録商標名)系と対ブルレラIgM
抗体測定との間の相関を示す、該相関は前者について相
関係数0.92、後者について相関係数0.91を与え
た。
L I Sへ捕穫試験から得られた成績と比Φ合L7た
IMl’ACT (登録商標名)系と対ブルレラIgM
抗体測定との間の相関を示す、該相関は前者について相
関係数0.92、後者について相関係数0.91を与え
た。
第4図ば1−ギソプラスモシス(1こ対するI P、M
抗体の測定のためのELTSA捕獲技法とTMPACT
(登録商標名)との間の相関を示す。相関係数−〇、
96゜本発明ばI−述の態様に限定されず、本発明の範
囲を逸脱することなく多くの変改を施されl)る、こと
が理解されるべきである。
抗体の測定のためのELTSA捕獲技法とTMPACT
(登録商標名)との間の相関を示す。相関係数−〇、
96゜本発明ばI−述の態様に限定されず、本発明の範
囲を逸脱することなく多くの変改を施されl)る、こと
が理解されるべきである。
既述の通り微細粒子群としてラテックス粉子j+Yの代
りに赤血球群を使用し得る。ln cj:、 i;を自
明である。
りに赤血球群を使用し得る。ln cj:、 i;を自
明である。
添(」図面の第1図はブルセラアボルタスζ、=感染し
た患者の血清IgM抗体?m度を示し2、第2図は面?
?を希釈0:)関数トb テ1gGAb 及?JIgH
Ah (7) 2挿1flL ?n中の相対濃度を示す
。曲線lは全抗体、曲線21.;il IP、GAb 、曲線3はIgHAb 4こ関する相対
濃度を示ず。 曲線4はD T T及び抗−Fc抗体の添加により阻害
された全抗体活性を示す。第3図はFLTSA 4Jン
ドイソヂ試験及びELTSA tdi獲試験から得られ
た成績と比較したIMIIACT系と対ブルセラIgH
抗体測定との間の相関を示す。第4閾はトキソプラスモ
シスに対するIgH抗体の測定のたぬのEL、ISA捕
獲技法とIMF’ACTとの間の相関を示す。 イムバグPA、U、 (増万y・)茅佐)釦0
1000 1500 2000ELISA
(ザントイ、/ヴ) A、U。 ’9MAb稚マ゛ルゼヅ 11− ’e 7 ) A、U、 <ML )
”g”J ヤイ叫)ELISA (→fl;)i> A
、U。 Fig、3゜ 手続補正書(方式) 1.事件の表示 昭和61年特許願第13598号2
、発明の名称 液体試料中の各種抗体の免疫定量方法
3、補正をする者 事件との関係 出願人 4、代理人
た患者の血清IgM抗体?m度を示し2、第2図は面?
?を希釈0:)関数トb テ1gGAb 及?JIgH
Ah (7) 2挿1flL ?n中の相対濃度を示す
。曲線lは全抗体、曲線21.;il IP、GAb 、曲線3はIgHAb 4こ関する相対
濃度を示ず。 曲線4はD T T及び抗−Fc抗体の添加により阻害
された全抗体活性を示す。第3図はFLTSA 4Jン
ドイソヂ試験及びELTSA tdi獲試験から得られ
た成績と比較したIMIIACT系と対ブルセラIgH
抗体測定との間の相関を示す。第4閾はトキソプラスモ
シスに対するIgH抗体の測定のたぬのEL、ISA捕
獲技法とIMF’ACTとの間の相関を示す。 イムバグPA、U、 (増万y・)茅佐)釦0
1000 1500 2000ELISA
(ザントイ、/ヴ) A、U。 ’9MAb稚マ゛ルゼヅ 11− ’e 7 ) A、U、 <ML )
”g”J ヤイ叫)ELISA (→fl;)i> A
、U。 Fig、3゜ 手続補正書(方式) 1.事件の表示 昭和61年特許願第13598号2
、発明の名称 液体試料中の各種抗体の免疫定量方法
3、補正をする者 事件との関係 出願人 4、代理人
Claims (11)
- (1)少くともIgM及びIgGを含有する液体試料例
えば生物学的流体の中の少くともひとつの抗原に対する
Ign抗体の免疫定量方法において、少くともひとつの
抗原に対するIgH抗体、IgG抗体及び恐らくIgA
抗体をも含有する液体試料をIgGに対する抗体と反応
させ、及び該試料がIgA抗体を含有する場合にはIg
Aに対する抗体と反応させ、微細粒子群と結合している
該抗原及び該結合抗原と同型の遊離抗原を上記反応に、
よって得られた生成物に対して添加し、これらの微細粒
子群の凝集度又は非凝集度を測定すること、IgM抗体
量が該非凝集微細粒子群量と逆比例することを特徴とす
る前記の方法。 - (2)IgGに対する抗体及びIgAに対する抗体であ
り得る抗体を添加した後に得られた溶液を攪拌下に約3
7℃の温度で約1〜15分間恒温保持する特許請求の範
囲第1項記載の方法。 - (3)微細粒子群と結合した抗原及び遊離抗原を添加し
た後に、得られたサスペンションを攪拌下に約37℃の
温度で約1〜15分間恒温保持する特許請求の範囲第1
項記載の方法。 - (4)IgGに対する抗体及びIgAに対する抗体であ
り得る抗体を添加した後、及びその後に得られた溶液を
恒温保持した後に、リウマチ因子によって起される影響
を中和するために該溶液に対して凝集したIgGを添加
する特許請求の範囲第2項記載の方法。 - (5)恒温保持後に得られた溶液に凝集IgGを添加し
た後に該溶液を攪拌下に約37℃の温度で約1〜15分
間再び恒温保持する特許請求の範囲第4項に記載の方法
。 - (6)得られたサスペンションの中の凝集又は非凝集の
微細粒子群量を比濁計によって測定する特許請求の範囲
第1項記載の方法。 - (7)得られたサスペンションの中の凝集又は非凝集の
微細粒子群量を濁度測定によって計測する特許請求の範
囲第1項記載の方法。 - (8)得られたサスペンションの中の凝集又は非凝集の
微細粒子群量を凝集粒子数又は非凝集粒子数の計測によ
り測定する特許請求の範囲第1項記載の方法。 - (9)微細粒子群としてラテックス粒子群又は赤血球群
を使用する特許請求の範囲第1項記載の方法。 - (10)IgG抗体に対する抗体がIgGの抗−Fc抗
体であり、抗原がブルセラから由来するリボポリサッカ
ライドである特許請求の範囲第1項記載の方法。 - (11)IgM抗体、IgG抗体及びIgA抗体を含有
する液体試料例えば生物学的流体の中のIgG抗体+I
gA抗体の免疫定量方法において、該液体試料中のIg
M抗体量を特許請求の範囲第1項記載の方法によって測
定し、かようにして得られたIgM抗体量をIgM抗体
+IgG抗体+IgA抗体の総量から差引くことによっ
てIgG抗体+IgA抗体量を得ることを特徴とする前
記の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
BE214388 | 1985-01-24 | ||
BE0/214388A BE901567A (fr) | 1985-01-24 | 1985-01-24 | Procede de dosage immunologique d'anticorps de diverses classes dans un echantillon liquide. |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6249258A true JPS6249258A (ja) | 1987-03-03 |
JPH0565029B2 JPH0565029B2 (ja) | 1993-09-16 |
Family
ID=3843850
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP61013598A Granted JPS6249258A (ja) | 1985-01-24 | 1986-01-24 | 液体試料中の各種抗体の免疫定量方法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4829012A (ja) |
EP (1) | EP0189389B1 (ja) |
JP (1) | JPS6249258A (ja) |
CA (1) | CA1273571A (ja) |
DE (1) | DE3662730D1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010026758A1 (ja) * | 2008-09-05 | 2010-03-11 | 積水メディカル株式会社 | モノクローナル抗体及びこれを用いた免疫学的測定方法 |
Families Citing this family (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2604526B1 (fr) * | 1986-09-30 | 1990-12-21 | Indicia Ste Civile Etu Rech | Procede et dispositif de dosage de substances d'interet clinique reactives immunologiquement |
DE3717401A1 (de) * | 1987-05-23 | 1988-12-08 | Behringwerke Ag | Einschritt-immuntest zur bestimmung von antigen-spezifischen antikoerpern aus einer der immunglobulin-klassen a, m, d oder e und dazu geeignetes mittel |
GB8717863D0 (en) * | 1987-07-28 | 1987-09-03 | Acade Diagnostic Systems Sa Nv | Determination of antibodies |
GB8724549D0 (en) * | 1987-10-20 | 1987-11-25 | Coombs R R A | Immunoassay |
JP3127449B2 (ja) * | 1989-07-28 | 2001-01-22 | 三菱化学株式会社 | 抗体の測定法 |
ATE139845T1 (de) * | 1989-08-23 | 1996-07-15 | Canon Kk | Methode zur messung eines immunologisch aktiven materials und vorrichtung, die dazu geeignet ist |
AU643454B2 (en) * | 1989-08-23 | 1993-11-18 | Canon Kabushiki Kaisha | Method for measuring an immunologically active material and apparatus suitable for practicing said method |
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ATE197504T1 (de) * | 1991-12-13 | 2000-11-11 | Abbott Lab | Bestimmung trizyklischer antidepressiva in gegenwart störender substanzen |
JPH0636168U (ja) * | 1992-10-06 | 1994-05-13 | 株式会社ゼクセル | スイッチ機構 |
US5556759A (en) * | 1993-08-02 | 1996-09-17 | Beach; Peter G. | Assay and method for determining newborn risk for sudden infant death syndrome |
US5561045A (en) * | 1994-01-04 | 1996-10-01 | Intracel Corporation | Detection reagent, article, and immunoassay method |
US5547833A (en) * | 1994-01-04 | 1996-08-20 | Intracel Corporation | Radial flow assay, delivering member, test kit, and methods |
DE69931600T2 (de) * | 1998-01-08 | 2007-05-03 | Chugai Seiyaku K.K. | Neues gen mit einem revers-transkriptase-motiv |
CA2283597C (en) | 1998-10-02 | 2008-02-05 | Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. | Reduced cortisol conjugates |
US6689571B1 (en) | 2002-11-13 | 2004-02-10 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Assay method and kit for pythium insidiosum antibodies |
FR2917173B1 (fr) | 2007-06-08 | 2009-07-31 | Bio Rad Pasteur Sa | Procede multiplexe de detection d'une infection |
CN104714028B (zh) * | 2015-03-02 | 2017-01-25 | 深圳市凯瑞德生物技术有限公司 | 一种检测IgM抗体的免疫检测方法 |
WO2023076832A1 (en) * | 2021-10-25 | 2023-05-04 | Singular Genomics Systems, Inc. | Manipulating and detecting biological samples |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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US4092114A (en) * | 1976-10-20 | 1978-05-30 | Fisher Scientific Company | Indirect latex test for determination of immunoglobulins |
ES471585A1 (es) * | 1977-07-15 | 1979-01-16 | Behringwerke Ag | Procedimiento para la determinacion de reactivos fc |
US4204837A (en) * | 1978-03-14 | 1980-05-27 | Beckman Instruments, Inc. | Method of rate immunonephelometric analysis |
DE2918342A1 (de) * | 1979-05-07 | 1980-11-20 | Behringwerke Ag | Latex-reagenz |
US4434227A (en) * | 1982-02-08 | 1984-02-28 | Abbott Laboratories | Immunoassay for class specific immunoglobulin antibodies |
JPS5931453A (ja) * | 1982-07-14 | 1984-02-20 | Fujirebio Inc | 梅毒抗体の測定方法 |
-
1986
- 1986-01-21 DE DE8686870009T patent/DE3662730D1/de not_active Expired
- 1986-01-21 EP EP86870009A patent/EP0189389B1/fr not_active Expired
- 1986-01-22 US US06/821,441 patent/US4829012A/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-01-23 CA CA000500250A patent/CA1273571A/en not_active Expired - Fee Related
- 1986-01-24 JP JP61013598A patent/JPS6249258A/ja active Granted
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010026758A1 (ja) * | 2008-09-05 | 2010-03-11 | 積水メディカル株式会社 | モノクローナル抗体及びこれを用いた免疫学的測定方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US4829012A (en) | 1989-05-09 |
CA1273571A (en) | 1990-09-04 |
JPH0565029B2 (ja) | 1993-09-16 |
EP0189389A1 (fr) | 1986-07-30 |
EP0189389B1 (fr) | 1989-04-05 |
DE3662730D1 (en) | 1989-05-11 |
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---|---|---|---|
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