JPS62266A - Ｌａｃ↑＋サツカロミセス・セレビシエ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 ラクトースを唯一の炭素源として利用する能力を菌株を
選択する方法に関する。

〔従来の技術〕

ホエー（乳漿）は多くの商業的酪農工程の副産物で、大
量のラクトースを含んでいる。ホエー中のラクトースは
、特にエタノールの製造にとっては、大量の潜在的な炭
素源かつエネルギ源を意味する。しかし、ホエーに含ま
れるラクトースを利用してラクトースを商業的に有用な
生成物に転化する方法は現在僅かしかない。さらに、現
在の方法は費用が高く、そのため現在大量のホエーが廃
棄され、高価な廃棄物処理工程が必要である。

ホエー中に含まれるラクトースを利用する種々の試みと
しては、タルイベロミセス・フラギリス（Ｋｌｕｙｖｅ
ｒｏｍｙｃｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓ）および他の酵母、
特にサツカロミセス・セレビシェの菌株による発酵があ
る。Ｓ、セレビシェを使用する際の主要な問題は、Ｓ、
セレビシェがラクトースを直接には発酵または利用でき
ないことである。ラクトースをまず加水分解して、Ｓ、
セレビシェが利用できるグルコースとガラクトースを形
成しなければならない。この方法は、ガラクトースを利
用する際の異化代謝産物抑制の原因となる高濃度の細胞
外グルコースを生成するので効率が悪い。異化代謝産物
抑制は、抑制に抵抗性の突然変異株を選択することによ
って多少は解決されてきた。これらの問題にもかかわら
ず、Ｓ、セレビシェはラクトース利用工程で使用するの
に望ましい酵母である。それはＳ、セレビシェが醸造工
業や製パン業で長年使用され、工業規模での使用方法が
高度に発達しているためである。さらに、Ｓ、セレビシ
ェは遺伝子工学を含む種々の技術によって遺伝子操作す
ることができる。最後に基礎研究の観点からは、で行わ
れているような種々の突然変異株選択法に用いることが
できるので、極めて有利である。したがって、ラクトー
スを直接利用し、発酵させることのできるＳ、セレビシ
ェの菌株を作製できれば、有効である。

Ｓ、セレビシェは、β−ガラクトシダーゼ構造遺伝子を
欠いており、したがってラクトースをグルコースとガラ
クトースとに加水分解することができないのでラクトー
スを利用できない。さらに、Ｓ、セレビシェはラクトー
スを細胞膜を横切って輸送する機構をもたない。このラ
クトース輸送機構の欠如は、Ｓ、セレビシェでのラクト
ース輸送を直接測定することにより、また細胞間ガラク
トシダーゼを生成するＳ、セレビシェの遺伝子操作した
菌株もラクトースで生育しないという報告により、実証
されている。Ｓ、セレビシェに輸送機構を創出する方法
の一つは、ラクトース透過酵素遺伝子、たとえばＥ、コ
リの１ａｃＹ遺伝子を、β−ガラクトシダーゼを生成す
るように遺伝子操作したＳ、セレビシェの菌株に導入す
る方法であろう。しかしこのアプローチは何故か成功し
たことがない。もう１つのアプローチは、Ｓ、セレビ＞
Ｘに、別の酵母からのラクトース透過酵素遺伝子を組み
込む方法であろう。

酵母タルイベロミセス・ラクチスはラクトースを唯一の
炭素源として生育でき、誘導ラクトース透過酵素システ
ムを有することが知られている。

透過酵素をコードする遺伝子はまだ固定されていない。

Ｋ、ラクチスのクローンバンクをβ−ガラクトシダーゼ
を合成するＳ、セレビシェの菌株に形質転換し、形質転
換細胞をラクトースでの生育に関して選択することによ
り、ラクトース透過酵素遺伝子を単離する試みは成功し
ていない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明の目的は、遺伝子操作したラクトースを唯一の炭
素源として利用する能力を有するサツカロミセス・セレ
ビシェの菌株を提供することにある。

・セレビシェの菌株を形質転換させることにある。

■の領域を含むプラスミドを挿入することによって、上
記Ｓ、セレビシェを形質転換する方法を提供することに
ある。

本発明のさらに他の目的は、Ｋ、ラクチスから誘導した
ＬＡＣ，！−ＬＡＣＩ　２の領域を含むプラスミドを提
供することにある。

本発明のさらに別の目的は、ラクトースをまずグルコー
スとガラクトースとに転換する予備加水分解工程なしで
、ホエーからラクトースを直接発酵させることができる
Ｓ、セレビシェの菌株を提供し、したがってホエーから
エタノールを製造する経済的な方法を提供することにあ
る。

本発明のさらに別の目的は、ラクトースを利用する能力
を有する結果ホエーで生育するＳ、セレビシェおよび他
の酵母の菌株を構成する方法を提供することにある。

本発明の他の目的および利点は、本発明の説明が進行す
るにつれて明らかになるであろう。

〔問題点を解決するための手段〕

以上の目的および利点を実現するため、本発明は遺伝子
工学的に作製した、ラクトースを唯一の炭素源として利
用する能力を有するサツカロミセス・セレビシェの菌株
を提供する。Ｓ、セレビシクチスから誘導したラクトー
ス透過酵素遺伝子（ＬＡＣ１２）を含むプラスミドを挿
入することに含ませなくてはならない。本発明は、ＬＡ
Ｃ４およびＬＡＣ１２を含むプラスミドならびにこれを
用いてＳ、セレビシェを形質転換し選択する方法も提供
する。

〔具体的説明〕

本発明は遺伝子工学的に作製したＳ、セレビシエの菌株
に関し、この菌株はラクトースを唯一の炭素源として利
用する能力を有するように形質転セレビシェに挿入する
ことによって形質転換される。ラクトースを利用できる
ためには、Ｓ、セレビシェはさらにに、ラクチスのβ−
ガラクトシダーゼ構造遺伝子ＬＡＣ４を含んでいなくて
はならず、このＬＡＣ４はＬＡＣｌ　２遺伝子と同時に
Σ。

セレビシェに形質転換するか、別の方法で菌株に挿入す
ることができる。あるいは、Ｅ、コリから誘導した１ａ
ｃＺが酵母プロモータと融合して酵母中でのβ−ガラク
トシダーゼの合成を可能にするならば、ＬＡＣ４のかわ
りにＩａｃＺ遺伝子を用いることもできる。

さらに本発明は、Ｋ、ラクチスからのＬＡＣｌ主遺伝子
を含むプラスミドならびにこれらのプラスミドをＳ、セ
レビシェに挿入することによりΣ。

セレビシェを形質転換する方法にも関する。

オペロン遺伝子ＺＹＡの一部とＨＴＳ４プロモータとの
融合により、高レベルのβ−ガラクトシダーゼ酵素活性
を生じる。この菌株は、すてにβ−ガラクトシダーゼを
産生ずるので、理論的には、機能的ラクトース透過酵素
系を菌株に導、入すれば、ラクトースで生育するはずで
ある。この菌株はすでにＥ、コリのラクトース透過酵素
をコードづけるＩａｃＹ遺伝子を含んでいるにもかかわ
らず、Ｌ１５８２菌株がラクトースでは生育しないこと
から、明らかにこの透過酵素は機能的ではない。

さらに別の系統のＳ、セレビシェＹＮＮ２７も使用した
。この菌株はＥ、コリのｌａｃオペロンのいずれの部分
も含まなかった。この菌株は組換えＤＮＡ実験ではうま
く働くことを確かめた。

本発明のプラスミドｐＫＲＩＢ−ＬＡＣ４−１は、抗生
物質Ｇ４１８への耐性に関する遺伝子およびに、ラクチ
スおよびＳ、セレビシェの複製を可能とするに、ラクチ
スのＡＲ３も含む。このプラスミドは、β−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子、ＬＡＣ４および以下に示したように、ラ
クトース透過酵素をコードするＤＮＡの隣接領域、ＬＡ
Ｃ１２を含むに、ラクチスのＤＮＡ１４キロベース（ｋ
ｂ）の断片を有する。さらに親ベクターｐＫＲＩＢも使
用し、このｐＫＲＩＢはＧ４１８耐性遺伝子を含むが、
ＬＡＣ４またはＬＡＣ１２遺伝子を含まない。

本発明は、ラクトースを唯一の炭素源として利用するこ
とのできるＳ、セレビシェの菌株を提供する。本発明の
種として好ましいのは、サツカロミセス・セレビシェの
系統である、ｐＫＲＩＢ−ＬＡＣ４−１で形質転換した
Ｌ１５８２と、ｐＫＲＩＢ−ＬＡＣ４−１で形質転換し
たＹＮＮ２７である。形質転換したＬ１５８２、ＡＴＣ
Ｃ２０７５７、形質転換したＹＮＮ２７、ＡＴＣＣ２０
７５８、及びｐＫＲＩＢ−ＬＡＣ４−−１、ＡＴＣＣ４
０１８６の培養は米国基準菌株保存機関（Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏ
ｎ）　　（米国２０８５２、メリーランド州、ロックビ
ル、パークレーン・ドライブ１２３０１番地（１２３０
１ＰａｒｋＬａｉｖｎＤｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌ
ｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ　２０８５２　）に寄託してあり
、上述の受託番号がつけられている。いずれについても
寄託物は、米国３７ＣＦＲ１，１４および米国特許法１
２２条の規定により入手が可能である場合を除いては、
特許証が発行されてこの寄託物が開示される時点まで制
限されている。特許証の発行後は、寄託された培養の公
衆の利用可能性に関するすべての制限は撤回条項なしで
取り外される。寄託物は寄託臼から３０年間にわたって
維持され、したがって公衆は特許証発行後は永久に培養
を入手できる。

ラクトースで生育するＳ、セレビシェを構成するために
、菌株Ｌ１５８２をｐＫＲＩＢ−ＬＡＣ土−１で形質転
換し、細胞を０４１８に対する耐性について選択した。

６４１８耐性の形質転換細胞をＹＥＰＤ／Ｇ４１８平板
上でコロニー純化し、純化したコロニーを無作為に選び
、Ｍ　ｉ　ｎ　Ｌ　ａ　ｃ平板（最少ラクトース培地、
Ｍｉｎｆｍａｌ　Ｌａｃｔｏｓｅ　Ｍｅｄｉｕｍ）およ
びＹＥＰＤ平板にその順番で滴下した。

Ｇ４１８及びＹＥＰＤ平板上ではすべてのコロニーが生
育した。Ｍ　ｉ　ｎ　Ｌ　ａ　ｃ平板上ではコロニーの
１９％しか生育しなかった。別の実験では、１０”−１
０’個の０４１８耐性形質転換細胞をＭｉ　ｎＬａ　ｃ
平板上にばらまいた。再度１９％のＧ４１８耐性コロニ
ーがラクトースで生育した。対照として、Ｌ１５８２も
親ベクターｐＫＲＩＢで形質転換した。こうして得られ
た６４１８耐性形質転換細胞を選択し、Ｍ　ｉ　ｎ　Ｌ
　ａ　ｃ平板上に細胞１０６−１０’個の密度で平板培
養した。Ｌａｃ”形質転換細胞はまったく観察されなか
った。

Ｌａｃ＋細胞が菌株Ｌ１５８２の何らかの特異性の結果
生成している可能性を除外するため、旦ユセレビシエの
菌株ＹＮＮ２７も形質転換した。再度、６４１８耐性形
質転換細胞を選択し、耐性コロニーをプールし、Ｍ　ｉ
　ｎ　Ｌ　ａ　ｃ平板上で培養した。６４１８耐性細胞
２５０個のうち、約１個しかＬａｃ＋コロニーを生成せ
ず、これは菌株Ｌ１５８２のｌ１５０程度の頻度である
。ＹＮＮ２７を親ベクターｐＫＲＩＢで形質転換しても
、Ｌａｃ”コロニーは全く観察されなかった。

観察されるＬａｃ十表現形にｐ　ＫＲＩ　Ｂ−ＬＡＣ↓
−１が関与していることをさらに証明するために、Ｌａ
ｃ十の性質とＧ４１８耐性の性質が同時に失われること
を判定した。Ｇ４１８耐性の表現型を用いて、プラスミ
ドが存在するか否かを測定した。この測定は、ＡＲＳレ
プリコンを有するベクターが不安定で、特に選択圧力が
無いときには細胞から失なわれるという観察に基づいて
いる。Ｌａｃ＋Ｌ　Ｌ　５　Ｂ　２を、０４１８による
選択なしでＹＥＰＤ培地で１０世代生育させた。Ｇ４１
８耐性細胞の頻度は当初の約２０％から約３％に減少し
、プラスミドの損失が示された。生育期間の最後に試験
した０４１８惑受性細胞はすべてＬａｃ−であった。こ
れらの結果は、Ｌａｃ十表視表現型ラスミドで媒介され
ていたことを示す。

対象としてＬａｃ”　ＹＮＮ　２７をＹＥＰＤ培地で１
０−２０世代生育させると、細胞の９９％以上が０４１
８耐性マーカーを保持していたが、依然としてＬａｃ＋
であったのは１０−３０％だけであった。０４１８耐性
表現型がこのように安定であることから、ベクターが宿
主染色体に組み込まれたことが示唆された。

Ｌａｃ”　Ｓ、セレビシェがｐＫＲＩＢ−ＬＡＣ４−１
を担持し、プラスミドが宿主染色体に組み込まれている
ことの直接の物理的な証明が、３２ｐ−ｐＫＲＩＢ−Ｌ
ＡＣ４−１をハイブリッド形成プローブとしたサザン・
ハイブリッド形成分析によって得られた。このサザン・
ハイブリッド形成のデータは第１図に示しである。全Ｄ
ＮＡを酵母がら抽出し、０．９％アガロースゲルで電気
泳動させ、””Ｐ−ｐＫＲＩＢ−ＬＡＣ４−１にハイブ
リッド形成した。第１図のかっこ内の数字は、λＤＮＡ
の分子量ストランドとの比較によって決定したキロベー
スベアを表わす。レーンＡおよびＫは精製ｐＫＲＩＢ−
ＬＡＣ４７１、レーンＢは非切断し１５８２／ｐ−ｘＲ
ＩＢ−ｔ、Ａｃ４−１で、レーンＣはＥｃｏＲＩで切断
した精製ｐＫＲＩＢ−ＬＡ旦↓−１に対応し、レーンＤ
−ＪはＥｃｏＲＩで切断したＬ１５８２／ｐＫＲＩＢ−
ＬＡＣ４−１、レーンＬは非切断ＹＮＮ２７／ｐＫＲＩ
Ｂ一旦八旦土一１、レーンＭはＢａｍＨＩおよびＢｇｌ
Ｕで切断した精製ｐＫＲＩＢ−ＬＡＣ４−１で、レーン
Ｎ−３はＢａｍＨＩおよびＢｇｊ！Ｉｆで切断したＹＮ
Ｎ２７／ｐＫＲＩＢ−ＬＡＣ４−１に対応する。

上述したように、７つの独立のＬａｃ”、Ｌ　１５８２
形質転換細胞から単離した非切断全ＤＮＡは染色体ＤＮ
Ａに対応するハイブリッド形成帯を示した（たとえば第
１図、レーンＢ）。−もしもベクターが組込まれない状
態つまり自律状態で存在すれば、２つの帯は混成してし
まい、速く泳動する方の帯が超らせんとなり、他方が開
環ＤＮＡとなる（レーンＡ）はずである。これらの２つ
のハイブリッド形成帯がないことから、プラスミドの組
込みが確かめられた。プラスミドの組込みの別の証拠が
、ＥＣ０ＲＩ制限エンドヌクレアーゼで切断した全ＤＮ
Ａを用いて得られた。もし１コピーのプラスミドが組込
まれれば、６個のＥｃｏＲＩベクターの断片のうち１個
は存在せず（８個の断片が存在したが、最も小さい断片
はゲルから流れてしまい、２個の断片は帯ｊとして一緒
に泳動した）組み込まれたベクターと側面を接する染色
体塩基配列を表わす２つの新しい帯が存在するはずであ
る。２つの染色体塩基配列の大きさは予測できない。よ
くあることだが、もし２コピ一以上のベクターが縦列に
組みこまれれば、ベクターの帯６本命部と２本の新しい
帯が観察されるはずである。

７個のＤＮＡのサンプル（レーンＤ−Ｊ）はすべて、６
本のベクターの帯（帯ｂ　ｅ　ｄ　９　ｇ　、ｈ　、１
およびｊ）と４本の特異だがかすかな帯（帯ａ。

ｃ、ｅおよびｆ）とを含む同じパターンを示した。

２本でなく４本の新しい帯が存在することから、プラス
ミドは２つの染色***置に組込まれているようである。

オートランジオグラムのデンシトメータでの走査にもと
づき、形質転換細胞毎に各非反復塩基配列の１コピーを
仮定すると、細胞毎に、３−５コピーのプラスミドが存
在することになる。

上記のデータからは、いくつかの細胞でプラスミドが片
方または両方の部位に組込まれたがどうか、そしてもう
片方の部位に複数コピーのプラスミド゛が縦列に組込ま
れているときに片方の部位がプラスミドを１コピーしか
有さないかどうかは判定できない。

サザン・ハイブリッド形成実験では、６個のＬａｃ＋形
質転換細胞からの全ＤＮＡが染色体ＤＮＡに対応した１
本のハイブリッド形成の帯を示したことから、ｐＫＲＩ
Ｂ−ＬＡＣ４−１がＹ、ＮＮ２７の染色体に組込まれて
いることが示された。６個のサンプルの代表例をレーン
Ｌに示しである。

組込みが単一の部位で生じたのか、そして複数コピーが
組込まれたのかを判定するために、制限コンドヌクレア
ーゼＢａｍＨＩおよびＢｇｆｌｌで切断した全ＤＮＡを
用いてサザン・ハイブリッド形成実験を繰返した。すべ
てのＤＮＡサンプル（レーンＮ−５）がプラスミド断片
に対応する５本の帯（１２、ｎ　ｅ　Ｏｓ　ｐ＊　ｑ）
と２本の新しいより弱い帯（ｋおよびｍ）を含んでいた
。このように、Ｌａｃ＋ＹＮＮ　２７は複数の縦列に並
んだｐＫＲＩＢ−ＬＡＣ４−１のコピーを含み、Ｌａｃ
”　Ｌ　１５８２とは対照的に組込みは１つの染色体部
位で生じた。オートラジオグラムのデンシトメータによ
る走査に基づくと、細胞１個当たり３−５コピーのプラ
スミドが存在していた。対照実験では、”Ｐ−ｐＫＲＩ
Ｂ−ＬＡＣ４−１４：！、形質転換ヲ行っていないＬ１
５８２またはＹＮＮ２７からのＤＮＡとはハイブリッド
形成を行わなかった。

さらに、別の証拠は、ｐＫＲＩＢ−ＬＡＣ４−■がその
宿主にＬａｃ十表視表現型与することを示している。ベ
クターを組み込む、形質転換した酵母から得た全ＤＮＡ
は、ベクターの自律的コピーがないので、通常はＥ、コ
リを形質転換することができない。しかしＬ１５８２と
ＹＮＮ２７の双方のＬａｃ＋形質転換細胞のいくつかか
らは、Ｅ。

亘をアンピシリンおよびカナマイシン耐性に形質転換す
る全ＤＮＡ調製物が得られた。このようなＥ、コリか９
調製したプラスミドＤＮＡは、本来のｐＫＲＩＢ−ＬＡ
Ｃ４−１と同じＥｃｏＲＴおよび３ａｍＨＩ／Ｂｇ／Ｉ
ｆ制限断片パターンをもっていた。さらにこのプラスミ
ドＤＮＡは、Ｌ１５８２またはＹＮＮ２７に、Ｇ４１８
耐性およびＬａｃ十表視表現型のｐＫＲＩＢ−ＬＡＣ４
ＤＮＡ調製物と同程度授与する。

ｐＫＲＩＢ−ＬＡＣ４−１のどの領域がＬａｃ”表現型
に関与しているのかを判定するために、第２図に示した
ようにＬ１５８２を１組の欠失プラスミドで形質転換し
た。第２図はｐＫＲＩＢ−ＬＡＣ４−１プラスミドの構
成と、その特異的欠失を示す。基本であるｐＫＲＩＢの
構成は、Ｓ、Ｍ。

バイリ　（Ｂｈａｉｒｉ）の１９８４年の博士論文（ケ
ンタラキー大学、米国ケンタラキー州、レキシントン）
に記載されている。このプラスミドは、Ｔｎ９０３由来
のアンピシリン（Ａｐ）耐性およびカナマイシン（Ｋｍ
）耐性を授与する細菌遺伝子、Ｅ、コリでの複製を可能
にするｐＢＲ３２２’ＤＮＡ複製開始機構、およびに、
ラクチスおよび肛セレビシェの双方での複製を可能にす
るに、ラフ±困の自律複製起点（ＡＲ３）をもつ。酵母
ではＫｍ遺伝子は抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を与え
る。プラスミドＡでは、ＬＡＣ４の転写の方向を図の上
側の矢印で示してあり、そのＡＴＧ開始コドンを示しで
ある。ＤＮＡ塩基配列は以下のように図示しである。細
い実線はＥ、コリのプラスミドｐＢＲ３２２を示し、Ｏ
印はＴｎ　９０３の塩基配列を示し、口はに、ラクチス
の塩基配列を示し、口はに、ラクチスのＬＡＣ４を表わ
し、口はに、ラクチスＡＲ３ＩＢを示す。田は主。

セレビシェのＴＲＰＩおよびＡＲ３Ｉ領域を表わす。制
限エンドヌクレアーゼ部位は以下の通りである。ＲはＥ
Ｃ０ＲＩ、Ｂは１３ａｍＨＩ、ＣはＣ１ａＩ、ＳａはＳ
ａｌ■、ｘｈはＸｈｏ　Ｉ、ＸｂはＸｂａ　Ｉ、Ｂｇは
ＢｇＪＩＩ、Ｓは５ｓｔＩＩ、ＸはＸｍａ■を示す。か
っこで示した制限部位はプラスミド構成の際には不活性
化された。プラスミドＢ−Ｅは、以下のようなプラスミ
ドＡの欠失を示す。ＢはΔ１５００、ＣはΔ１０８７、
ＤはΔＳ−Ｘ、そしてＥはΔＸを示す。プラスミドＧは
ｐＢＮ５３である。

第２図で説明したような１組の欠失プラスミドでのＬ１
５８２菌株の形質転換の後、得られたＧ４１８形質転換
細胞をＭ　ｉ　ｎ　Ｌ　ａ　ｃ平板上で細胞１０’−１
０６個／平板で平板培養した。Ｌａｃ”コロニーはプラ
スミドＢ、Ｃ，Ｄで得られたが、プラスミドＥでは得ら
れなかった。したがって、菌株Ｌ　１５８２．ではｐＫ
ＲＩＢ−ＬＡＣ４−１の−２０００と−８６００の間の
領域がＬａｃ十表視表現型んでいるとの結論に達した。

ｐＫ、ＲＩＢ−ＬＡＣ４−１の−２０００と−８６００
の間の領域はラクトース透過酵素をコードすると考えら
れる。ＹＮＮ２７はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を欠く
ため、この菌株は欠失のない−２０００から−８６００
の領域の他にβ−ガラクトシダーゼ構造遺伝子ＬＡＣ４
を有するプラスミドであるプラスミドＡ、ＢおよびＣに
よってのみＬａｃ十表視表現型質転換される。

表現型を授与するとすれば、Ｌａｃ”Ｓ、セレビシエと
Ｌａｃ”　Ｋ、　　ラクチスでのラクトース輸送は類似
した性質を有するはずである。動的なラクトース輸送現
象（輸送速度）をまず測定して、Ｌａｃ”Ｓ、セレビシ
ェが測定可能量のラクトースを輸送するのかを゛判定し
、そして輸送のみかけ初速度を測定できる時間スケール
を判定した。第３図に結果を示す。第３図の目的には、
ラクトースの最終濃度を０．５ｍＭとした。第３図のサ
ンプルは以下の通りである。〇−〇はに、ラクチスの菌
株ＭＳ４２５／ｐＫＲＩＢ、ロー口はＳ、セレビシェの
菌株Ｌ１５８２／ｐＫＲＩＢ−ＬＡＣ４−Δ１０８７、
△−△はＳ、セレビシェの菌株ＹＮＮ２７セレビシエの
菌株Ｌ１５８２／ｐＫＲＩＢを表わす。Ｌａｃ”Ｓ、セ
レビシェの菌株Ｌ　１５８２／ｐＫＲＩＢ−ＬＡＣ４−
Δ１０８７およびＹＮＮ　２７／ｐＫＲＩＢ−ＬＡＣ４
−１は両方とも、しラクチスの菌株ＭＳ４２５／ｐＫＲ
ＩＢより速度は遅いが、節電に測定できるｐｍｏｌ量の
ラクトースを輸送していた。ラクトース輸送は少なくと
も３分までは一次であり、みかけの初速度を測定するこ
とができた。第３図は親ベクターｐＫＲＩＢで形質転換
したＳ、セレビシェＬ１５８２のＬａｃ−の対照菌株が
ラクトースを輸送しなかったことを示唆した。

膜結合透過酵素によって媒介されたラクトース輸送は、
輸送プロセスが高濃度のラクトース輸送和することで示
される。他方、膜を横切る単純拡散による輸送は飽和が
ないことにより示される。

第４図は、Ｌａｃ”Ｓ、セレビシェでのラクトース輸送
が輸送体に媒介されていることを示す。基質濃度の関数
としてのラクトースの輸送速度を、Ｌａｃ”　Ｌ１５８
２／Ｉ）ＫＲＩＢ−ＬＡＣ４−１（〇−〇）およびＬａ
ｃ＋Ｌ　１５８２／ｐ　ＫＲＩ　Ｂ−ＬＡＣ４−△１０
８７　（ローロ）を用いた２つの実験について示す。ラ
クトースの各濃度について、輸送速度は３０．６０およ
び９０秒で採取したサンプルの平均を示した。したがっ
て、第４図はＬａｃ＋細胞中のラクトース輸送が、ラク
トースの濃度の上昇にともない飽和することを示してい
る。

第４図に開示したデータからはラクトース輸送について
のみかけのＫ　ｍ４ｆｉ　０．９７および１．０９ｍＭ
が得られた。Ｋ、ラクチスの菌株ＭＳ４２５は、ラクト
ース輸送についてのみかけのＫｍが０．６７±０．１１
であった。

担体膜輸送は基質についての高度の立体特異性を示す。

したがって、もしｐＫＲＩＢ−ＬＡＣ４−１がラクトー
ス透過酵素をコードするに、ラフ±困遺伝子をもつなら
ば、Ｌ１５８２／ｐＫＲＩＢ−ＬＡＣ４−１はに、ラク
チスと同じ基質立体特異性を示すであろう。立体特異性
は、化合物がどのくらいラクトース輸送を阻害するかを
測定することにより示される（第１表参照）。ラクトー
スはβ−ガラクトシドである４−０−β−Ｄ−ガラクト
シルーＤ−グルコースであり、そのためラクトース輸送
はα−ガラクトシド、メリビオースおよび４−ニトロフ
ェニル−α−Ｄ−ガラクトースにより少ししか阻害され
ない。ラクトース透過酵素は、単糖ガラクトースにより
穏かにしか阻害されないことから、三糖に対して特異性
を示す。

この透過酵素は、チオガラクトシドにより穏かにしか阻
害されないことから、チオ結合よりＯ結合を好む。最も
強い阻害はβ−〇−結合を有する三糖である３−０−β
−Ｄ−ガラクトシルーＤ−アラビノースによって示され
た。

里−一」−一一聚 に、ラクチス　　　　　　　Ｓ、セレビシＩな　　し　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＯＱＤ
−ｉラクトース　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　２６　　　　　　　　２４．３±７
．２６−Ｏ−ｅｘ−Ｄ−１９クトシｎ−Ｄ−Ｉｎコース
（ｊリビｔ−７）　　　　１０　　　　　　　　１０．
７±　８３−０−β−Ｄ−ガラクトシルーｎ−７ラビノ
ース　　　　　　　　　　９３　　　　　　　　９ｏ　
±　６４−ニトロフェニル−α−ｏ−ｉラクトシＦ　　
　　　　　　　　　　　　　６　　　　　　　　　１．
１±　Ｉｎ−ガラクトシル−１−チオーβ−Ｄ−ガラク
トシＦ　　　　　　　　　　　２Ｂ　　　　　　　　　
　　４．９±　４（チオシガラクトシＦ） ａ、ラクトース輸送の測定のための細胞は実施例８で説
明したとおりに調製した。細胞を２３℃に暖めてから、
拮抗化合物を最終濃度５０ｍＭまで加えた。３０秒後に
（”Ｃ）ラクトースを最終濃度１ｍＭまで加え、１００
μｌのサンプルを１分および２分後に濾過した。阻害剤
の濃度は、ラクトース（計算には１ｍＭを用いた）と同
じ輸送のＫｍを有するとしてラクトース輸送が９７％阻
害される（５０　ｋｍ／　５０　ｋｍ”　ｋｍ”０．２
５ｋｍ＝阻害（％））よう選んだ。Ｋ、ラフ±久に関し
ては実験を２回行い、Ｓ、セレビシエに関しては３回行
った。平均値、または平均値と標準偏差を示す。

最後に、Ｌａｃ”Ｓ、セレビシェでのラクトース輸送は
に、ラクチスと同じくエネルギ依存性プロセスであると
判定された。エネルギ依存性を測定するために、細胞を
１ｍＭの２．４−ジニトロフェノールとともに周囲温度
で２０分間予備恒温培養した。ラクトース輸送は、Ｌａ
ｃ＋菌株のＳ、セレビシェ、Ｌｌ　５８２／’ｐＫＲＩ
Ｂ−ＬＡＣ４−１とに、ラクチスの菌株ＭＳ４２５／ｐ
ＫＲＩＢの両方でほぼ完全に阻害された。

Ｌａｃ”Ｓ、セレビシェの生育速度は細胞の倍加時間を
測定することによって判定した。菌株をＭｉｎＬａｃ培
地で対数期まで予備生育し、次に新たな培地に希釈し、
吸光度を測定した。倍加時間は以下の通りであった。Ｋ
、ラクチスの野性型菌株Ｙ１１４０は１．６時間、Ｓ、
セレビシェの菌株Ｌ１５８２／ｐＫＲＩＢ−ＬＡＣ４−
１は１３．０時間、Ｌ１５８２／Ｉ）ＫＲＩＢ−ＬＡＣ
４−Δ１０８７は１０．０時間、そしてＹＮＮ２７／ｐ
ＫＲＩＢ−ＬＡＣ４−１は６．７時間であった。これら
の生育速度はＭ　ｉ　ｎ　Ｌ　ａ　ｃ平板上のコロニー
の生育速度に反映された。

ｐＫＲＩＢ−ＬＡＣ４−１の−２０００から−８６００
の領域がＫ．ラクチスのラクトース透過酵素をコードす
ることの別の証拠は、ＬＡＣ４から１．６センチモルガ
ンでの突然変異マツピングによって透過酵素（−）表現
型ができることを実証することによって得られた。この
突然変異株および透過酵素（−）表現型はｐＫＲＩＢ−
ＬＡＣ４−１または第２図に示したプラスミドＢ、Ｃま
たはＤによって補える。ラクトース輸送に欠陥のあるに
、ラクチスの突然変異株は、菌株１３Ｃ４７６の細胞１
０’−１０７個を、デキストロースと１　ｍｍ当たり４
０μｇの５−プロモー−４−クロロ−３−インドリル−
β−ガラクトシド（Ｘｇａｌ）を含むＭ　ｉ　ｎ　Ｌ　
ａ　ｃ平板上で平板培養することにより得た。菌株１３
Ｃ４７６は、ラクトースがガラクトースに加水分解され
、このガラクトースがガラクトシルエピメラーゼ（ＥＣ
５，１，３，２）構造遺伝子又土上上度での突然変異の
ために生育を阻害するので、この培地では生育しない。

ラクトースに対して耐性となり、そのためこれらの平板
培養条件で生育できる復帰細胞は、１個以上の遺伝子で
の突然変異によって発生し、これらの突然変異には、菌
株１３Ｃ４７６での本来のｇａ！１０−１の突然変異に
よる復帰、ガラクトキナーゼ構造遺伝子、ＧＡＬＬでの
突然変異、正の調節遺伝子での突然変異、およびラクト
ース透過酵素遺伝子での突然変異がある。数日の恒温培
養の後、ラクトース耐性復帰コロニーが細胞１０６個に
１個の頻度で現れた。これらの復帰コロニーを採集し、
コロニー純化し、Ｋ、ラクチスのＬａｃ＋菌株と戻し交
雑した。この方法により、ラクトース耐性表現型を発現
した突然変異株を、Ｋ、ラクチスの菌株１３Ｃ４７６が
もつ本来のｇａｌｌＯ１および１ａｃｌｏ’突然変異株
から分離することができた。デキストロースとＸｇａ　
１を含むＭｉ１Ｌａｃ平板上で、コロニーの色が白また
は水色を呈するラクトース耐性突然変異株をとり出して
、さらに調べた。ラクトース透過酸素に欠陥があると、
ラクトースで生育せず、β−ガラクトシダーゼの誘導お
よびガラクトース異化作用酵素を示さない細胞が生じる
はずである。このように誘導物質であるラクトースの排
除によって誘導がなくなると、Ｘｇａ　１指示平板上に
は白いコロニーが生じる。２％ソルビトールと要求栄養
素を含むダブル・ストレングス・酵母窒素ベース（ディ
フコ−Ｄｉｒｃｏ　）上で２％ガラクトースの不在（非
誘導）または存在（誘導）下で生育させた細胞から調製
した無細胞抽出物上で、ラクトース誘導酵素を測定した
。このような条件下では、野性型基、旦±丞菌株Ｙ１１
４０の非誘導β−ガラクトシダーゼおよびガラクトキナ
ーゼの特異活性レベルはそれぞれ１００および５単位で
、誘導レベルはそれぞれ６５００および１００であった
。１１Ｄ３０４と名づけだラクトース耐性突然変異株の
非誘導β−ガラクトシダーゼおよびガラクトシダーゼレ
ヘルはそれぞれ１９０および１０で、誘導レベルはそれ
ぞれ４０００および９０であった。したがって、この菌
株はβ−ガラクトシダーゼとガラクトキナーゼを正常に
誘導した。対照的に、菌株１１０３０４を酵素活性検定
法と同じ誘導条件で生育させても、輸送活性の誘導を示
さなかった。ラクトース輸送活性は実施例１０で説明し
た通りに測定した。菌株Ｙ１１４０および１１Ｄ３０４
は、非誘導ラクトース輸送活性がそれぞれラクトース４
０および１．３ピコモル／Ａ６゜。７分で、２％ガラク
トースを含有する培地で生育させることにより２４時間
誘導した後の値はそれぞれ８００および４．５であった
。ラクトース輸送のデータは、菌株１１Ｄ３０４では基
礎輸送活性が野性型菌株Ｙ１１４０の約３０分の１で、
輸送活性が約２−３倍しか誘導されないことを例証し、
これは菌株Ｙ１１４０でみられる２０倍の誘導よりはる
かに少ない。このように菌株１１Ｄ３０４は、ＬＡＣｌ
主と名づけたラクトース透過酵素構造遺伝子に突然変異
を有する。１１０３０４でのｌ　ａ　ｃ　１２−２３０
の突然変異を、四分子分析によってＬＡＣ↓に関してマ
ツプした。データを次に示す。

ＸＩａｃ４−１４　　６５　　　　　０　　　　　０Ｘ
ｌａｃ４−２３　　１８　　　　　２　　　　　０ＸＩ
ａｃ４−３０　　１９　　　　　０　　　　　０これら
の四分子のデータは、ＬＡＣ１２が１人Ｃ４から１．６
センチモルガンに認められることを示す。

ＬＡＣ４から１．６センチモルガンに認められる突然変
異は、ｐＫＲＩＢ−ＬＡＣ４−１の−２０００から−８
６００の領域と相同な染色体領域に生じる可能性がある
。これが真実であれば、ｐＫＲＩＢ−ＬＡＣ４−１また
は−２０００から−８６００の領域をもつその誘導体で
ある第２図のプラスミドＢ、ＣおよびＤは菌株１１Ｄ３
０４の±２−２３０突然変異を補い、菌株を透過酵素（
＝）の（Ｌａｃ−）表現型から透過酵素（＋）の（Ｌａ
ｃ”）表現型に転換するはずである。このことはｐＫＲ
ＩＢ−ＬＡＣ４−１の−２０００から−８６００の領域
がラクトース透過酵素をコードすることを意味する。こ
の仮説を試験するために、菌株１１Ｄ３０４をプラスミ
ドＡ、Ｂ、Ｃ，Ｄ、ＥおよびＦ（第２図）で形質転換し
た。形質転換細胞をまずＧ４１８に対する耐性で選択し
、次にＭ　ｉ　ｎ　Ｌａｃ平板上での生育に関し、レプ
リカ培養または画線培養により単一コロニーについてス
クリーニングした。プラスミドＡ、Ｂ、ＣおよびＤはＬ
ａｃ”コロニーを生じ、したがって突然変異１２−２３
１を補った。プラスミドＥおよびＦはＬａｃ＋コロニー
を生じず、したがって突然変異１２−２３０を補わなか
った。このようにｐＫＲＩＢ−ＬＡＣ±−１の−２００
０−−８６００の領域は、笠ユラクチスのラクトース透
過酵素をコードする。

したがって、本発明は、ラクトースを唯一の炭素源とし
て利用することのできる、Ｓ、セレビシェの菌株の性質
を有する微生物を提供する。この性質を有するＳ、セレ
ビシェは、野性型のＳ、セレビシェでは必要とされるよ
うな、まずラクトースを加水分解してグルコースとガラ
クトースを形成する予備工程なしで、ラクトースを直接
利用することができる。この性質によって、チーズ産業
の副産物であるホエー中のラクトースを転換して化学的
生成物、たとえばエタノールを得る経済的かつ効率の良
い方法が得られる。

以下の実施例は本発明を例示するために掲げてあ′るも
ので、本発明はこれらに限定されると解すべきではない
。実施例および明細書全体において、特記しない限り部
は重量基準である。

実施例では以下の材料を用いた。

刀、コリ：菌株ＤＧ７５（田虹１亘６肛ａ　１４ｐ±」
２　」旦１　　ｒｐｓＬ　２０　　ｔｈｉ　ｌ　　５ｕ
ｐＥ　４４ＩａｃΔ　Ｚ３９　λ−）をすべての最近の
形質転換およびプラスミドの増殖に用いた。

Ｓ、セレビシェ：菌株ＹＮＮ　２７　　（αｔｒｐｌ　
−２８９頭−５２堕Ｕ　、スティンコウム（Ｓｔｉｎｃ
ｏｍｂ　）ら（１９８０）プロシーディング・オプ・ナ
ショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・Ｕ　Ｓ　Ａ
　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、＾、）７７．４５５９−４５６３）；Ｌｉ２８
２　（ｃ［ｎｏ　１ｌＩｓ４　　：：　Ｉａｃ　Ｚ）は
米国マサチューセソツ州ケンブリッジのマサチューセソ
ツエ科大学（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ　Ｉｎ５ｔｉ
ｔｕｔｅ　ｏｆＴｅｃ＋＋ｒ＋ｏｌｏｇｙ＋　Ｃａｍｂ
ｒｉｄｇｅ＋　ＭＡ　）のＧ、　Ｒ，フィンク（Ｆｉｎ
Ｋ）氏より入手した。

Ｋ、ラクチス：野性型菌株Ｙ１１４０（α１ａｃＩＬＡ
Ｃ２）および突然変異株ＭＳ　４２５　（ｃｕａｃ　４
−８　ａｄｅｌ−１）および対立遺伝子１ａｃ４−１４
、］ａｃ４−２３、およびＩａｃ４−３度を有する菌株
はＲ，Ｍ、　　シーツ（Ｓｈｅｅｔｚ）、およびＲ，Ｃ
，ディクソン（Ｄｉｃｋｓｏｎ　）、（１９８１）ジェ
ネティソクス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）　９１．７２９−７
４５に記載されている。

Ｋ、ラクチスの他の突然変異菌株（未発表結果）には、
１３　Ｃ４７６（Ｉａｃ　１０’　−１ｇａｌｌｏ−１
ｈｉｓ２−２ｍｅｔ２−２　　ｔｒｐｌ−１）および１
１　Ｄ　３０４　（Ｉａｃ１２−２３０　ｈｉｓ−２−
２）がある。

抗生物質０４１８サルフエートは、グランド・アイラン
ド・ハイオロジカルス（Ｇｒａｎｄ　ＩｓｌａｎｄＢｉ
ｏｌｏｇｃａｌｓ）米国ニューヨーク州グランド・アイ
ランド）から入手し、抗生物質カナマイシンおよびアン
ピシリンはシグマ（Ｓｉｇｍａ　）　　（米国ミズリー
州セントルイス）から入手した。制限酵素、酵素等級の
生血清アルブミンおよびＤＮＡポリメラーゼＩ　（フレ
ノウフラグメント）はＢＲＬ　（ベセスダ・リサーチ・
ラボラトリーズ、米国メリーランド州ヘセスダ）の製品
であった。Ｄ−グルコース−（１４Ｃ）ラクトースはア
メルシャム（八ｍｅｒｓｈａｍ）　　（ＣＦＡ２７８；
５８ｍＣ１／ｍＭ；米国マサチューセッツ州レキシント
ン）から、ブロモクロロインドールガラクトシド（Ｘｇ
ａｌ）はリサーチ・オーガニック・インコーホレイテッ
ド（Ｒｅｓｓｅｒｃｈ　０Ｂａｎｉｃ　Ｉｎｃ、　）　
　（米国オハイオ州クリーブランド）から購入した。

ＹＥＰＤは、１β当たり２０ｇのグルコース、２０ｇの
ペプトンおよびＩＯｇの酵母エキスを含んでいた。最小
ラクトース培地（ＭｉｎＬａｃ）は、１１当たり３．４
ｇの酵母窒素ヘース（Ｄｉｒｃｏ、アミノ酸または硫酸
アンモニウムを含まない）、１０ｇの硫酸アンモニウム
、２０ｇのラクトース、１０ｍｇのウラシル、４０■の
ロイシン、４０■のトリプトファンおよび４０■のヒス
チジンを含有した。上記培地のベトリ平板は寒天を１５
　ｇ／ｊ２含有した。

プラスミドｐＫＲＩＢは本明細書中ですでに説明しであ
る（第２図参照）。ｐＫＲＩＢはに、スリークリシュナ
（Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ　）　、、　Ｔ、　　Ｄ、　
　ウェブスター（Ｗｅｂｓｔｅｒ　）　、およびＲ，Ｃ
，ディクソン（Ｄｉｃｋｓｏｎ　）、（１９８４）ジー
ン（Ｇｅｎｅ）　２８ニア３−８１にも記載されている
。Ｅ、コリはＭ、ダガート（Ｄａｇｅｒｔ）　、および
Ｓ、Ｄ、ニーリック（Ｅｈｒｌｉｃｋ　）　　（１９７
９）ジーン（Ｇｅｎｅ）　６：２３−２８に従って形質
転換した。プラスミドＤＮＡの少量および大量の調製物
は、Ｅ、コリからＨ，Ｃ，バーンポイン（Ｂｉｒｎｂｏ
ｉｎ）およびＪ。

ドリー（Ｄｏｌｙ）　　（１９７９）ニュークレイツク
・アシド・リサーチ（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅ
５）　７　：　１５１３−１５２３の方法によって得た
。精製超らせんプラスミドＤＮＡは、ＣｓＣ１−ＥｔＢ
ｒ密度勾配遠心法によって得た。酵母は、Ａ、ヒネン（
Ｈ４ｎｎｅｎ）　、Ｊ、　Ｂ、　ヒックス（Ｈｉｃｋｓ
　）およびＧ。

Ｒ，フィンク（Ｆｉｎｋ）　　（１９７８）プロシーデ
ィング・オプ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエ
ンス・Ｕ　Ｓ　Ａ　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、八ｃａｄ
、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ）７５　：１９２９−１９３３の
手順にしたがって形質転換し、抗生物質Ｇ４１８に耐性
の形質転換細胞は、Ｔ、Ｄ、ウェブスター（Ｗｅｂｓｔ
ｅｒ　）およびＲ，Ｃ，ディクソン（Ｄｉｃｋｓｏｎ　
）　　（１９８３）ジーン（Ｇｅｎｅ）　　２６　：　
２４３−２５２の方法により選択した。未形質転換細胞
および形質転換細胞の両方からの酵母全ＤＮＡは、Ｋ、
ストルール（Ｓｔｒｕｈｌ）　、Ｄ、　Ｔ、ステインク
コーム（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ）、Ｓ、シェラ−（Ｓｃ
ｈｅｒｅｒ　）およびＲ，Ｗ、デービス（Ｄａｖｉｓ　
）　’（］　９７９）プロシーディング・オブ・ナショ
ナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・　Ｕ　　Ｓ　　
Ａ　　（Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　八ｃａｄ、　　Ｓ
ｃｉ、　　ＵＳＡ）　　　７　６　　：１０３５−１０
３９の方法によって調製した。サザン・ハイブリッド形
成は、Ｅ、Ｍ、サザン（Ｓ。

ｕｔｈｅｒｎ）　、１９７５、ジャーナル・オブ・モレ
キュラー・バイオロジー　（Ｊ、Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ　
）　９８　：　５０３−５１７に記載されている。他の
プラスミドは実施例３に説明してあり、またＳ、Ｍ、バ
イツ（Ｂｈａｉｒｉ）の１９８４年の博士論文（ケンタ
ソキー大学、米国ケンタラキー州しキシントン）に記載
されていた。

実施例１ Ｋ、ラクチスのＤＮＡは以下のようにして調製した。Ｋ
、ラクチスの菌株Ｙ１１４０を、１％のグルコースを含
有するダブル・ストレングス酵母窒素ベース（Ｄｉｒｃ
ｏ　）で定常期まで生育させ、新たな培地に希釈して、
初期密度を０．３Ａ６゜。単位／　ｍＱとした。密度が
１１Ａ６゜。単位／ｍΩの値に達するまで３０℃で生育
を継続した。ＧＳ３ソーパル（Ｓｏｒｖａｌｌ　）ロー
タで５０００Ｘｇ、周囲温度で５分間遠心することによ
り細胞を集めた。細胞ペレットをｌ／１０容量の１．２
Ｍソルビトール、５０ｍＭＮａＰ○４　（ｐＨ７，９）
　、２０ｍＭジチオトレイトールに再）課濁した。チモ
リアーゼ６０゜０００　（マイルス・ラボラトリーズ（
Ｍｉｌｅｓ　Ｌａｂ。

ｒａｔｏｒｉｅｓ）を最終濃度４０ｐｇ／ｍＱまで加え
、培養をゆるやかに振りながら３０℃で恒温培養した。

スフェロプラストへの転化の程度は、１．５Ｍソルビト
ールへの１０倍希釈後の細胞数と５％ドデシル硫酸ナト
リウムへの１０倍希釈後の細胞数とを比較することによ
り監視した。細胞の８０％以上がスフェロプラストに転
化されたら、サンプルを１１０００Ｘ、室温で５分間遠
心した。スフェロプラストを、１．５Ｍソルビトール溶
液を用いてもとの容量の１／２００にＱ、　％した。３
容量のＰＬＢＩＴ　　（０，１Ｍ　　　ＮａＣｌ　、０
．０２ＭＥＤＴＡ。

ｐ　Ｈ７，０）　　と１容量のＤＭ溶液（１０ｍＭｌ−
リース−ＨＣｌ、２０ｍＭＥＤＴＡ、２％サルコシル、
３％デオキシコレート、５％ドデシル硫酸ナトリウム、
ｐ　Ｈ８，０）を加え、混合物をロッカー・プラットホ
ーム上で２０分間ゆるやかに振った。４容量のＰＬＢ■
と１容量のＤＭとの混合物を加えて最終ＡＺ６゜値を１
０単位／　ｍｕとし、この溶液をＰＬＢｒｆで飽和した
等容量のフェノール：クロロホルム（１：　１）で抽出
した。フェノール：クロロホルムでの抽出を合計３回繰
り返してから、水１生相を等容量のクロロホルムで１回
抽出した。水１生相を０．２５Ｍ　　ＮａＣｌに調節し
、ＤＮＡを２容量の９５％エタノールで一２０゛Ｃにて
一晩沈殿させた。ＤＮＡをＧＡＳソーハルロータで５０
００Ｘｇ、４℃で２０分間遠心した。ＤＮＡペレットを
１５２０ｍＱの５０ｍＭトリス（ｐＨ７，，０）：こ懸
濁し、ＣｓＣｌを加えて最終濃度０．９５ｇ／ｌΩ（屈
折率：１．４０００）とした。ＤＮＡをＴｉ７０ベツク
マン（Ｂｅｃｈｍａｎ　）ロータで、５５．ＯＯＯｒｐ
ｍ　。

２０℃で２０時間平衡遠心して帯状に分離させた。

チューブに１８ゲージの針で孔をあけることにより、チ
ューブの底からフラクションを採取した。

４つ目のフラクション毎にＤＮＡが存在するかどうかを
、０．８％アガロースゲルでの３０μｌのサンプルの電
気泳動によって分析した。ＤＮＡを含むフラクションを
プールし、３容量の７０％エタノールで４℃にて一晩沈
殿させ、０６３Ｍ酢酸ナトリウムおよび３容量の９５％
エタノールで一２０℃にて再度沈殿させた。ＤＮＡを１
０ｍＭ）リス（ｐＨ８，０）　、１ｍＭ　　ＥＤＴＡに
溶解した。

大旌炭主 に、ラクチスの１５−２５ｋｂのＤＮＡ断片を以下のよ
うにして単離した。まず、実施例１の基。

ラクチスのＤＮＡの少量の消化を行って、５ａｕ３Ａ酵
素とＤＮＡの最適濃度を決定し、１Ｏ−２５ｋｂのＤＮ
Ａ断片の最大収量を達成するのに必要な培養期間を決定
した。大量の消化では、これらのパラメータを正比例で
、増やした。たとえば、それぞれが緩衝塩培地（ベセス
ダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）１ｍ１２
中に２０（ｌμｇのに、ラクチスのＤＮＡと、１００μ
ｇ　／　ｍΩのＢＳＡを含有する５本の反応管を３７℃
で平衡化させる。６単位の５ａｕａＡ制報エンドヌクレ
アーゼ（ベセスダ・リサー　チ・ラボラトリーズ）を各
反応管に加え、この反応管を１０　、１５　、２０　、
３０および３５分間恒温培養した。この消化は、ＥＤＴ
Ａを最終濃度１５ｍＭまで加え、６５＠で１０分間加熱
することにより終結させた。ＤＮＡを濃縮するために、
５本の反応管の内容物をプールし、５０ｍＭ１−リス−
ＨＣ１（ｐＨ８，０）と１ｍＭ　　ＥＤＴＡで飽和した
フェノール：クロロホルム（１：　１）で２回抽出した
。水性層を等容量のエーテルで抽出し、エーテルを６０
℃で１０分間加熱して除去した。ＤＮＡを０．３Ｍ酢酸
ナトリウムおよび３容量の９５％エタノールで、−２０
℃にて一晩沈殿させた。サンプルはＨＢ４ソーパルロー
タで１２，０００Ｘｇ。

４℃で３０分間遠心した。ペレットを７０％エタノール
で洗い、乾燥し、５ｍＭ　　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）
１＋ｒ＋Ｑに１ｍｇ／ｍΩの濃度で溶解し、以下のよう
にして調製したシーＪＩＪ！勾配にかけた。ＩＭＮａＣ
ｌ、２０ｍＭ）リス（ｐＨ８，０）　、５ｍＭＰ、ＤＴ
Ａへのショ糖溶液（４０％（Ｗ／　Ｖ　）および１０％
（Ｗ／Ｖ））を作製し、１５分間オートクレーブにかけ
て滅菌した。勾配装置（ブクラー・インストルメント（
Ｂｕｃｈｌｅｒ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）　、米国ニュ
ーシャーシー州フォートリー（Ｆｏｒｔ　Ｌｅｅ）　）
およびテフロンチューブは、蒸留水、０．１％ジエチル
ピロカーボネート、５ｍＭ　　ＥＤＴＡ、および滅菌脱
イオン水をこの順に用いて完全に清浄にした。５ａｕ３
Ａで消化したＤＮＡ（２５０，ｃｒｙ中に２５０．ｃｒ
ｇ）を勾配の上に重層し、この勾配をヘッダ？７ＳＷ２
７　ｏ−９７：　２６，０００　ｒｐｍ　、　２０°Ｃ
で３０時間遠心した。３０滴のフラクションを勾配の底
からペリスタルチック・ポンプでくみ出すことにより集
めた。５っめのフラクション毎に３０μｌを０．８％ア
ガロースで電気泳動にかけ、ＤＮＡの存在を判定し、そ
の大きさも推定した。

１Ｏ−２５ｋｂのＤＮＡ断片を含むフラクションをプー
ルし、等容量のイソプロパツールで一２０℃にて一晩沈
殿させた。サンプルをソーパルＨＢ４０−夕で１２．０
００　Ｘ　ｇ、４℃で３０分間遠心した。ＤＮＡペレッ
トを水に再度懸濁し、０．３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４
，８）および２容量のエタノールで再度沈殿させた。Ｄ
ＮＡペレッ）を１ｍＭＥＤＴＡ　（ｐＨ８，０）に溶解
した。

実施±ニ プラスミドｐＫＲＩ　Ｂ−ＬＡＣ４−１を以下のように
して構成した。

３μｇのＹＲｐ７プラスミドＤＮＡ　（Ｋ、ストルール
（Ｓｔｒｕｈｌ）ら、１９７９）を、１００μｇ／　ｍ
ｆｌのＢＳＡを含む緩衝液（ベセスダ・リサーチ・ラボ
ラドリース（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌ
ａｂｏｒａｔ。

ｒｉｅｓ）　％米国メリーランド州ベセスダ）５０μβ
中のｌＯ単位のＢａｍＨｌで、３７℃にて９０分間消化
した。反応混合物を５０ｍＭのトリス（ｐＨ８，０）　
、５ｍＭのＭ　ｇ　ＣＩ　ｚで２５０．ｃｒｊ＋に希釈
し、２単位の仔つシ腸アルカリホスファターゼとともに
３７℃で１５分間、次いで６０℃で１５分間培養した。

反応混合物を、５０ｍＭ）リス（ｐ　Ｈ８，０）と１ｍ
Ｍ　　ＥＤＴＡで会包和したフェノール：クロロホルム
：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で２回抽出
して酵素を除去した。

フェノールをエーテルで抽出することにより除去した。

エーテルを６０℃に１０分間加熱して除去した。ＤＮＡ
を０．３Ｍ酢酸ナトリウムと６７％エタノールで沈殿さ
せ、６０μｌの水に溶解した。

ホスファターゼ処理したベクター（０，５μｇ）を、１
００μｇ／□ΩのＢＳＡを加えたＴ４ＤＮＡリガーゼ緩
衝液３００μ！中で、１Ｏ−２５ｋｂのに、ラクチスの
５ａｕ３Ａ切断ＤＮ切断ＤＮＡ族例２参照）１−２．５
μｇと混合し、２単位のＴ４ＤＮＡリガーゼとともに４
℃で１６時間恒温培養した。

１００μｌのコンピテントＥ、コリＤＧ７５を、３０μ
ｌの連結ＤＮＡとともに０℃で２５分間恒温培養するこ
とによって形質転換し、３７℃で３分間加温した。この
細胞を１ｍＱのＬＢ培地中で３７℃にて１時間生育させ
、プラスミドにコードづけされた遺伝子を発現させた。

数本のチューブからの形質転換混合物をプールし、遠心
し、１　ｍＱのＬＢ培地に懸濁した。１００μｌの細胞
をＬＢ−アンピシリン平板上に広げ、３０℃で２０−２
４時間恒温培養した。数枚の平板からの形質転換細胞を
プールし、遠心し、５ｍΩの５０％グリセロール、５ｍ
Ｍ　　ＨｇＣ１，で懸濁した。これを５００ｐｌずつ−
−２０℃で保存し、以下では５ａｕ３Ａクローンバンク
と称する。

実り例４ 実施例３で作製した５ａｕ３Ａクローンバンクを、ハイ
ブリッド形成プローブとして３２Ｐで標識した２、４　
ｋ　ｂのＥｃｏＲＩ断片であるｐＫ１６　（ＲｌＣ，デ
ィンマン（旧ｃｋｓｏｎ　）およびＪ、Ｓ。

マーキン（Ｍａｒｋｉｎ）　、１９７８、セル（Ｃｅｌ
ｌ）　１５：１２−１３０）を用いるインシトウ（ｉｎ
ｓ−匹Ｕ）でのコロニー・ハイブリッド形成により、Ｌ
ＡＣ４をもつプラスミドが存在するかどうかをスクリー
ニングした。このＥｃｏＲＩ断片は、第２図でプラスミ
ドＡ上に示したように、ＬＡＣ４のＡＴＧコドンを含む
。上記の目的のために、５ａｕ３Ａクローンバンクを、
β−ガラクトシダーゼのクロモジェニック基質であるＸ
ｇａｌを含む１０枚のＬＢ−アンピシリン平板上に（１
平板あたり細胞５，０００個を）広げた。基質を含有さ
せたのは、ＬＡＣ４を偶然発現し、色が青いことにより
確認できるコロニーをスクリーニングするためである。

３０℃で１６−２０時間恒温培養した後、いくつかの青
いコロニー（１平板あたり約２０個）が観察された。Ｊ
、Ｐ、ジャーゲン（Ｇｅｒｇｅｎ）、Ｒ，Ｈ，スターン
（Ｓｔｅｒｎ　）およびＰ、　Ｃ，ウヱンシンク（Ｗｅ
ｎｓｉｎｋ　）　　（１９７９）ニュークレイ・ンク・
アシド・リサーチ（Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　
７　：２１１５−２１３６の手順に従って各平板のコロ
ニーをワットマン（貼ａｔｍａｎ　）　５４１フイルタ
ーに移し、クロラムフェニコールで増幅させ、そしてプ
ローブにハイブリッド形成させた。オートラジオグラフ
ィーにより、予想通りすべての青色のコロニーがプロー
ブにハイブリッド形成したことが明らかになった。青色
のコロニーを、Ｘｇａ　１を含むアンピシリン平板上で
繰り返し画線培養することによりコロニー純化し、テト
ラサイクリン感受性に関してスクリーニングした。試験
した１４０個のコロニーのうち２０個がテトラサイクリ
ン感受性であることがわかった。テトラサイクリン感受
性であることは、５ａｕ３Ａ断片がベクターのテトラサ
イタリフ遺伝子中のＢａｍＨｒ部位にクローニングされ
ていたとすれば、予期されることである。２０個の青色
テトラサイクリン感受性コロニーから少量のＤＮＡｆ；
：Ａｍ製した。

これらの各ＤＮＡでのＥｃｏＲＩｉｌｌ限パターンを０
．９％アガロースゲルで判定し、ｐＫ１６のパターンと
較べた。試験した２０個のプラスミドのうちの１個であ
るｐＢＮ５３　（第２図のプラスミドＧ）を、このプラ
スミドがＫ．ラクチスのＤＮＡに対応するＥＣ０ＥＩ断
片ｐＫ１６と他の盈ユラクチスの断片を含んでいるとの
理由で、さらに制限分析を行うため選んだ。Ｋ、ラクチ
スのＤＮＡを含むｐＢＮ５３からの１３ｋｂのＸｈ、ｏ
ｒＤＮＡ断片を、ｐＫＲＩＢの５ａｌｌの部位にサブク
ローニングした。得られたプラスミド、ｐＫＲＩＢ−Ｌ
ＡＣ４−１（第２図）を用いてに６ラク±囚の突然変異
株ＭＳ　４２５を形質転換した。形質転換細胞をまずＧ
４１８耐性（抗生物質７５μｇ／寒天培地１ｍＱ）につ
いて選択し、次にＭｉｎＬ、ａｃ平板上での生育につい
て試験した。６個の６４１８耐性コロニーがＬａｃ十で
もあり、Ｌａｃ”表現型がプラスミドにより授与された
ことが示唆された。これらのデータにより、ｐＫＲＩＢ
−ＬＡＣ４−１が、ＭＳ４２５で±ａｃ４突然変異を補
うことのできるＤＮＡ塩基配列をもっていることが示さ
れる。

プラスミドＢ（第２図）およびＣ（第２図）を、ｐＫＲ
ＩＢ−ＬＡＣ４−１をその非反復５ｓｔ１１部位で線状
にしてから制限Ｂａ　１３１処理および５ａｉｌリンカ
−挿入を行うことによって構成した。ＬＡＣｄ側への欠
失の範囲はＤＮＡ塩基配列決定（Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
）　　（バイツ　（Ｂｈａｉｒｉ）　　１９８４）によ
り精密に確定されたが、他の側への欠失は５ａｌｌおよ
びＸｂａ　Ｉの両方によるプラスミドの消化後得られた
ＤＮＡ断片の大きさを判定することによって推定した。

プラスミドＥ（第２図）は、ｐＫＲＩＢ−ＬＡＣ４−１
のＸ　ｍ　ａ　ｍ消化の後に自己連結を行い作製した。

プラスミドＤ（第２図）は、ｐＫＲＩＢ’−ＬＡＣ４−
１を５ｓｔＩＩで線状にしてからＸｂａｒで部分的消化
を行い、ＤＮＡポリメーラゼ■でプラントエンドとし、
連結することにより構成した。連結混合物を用いてＥ、
コリＤＧ７５をアンピシリンおよびカナマイシン耐性に
形質転換した。プラスミドＤＮＡをいくつかの形質転換
細胞から分析し、所望の欠失プラスミドについてスクリ
ーニングした。

大施炎ｌ ラクトースで生育するＳ、セレビシェを構成するために
、Ｌ１５８２の菌株をｐＫＲＩＢ−五へ旦−１で形質転
換し、細胞をＧ４１８への耐性について選択した。形質
転換を行ってＳ、セレビノ盃のＧ４１８耐性形質転換細
胞を選択するには、Ｔ、Ｄ、ウェブスター（Ｗｅｂｓｔ
ｅｒ　＞およびＲ，Ｃ。

ディクソン（Ｄｉｃｋｓｏｎ　）　　（１９８３）ジー
ン（Ｇｅｎｅ）２６：２４３　２５２の手順を用いた。

１０個のＧ４１８耐性形質転換細胞をＹＥＰＤ／Ｇ４１
８（２００μｇ／ｍΩ）平板上でコロニー純化し、無作
為に選んだ６２個の純化したコロニーをＭｉｎＬａ　　
ｃ　平キ反、　ＹＥＰＤ／Ｇ４１８　　（２００μ　ｇ
／ｍΩ）平板そしてＹＥＰＤ平板上にこの順番でスポツ
ティングした。６２個のすべてのコロニーがＧ４１８お
よびＹＥＰＤ平板上で生育した。Ｍｉｎ　Ｌ　ａ　ｃ平
板上では１２個のコロニー（１９％）しか生育しなかっ
た。別の実験では、１０２−１０３個のＧ４１８耐性の
形質転換細胞をＭ　ｉ　ｎ　Ｌａｃ平板上にばらまいた
。この場合にもＧ４１８耐性コロニーの１９％がラクト
ースで生育した。

対照として、Ｌ１５８２も親ベクターｐＫＲＩＢで形質
転換した。こうして得られたＧ４１８耐性形質転換細胞
を選択し、Ｍ’１ｎＬａｃ平板１枚あたり１０２−１０
６の範囲の濃度で平板培養した。

Ｌａｃ＋形質転換細胞は全く認められなかった。

実施例６ Ｌａｃ＋細胞が菌株Ｌ　１５８２に特有の何らかの性質
の結果生育している可能性を除外するため、Ｓ、セレビ
シェの菌株ＹＮＮ２７も形質転換した。

ＹＮＮ２７をｐＫＲＩＢ−ＬＡＣ４−１で形質転換し、
Ｇ４１８耐性形質転換細胞を選択した。耐性のコロニー
をプールし、１０”−１０６個の細胞をＭ　ｉ　ｎ　Ｌ
　ａ　ｃ平板で平板培養した。２５０個のＧ４１８耐性
細胞のうちたった１個の細胞しかＬａｃ＋コロニーを生
成せず、これは菌株Ｌ１５８２の１１５０程度の頻度で
ある。ＹＮＮ２７を親ベクターｐＫＲＩＢで形質転換し
た際もしａｃ＋コロニーは全く認められなかった。

実施例７ ｐＫＲＩＢ−ＬＡＣ４−１が観察されるＬａｃ＋表現型
に関与していることをさらに証明するため、Ｌａｃ＋の
性質とＧ４１８耐性の性質が同時に失われることを判定
した。Ｇ４１８耐性表現型を用いてプラスミドが存在す
るか否かを測定した。この判定は、ＡＲＳレプリコンを
有するベクターが不安定で、特に何ら選択圧力が存在し
ない際には細胞から失われるとの観察に基づいている。

Ｌａｃ＋１５８２をＹＥＰＤ培地でＧ４１８選択を行わ
ずに１０世代生育させた。Ｇ４１８耐性細胞の頻度は当
初の２０％から３％に減少してプラスミドの損失を示唆
し、１００個のＧ４１８感受性細胞を生育期間の終わり
にレプリカ培養で試験したところすべてＬａｃ−であっ
た。これらの結果はＬ　ａｃ十裏表現型プラスミドで媒
介されでいたことを示唆する。

法要ｌ」影 対照として、Ｌａｃ”　ＹＮＮ　２７をＹＥＰＤ媒地で
１０−２０世代生育させると、細胞の９９％以上が６４
１８耐性マーカーを保持していたが、依然としてＬａｃ
＋であったのは１０−３０％だけであった。０４１８耐
性表現型がこのように安定であることから、ベクターが
宿主染色体に組込まれたことが示唆された。

実施例９ Ｌａｃ”　Ｓ、セレビシェがｐＫＲＩＢ−ＬＡＣ４−１
をもち、プラスミドが宿主染色体に組込まれていること
の直接の物理的な証明は、ハイブリッド形成プローブと
して”Ｐ−ｐＫＲＩ　Ｂ−ＬＡＣ↓−１を用いたリジン
・ハイブリッド形成分析によって得られた。リジン・ハ
イブリッド形成のデータを第１表に示しである。全ＤＮ
Ａを酵母からメソッド・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　　（１９８
０）　６５　：　４０８−４１０に記載された手順を用
いて抽出し、０．９％アガロースゲルで電気泳動させた
。ＤＮＡをニトロセルロースに移し、”Ｐ−ｐＫＲＩＢ
−ＬＡＣ４−１にハイブリッド形成した。

大旌炎土度 ラクトース輸送速度を測定して、Ｌａｃ”Ｓ、セレビシ
ェが測定可能量のラクトースを輸送するのかを判定し、
そして輸送のみかけの初速度を測定可能な時間スケール
を判定した。ラクトース輸送を以下の手順で測定した。

培地Ａ〔１１当たり１０ｇの酵母エキス、２０ｇのペプ
トン、１００Ｊの２０％乳酸（固体の水酸化ナトリウム
でｐ　Ｈ４゜５に滴定）および１００−の２０％グリセ
ロール〕または培地Ｂ〔１１当たり３．４ｇの酵母窒素
ベース（ディフコ＝Ｄｉｒｃｏ　、アミノ酸または硫酸
アンモニウムを含まない）、１０ｇの硫酸アンモニウム
、２０ｇのラクトース、２０■のアデニン、２０ｍｇの
ウラシル、２０ｍｇのロイシン、２０■のヒスチジン、
２０■のトリプトファン、２０ｎ＋＋ｒのメチオニンお
よび２０■のリジン〕で３０℃にて生育させることによ
り細胞の飽和培養を得た。笠エラクチスの菌株ＭＳ４２
５／ｐＫＲＩＢを、Ｇ４１８をｌＯＩＪｇ／□β含む培
地Ａで生育させ、盈ユセレビシエの菌株ＬＬ５８２／ｐ
ＫＲＩＢおよびＹＮＮ２７／ｐＫＲＩＢを、Ｇ４１８を
２００Ｊｇ　／　ｍＱ含む同じ培地で生育させた。プラ
スミドＡ。

ＢまたはＣ（自律的状態または組込まれた状態）で形質
転換した菌株Ｌ１５８２またはＹＮＮ２７を培地Ｂで生
育させた。

この手順は、Ｒ，セラノ　（Ｓｅｒｒａｎｏ　）　　（
１９７７）ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケ
ミストリー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊ、　ｏｆ　Ｂｉｎｃ
ｈｅｍ、　）　　８０　：９７−１０２に記載された手
順を改良したものである。輸送の測定に用いる細胞を調
製するために、飽和培養を新たな培地に希釈し、０．１
　Ａ　６００　／　ｍＱから３±ＩＡｂ。。／。Ｑまで
生育させた。細胞を濾過（直径４５關、０．４５ｐ　ｍ
ミリポア型１（Ａ）により集め、１０ｍｇの氷冷した蒸
留水で４回洗ってから、１００ｍＭの酒石酸（水酸化ナ
トリウムでｐ　Ｈ４，２に滴定）に６Ｏ−１００Ａ、、
。／−で再度懸濁した。この時点では、細胞は輸送活性
の損失なしに４℃で２４時間まで保存することができた
。

ラクトース輸送を測定するために、細胞の０．３１、０
　ｍＱのサンプルを２３°Ｃに２分間あたため、ラクト
ースを希望する濃度まで加え、セ゛ロ時点に細胞０．３
ｍΩ当たり０．１μＣ４のＤ−グルコース−（＋４ｃ）
ラクトース（ＣＦＡ　　２７８；５８ｍＣ１／　ｍ　Ｍ
　；アメルシャム・コーポレーション（４ｍ６ｒｓｈａ
ｍ　Ｃｏｒｐ、）米国マサチューセッツ州レキシントン
）を加えた。グラフに表示した時点で１００μｌのサン
プルを直径２５璽飄のヌクレボア（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ
　）　　・フィルター（孔径０．４μｍ；ヌクレオポア
・コーポレーション（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐ、
　）米国カリフォルニア州プレザントン（Ｐｌｅａｓａ
ｎｔｏｎ）　）で濾過した。フィルターを５ｍΩの水冷
蒸留水で２回洗い、乾燥し、液体シンチレーションカウ
ンターを使用して１１当たり２５０ｍ（２のトリトンＸ
−１００と６．５ｇのｐ−テルフェニルを含有するトル
エンを主成分とするカクテル４ｍＱの中でカウントした
。各反応の比活性（ｃｐｍ　／ｐｍｏｌラクトース）を
１０μｌのサンプルをカウントすることによって測定し
た。データは、細胞間ラクトースのｐｍｏ　Ｉ　／　Ａ
　６Ｇ（＋として表現しである。バックグラウンド輸送
を９０℃で３分間加熱した細胞を用いて測定した。バッ
クグラウンドとしては、２２５−３Ｑｃｐが代表的であ
った。

実施例１１ Ｌａｃ”Ｓ、セレビシェでのラクトース輸送は、Ｋ、ラ
クチスの場合と同じくエネルギ依存性のプロセスである
と判定された。エネルギ依存性を測定するために、細胞
を１ｍＭの２，４−ジニトロフェニルとともに周囲温度
で２０分間予備恒温培養してから１ｍＭ”Ｃ−ラクトー
スの吸収量を測定した。ラクトース輸送は、Ｓ、セレビ
シェのしａｃ十菌株、Ｌ１５８２／ｐＫＲＩＢ−ＬＡＣ
４−１とに、ラクチス菌株ＭＳ４２５／ｐＫＲＩＢの両
方で９１％阻害された。

災彬性Ｌ１′ Ｌａｃ”Ｓ、セレビシェの生育速度を細胞の倍加時間を
測定することにより判定し。菌株をＭ　ｉ　ｎＬ　ａ’
ｃ培地中−で対数期まで予備生育してから、新たな培地
に希釈し、そしてＡ、。。を０．２から飽和まで測定し
た。

本明細書では、本発明を特定の好適実施態様について説
明していた。しかし、本発明の明白な変更が当業者に明
らかであるように、本発明はこれらの実施例に限定され
るものではない。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＬａｃトＳ、セレビシェのｐＫＲＩＢ−ＬＡ
Ｃ４−１の塩基配列のリジン・ハイブレッド形成分析を
示す。 第２図は、本発明で説明した酵母のプラスミドの構造を
示す。プラスミドＡはｐＫＲＩＢ−ＬＡ旦↓−１を表わ
し、他のプラスミドＢ、Ｃ，ＤおよびＥはプラスミドＡ
から誘導したもので、プラスミドＡからの特定の欠失を
有している。プラスミドＧはｐＢＮ５３で、このｐＢＮ
５３からｐＫＲＩＢ−ＬＡＣ４−１のに、ラクチスの領
域を得た。 第３図は、Ｌａｃ”Ｓ、セレビシェでのラクトース輸送
速度を示すグラフである。 第４図は、Ｌａｃ”Ｓ、セレビシェでのラクトース輸送
が輸送体によって媒介されていることを示すグラフであ
る。 特許出願人　　ザ　ユニバーシティ　オプケンタッキー
　リサーチ ファウンデーション ＦＩＧ　　　　３ 介 ＦＩＧ ＡＢＣＤεＦＧＨＩＪ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、￥サッカロミセス￥属の菌株と同一の性質を有する
   酵母のＬａｃ＾＋菌株。 ２、上記菌株が￥サッカロミセス￥である特許請求の範
   囲第１項記載の菌株。 ３、ラクトース透過酵素遺伝子を含むプラスミドが菌株
   中に挿入された特許請求の範囲第２項記載の￥サッカロ
   ミセス￥の菌株。 ４、上記ラクトース透過酵素遺伝子が￥クルイベロミセ
   ス￥酵母から誘導された特許請求の範囲第３項記載の菌
   株。 ５、上記￥クルイベロミセス￥酵母が、￥Ｋ．ラクチス
   ￥である特許請求の範囲第４項記載の菌株。 ６、上記プラスミドがさらにβ−ガラクトシダーゼ遺伝
   子を含む特許請求の範囲第３項記載の￥Ｓ．セレビシエ
   ￥の菌株。 ７、ラクトース透過酵素遺伝子ＬＡＣ１２を含むＤＮＡ
   の断片を含むプラスミド。 ８、上記ラクトース透過酵素遺伝子を￥グルイベロミセ
   ス￥酵母から得た特許請求の範囲第７項記載のプラスミ
   ド。 ９、上記￥クルイベロミセス￥酵母が￥Ｋ．ラクチス￥
   である特許請求の範囲第８項記載のプラスミド。 １０、上記プラスミドがさらにβ−ガラクトシダーゼ遺
   伝子￥ＬＡＣ４￥を含む特許請求の範囲第７項記載のプ
   ラスミド。 １１、ラクトース透過酵素遺伝子を含むプラスミドを￥
   Ｓ．セレビシエ￥の菌株中に挿入する工程を含む、￥サ
   ッカロミセス￥属の菌株と同一の性質を有する酵母のＬ
   ａｃ＾＋菌株の製造方法。 １２、上記ラクトース透過酵素遺伝子を￥クルイベロミ
   セス￥酵母から得る特許請求の範囲第１１項記載の方法
   。 １３、上記￥クルイベロミセス￥酵母が、￥Ｋ．ラクチ
   ス￥である特許請求の範囲第１１項記載の方法。 １４、上記プラスミドがさらにβ−ガラクトシダーゼ遺
   伝子を含む特許請求の範囲第１１項記載の方法。 １５、￥サッカロミセス￥属の菌株と同一の性質を有す
   る酵母のＬａｃ＾＋菌株をラクトースの直接利用に使用
   して、ラクトースをグルコースとガラクトースに加水分
   解する、Ｌａｃ＾＋菌株の使用方法。 １６、ラクトースをホエーから得る特許請求の範囲第１
   ５項記載の方法。