JPS6245533A - Novel peptide and production thereof - Google Patents

Abstract

NEW MATERIAL:A peptide expressed by formula I (P is peptide residue having one or more cysteine residue; S1 is S derived from the cysteine residue contained in the above-mentioned peptide residue; gamma-Glu is gamma-glutamine residue; Cys is cysteine residue; Gly is glycine residue; S2 is S derived from cysteine residue in the group expressed by formula II; n is an integer >=1) and a salt thereof. USE:Capable of holding the biological activity of the corresponding cyclic peptides or free mercapto group-type peptides and useful as an experimental reagent and further diagnostic agent by establishing an immunoassay system and medicines and animal drugs based on the biological activity. PREPARATION:A peptide having one or more cysteine residues is, as necessary, reduced with a reducing agent and reacted with a reduced form or oxidized form glutathione in a basic aqueous solution to afford the aimed peptide expressed by formula I and salt thereof.

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の技術分野］ 本発明は、新規ペプチド及びその製造法に関し、更に詳
しくは、１つ以上のシスティン残基を有するペプチドの
該システィン残基をグルタチオンで保護してなる新規ペ
プチド及びその製造法に関するものである。Detailed Description of the Invention [Technical Field of the Invention] The present invention relates to a novel peptide and a method for producing the same, and more particularly, to a novel peptide having one or more cysteine residues protected with glutathione. The present invention relates to a novel peptide and a method for producing the same.

［従来技術及びその問題点］ ペプチド類には、ホルモン、抗生物質等として１種々の
生物活性を有するものが多数存在する。これらのペプチ
ド類の中には、カルシトニン（以下ｒ　ＣＴＪという）
、オキシトシン、パンプレンシン、ソマトスタチン等の
ようにそのペプチド鎖中のシスティン残基がジスルフィ
ド結合し、環状構造を形成しているものがある。[Prior art and its problems] There are many peptides that have various biological activities such as hormones and antibiotics. Among these peptides, calcitonin (hereinafter referred to as rCTJ)
, oxytocin, pamplesin, somatostatin, etc., cysteine residues in their peptide chains are bonded with disulfide to form a cyclic structure.

これらの環状ペプチドは、ジスルフィド結合が開裂する
とその生物活性がほとんど消失し［エイチＯビーφブリ
ューアー・ジュニア（＋（、Ｂ。These cyclic peptides lose most of their biological activity when the disulfide bond is cleaved [H.

Ｂｒｅｗｅｒ、　Ｊｒ、　）他；フェデレーション・プ
ロシーテイング（Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｃ、）
、　２７．８９０（１９８Ｂ）。Brewer, Jr.) et al.; Federation Proc.
, 27.890 (198B).

υ、　３８３　（１９Ｅ１９）１　、環状構造をとるこ
とが生物活性を示すのに必須であることが示されていこ
のため、このような環状ペプチドを医薬品とする場合、
不安定なジスルフィド結合を溶液中で安定性高く、薬効
時間の長い医薬とするため多くの研究がなされた。この
問題に対する唯一の成功した例は、ジスルフィド結合を
アミノスペリン酸を用いてエチレン結合にし、安定性を
改良した方法である（特公昭５３−４１８７７号公報）
。υ, 383 (19E19)1, it has been shown that a cyclic structure is essential for exhibiting biological activity. Therefore, when using such a cyclic peptide as a drug,
Many studies have been conducted to develop unstable disulfide bonds into pharmaceuticals that are highly stable in solution and have a long efficacy. The only successful example of solving this problem is a method in which disulfide bonds are converted into ethylene bonds using aminosperinic acid to improve stability (Japanese Patent Publication No. 41877/1987).
.

しかしながら、この方法はアミノスペリン酸をペプチド
鎖中に導入しなければならないため操作が煩雑であり、
容易な手段により得られ、その生物活性が保持されてい
る誘導体の出現が望まれている。However, this method requires complicated operations because aminosperinic acid must be introduced into the peptide chain.
It is desired to develop derivatives that can be obtained by easy means and retain their biological activity.

最近、本発明者らは、ニワトリ！！後体から２種の新規
なＣＴを単離・精製することに成功し、それぞれ特願昭
５８−２３０５９３号（特開昭Ｇｏ−１２３５００号）
及び４￥願昭５９−１７８５０３号として既に出願して
いる。このうちの１種であるニワトリＣＴＩＩは、ジス
ルフィド結合が１３１１裂され、対応するシスティンＢ
’、　）、Ｉ（がグルタチオンで保護された構造を有す
るものであるが、環状構造をとる他の１種であるニワト
リＣＴｒと同様に高い生物活性を有している。Recently, the inventors have developed a technique called Chicken! ! We succeeded in isolating and purifying two new types of CT from the posterior body, and each was published in Japanese Patent Application No. 58-230593 (Japanese Unexamined Patent Publication No. 123500).
and 4 yen Application No. 178503/1983. One of these, chicken CTII, has a disulfide bond cleaved at 1311, and the corresponding cysteine B
', ), I( has a structure protected by glutathione, but it has high biological activity like chicken CTr, which is another type with a cyclic structure.

そこで、本発明者らは、他の環状又は非環状のシスティ
ン含有ペプチドのシスティン残基をグルタチオンで保護
せしめたところ、生物活性が保持されていることを見い
出し、本発明を完成するに至った。Therefore, the present inventors discovered that when the cysteine residues of other cyclic or non-cyclic cysteine-containing peptides were protected with glutathione, biological activity was retained, and the present invention was completed.

［発明の構成〕 本発明は。[Structure of the invention] The present invention is.

次式（ｒ）： （式中、［Ｆ］は１つ以上のシスティン残基を有するペ
プチド残基を、　ＳＬは該ペプチド残基に含まれるシス
ティン残基由来のイオウ原子を、γ−Ｇｌｕはγ−グル
タミル残基を、Ｃｙｓはシスティン残基を、Ｇｌｙはグ
リシン残基を、Ｓ２はｙ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ残基
中のシスティン残基由来のイオウ原子を、ｎは１以上の
整数を表わす、） で示される新規ペプチド及びその塩並びにそれらの製造
法に関するものである。The following formula (r): (wherein, [F] is a peptide residue having one or more cysteine residues, SL is a sulfur atom derived from a cysteine residue contained in the peptide residue, and γ-Glu is γ-glutamyl residue, Cys is cysteine residue, Gly is glycine residue, S2 is sulfur atom derived from cysteine residue in y-Glu-Cys-Gly residue, n is an integer of 1 or more. The present invention relates to novel peptides and salts thereof, and methods for producing them.

未発明に用いる１つ以上のシスティン残基を有するペプ
チドとしては、ジスルフィド結合による環状構造を有す
るもの及びジスルフィド結合を有さないもののいずれを
用いてもよい。As the peptide having one or more cysteine residues used in the present invention, either one having a cyclic structure with a disulfide bond or one having no disulfide bond may be used.

工；状構造を有するペプチドとしては、例えば、ＣＴ、
オキシトシン、パンプレンシン、ンマトスタチン１心房
性Ｎａ利尿ホルモン（以下ｒＡＮＰｊという）９′の１
つのジスルフィド環を有するもの、−］−皮、ＩＩＩ胞
成長因子（ＥＧＦ）等の２つのジスルフィド環を４１す
るもの、エンテロトキシン笠の３つのジスルフィド環を
有するものが挙げられる。Examples of peptides having an engineering structure include CT,
Oxytocin, Pamprecin, Nmatostatin 1 Atrial Na diuretic hormone (hereinafter referred to as rANPj) 9' 1
Examples include those with two disulfide rings, such as -]-rin, follicle growth factor III (EGF), and three disulfide rings, such as enterotoxin.

ジスルフィド結合を形成していないシスティン残基を有
するペプチドとしては、例えば、下垂体後葉ペプチド等
が挙げられる。Examples of peptides having a cysteine residue that does not form a disulfide bond include posterior pituitary peptide.

これらのペプチドは、生物活性を有し、種々の病気の治
療に有用である。例えば、ＧＴは高Ｇａ血症、骨粗ｒ症
、ベージェット病の治療に有用であり、その構成アミノ
酸の１位及び７位のシスティン残基間にジスルフィド結
合を有する。オキシトシンは、ヒト及び動物の刺激又は
治療誘導に並びに分娩後の子宮出血を制御するのに有用
であり、１位及び６位のシスティン残基間にジスルフィ
ド結合を有する。バンブレッシン及び同族体たるリブジ
ノシンは、抗利尿剤として用いられ、そのペプチド鎖の
１位及び６位のシスティン残基間にジスルフィド結合を
有する（ハンドブック・オブ・バイオケミストリー、Ｃ
−１６４頁からＣ−１８８頁）。These peptides have biological activity and are useful in treating various diseases. For example, GT is useful for treating hypergaemia, osteoporosis, and Beget's disease, and has a disulfide bond between cysteine residues at positions 1 and 7 of its constituent amino acids. Oxytocin is useful for stimulating or therapeutic induction in humans and animals as well as for controlling postpartum uterine bleeding, and has a disulfide bond between cysteine residues at positions 1 and 6. Vambressin and its homologue, ribudinosin, are used as antidiuretics and have a disulfide bond between cysteine residues at positions 1 and 6 of their peptide chain (Handbook of Biochemistry, C.
- pages C-188).

ソマトスタチンは、末端巨大症及び糖尿病の治療に有効
とされ、そのペプチド鎖の３位及び１４位のシスティン
残基間にジスルフィド結合を有する。Somatostatin is said to be effective in treating acromegaly and diabetes, and has a disulfide bond between cysteine residues at positions 3 and 14 of its peptide chain.

最近発見されたＡＭＰは、血圧低下剤及び利尿剤として
期待されており、７位及び２３位のシスティン残基間に
ジスルフィド結合を有する。AMP, which was recently discovered, is expected to be a hypotensive agent and a diuretic, and has a disulfide bond between cysteine residues at positions 7 and 23.

ＣＴ、オキシトシン、パンプレッシン、ソマトスタチン
、ＡＭＰのアミノ酸配列は、それらの原料の種類によっ
て異なるが、哺乳類、鳥類、魚類、両生類、爬虫類の腺
から抽出されたペプチド類はすべて前述のような環状構
造を有している。The amino acid sequences of CT, oxytocin, pamplesin, somatostatin, and AMP differ depending on the type of raw material, but all peptides extracted from the glands of mammals, birds, fish, amphibians, and reptiles have the above-mentioned cyclic structure. have.

本発明の新規ペプチドの塩としては、塩酸、硫酸、臭化
水素酸、リン酸等の鉱酸との塩；メタンスルホン酸、Ｐ
ｌルエンスルホン酸、ベンゼンスルホノ酸、酢酩、グリ
コール酸、グルクロン酸。Salts of the novel peptide of the present invention include salts with mineral acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, hydrobromic acid, phosphoric acid; methanesulfonic acid, P
l Luenesulfonic acid, benzenesulfonate, acetic acid, glycolic acid, glucuronic acid.

マレイン酸、フマル酸、シュウ酸、アスコルビン酸、コ
ハダ酸、クエン酸、サリチル酸、ニコチン酸、酒石酸等
の有機酸との塩；アンモニア、トリス（ヒドロキシエチ
ル）アミノメタン、Ｎ、Ｎ−ビス（ヒドロキシエチル）
ピペラジン、２−アミ／　−２−メチル−１−プロパツ
ール、エタノールアミン、Ｎ−メチルグルカミン のｔｌＡが挙げられる。Salts with organic acids such as maleic acid, fumaric acid, oxalic acid, ascorbic acid, succinic acid, citric acid, salicylic acid, nicotinic acid, tartaric acid; ammonia, tris(hydroxyethyl)aminomethane, N,N-bis(hydroxyethyl )
Examples include tlA of piperazine, 2-amino/-2-methyl-1-propanol, ethanolamine, and N-methylglucamine.

本発明の新規ペプチド及びその塩は、次のようにして製
造することがでＳる。The novel peptide of the present invention and its salt can be produced as follows.

即ち、１ｒｊ述した１つ以−Ｆのシスティン残基を有す
るペプチドを塩ノ，（性水溶液中で還元型又は酸化型の
グルタチオンと反応させることにより製造することがで
きる。That is, it can be produced by reacting a peptide having one or more cysteine residues as described above with reduced or oxidized glutathione in an aqueous solution.

また、前記ペプチドがジスルフィド結合を有する場合に
は、還元剤により還元した後、前述と同様に処理しても
よい。Further, when the peptide has a disulfide bond, the peptide may be reduced with a reducing agent and then treated in the same manner as described above.

未発明に用いる前記ペプチドは、天然品、合成品及び遺
伝子工学技術によって製造したもののいずれを用いても
よい．合成品を用いる場合、個々の構成アミノ酸として
は、　０体、　１体及びラセミ体のいずれを用いてもよ
いが、１体を用いることが特に好ましい。The peptide used in the invention may be any of natural products, synthetic products, and those produced by genetic engineering technology. When a synthetic product is used, the individual constituent amino acids may be either 0-, 1-, or racemic, but it is particularly preferable to use 1-amino acid.

本発明の製造法における塩基性水溶液としては、通常ｐ
Ｈ　７．５〜１３の各種緩衝液を用いる。かかる緩衝液
としては、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン−塩酸、リン酸、イミダゾール−塩酸、アセトア
ミドグリシン−水酸化す゛　トリウム、トリエタノール
アミン−ｎ１酸−水酸化ナトリウム、グリシンアミド−
塩酸、グリシルグリシン−水酸化ナトリウム、ピロリン
酸ナトリウム−塩酸，ジェタノールアミン−塩酸、ホウ
酸、ホウ酸−塩酸、グリシン−水酸化ナトリウム、炭酸
ナトリウム−炭酸水素ナトリウム、ホウ酸−水酸化ナト
リウム、炭酸水素ナトリウム−水酸化ナトリウム等の各
種緩衝液が挙げられるが、トリス（ヒドロキシメチル）
アミンメタン−塩酸緩衝液（以下ｒ　Ｔｒｉｓ　＊　Ｈ
ＣＩ　Ｊという）（ｐＨ９．０）が特に好ましい。The basic aqueous solution used in the production method of the present invention is usually p
Various buffer solutions of H 7.5 to 13 are used. Such buffers include, for example, tris(hydroxymethyl)aminomethane-hydrochloric acid, phosphoric acid, imidazole-hydrochloric acid, acetamidoglycine-sodium hydroxide, triethanolamine-n1 acid-sodium hydroxide, glycinamide-
Hydrochloric acid, glycylglycine-sodium hydroxide, sodium pyrophosphate-hydrochloric acid, jetanolamine-hydrochloric acid, boric acid, boric acid-hydrochloric acid, glycine-sodium hydroxide, sodium carbonate-sodium hydrogen carbonate, boric acid-sodium hydroxide, Examples include various buffers such as sodium hydrogen carbonate-sodium hydroxide, but tris(hydroxymethyl)
Amine methane-hydrochloric acid buffer (r Tris*H
CI J) (pH 9.0) is particularly preferred.

５元型又は酸化型のグルタチオンの使用量は。What is the usage amount of 5-form or oxidized glutathione?

グルタチオン化されるペプチドの、通常　１〜１０００
倍当ｊ１ｔ、好ましくは１０〜３００倍当量である．反
応温度は，通常ｌ〜６０℃、好ましくは２０〜４０℃で
ある。反応時間は、通常１〜４８時間，好まり．　＜は
２０〜３０時間である。Usually 1 to 1000 of peptides to be glutathionylated
It is preferably 10 to 300 times equivalent. The reaction temperature is usually 1 to 60°C, preferably 20 to 40°C. The reaction time is usually 1 to 48 hours, preferably. < is 20 to 30 hours.

グルタチオン化に先立って、還元処理を施す場合、還元
剤としては、有機合成で一般に用いられる口元剤をすべ
て用いることができる．例えば、各種千オール類のジチ
オスレイトール、ジチオエリスリトール、２−メルカプ
トエタノール、チオグリコール酸，チオリンゴ酸、Ｎ−
メチルメルカプトアセトアミド、その他，水素化ホウ素
ナトリウム、水素化アルミニウムリチウム、亜鉛、パラ
ジウム−炭素、パラジウム−ブラック等が用いられる。When a reduction treatment is performed prior to glutathionylation, any of the agents commonly used in organic synthesis can be used as the reducing agent. For example, dithiothreitol, dithioerythritol, 2-mercaptoethanol, thioglycolic acid, thiomalic acid, N-
Methylmercaptoacetamide, sodium borohydride, lithium aluminum hydride, zinc, palladium-carbon, palladium-black, etc. are used.

かかる還元処理に用いる溶媒は，還元剤の種類により異
なるが、例えば還元剤としてジチオスレイトールを用い
る場合には，通常ｐＨ　７．５〜１３の各種緩衝液を用
いる。この場合、ジチオスレイトールの使用量は、ペプ
チドの、通常０．１〜１００倍当量、好ましくは　１−
１ｏ倍当量であり、反応温度は、通常１〜６０℃、好ま
しくは２０〜４０℃であり、反応時間は１通常１〜２４
時間、好ましくは３〜５時間である。The solvent used for such reduction treatment varies depending on the type of reducing agent, but for example, when dithiothreitol is used as the reducing agent, various buffer solutions having a pH of 7.5 to 13 are usually used. In this case, the amount of dithiothreitol used is usually 0.1 to 100 times the equivalent of the peptide, preferably 1-
10 times equivalent, the reaction temperature is usually 1 to 60°C, preferably 20 to 40°C, and the reaction time is usually 1 to 24°C.
time, preferably 3 to 5 hours.

かくして得られたグルタチオン化ペプチドは、通常、ゲ
ルか適法、イオン交換クロマトグラフィー、分配クロマ
トグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（以下ｒ　
ＨＰＬＣＪという）、向流分配法、電気泳動法により精
製を行なうが、逆相ＨＰＬＣ：　（逆相ＨＰＬ、Ｃの一
般的操作法）による精製が最も有効である。The glutathionylated peptide thus obtained is usually processed by gel or other suitable methods, ion exchange chromatography, partition chromatography, high performance liquid chromatography (hereinafter referred to as r).
Purification is carried out by HPLCJ), countercurrent partitioning, and electrophoresis, but purification by reversed-phase HPLC (general operating method for reversed-phase HPLC) is the most effective.

［発明の効果］ 本発明のペプチドは、対応する環状ペプチド又はメルカ
プト基ＴＬ離型ペプチドの生物活性を保持し、実験用試
薬として、更にこれを用いてイムノアッセイ系を確立し
診断薬として用いうるし、生物活性に基づいて医薬又は
動物薬として利用することも可俺である。[Effects of the Invention] The peptide of the present invention retains the biological activity of the corresponding cyclic peptide or mercapto group TL release peptide, and can be used as an experimental reagent, and can be used as a diagnostic agent by establishing an immunoassay system. It is also possible to use it as a medicine or veterinary drug based on its biological activity.

［発明の実施例］ 次に、実施例及び試験例を挙げて本発明を具体的に説明
するが、本発明はこれらにより制限されるものではない
。[Examples of the Invention] Next, the present invention will be specifically described with reference to Examples and Test Examples, but the present invention is not limited thereto.

実施例１ ニワトリＣＴＩ　（１０ｎ　ｍｏｌ　）を　０．５Ｍ　
Ｔｒｉｓ　ｅ　ＨＣ：ｎ（ｐＨ！３．０）　５０　ａ　
ｌに溶解した。この溶液に　ｌ　ｕＬｍｏｌのグルタチ
オン（還元型）を加え、３７℃で２４時間反応した。こ
の反応液を以下の条件に従いＨＰＬＣ（逆相）に付した
。Example 1 Chicken CTI (10 nmol) at 0.5M
Tris e HC: n (pH! 3.0) 50 a
Dissolved in l. To this solution, l uLmol of glutathione (reduced form) was added and reacted at 37°C for 24 hours. This reaction solution was subjected to HPLC (reverse phase) according to the following conditions.

測定条件： カラム；ケムコ社製Ｃｈｅ＋ｍｃｏｓａｒｂ　５０ＤＳ
−Ｈ（４，８ｍ履φ　Ｘ　２５０℃磨） 流速；　　１．Ｏｍ？／ｗｉｎ 溶離液：Ａ液（水ニアセトニトリル２ニ０アセトニトリ
ル：１０％トリフルオロ酢酸＝４０：８０：１）をＡ液
からＢ液へ直線型濃度勾配溶出　（３０分） その結果、保持時間２３．６分、２４．４分、２６．２
分にペプチドに基づく強い吸光度（Ａ２１０）が認めら
れた。これらの吸光度のある両分を分取後、凍結乾燥し
てアミノ酸分析に付した。Measurement conditions: Column: Che+mcosarb 50DS manufactured by Chemco
-H (4.8m diameter x 250℃ polished) Flow rate; 1. Om? /win Eluent: Linear concentration gradient elution of solution A (water, diacetonitrile, 20% acetonitrile: 10% trifluoroacetic acid = 40:80:1) from solution A to solution B (30 minutes), resulting in a retention time of 23 .6 minutes, 24.4 minutes, 26.2
A strong absorbance (A210) based on the peptide was observed at 10 minutes. Both fractions with high absorbance were collected, lyophilized, and subjected to amino acid analysis.

乾燥粉末を６Ｎ塩酸を用いて　１１０℃で２２時間加水
分解し、脱塩酸後、０．２Ｎクエン酸緩衝液（ｐＨ２、
２５）　５０　ｈ　ｌに溶解し、半量を分析に供した．
その結果．　２３．６分に溶出した両分がニワトリＧＴ
Ｉの１位と　７位のシスティン残基にグルタチオンがジ
スルフィド結合したペプチドであった．目的物のアミノ
酸分析値を表１に示す０合成収率は８３％であった．こ
のペプチドは、ラットを用いた血清Ｃａ低下作用試験を
行ない、生物活性を認めた。The dry powder was hydrolyzed with 6N hydrochloric acid at 110°C for 22 hours, and after dehydrochlorination, 0.2N citric acid buffer (pH 2,
25) It was dissolved in 50 hl, and half of it was used for analysis.
the result. Both fractions eluted at 23.6 minutes are chicken GT.
It was a peptide in which glutathione was disulfide bonded to cysteine residues at positions 1 and 7 of I. The amino acid analysis values of the target product are shown in Table 1. The synthesis yield was 83%. This peptide was tested for its serum Ca lowering effect using rats and was found to have biological activity.

表１ Ｃｈｅｗ．）、　２３８　、　２３５　（１９８３）］
実施例２〜５ 実施例１と同様の方法にて、各種ＣＴ（ウナギ。Table 1 Chew. ), 238, 235 (1983)]
Examples 2 to 5 Various CTs (eel) were prepared in the same manner as in Example 1.

サケ、ヒト、ウシ由来）の　１位と　７位のシスティン
残基にグルタチオンがジスルフィド結合したペプチドを
得た。We obtained a peptide in which glutathione was disulfide-bonded to the cysteine residues at positions 1 and 7 of salmon, human, and cow origin.

表２にその結果を、ＨＰＬＣでの保持時間と合成収率で
示す。また、それぞれのグルタチオン化ペプチドのアミ
ノ酸分析値を表３に示す。Table 2 shows the results in terms of HPLC retention time and synthesis yield. Furthermore, the amino acid analysis values of each glutathionylated peptide are shown in Table 3.

表２ 表３−１　グルタチオン化つナキＣＴ Ｃｈｅｓｓ、）、　２３８　、２３５　（１９８３）１
表３−２　グルタチオン化すケＣＴ 表３−３　グルタチオン化ヒトＣＴ Ｃｈｅ＋ｓ、）、　２３８　、２３５　（１９６３）］
表３−４　グルタチオン化ウシＣＴ Ｃ：ｈｅｍ、）、　２３８　、２３５　（１９８３）］
これらのペプチドは、ラットを用いた血清Ｃａ低下ｆｉ
用試験を行ない生物活性を認めた。Table 2 Table 3-1 Glutathionylated Tsunaki CT Chess, ), 238, 235 (1983) 1
Table 3-2 Glutathionylated human CT Table 3-3 Glutathionylated human CT Che+s, ), 238, 235 (1963)]
Table 3-4 Glutathionylated bovine CT C:hem,), 238, 235 (1983)]
These peptides have been shown to reduce serum Ca in rats.
A bioactivity test was conducted and biological activity was observed.

実施例６ オキシトシン（５０ｎ　ｓｏｕ　）を０．５Ｍ　Ｔｒｉ
ｓｓ　ＨＣＡ（ｐＨ９，０）　２５０μ文に溶解した。Example 6 Oxytocin (50 n sou ) in 0.5 M Tri
Dissolved in 250μ of ss HCA (pH 9,0).

この溶液に５０弘１ａｏＱのグルタチオン　（酸化型）
２５０　ｐ文を加え、３７°Ｃで３００時間反応た。こ
の反応液を実施例１と同様の方法にて、）ＩＰＬＧを実
施後、その両分を分取しその両分のアミノ酸分析、質量
分析を行ない、グルタチオン化オキシトシンを確認した
。その結果、オキシトシンの　１位と　８位のシスティ
ン残基がグルタチオンとジスルフィド結合したペプチド
が）ＩＰＬＣの保持時間１５．４分、収率７４％で得ら
れた。Add 50 hiro1aoQ of glutathione (oxidized form) to this solution.
250 p-bun was added and reacted at 37°C for 300 hours. After performing IPLG on this reaction solution in the same manner as in Example 1, both fractions were separated and subjected to amino acid analysis and mass spectrometry to confirm glutathionylated oxytocin. As a result, a peptide in which cysteine residues at positions 1 and 8 of oxytocin were disulfide-bonded with glutathione was obtained with an IPLC retention time of 15.4 minutes and a yield of 74%.

目的物のアミノ酸分析値を表４に示す。Table 4 shows the amino acid analysis values of the target product.

表４ 実施例７ ハソブレ、シン（ｔｏ　ｎ　ｍｏｕｌｔ　）を０．５Ｍ
　Ｔｒｉｓ　ｅＨ（、Ｑ　（ｐＨ８，５，５０１１ＩＭ
ジチオスレイトール、　１ｇＭｘチレンジアミン四酢酸
食酢酸含有０ｐｉに溶解し、３７°Ｃで、４時間反応さ
せた。この反応液を実施例１と同様の方法にてＨＰＬＣ
を実施し、−元型７＜ソブレンシン画分を分取した。こ
の両分を凍結乾燥後、０．５Ｍ　　Ｔｒｉｓ　−）ＩＣ
Ｍ　（ｐＨ９，０）５０ｐ　ｌに溶解した。この溶液に
　Ｌ＃Ｌ＋ｎｏ免のグルタチオン（５元型）５０ｇＭを
加え、３７℃で２４時間反応させた。この反応液を実施
例１と同様の方法にてＨＰＬＣ：を実施後、その両分を
分取し、その両分のアミノ酸分析、質量分析にてグルタ
チオン化バンブレッシンを確認した。その結果バソプレ
ッシンの　１位と６　イ：７のシスティン残基がグルタ
チオンとジスルフィド結合したペプチドが）ＩＰＬｃの
保持時間１３．７分、収−１４２％で得られた。Table 4 Example 7 0.5M of ton moult
Tris eH(,Q(pH8,5,5011IM
Dithiothreitol was dissolved in 0 pi containing 1 g Mx ethylenediaminetetraacetic acid and acetic acid, and reacted at 37°C for 4 hours. This reaction solution was subjected to HPLC in the same manner as in Example 1.
was carried out, and the -archetype 7 < sovrencin fraction was fractionated. After freeze-drying both parts, 0.5M Tris-)IC
M (pH 9,0) was dissolved in 50 pl. To this solution, 50 gM of L#L+no glutathione (pentameric form) was added and reacted at 37°C for 24 hours. After performing HPLC on this reaction solution in the same manner as in Example 1, both fractions were separated, and glutathionylated vanblesin was confirmed by amino acid analysis and mass spectrometry of both fractions. As a result, a peptide in which cysteine residues at positions 1 and 6:7 of vasopressin were disulfide bonded to glutathione was obtained with an IPLc retention time of 13.7 minutes and a yield of -142%.

目的物のアミノ酸分析値を表５に示す。Table 5 shows the amino acid analysis values of the target product.

表５ Ｃｈｅｆｆｉ、）、　２３８　、２３５　（１９８３）
］実施例８ ソマトスタチン（１０ｎ　ｍｏｌ　）を　０．５Ｍ　Ｔ
ｒｉｓ＊ＨＣ交（ｐＨ８，５，５０ｍＭジチオスレイト
ール、ｌｌ！１Ｍエチレンシアミン四ｓ酎含有）耐００
用２に溶解し、３７°Ｃで４時間反応させた。この反応
液を実施例１と同様の方法にてＨＰＬＣを実施し、量元
型ソサトスタチン画分を分取した。この両分を凍結乾燥
後、　０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｆＬ＜Ｐ）＋　９．０
）５０ｇ　ｌに溶解した※この溶液に　Ｉｇｍｏ４のグ
ルタチオン（酸化型）５０ｐｉを加え、３７°Ｃで２４
時間反応させた。この反応液を実施例１と同様の方法に
てＨＰＬＣを実施後、その両分を分取し、その両分のア
ミノ酸分析、質量分析にてグルタチオン化ソマトスタチ
ンを確認した。その結果ソマトスタチンの　１位と１２
位のソステイン残基がグルタチオンとジスルフィド結合
したペプチドが）ＩＰＬＣの保持時間１９．８分、収率
５２％で得られた。Table 5 Cheffi, ), 238, 235 (1983)
] Example 8 Somatostatin (10 nmol) at 0.5M T
ris*HC exchange (pH 8, 5, containing 50mM dithiothreitol, ll!1M ethylenecyamine 4s) resistance 00
2 and reacted at 37°C for 4 hours. This reaction solution was subjected to HPLC in the same manner as in Example 1, and a quantitative sosatostatin fraction was collected. After freeze-drying both parts, 0.5M Tris・HCfL<P)+9.0
) 50g l *To this solution, 50pi of Igmo4 glutathione (oxidized form) was added and incubated at 37°C for 24 hours.
Allowed time to react. After performing HPLC on this reaction solution in the same manner as in Example 1, both fractions were separated, and glutathionylated somatostatin was confirmed by amino acid analysis and mass spectrometry of both fractions. As a result, somatostatin ranks 1 and 12.
A peptide in which the sostein residue at position 2 was disulfide bonded to glutathione was obtained with an IPLC retention time of 19.8 minutes and a yield of 52%.

（１的物のアミノ酸分析値を表６に示す。(Table 6 shows the amino acid analysis values for one target.

表６ による加水分解後のアミノ酸分析 実施例９ ヒ　　ト　　ＡＮＰ　　　（５０ｎ　　　ｌ１ｏｂ　　
　）　　　　を　　　０．５Ｍ　　　Ｔｒｉｓ　　ｅ　
　　ＨＣＩ（ｐ）！　９．０）　２５０　ｇ　ｌ　ニ溶
解１．．り、　コノ溶液ニｌ。Amino acid analysis example 9 after hydrolysis according to Table 6 Human ANP (50n l1ob
) to 0.5M Tris e
HCI(p)! 9.0) 250 g l di-dissolved 1. ．． Then, use the Kono solution.

ｇ　ｍｏｌのグルタチオン（還元型）を加え、３７℃で
２４時間反応した。この反応液を実施例１と同様の方法
にてＨＰＬＣ：を実施後、その両分を分取し、その両分
のアミノ酸分析、質量分析にてグルタチオン化ヒト＾Ｎ
Ｐを確認した。その結果、ヒトＡＮＰの７位と２３位の
システィン残基がグルタチオンとジスルフィド結合した
ペプチドがＨＰＬＣの保持時間１８．６分、収率４９％
で得られた。g mol of glutathione (reduced form) was added and reacted at 37°C for 24 hours. After performing HPLC on this reaction solution in the same manner as in Example 1, both fractions were fractionated, and amino acid analysis and mass spectrometry analysis of both fractions revealed that glutathionylated human^N
I confirmed P. As a result, a peptide in which the cysteine residues at positions 7 and 23 of human ANP were disulfide-bonded with glutathione was found to have an HPLC retention time of 18.6 minutes and a yield of 49%.
Obtained with.

１］的物のアミノ酸分析値を表７に示す。1] Table 7 shows the amino acid analysis values of the target.

表７ 試シト例１　グルタチオン化ＣＴの生物活性試験（１）
試験方法 吊検体を　１％酢酸ナトリウム（ｐＨ４，ｏ　；ｏ、　
１％生血＃＋’ｉアルブミン含有）溶液を用いて適当に
希釈後、更にＲｒ釈した液数種を雄幼若うｙ　ト（１０
０ｇ前後）１匹当り０．１ｍＱを尾静脈に注射し、注射
　１時間後に心１藏より血液を採取する。採取後、遠心
分離して血清を採取し、血清中のカルシウム濃度を分光
学的方法（試薬；−ワコーカルシウムＪｌｌｌ定用２＋ キ７．ト）にてＣａ　濃度を測定する。血清中のＣａ”
ｃ＋＝をｌＯ％低ドさせるのに心安な量を１０ｍ　ＭＲ
Ｃ（Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｏｕｎｃｉ
ｌ）Ｕ　と定義する。Table 7 Test sample 1 Biological activity test of glutathionylated CT (1)
Test method The suspended specimen was treated with 1% sodium acetate (pH 4, o;
Appropriately diluted with 1% fresh blood #+'i albumin-containing solution and further diluted with Rr, several kinds of the solution were added to male and young pigs (10
0.1 mQ per animal was injected into the tail vein, and blood was collected from the heart 1 hour after the injection. After collection, the serum is collected by centrifugation, and the Ca concentration in the serum is measured using a spectroscopic method (reagent: - Wako Calcium Jlll Standard Kit 7.). Ca in serum
10m MR is a safe amount to lower c+= by lO%.
C (Medical Research Council
l) Define U.

（２）試験結果 ＣＴにワトリ、ウナギ、サケ、ヒト、ウシ由来）の　１
位と　７位のシスティン残基にグルタチオンかジスルフ
ィド結合したペプチドは、　１位と７　（：（がジスル
フィド結合したペプチドの有するう・ト血清Ｃａ低ｒ作
用を保持していた。結果を表８に示す。(2) Test result CT shows 1 of the following (originated from Japanese chicken, eel, salmon, human, and cow).
The peptides with glutathione or disulfide bonded to the cysteine residues at positions 1 and 7 (:() retained the effect of lowering the porosity and serum Ca levels of the peptides with disulfide bonds at positions 1 and 7. The results are shown in Table 8. show.

表　　８ １１ラット血Ｉ−１中Ｃａ２”ｅ度を１０％低下させる
巾位をｌＯｍにＲＣＵ　とする。Table 8 11 The width at which the concentration of Ca2''e in rat blood I-1 is reduced by 10% is defined as 10m and RCU.

２ＪＮｌｌ＋定回数（１回）。2JNll + constant number of times (1 time).

Claims (2)

【特許請求の範囲】[Claims] （１）次式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、■は１つ以上のシステイン残基を有するペプチ
ド残基を、Ｓ＿１は該ペプチド残基に含まれるシステイ
ン残基由来のイオウ原 子を、γ−Ｇｌｕはγ−グルタミル残基を、Ｃｙｓはシ
ステイン残基を、Ｇｌｙはグリシン残基を、Ｓ＿２はγ
−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ残基中のシステイン残基由来
のイオウ原子を、ｎは１以上の整数を表わす。） で示される新規ペプチド及びその塩。(1) The following formula: ▲Mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc. sulfur atom, γ-Glu is γ-glutamyl residue, Cys is cysteine residue, Gly is glycine residue, S_2 is γ
-Glu-Cys-Gly residue, n represents a sulfur atom derived from a cysteine residue, and n represents an integer of 1 or more. ) A novel peptide and its salt. （２）１つ以上のシステイン残基を有するペプチドを；
必要に応じて還元剤により還元後；塩基性水溶液中で還
元型又は酸化型のグルタチオンと反応させることを特徴
とする 次式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、■は１つ以上のシステイン残基を有するペプチ
ド残基を、Ｓ＿１は該ペプチド残基に含まれるシステイ
ン残基由来のイオウ原 子を、γ−Ｇｌｕはγ−グルタミル残基を、Ｃｙｓはシ
ステイン残基を、Ｇｌｙはグリシン残基を、Ｓ＿２はγ
−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ残基中のシステイン残基由来
のイオウ原子を、ｎは１以上の整数を表わす。） で示される新規ペプチド及びその塩の製造法。(2) a peptide having one or more cysteine residues;
After reduction with a reducing agent if necessary; reacting with reduced or oxidized glutathione in a basic aqueous solution. The following formula: ▲There are mathematical formulas, chemical formulas, tables, etc.▼ S_1 is a sulfur atom derived from a cysteine residue contained in the peptide residue, γ-Glu is a γ-glutamyl residue, Cys is a cysteine residue, Gly is a glycine residue, S_2 is γ
-Glu-Cys-Gly residue, n represents a sulfur atom derived from a cysteine residue, and n represents an integer of 1 or more. ) A method for producing the novel peptide and its salt.