JPS6242887B2 - - Google Patents

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JPS6242887B2
JPS6242887B2 JP52009594A JP959477A JPS6242887B2 JP S6242887 B2 JPS6242887 B2 JP S6242887B2 JP 52009594 A JP52009594 A JP 52009594A JP 959477 A JP959477 A JP 959477A JP S6242887 B2 JPS6242887 B2 JP S6242887B2
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JP
Japan
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polyethylene glycol
fibrinogen
factor
precipitate
ahf
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Shanburomu Edowaado
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ANSUCHI MERYUU
Original Assignee
ANSUCHI MERYUU
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Publication date
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Publication of JPS6242887B2 publication Critical patent/JPS6242887B2/ja
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    • A61L2/00—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor
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Description

【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]

選択的沈澱、吸収や分別溶離、弱イオン性媒体
での抽出およびクロマトグラフイー等を用いて、
医療用として用いる抗血友病フアクター（AHF
すなわちフアクター）を製造する方法は既に種
種知られている。沈澱法において最も頻繁に使用
されている化学薬品はアルコール、タンニン酸、
硫酸アンモニウム、グリシンおよびポリエチレン
グリコールである。このようなフアクターの精
製によつて他の数種類の血漿タンパクを除去する
ことはできるが、これらのタンパクの中でもフイ
ブリノーゲンは量が一番多く、特にアルコールに
よる沈澱、凍結および解凍などの処理によつてこ
れが変性する場合には最も厄介なものとなる。変
性されたフイブリノーゲンはAHFの濾過を阻害
し、精製段階におけるかなりの量のAHFの損失
を生じ且つ復元液体に対する凍結乾燥生成物の溶
解度を減じてしまう。従つて、AHFの全精製行
程中に多量のフイブリノーゲンを除去することが
必要である。前記の選択的沈澱法はこの目的のた
めに用いられるが、これらの方法はフイブリノー
ゲンとAHFをさらに変質させるか、もしくは
AHFの好ましからぬ損失を招くという欠点を有
している。 化学薬品を用いない単純な冷却沈澱法を用いた
方法（低温沈澱法）では、フアクターの生産量
が一般の血液銀行で行う方法としては少な過ぎ、
医療用に用いるには血液中のフイブリノーゲンの
含有量が高過ぎるため、この方法は好ましくない
ものと考えられている。 低イオン強度の緩衝液内の低温沈澱物からフア
クターを抽出する方法は最終製品のフイブリノ
ーゲンの含有量をある程度まで減少させるが、依
然として不当に高い蛋白含量を有しており、特殊
な装置と遠心分離行程が必要であり、且つ精製を
阻害することなく低温沈澱物から抽出することの
できるAHFの全量が制限されてしまう。 また、AHFの大規模生産に関連する他の問題
は、特に発熱性物質、同種血球凝集素および肝炎
誘発ウイルス（肝炎関連抗原、HAA）による最
終製品の汚染である。ある種の沈澱剤は好ましか
らぬこれら不純物の存在を助長する。現在、高純
度のフアクター濃縮物の製造においては、一般
にポリエチレングリコールが用いられているが、
このような方法では高濃度のポリマーを使う必要
があるので、最終製品から過剰のポリエチレング
リコールを除去するために洗浄と再沈澱をする必
要がある。従つて、これらの方法においては
AHFのさらなる損失をこうむる。この点に関し
ては次の各文献を参照されたい。M.ヴイカーハ
ウザの“低温エタノール沈澱物からのフアクター
―濃縮物の大規模分別法”（参照文献１）、E.
シヤンブロンとL.フエケトの“濃縮AHFの低温
沈澱物を分別するためのポリエチレングリコール
とグリシンを用いた安定な高力価ヒトAHFの製
法”、米国特許第3631018（参照文献２）、J.T.ス
グリスとM.ヴイカーハウザの“医療用濃縮フア
クターの製造のための凍結低温沈澱物の利
用”、Transfusion，13399（1973）（参照文献
３）、ニユーマン、A.J.ジヨンソン、M.H.カルパ
トキンとS.プスキンの“医療上有効な中間体およ
び高純度濃縮フアクターの製造法”、Brit.J.
Haemat、1971、211（参照文献４）、L.F.フエケ
トとS.L.ホルストの“ヘパリンを用いるAHFの
安定化”、米国特許第3803115号（参照文献５）。 本発明による方法は、前記の問題点を排除し、
前記の化学的沈澱法に関連した欠点を持たず、且
つ、４容量％のポリエチレングリコールの添加に
よりフイブリノーゲンと変性並びに分解生成物と
を選択的に沈澱させ、この沈澱を分離し、沈澱を
分離した溶液にさらに２容量％のポリエチレング
リコールを添加することによつてフアクターを
選択的に濃縮する簡単な方法を特徴とするもので
ある。フイブリノーゲンの除去に伴つて、以下で
述べるように、変性並びに分解生成物をも除去で
きる。 フアクターの損失を伴わずにフイブリノーゲ
ンを選択的に除去することは、一般に高純度
AHF濃縮物の大規模生産のための実際的方法と
しては従来行なわれていなかつた。事実、ビツカ
ーハウザはAHFの抽出時間と温度とが重要な要
素であること９強調している。すなわち“緩衝液
トリスを用い、30℃で60分以上の長期に亘る抽出
を行なうことによりAHFの収率はわずかに増大
するが、抽出物は更に一層フイブリノーゲン凝集
物で汚染され、その結果最終濃縮物の濾過が困難
になる”ことを強調している。 “高純度フアクターを高収率で製造するため
の簡単な方法”と題する1975年６月16日付けE.
シヤンブロンの米国特許出願第586948号（参照文
献７）は、高純度のフアクター濃縮物を高収率
で大量生産するためのフイブリノーゲンの低温選
択沈澱法を利用する方法を目的とするものであ
る。この方法は低温下にポリエチレングリコール
による沈澱法を利用することによつて、調製物を
さらに精製および濃縮することができるというこ
とを示している。 最近まで、AHF濃縮物の製造にポリエチレン
グリコールを用いる全ての方法では、使用するポ
リマー濃度が高い（10〜12％）ため、グリシンや
アルコールによる余分の洗浄および／または再沈
澱工程を行う必要があつた（前記参照文献１、２
等参照）。最近ではポリエチレングリコールで低
温沈澱するという考えが用いられるようになつ
た。C.ベルミール、B.A.M.スートおよびH.G.J.
ブルームルイスの“濃縮フアクターの調製法の
改良”、1975年７月、パリでのヘマトスタシスと
スロンボシス国際学会報告書（参照文献８）参
照。しかし、フイブリノーゲンを沈澱させるため
に用いるポリエチレングリコールの濃度はわずか
に２1/2％であるため、得られる生成物の純度は
低い。さらに、これらの著者はタンパク濃度を重
要視しておらず、フイブリノーゲンの不可逆沈澱
を避けるためにマンデル酸塩を用いているため
に、生成物の純度はかなり低く且つ収率も低い。
同様に、シヤンブロンとフエケトの方法（前記文
献２）でもポリエチレングリコールの沈澱段階に
おいて比較的低いタンパク濃度、すなわち10容量
の緩衝溶液中に沈澱物１容量を用いている。その
ため、収率は低く且つ純度にも限界がある。これ
らの著者並びにジヨンソン等（参照文献４）およ
びジヨンソン等の“ポリエチレングリコールを用
いて血漿から調製された抗血友病フアクター”、
米国特許第3652530号（参照文献６）はAHFを最
終的に濃縮するために10〜12％のポリエチレング
リコールを用いているので、最終生成物中のポリ
エチレングリコール含有量を低下させる目的で、
グリシンまたは冷エタノールによる余分の溶解並
びに再沈澱を行う必要があつた。 タンパク濃度と低温ポリエチレングリコール沈
澱とが重要であり且つ純粋な生成物に導くという
ことの別の証明は“不完全”同種血球凝集素（抗
体）がほとんど排除されているということにあ
り、それによつて、商業的に実際に使用し得る濃
度で多量に注射する必要がある場合に起り得る、
溶血作用の危険性を回避することができる。（R.
A.シーラー、M.テリシイ、P.L.ラングヘニング
およびJ.B.アスヘンヌルスの“濃縮物凝集におけ
る抗―Ａおよび抗―Ｂ力価”、1975年のヘルシン
キにおける国際輸血学会抄録参照（参照文献
９））。 本発明による生成物の独特な他の特色は純度が
高い（すなわち、低タンパク含有量）ということ
であり、特にフイブリノーゲンの検出量が少ない
という点にある。このように純度が高いため生成
物は高い溶解性を有し、復元した後にもビンの中
には不溶性物質がまつたく存在しない程に可溶性
である。これによつて、患者に注射する前に不溶
性タンパクを除去するために必要な特殊フイルタ
ーやフイルター付き針を用いる必要がなくなる。
また、金属粒子によるフアクター濃縮物の汚染
も回避される。（I.A.クーパー、J.H.マツクアダ
ム、M.S.マツケンジー、J.F.ダビドソンの“金属
粒子によるフアクター濃縮物の汚染”
Lancet、（1974年12月21日）、第1515頁（参照文
献10））。 前記の方法あるいはその一部分は他の方法で製
造した濃縮フアクターの発熱性ロツトを“再処
理”して、医療者にとつて利用価値のない発熱性
フアクターを有用なものに変えるために本発明
を利用することもできる。本発明で詳細に説明す
る方法を行なうことによつて、再処理した生成物
から発熱性物質が除去される。 本発明によつて得られる前記の思いがけない大
きな効果は従来法の教えや方針とは逆であり、系
統的研究の過程でその原理を偶然見つけたもので
ある。 本発明は極めて純度の高いフアクター濃縮物
を大量生産するための独特な方法に関するもので
ある。本発明の操作の中で最も特徴的な操作は４
容量％のポリエチレングリコールの添加により過
剰量のフイブリノーゲンと変性並びに分解生成物
を選択的に沈澱させ、同種血球凝集素などの望ま
しくない他のタンパクを除去し、AHFの活性を
不当に失わせずに、さらに２容量％のポリエチレ
ングリコールを添加して低温沈澱させることによ
りフアクターを濃縮させることにある。その他
の顕著な特色は、用いた血漿の理論量の約20〜40
％という驚くほどに高いフアクターの収率にあ
る。さらに、AHFの収率が上つたにもかかわら
ず、タンパク含有率、特にフイブリノーゲンの含
有量は他の方法による生成物と比較して明らかに
少なくなる。このことは添付の表１に示されてい
る。純度の高い凍結乾燥AHF濃縮物の収率を上
げる必要性は世界的に認識されており、国際的な
計画として注目を集めている。Am.N.Y.Acad.
Sci.，240、1975の“血友病の最近の進歩”（参照
文献11）や、J.G.プールの“フアクター物語の
最近の出来事：タンパクの危険性、West J.of
Med.，122.406（1975）（参照文献12）を参照さ
れたい。純度の高い製品を作る時の収率は依然と
して極めて低い一方で、市販の濃縮物の濃度は血
漿中におけるAHF理論量の20％以下であるとい
うことが一般に知られている（参照文献11の第
156、208頁、参照文献５、８参照）。 以下の表１における数値の内、本発明の方法に
よつて得られる結果以外の数値はロバート、ブレ
ツケンリツジの論文：“血友病に関する最近の進
歩”、Ann.N.Y.Acad.of Science，240、1975から
とつたものである。 Using selective precipitation, absorption and fractional elution, extraction in weakly ionic media, and chromatography,
Anti-hemophilia factor (AHF) for medical use
In other words, various methods for producing such factors are already known. The chemicals most frequently used in precipitation methods are alcohol, tannic acid,
ammonium sulfate, glycine and polyethylene glycol. Although several other plasma proteins can be removed by purification of these factors, fibrinogen is the most abundant of these proteins and is particularly susceptible to treatments such as alcohol precipitation, freezing, and thawing. This is the most troublesome thing if it degenerates. The denatured fibrinogen inhibits the filtration of AHF, resulting in significant losses of AHF during the purification step and reducing the solubility of the lyophilized product in the reconstitution liquid. Therefore, it is necessary to remove large amounts of fibrinogen during the entire purification process of AHF. The selective precipitation methods described above are used for this purpose, but these methods either further alter fibrinogen and AHF or
It has the disadvantage of causing undesirable loss of AHF. In the method using a simple cold precipitation method that does not use chemicals (low temperature precipitation method), the amount of factor produced is too small for a method used in general blood banks.
This method is considered undesirable because the fibrinogen content in the blood is too high for medical use. Although the method of extracting the factor from cryogenic precipitates in low ionic strength buffers reduces the fibrinogen content of the final product to some extent, it still has an unreasonably high protein content and requires specialized equipment and centrifugation. steps are required and limit the total amount of AHF that can be extracted from the cryoprecipitate without interfering with purification. Also, other problems associated with large-scale production of AHF are contamination of the final product, especially with pyrogens, allohemagglutinins and hepatitis-inducing viruses (hepatitis-associated antigens, HAAs). Certain precipitants promote the presence of these undesirable impurities. Currently, polyethylene glycol is commonly used in the production of high-purity factor concentrates;
These methods require the use of high polymer concentrations and require washing and reprecipitation to remove excess polyethylene glycol from the final product. Therefore, in these methods
AHF suffers further losses. Regarding this point, please refer to the following documents. M. Wikerhauser, “Large-scale fractionation of factor-concentrates from cryogenic ethanol precipitates” (Ref. 1), E.
Chiambron and L. Houeket, “Production of stable high-potency human AHF using polyethylene glycol and glycine for fractionation of the cryogenic precipitate of concentrated AHF,” U.S. Patent No. 3631018 (Ref. 2), J.T. . Wiker Hauser, “Use of frozen cryoprecipitates for the production of medical concentration factors,” Transfusion, 13399 (1973) (ref. 3); Newman, AJ Johnson, MH Karpatkin and S. Puskin, “Medically effective “Production of intermediates and high-purity enrichment factors”, Brit.J.
Haemat, 1971, 211 (ref. 4), LF Huecket and SL Horst, “Stabilization of AHF with Heparin”, US Pat. No. 3,803,115 (ref. 5). The method according to the invention eliminates the above problems and
It does not have the disadvantages associated with the chemical precipitation methods described above and selectively precipitates fibrinogen and denaturation and decomposition products by adding 4% by volume of polyethylene glycol, separates the precipitate, and separates the precipitate. It features a simple method to selectively concentrate the factors by adding an additional 2% by volume of polyethylene glycol to the solution. Along with fibrinogen removal, denaturation and decomposition products can also be removed, as discussed below. Selective removal of fibrinogen without loss of factors generally results in high purity
A practical method for large-scale production of AHF concentrates has not previously been implemented. In fact, Bitkerhauser emphasizes that AHF extraction time and temperature are important factors9. Thus, ``prolonged extraction with buffer Tris at 30°C for more than 60 minutes slightly increases the yield of AHF, but the extract becomes even more contaminated with fibrinogen aggregates, resulting in lower final concentration. It emphasizes that "it becomes difficult to filter substances." E., June 16, 1975, entitled “A Simple Method for Producing High-Purity Factors in High Yields.”
US patent application Ser. No. 586,948 to Chiambrone (Ref. 7) is directed to a process utilizing low temperature selective precipitation of fibrinogen to produce high yields of high purity factor concentrates in large quantities. This method shows that the preparation can be further purified and concentrated by using precipitation with polyethylene glycol at low temperatures. Until recently, all methods using polyethylene glycol to produce AHF concentrates required extra washing and/or reprecipitation steps with glycine or alcohol due to the high polymer concentrations used (10-12%). (References 1 and 2 above)
etc.). Recently, the idea of low-temperature precipitation with polyethylene glycol has come into use. C. Bellemire, BAM Soot and HGJ
See Bloom-Lewis, “Improvements in the Preparation Method for Concentration Factors”, Report of the International Society of Hematostasis and Thrombosis, Paris, July 1975 (Reference 8). However, since the concentration of polyethylene glycol used to precipitate the fibrinogen is only 21/2%, the purity of the product obtained is low. Moreover, these authors do not attach importance to protein concentration and use mandelate to avoid irreversible precipitation of fibrinogen, resulting in rather low product purity and low yield.
Similarly, the method of Chiambron and Huecket (cited above) uses a relatively low protein concentration in the polyethylene glycol precipitation step, ie 1 volume of precipitate in 10 volumes of buffer solution. Therefore, the yield is low and the purity is also limited. These authors as well as Jyonson et al.
Since U.S. Pat. No. 3,652,530 (Reference 6) uses 10-12% polyethylene glycol for final concentration of AHF, in order to reduce the polyethylene glycol content in the final product,
Additional dissolution with glycine or cold ethanol and reprecipitation were necessary. Another proof that protein concentration and low temperature polyethylene glycol precipitation are important and lead to a pure product is that "incomplete" allohemagglutinins (antibodies) are largely eliminated, thereby This may occur when it is necessary to inject large quantities at concentrations that can be practically used commercially.
The risk of hemolytic effects can be avoided. (R.
See A. Seeler, M. Tellisii, PL Langhenning and JB Aschennulls, “Anti-A and anti-B titers in concentrate agglutination”, Abstracts of the International Congress of Blood Transfusion, Helsinki, 1975 (ref. 9). Another unique feature of the products according to the invention is their high purity (ie low protein content) and in particular the low detectable amounts of fibrinogen. Due to this high purity, the product has a high solubility and is so soluble that even after reconstitution there is no insoluble material present in the bottle. This eliminates the need for specialized filters or filtered needles to remove insoluble proteins prior to injection into the patient.
Contamination of the factor concentrate with metal particles is also avoided. (“Contamination of factor concentrates with metal particles” by IA Cooper, JH Matsuku Adam, MS Matsukenzie, JF Davidson)
Lancet, (December 21, 1974), p. 1515 (Reference 10)). The above method, or a portion thereof, utilizes the present invention to "reprocess" pyrogenic lots of concentration factors produced by other methods, converting pyrogenic factors of no use to the medical practitioner into something useful. You can also use it. By carrying out the process detailed in this invention, pyrogens are removed from the reprocessed product. The above-mentioned unexpectedly large effect obtained by the present invention is contrary to the teachings and policies of conventional methods, and its principle was accidentally discovered in the course of systematic research. The present invention relates to a unique method for producing highly pure factor concentrates in large quantities. The most characteristic operations of the present invention are 4.
The addition of % by volume polyethylene glycol selectively precipitates excess fibrinogen and denaturation and degradation products and removes other undesirable proteins such as allohemagglutinin without unduly losing AHF activity. , furthermore, 2% by volume of polyethylene glycol is added and the factor is concentrated by low-temperature precipitation. Another notable feature is that approximately 20-40% of the theoretical amount of plasma used
%, a surprisingly high factor yield. Moreover, despite the increased yield of AHF, the protein content, especially the fibrinogen content, is clearly lower compared to products from other methods. This is shown in the attached Table 1. The need to increase the yield of highly pure freeze-dried AHF concentrates is recognized worldwide and is attracting attention as an international project. Am.NYAcad.
Sci., 240, 1975, “Recent Advances in Hemophilia” (ref. 11), JG Poole, “Recent Events in the Factor Story: The Danger of Proteins,” West J.of
Med., 122.406 (1975) (ref. 12). It is generally known that the concentration of commercially available concentrates is less than 20% of the theoretical amount of AHF in plasma, while yields for high-purity products are still extremely low (ref.
156, 208, see references 5 and 8). The numerical values in Table 1 below, other than those obtained by the method of the present invention, are taken from Robert Bretzkenridge's article: “Recent Advances in Hemophilia”, Ann.NYAcad.of Science, 240, 1975. It's a great thing.

【表】 本発明の目的はフアクターと２回の合計で約
６容量％のポリエチレングリコールを含む緩衝液
を、そこに沈澱が生成されるまで、約０〜５℃の
温度に維持する段階を含むことを特徴とする、フ
アクター濃縮物の製造方法にある。 特に、本発明は、緩衝溶液中の血漿または血漿
の低温沈澱物溶液から、該溶液に約４容量％のポ
リエチレングリコールを加えることによりフイブ
リノーゲンを選択的に沈澱させ、ポリエチレング
リコールの濃度を約６％となるまで高めて該溶液
中のフアクターを濃縮し、且つ沈澱が生じるま
で約０〜５℃の温度で６％ポリエチレングリコー
ル含有溶液を維持することを特徴とする方法を目
的とする。次いで不純物である不用なタンパクを
実質的に含まない純度の極めて高いフアクター
含有溶液にするために沈澱したフアクターを緩
衝溶液中に再溶解することができる。 本発明の好ましい実施の態様では、本発明の方
法は次の各特色を単独または組合せとして有して
いる。すなわち、 ― フアクターの供給源はその体積の約２〜４
倍の緩衝液に溶解した低温沈澱物である。 ― 緩衝液に対する低温沈澱物の容量比は約１〜
３である。 ― 沈澱したフアクターを緩衝液に再溶解し、
得られた溶液を約12〜24時間、約0.5〜５℃の
温度に維持し、次いでこの溶液から生成される
粒状物質を分離して、フイブリノーゲンやその
断片およびそれらの複合物を実質的に含まない
フアクターを得るといつた一連の段階によつ
て前記方法が構成されていてもよい。 ― 緩衝液はクエン酸塩緩衝液である。 ― 使用するポリエチレングリコールとして、ポ
リエチレングリコール4000を使用することがで
きる。 ― ６％ポリエチレングリコール存在下でのフア
クターの沈澱はPH6.8〜7.2で行うのが好まし
い。 ― ４％ポリエチレングリコールの存在下でのフ
イブリノーゲンの予備沈澱はPH6.0〜6.5で、約
20〜30℃の温度にて行なうことが好ましい。 以下、本発明の好ましい態様について説明す
る。以下、特に断らない限り遠心分離操作は公知
方法に従つて行つた。 例えば100〜3000リツトルの凍結血漿を約−５
℃〜約２℃の温度で解凍し、適当な容器に入れ
る。これより大きな容積の血漿を処理することも
可能だが、操作が困難になる。低温下で不溶な成
分（低温沈澱物）は３℃以下の温度で、好ましく
は連続循環型遠心分離機（シヤープレスあるいは
その類似遠心分離機）で回収する。他の回収方法
は使えるが効率は低下する。この低温沈澱物を秤
量し、小サンプルにして取出すかあるいは数秒間
ワーリング型混合器内で混合してペーストまたは
エマルジヨンを作る。この低温沈澱物またはその
ペーストのサンプルを0.02モルのクエン酸三ナト
リウムと0.1モルのグリシンで構成される２〜４
容量の緩衝液に溶かし、温度20〜30℃でクエン酸
でPHを6.9に調整する。完全溶解後に、PH6.0〜6.5
にて約25℃の温度下でポリエチレングリコール
4000を４％加えてフイブリノーゲンを選択的に沈
澱させる。沈澱物をシヤープレス型装置内で連続
遠心分離することにより除去し、上澄液体のPHを
6.8〜7.2に調整する。ポリエチレングリコールを
２％の追加量でさらに添加し、沈澱物が肉眼で見
える程度に形成されるまで懸濁液を０〜５℃で冷
却する。 これら溶解と沈澱操作は全て連続的に撹拌しつ
つ２重壁反応槽内で、泡の発生を防止しながら行
う。 前記の第２沈澱工程に続いて、１〜２℃で連続
循環式遠心分離を行なつて上澄み液を除去する。
こうして得られた沈澱物は次いでグリシン―クエ
ン酸塩緩衝液まはクエン酸塩緩衝液中に溶解され
る。この容積は低温沈澱物の量並びに最初の溶液
内に存在するAHFの単位数によつて決定され
る。この容積を計算する方法は次の２つである。 すなわち １ 最終沈澱物を最初の血漿の容積の1/100に等
しい容積の緩衝液に溶解する。 ２ 最終沈澱物を沈澱物重量の15〜25倍に等しい
容積の緩衝液に溶解する。この溶液のPHをクエ
ン酸で6.7〜6.9に調整し、精製し、次いで例え
ば直径が1.2―0.65―0.45―0.3ミクロンの孔を
有する複数のミクロポアメンブランフイルター
（フイルターの厚さは293mmまたはカートリツジ
と同じ）に前記液体を通して滅菌する。最初の
血漿中のフアクターの約20〜40％を含むこの
滅菌溶液は保存のために公知の方法で凍結乾燥
される。 本発明の別の態様によれば第１の態様に記載し
た方法を実施するが、最終濾過段階を行なう前
に、生成物を冷蔵室（0.5〜５℃）内に静置して
12〜24時間放置しておく。この放置期間後に生じ
る白い凝集物をデカンテーシヨン、遠心分離ある
いは予備濾過によつて除去する。この最終生成物
を前記のように濾過して滅菌し、同様な方法で凍
結乾燥する。この生成物は前記の生成物と同じ純
度を持ち且つ容易に濾過し得るものである。この
補足的な操作をすることによるフアクターの損
失はない。 こうして得られた製品は５℃の貯蔵温度で２年
間の間貯蔵でき、蒸留水あるいは生理的漿液で復
元することができる。この製品は純度が極めて高
く且つフイブリノーゲン含有量が極めて少ないの
で、その凍結乾燥製品は迅速に（１〜２分で）溶
解させることができる。血漿ビンの口を開けてか
らの全処理時間は他の方法に比べて極めて短いの
で、バクテリアの増殖が制限される。最初の溶解
が単に少量の緩衝液内で行なわれているため溶液
中に入るγ―グロブリンの量を減らすことがで
き、過剰のフイブリノーゲンは４％のポリエチレ
ングリコール濃度を用いることによつて最大限沈
澱させることができる。さらに、フイブリノーゲ
ンが凝集した重質沈澱物は一緒に発熱性物質をも
取り込み、肝炎関連抗原（HAAまたは肝炎ウイ
ルス）の量を減すことができる。低温沈澱工程に
おいて単に６％のポリエチレングリコールしか用
いないので、緩衝液が少ない場合に溶け込むおそ
れのある好ましくないタンパク、特に同種血球凝
集素はAHFと共に沈澱せず、これらのタンパク
は上澄液と共に除去される。かくして血漿に対し
て200〜400倍の純度を有し且つフイブリノーゲン
および同種血球凝集素の極めて少ない製品を得る
ことができる。例えば10倍容量の抽出用緩衝液を
用いて（参照文献２）大量の緩衝液でフアクター
濃縮物を製造すると、共沈の際のポリマーに対
するタンパクの最適比率が達成されないために前
記と同程度の純度やAHFの収率を達成できな
い。（参照文献１、２、３、４、８）。本発明の製
品は必要に応じて公知または新規な方法でさらに
精製並びに濃縮することもできる。本発明の大き
な利点は他の方法に必要な時間の1/2もくしは2/3
の時間で純度の高いAHFを大量生産できるとい
う点にある。 以下本発明を非限定的実施例によりさらに具体
的に説明する。 実施例 出発物質は凍結血漿を＋２℃まで加熱すること
によつて得られる低温型沈澱物であつた。不溶解
分として残る留分（低温型沈澱物）は＋２℃にお
いて遠心分離によつて集められた。この低温型沈
澱物の2130ｇが23℃の温度において緩衝液（クエ
ン酸ナトリウム0.02モル＋グリシン0.1モル）の
3700mlと混合された。クエン酸を加えることによ
つてPHは6.3に調節された。溶液の全容量は5800
mlであつた。この溶液はつぎの内容を有するもの
であつた。 フアクター：21.3μ／ml（μ：国際単位） 全タンパク（TP）：58.5ｇ／ フイブリノーゲン：39.8ｇ／ 比活性：（TPの１ｇ当たり）：364μ つぎにポリエチレングリコール4000が、４％濃
度になるまで23℃の温度でこの溶液に加えられ
た。沈澱物は遠心分離によつて除去されて廃棄さ
れた。上澄液5000mlはPH6.9に調節され、６％濃
度になるまでポリエチレングリコール4000が加え
らた。この懸独液は＋１℃に冷却された。沈澱物
は同温度で遠心分離によつて集められた。この沈
澱物60ｇは上記と同様なクエン酸緩衝液に溶解さ
れて、全容量は1730mlとなつた。この溶液はミク
ロポアメンブランで濾過することによつて滅菌さ
れた。 この精製されたフアクターの溶液の内容はつ
ぎのとおりであつた。 フアクター：35.1μ／ml 全タンパク（TP）：5.06ｇ／ フイブリノーゲン：0.8ｇ／ 比活性：TPの１ｇ当たり6950μ フアクターの1000μ当たりフイブリノーゲン
の重量（mg）：22.8 本発明を実際に実施した時の方法を前記した
が、本発明の原理に従つて従来の処理技術と材料
を用いて実施することができるということは明ら
かである。例えば、約100リツトル以下の血漿ま
たはこの量の血漿からの低温沈澱物を用いて操作
することは経済的なことではないが、前記した容
積は増減した値を用いて行なつても何ら不都合は
なく、容積の変動によつて本発明が阻害されるこ
とはない。前記した方法は例えばシヤープレス型
遠心分離機やワーリング型混合機のような公知の
入手容易な機械を使用して実施でき、発明の原理
とは無関係な各段階の操作自体並びに用いる機械
は本質的なものはなく、本発明の範囲を逸脱しな
い範囲で、当業者がその入手し得る機械を用いて
種々の変法を自由に行ない得ることは理解できよ
う。一旦、フアクターを高回収率で含む上澄み
液が得られれば、これは従来の処理法、例えば標
準型のミクロポアフイルターを通すことにより精
製しかつ減菌し、凍結乾燥して、貯蔵容易とすべ
く小容量にフアクターを濃縮し、例えば非発熱
性蒸留水または生理的漿液などの公知の液体を用
いて復元される。 本発明は前記した方法にのみ限定されるもので
はない。本発明によつて得られる生成物は患者に
とつて有利な独特な特性と、現在実際に作られて
いる実際のフアクター濃縮物が持つ特有の特性
とを備えている。すなわち、 １ 純度が最高に高く、従つて“比活性”が極め
て高い。 ２ 最終製品の溶解の迅速さと溶解度に関連し
て、溶解度が極めて大きいことは緊急治療にと
つて理想的である。 ３ タンパク含有量が極めて少なく、このことは
好ましくない副作用を減ずる。 ４ 免疫グロブリン含有量が極めて少ないため、
アレルギー作用が低い。 ５ 同種血球凝集素の含有量は無視できるほど小
さいため、溶血作用は無くなる。 ６ フイブリノーゲン含有量が極めて少ないの
で、高フイブリノーゲン血症併発症が無くな
る。 ７ 異種粒子が混入する危険が無いので、フイル
ター付注射針は不要である。 ８ 本発明方法の実施中に発熱性物質は除去され
るので、フアクターの利用性が増加する。 これらおよびその他の利点は単に例として示し
た前記方法および特許請求の範囲に示した方法に
よつて達成できる。[Table] The object of the present invention involves maintaining a factor and a buffer solution containing two times a total of about 6% by volume of polyethylene glycol at a temperature of about 0 to 5°C until a precipitate is formed therein. A method for producing a factor concentrate, characterized in that: In particular, the present invention selectively precipitates fibrinogen from plasma or cryoprecipitated solutions of plasma in a buffered solution by adding about 4% by volume of polyethylene glycol to the solution, reducing the concentration of polyethylene glycol to about 6%. and maintaining the 6% polyethylene glycol-containing solution at a temperature of about 0 to 5° C. until precipitation occurs. The precipitated factors can then be redissolved in the buffer solution to obtain an extremely pure factor-containing solution that is substantially free of unwanted protein impurities. In preferred embodiments of the invention, the method of the invention has the following features alone or in combination: i.e. - the source of the factor is approximately 2 to 4 of its volume
Cryoprecipitate dissolved in 1x buffer. - The volume ratio of cryogenic precipitate to buffer is approximately 1~
It is 3. - redissolve the precipitated factor in buffer;
The resulting solution is maintained at a temperature of about 0.5 to 5°C for about 12 to 24 hours, and the particulate material produced from the solution is then separated to substantially contain fibrinogen, its fragments, and complexes thereof. The method may consist of a series of steps, such as obtaining a factor that is not present. - The buffer is a citrate buffer. - Polyethylene glycol 4000 can be used as the polyethylene glycol. - Precipitation of the factor in the presence of 6% polyethylene glycol is preferably carried out at a pH of 6.8 to 7.2. - Pre-precipitation of fibrinogen in the presence of 4% polyethylene glycol at pH 6.0-6.5, approx.
Preferably it is carried out at a temperature of 20-30°C. Preferred embodiments of the present invention will be described below. Hereinafter, unless otherwise specified, centrifugation operations were performed according to known methods. For example, 100 to 3000 liters of frozen plasma should be
Thaw at a temperature of ~2°C and place in a suitable container. It is possible to process larger volumes of plasma, but this makes the process more difficult. Components that are insoluble at low temperatures (low temperature precipitates) are recovered at temperatures below 3° C., preferably in a continuous circulation centrifuge (shear press or similar centrifuge). Other recovery methods can be used but are less efficient. The cryoprecipitate is weighed and removed in small samples or mixed in a Waring mixer for a few seconds to form a paste or emulsion. A sample of this cryoprecipitate or its paste is prepared from 2 to 4
Dissolve in a volume of buffer solution and adjust the pH to 6.9 with citric acid at a temperature of 20-30 °C. After complete dissolution, PH6.0~6.5
polyethylene glycol at a temperature of approximately 25°C.
Add 4% of 4000 to selectively precipitate fibrinogen. The precipitate was removed by continuous centrifugation in a shear press type device, and the pH of the supernatant liquid was
Adjust to 6.8-7.2. A further 2% of polyethylene glycol is added and the suspension is cooled at 0-5° C. until a precipitate is visible to the naked eye. All of these dissolution and precipitation operations are carried out in a double-walled reactor with continuous stirring to prevent the formation of bubbles. Following the second precipitation step described above, the supernatant liquid is removed by continuous circulation centrifugation at 1-2°C.
The precipitate thus obtained is then dissolved in glycine-citrate buffer or citrate buffer. This volume is determined by the amount of cryoprecipitate as well as the number of AHF units present in the initial solution. There are two methods to calculate this volume: 1. Dissolve the final precipitate in a volume of buffer equal to 1/100 of the initial plasma volume. 2 Dissolve the final precipitate in a volume of buffer equal to 15-25 times the weight of the precipitate. The pH of this solution is adjusted to 6.7-6.9 with citric acid, purified and then filtered through multiple micropore membrane filters with pores of 1.2-0.65-0.45-0.3 microns in diameter (filter thickness is 293 mm or same as cartridge). ) to sterilize the liquid. This sterile solution, containing about 20-40% of the factors in the initial plasma, is lyophilized for storage in a known manner. According to another embodiment of the invention, the method as described in the first embodiment is carried out, but before carrying out the final filtration step, the product is left in a cold room (0.5-5°C).
Leave it for 12-24 hours. The white aggregates that form after this standing period are removed by decantation, centrifugation or prefiltration. The final product is filtered and sterilized as described above and lyophilized in a similar manner. This product has the same purity as the previous product and is easily filterable. There is no loss of factor by performing this supplementary operation. The product thus obtained can be stored for a period of 2 years at a storage temperature of 5° C. and can be reconstituted with distilled water or physiological serum. Because this product is extremely pure and has a very low fibrinogen content, the lyophilized product can be dissolved quickly (1-2 minutes). The total processing time from opening the plasma vial is extremely short compared to other methods, thus limiting bacterial growth. The amount of γ-globulin entering the solution can be reduced since the initial lysis is simply carried out in a small volume of buffer, and excess fibrinogen is maximally precipitated by using a polyethylene glycol concentration of 4%. can be done. Furthermore, the heavy precipitate in which fibrinogen is aggregated also incorporates pyrogenic substances, which can reduce the amount of hepatitis-associated antigen (HAA or hepatitis virus). Because only 6% polyethylene glycol is used in the cryogenic precipitation step, undesirable proteins, especially allohemagglutinins, which may dissolve in low buffer volumes, are not precipitated with AHF, and these proteins are removed along with the supernatant. be done. It is thus possible to obtain a product that is 200 to 400 times more pure than plasma and extremely low in fibrinogen and allohemagglutinin. If a factor concentrate is prepared with a large amount of buffer (for example, using 10 times the volume of extraction buffer (Ref. 2)), the optimum ratio of protein to polymer during co-precipitation will not be achieved and the same level of Unable to achieve purity or yield of AHF. (References 1, 2, 3, 4, 8). The products of the invention can also be further purified and concentrated by known or novel methods, if necessary. A major advantage of the present invention is that it takes 1/2 or 2/3 of the time required for other methods.
The advantage is that high-purity AHF can be mass-produced in a time of . The present invention will be explained in more detail below using non-limiting examples. EXAMPLES The starting material was a cryogenic precipitate obtained by heating frozen plasma to +2°C. The fraction remaining as undissolved (cryogenic precipitate) was collected by centrifugation at +2°C. 2130 g of this low-temperature precipitate was mixed with a buffer solution (0.02 mol of sodium citrate + 0.1 mol of glycine) at a temperature of 23°C.
Mixed with 3700ml. The pH was adjusted to 6.3 by adding citric acid. Total volume of solution is 5800
It was hot in ml. This solution had the following contents. Factor: 21.3μ/ml (μ: international unit) Total protein (TP): 58.5g/Fibrinogen: 39.8g/Specific activity: (per 1g of TP): 364μ Next, add polyethylene glycol 4000 until the concentration is 4%. It was added to this solution at a temperature of 23°C. The precipitate was removed by centrifugation and discarded. 5000 ml of supernatant was adjusted to pH 6.9 and polyethylene glycol 4000 was added to a concentration of 6%. This suspension was cooled to +1°C. The precipitate was collected by centrifugation at the same temperature. 60 g of this precipitate was dissolved in the same citrate buffer as above to give a total volume of 1730 ml. This solution was sterilized by filtration through a micropore membrane. The contents of this purified factor solution were as follows. Factor: 35.1μ/ml Total protein (TP): 5.06g/Fibrinogen: 0.8g/Specific activity: 6950μ per 1g of TP Weight of fibrinogen (mg) per 1000μ of factor: 22.8 Method when the present invention was actually implemented Although described above, it will be apparent that the principles of the invention may be practiced using conventional processing techniques and materials. For example, it is not economical to operate with less than about 100 liters of plasma or cryoprecipitates from this amount of plasma, but there is no disadvantage in working with larger or smaller volumes. Therefore, the present invention is not hindered by variations in volume. The above-described method can be carried out using known and readily available machines, such as shear press centrifuges and Waring mixers, and the operations of each step, which are unrelated to the principles of the invention, as well as the machines used are essential. It will be appreciated that those skilled in the art are free to make various modifications using the machinery available to them without departing from the scope of the invention. Once a supernatant containing a high recovery of the factor is obtained, it can be purified and sterilized using conventional processing methods, such as passing through a standard micropore filter, and lyophilized for ease of storage. The factor is concentrated to a small volume and reconstituted using known liquids such as non-pyrogenic distilled water or physiological serum. The present invention is not limited to the method described above. The products obtained according to the present invention have unique properties that are advantageous to patients and have the unique properties of actual factor concentrates currently produced in practice. Namely: 1. It has the highest purity and therefore has an extremely high "specific activity". 2 Regarding the rapid dissolution and solubility of the final product, the extremely high solubility is ideal for emergency treatment. 3. Very low protein content, which reduces undesirable side effects. 4 Because the immunoglobulin content is extremely low,
Low allergic effect. 5 Since the content of allohemagglutinin is negligibly small, the hemolytic effect is eliminated. 6. Since the fibrinogen content is extremely low, complications of hyperfibrinogenemia are eliminated. 7. Filtered needles are not required as there is no risk of contamination with foreign particles. 8 During the implementation of the process of the invention pyrogens are removed, thus increasing the availability of the factor. These and other advantages can be achieved by the method described above and in the claims, given by way of example only.

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １ 血漿の低温沈澱によつて得られたフアクター
を含む緩衝液にPH6.0〜6.5のもとで４容量％の
ポリエチレングリコールを添加してフイブリノー
ゲンを沈澱させ、このフイブリノーゲンの沈澱を
溶液から分離し、さらにPH6.8〜7.2のもとで２容
量％のポリエチレングリコールを加え、フアクタ
ーの沈澱物が沈澱するまで溶液を０〜５℃の温
度に維持することを特徴とする、フアクター濃
縮物の製造方法。 ２ フイブリノーゲンの選択的沈澱工程が、温度
20〜30℃で行われる特許請求の範囲第１項記載の
方法。 ３ 緩衝液がクエン酸塩を含有する特許請求の範
囲第１項記載の方法。 ４ ポリエチレングリコールがポリエチレングリ
コール4000である特許請求の範囲第１項記載の方
法。[Claims] 1. Fibrinogen is precipitated by adding 4% by volume of polyethylene glycol to a buffer solution containing factors obtained by low-temperature precipitation of plasma at pH 6.0 to 6.5. Separating the precipitate from the solution, further adding 2% by volume of polyethylene glycol under pH 6.8-7.2, and maintaining the solution at a temperature of 0-5 °C until the precipitate of the factor is precipitated. , a method for producing factor concentrates. 2 The selective precipitation step of fibrinogen is
The method according to claim 1, which is carried out at 20-30°C. 3. The method according to claim 1, wherein the buffer contains citrate. 4. The method according to claim 1, wherein the polyethylene glycol is polyethylene glycol 4000.
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