JPS62247254A - Signal processing for determining base sequence of nucleic acid - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To enable the obtaining of a base sequence of nucleic acid handily at a high accuracy, by finding one band nearest a searching start point from a signal level and a threshold thereof at the searching start point on a straight line along a separation/development direction for each of separation/development trains. CONSTITUTION:One band nearest a searching start point is found from a signal level ls and a threshold ln (n is 0 or positive integer) thereof at the searching start point on a straight line along a separation/development direction x for each of separation/development trains. After an area of this band is determined from the threshold ln, the band is determined to be true according to the size of the area to detect this band, or it is determined that this band is not true and the operation is redone. This enables accurate detection of bands without misrecognition of a noise such as extra band for a band or misreading of fusion band for a single band.

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の分野］ 本発明は、核酸の塩基配列決定のための信号処理方法に
関するものである。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION [Field of the Invention] The present invention relates to a signal processing method for determining the base sequence of a nucleic acid.

［発明の背景］ 近年、急速に発達して来た分子生物学の分野においては
、生物体のａ能や複製のメカニズムを解明するために、
生物体のもつ遺伝情報を明らかにすることが必須のこと
となっている。とりわけ。[Background of the Invention] In the field of molecular biology, which has developed rapidly in recent years, in order to elucidate the a-ability and replication mechanisms of living organisms,
It is essential to clarify the genetic information possessed by living organisms. Among other things.

特定の遺伝情報を担うＤＮＡ　（もしくはＤＮＡ断片物
、以ド同様）などの核酸の１１！基配列を決定すること
が必要不ＩＩｆ矢なこととなっている。11 of nucleic acids such as DNA (or DNA fragments, the same) that carry specific genetic information! It has become unnecessary to determine the base sequence.

ＤＮＡ、ＲＮＡなとの核酸の塩基配列を決定するための
代表的な方法として、オートラジ才グラフィーを利用す
るマキサム・ギルバート（＋４ａｘａ鵬−Ｇｉｌｂｅｒ
ｔ　）法およびサンガー・クールソ７　（Ｓａｎｇｅｒ
−（：ｏｕ、１ｓｏｎ）法が知られている。前者のマキ
サム・ギルパート法は、まず、塩基配列を決定しようと
しているＤＮＡあるいはＤＮＡ断片物の鎖状分子の一方
の端部に３２　ｐ　’Ｊの放射性同位元素を含む基を結
合させることにより、その対象物を放射性標識物質とし
たのち、化学的なｆ段を利用して鎖状分子の各構成中位
間の結合を塩基特異的に切断する。次に、この操作によ
り得られた塩基特異的ＤＮＡ切断分解物の混合物をゲル
電気泳動法により分離展開し、多数の切断分解物がそれ
ぞれ分離Ｉｔ＜開されて形成された分離展開パターン（
ただし、視覚的には見ることができない）を得る。この
分離展開パターンをたとえばＸ線フィルム」二に可視化
してそのオートラジオグラフを得、得られたオートラジ
オグラフと各々のＪ！！基特異的切断−［段とから、放
射性同位元素が結合された鎖状分子の端部から一定の位
置関係にある塩基を順次決定し、これにより対象物全て
の＃１基配列を決定することができる。Maxim Gilbert (+4axa Peng) uses autoradiography as a typical method for determining the base sequence of nucleic acids such as DNA and RNA.
t) Law and Sanger-Courso7 (Sanger
-(:ou, 1son) method is known. The former Maxam-Gilpert method first involves attaching a group containing a 32p'J radioisotope to one end of a chain molecule of DNA or DNA fragments whose base sequence is to be determined. After converting the object into a radiolabeled substance, the chemical f-stage is used to base-specifically cleave the bonds between each constituent center of the chain molecule. Next, the mixture of base-specific DNA cleavage products obtained by this operation is separated and developed by gel electrophoresis, and a separation and development pattern (
However, you can't see it visually). This separation development pattern is visualized on, for example, an X-ray film to obtain its autoradiograph, and the obtained autoradiograph and each J! ! Group-specific cleavage - Step by step, determine the bases in a certain positional relationship from the end of the chain molecule to which the radioactive isotope is bound, thereby determining the #1 group sequence of all the target objects. I can do it.

また、後者のサンカー・クールンノ法は、ＤＮＡあるい
はＤＮＡ断片物の鎖状分子−と相補的であって、かつ放
射性標識が付！ｊ−されたＤＮＡ合成物を化学的な１段
を利用して１１！、！、（特異的に合成し、この塩基特
異的ＤＮＡ合成物の混合物を用いてＬ記と同様にしてそ
のオートラジオグラフからＩｉ！基配列配列定する方法
である。In addition, the latter Sankar-Kourunno method is complementary to a chain molecule of DNA or DNA fragments, and is labeled with a radioactive label! 11! using one chemical step to convert the j-containing DNA compound into 11! ,! , (specifically synthesized, and using a mixture of this base-specific DNA compound, the base sequence of Ii! is determined from its autoradiograph in the same manner as described in L.).

本出願人は、Ｊ二記核酸の塩基配列決定を簡易かつ高精
度で行なうことを目的として、それに利用されるオート
ラジオグラフ測定操作において、上記Ｘ線フィルム等の
写真感光材料を用いる従来の放射線写真法の代りに、蓄
積性蛍光体シートを用いる放射線像変換方法を利用する
方法について既に特許出願している（特開昭５９−８３
０５７号、特願昭５８−２０１２３１４じ−）。ここで
、蓄積性蛍光体シートは輝尽性蛍光体からなるものであ
り、放射線エネルギーを該蛍光体シートの輝尽性蛍光体
に吸収させたのち　ｔ＋（視乃至赤外領域の電磁波（励
起光）で励起することにより、放射線エネルギーを蛍光
として放出させることができるものである。この方法に
よれば、露光時間を大幅に短縮化することができ、また
従来より問題となっていた化学カブリ等が発生すること
がない、さらに、放射性標識物質のオートラジオグラフ
は。With the aim of determining the base sequence of J2 nucleic acids easily and with high precision, the present applicant has proposed conventional radiation therapy using photographic materials such as the above-mentioned A patent application has already been filed for a method using a radiation image conversion method using a stimulable phosphor sheet instead of the photographic method (Japanese Patent Laid-Open No. 59-83
No. 057, patent application No. 58-2012314-). Here, the stimulable phosphor sheet is made of a stimulable phosphor, and after radiation energy is absorbed by the stimulable phosphor of the phosphor sheet, t+ (electromagnetic waves in the visible to infrared region (excitation light ), it is possible to emit radiation energy as fluorescence.This method can significantly shorten exposure time and also eliminate chemical fog, which has been a problem in the past. Additionally, autoradiographs of radiolabeled substances may not occur.

・旦放射線エネルギーとして蛍光体シートに蓄積された
のち輝尽光として光電的に読み出されるから、直接にデ
ジタル信号として得たのち適当な記録媒体に保存するこ
とができる。・Since it is first stored in a phosphor sheet as radiation energy and then read out photoelectrically as photostimulated light, it can be directly obtained as a digital signal and then stored in a suitable recording medium.

従来より、核酸の塩基配列は、可視化されたオートラジ
オグラフについて放射性標識が付榮された核酸の塩基特
異的切断分解物もしくは塩基特異的合成物（以下、単に
核酸の塩基特異的断片物と称する）の分＃展開部位（バ
ンド）を視覚的に判断し、それらバンドの位置を相互に
比較することにより決定されている。よって、オートラ
ジオグラフの解析は通常人間の視覚を通して行なわれて
おり、そのために多大な時間と労力が費されている。Conventionally, the base sequence of a nucleic acid is a base-specific cleavage product or a base-specific composite of a nucleic acid labeled with a radioactive label (hereinafter simply referred to as a base-specific fragment of a nucleic acid) on a visualized autoradiograph. ) is determined by visually judging the development site (band) and comparing the positions of these bands with each other. Therefore, analysis of autoradiographs is usually performed through human vision, which requires a great deal of time and effort.

また、人間の目に依存しているため、オートラジオグラ
フを解析して得られる核酸の塩基配列が解析者によって
異なるなど１１！基配列情報の精度には限界がある。In addition, since it relies on the human eye, the base sequence of the nucleic acid obtained by analyzing an autoradiograph may differ depending on the analyst.11! There is a limit to the accuracy of base sequence information.

そこで、本出願人は、Ｌ記オートラジオグラフをデジタ
ル信号として得た後このデジタル信号−に適当な信１）
処理を施すことにより、ＤＮＡの塩基配列を１゛１動的
に決定する方法についても既に特許出願している（特開
昭５９−１２６５２７号、特願昭５９−８９６１５号、
特願昭６０−２２６０９１号−１特願閑６０−２２６０
９２号等）、オートラジオグラフに対応するデジタル信
号は、従来の放射線フィルムを利用する場合には一旦オ
ートラジオグラフを該フィルム上にｏｆ視両画像化たの
ち、反射光または透過光を利用して光電的に読み取るこ
とにより得られる。また、蓄積性蛍光体シートを用いる
場合には、オートラジオグラフが蓄積記録された蛍光体
シートを直接に読み出すことにより得られる。Therefore, after obtaining the autoradiograph described in L as a digital signal, the applicant has developed an appropriate signal 1) for this digital signal.
We have already filed a patent application for a method for dynamically determining the base sequence of DNA one by one through processing (Japanese Patent Laid-Open No. 126527/1989, Japanese Patent Application No. 89615/1983,
Patent Application No. 60-226091-1 Patent Application No. 60-2260
No. 92, etc.), when using a conventional radiographic film, the digital signal corresponding to the autoradiograph is generated by first imaging the autoradiograph on the film and then using reflected light or transmitted light. It can be obtained by reading it photoelectrically. When a stimulable phosphor sheet is used, an autoradiograph can be obtained by directly reading out the phosphor sheet on which the stimulable phosphor sheet has been stored.

しかしながら、実際に放射性標識物質を電気泳動法など
により支持媒体上に分ａ展開させてＩｉＩられた分離展
開パターンには種々の歪みおよびノイズが生じがちであ
る。たとえば、試料の作成時において核酸の塩基特異的
断片物の調製、分離がネト分であったり、試料を支持媒
体の各スロットに注入する際に他のスロットの試料が混
入したりすることにより、本来現われるべきではない位
とにバンド（これをゴーストバンドまたはエクストラバ
ンドと呼ぶ）が現われることがある。あるいは試料に放
射性不純物が混入したり、露光過程で自然放射線等の照
射を受けたりすることによりノイズが発生することがあ
る。However, various distortions and noises tend to occur in the separation and development pattern obtained by actually developing a radiolabeled substance on a support medium by electrophoresis or the like. For example, when preparing a sample, the preparation and separation of base-specific fragments of nucleic acids may be a problem, or when a sample is injected into each slot of the support medium, samples from other slots may be mixed in. A band (this is called a ghost band or extra band) may appear at a position where it should not appear. Alternatively, noise may occur due to radioactive impurities being mixed into the sample or exposure to natural radiation during the exposure process.

また、分１ｌＩＩ展開開始位置付近のバンドの密な領域
においては−・つ一つのバンドが七分に分離していす、
複数のバンドが融合していることがある。In addition, in the region where the band is dense near the starting position of minute 1lII expansion, each band is separated into seven parts.
Sometimes multiple bands are fused.

この結果、これらのエクストラバンド、ノイズおよび融
合バンドも含めてバンドの比較同定が行なわれるために
、塩基配列決定に誤差が生じて得られる情報の精度が低
ドしてしまう、このようなノイズあるいはバンドの融合
が発生した場合であっても、そのオートラジオグラフに
対応するデジタル信号を効率良く信り処理して核酸の塩
基配列を品枯Ｉｆｆで１°１動決定することが申まれる
。As a result, comparative identification of bands is performed including these extra bands, noise, and fusion bands, which causes errors in base sequencing and reduces the accuracy of the information obtained. Even when band fusion occurs, it is recommended to efficiently process the digital signal corresponding to the autoradiograph and determine the base sequence of the nucleic acid 1° 1 at the time of depletion Iff.

［発明の要旨］ 本発明者は、オートラジオグラフィーを利用して核酸の
塩基配列を自動決定する方法において、ノイズあるいは
バンドの融合が生じている分離展開パターンであっても
そのオートラジオグラフに対応するデジタル信号を好適
に信号処理することにより、核酸の塩基配列を簡易かつ
高精度で自動決定することを実現した。[Summary of the Invention] In a method for automatically determining the base sequence of a nucleic acid using autoradiography, the present inventor has devised a method for automatically determining the base sequence of a nucleic acid using autoradiography, even if the separation development pattern includes noise or band fusion. By suitably processing the digital signals, we have succeeded in automatically determining the base sequence of a nucleic acid with ease and high accuracy.

すなわち１本発明は、放射性標識が付４Ｆされた塩基特
異的ＤＮＡ断片物もしくは塩基特異的ＲＮＡ断片物の混
合物が支持媒体上に−・次元的方向に分離展開されて形
成された複数の分離展開列のオートラジオグラフに対応
するデジタル信号について信号処理を行なうことにより
、核酸の塩基配列を決定する方法において、 ｌ）分離展開列ごとに分１ｌＩｌ展開力向Ｘに沿った直
線１−で、探索開始点の信号レベル交Ｓおよび信５！ｆ
レベルの悶（Ｍｉｎ（ただし、ｎはＯまたは正の整数で
ある）に基づいて探索開始点に最も近いバンドを一つ探
し出す工程、および ２）悶値見。に基づいて該バンドの領域を求めたのち、
この領域の大きさに基づいて ａ）該バンドは真のバンドであると決定してバンドを検
出する、または ｂ）該バンドは真のバンドではないと決定して上記第一
・工程からやり直す、 ことにより、各分離展開列について−・つのバンドを検
出する工程、 を含むことを特徴とする核酸の塩基配列決定のための信
号処理方法を提供するものである。In other words, the present invention provides a plurality of separated spreads formed by spreading a mixture of base-specific DNA fragments or base-specific RNA fragments labeled with a radioactive label in a dimensional direction on a support medium. In a method for determining the base sequence of a nucleic acid by performing signal processing on a digital signal corresponding to an autoradiograph of a column, l) searching in a straight line 1- along the unfolding force direction X for each separation/deployment column; The signal level of the starting point is S and S! f
2) finding one band closest to the search starting point based on the level Min (where n is O or a positive integer); and 2) checking the score. After finding the area of the band based on
Based on the size of this region, a) determining that the band is a true band and detecting the band, or b) determining that the band is not a true band and starting over from the first step above. This provides a signal processing method for determining the base sequence of a nucleic acid, which comprises the steps of: detecting one band for each separation and expansion column.

本発明によれば、核酸の塩基特異的断片物の混合物を支
持媒体上で分離展開させて得られた分離展開パターンの
オートラジオグラフに対応するデジタル信号について、
分離展開パターンにノイズおよび／または融合バンドが
生じている場合であっても、ノイズをバンドと判断する
ことなく、かつ融合バンドを一つ一つのバンドに分離し
ながらイを正なバンドのみを有効に検出しうる機ス赦を
有する信り処理回路を通すことにより、核酸の塩基配列
を自動的に簡易かつ高精度で得ることができる。According to the present invention, regarding a digital signal corresponding to an autoradiograph of a separated development pattern obtained by separating and developing a mixture of base-specific fragments of nucleic acids on a support medium,
Even if noise and/or fused bands occur in the separation expansion pattern, only the positive bands are enabled while separating the fused bands into individual bands without determining the noise as a band. The base sequence of a nucleic acid can be automatically obtained easily and with high precision by passing it through a trust processing circuit that has a chance of detecting it.

すなわち、ｔめ信号レベルの悶イ１とバンドの大きさに
関する　・定範囲とを設定しておき、まず分離展開方向
に沿った探索線Ｅで閾値を越える信号が見つかった場合
にバンド有りとみなし、次いでこのバンドの大きさが一
定１ｉ囲内である場合に真正な−のバンドと決定するこ
とにより、エキストラバンドＴのノイズをバンドと誤認
することなく、また融合バンドを一つのバンドと読み誤
ることなく、精確にバンドを検出することができる。In other words, a certain range regarding the tth signal level and the size of the band is set, and first, if a signal exceeding the threshold is found on the search line E along the separation development direction, it is assumed that a band exists. Then, if the size of this band is within a certain 1i range, it is determined to be a true - band, so that the noise of the extra band T is not mistaken as a band, and the fused band is not mistaken as one band. It is possible to accurately detect bands.

特に、バンドの大きさが予め設定された範囲を越えた場
合には悶イめをより大きな値に変更してＬ記操作をやり
直すことにより、ノイズの影響を排除し、融合バンドを
適確に分離しながらバンドを確定することができる。In particular, if the size of the band exceeds the preset range, change the value to a larger value and repeat the operation described in L to eliminate the influence of noise and accurately form the fusion band. Bands can be determined while separating.

また、試料の分離展開条件は展開条件等に左右されやす
いために分ｇｌ展開列自体が曲がって蛇行したり、また
支持媒体と写真感光材料もしくは蓄活性蛍光体シートと
を重ね合わせて露光する際に、その東ね合わせがずれた
ためなどによりパターン全体が傾くことが多い、核酸の
塩ノＳ配列を高精度で自動決定するためには一般に、各
分離展開列（レーン）についてそのレーンに精確に沿っ
た一次元波形（プロファイル）を作成することが望まれ
るが、レーンの蛇行あるいはパターンの傾斜が生じてい
る場合にはその作成に際して各レーンを追尾する必要が
ある０本発明によれば、真のバンドおよびその形状を確
定することができるから、この結果を用いて好適にレー
ン追尾を行なうことがＩＩｆ濠である。In addition, since the sample separation and development conditions are easily influenced by the development conditions, etc., the GL development column itself may bend and meander, or when the support medium and the photographic light-sensitive material or the active phosphor sheet are overlapped and exposed. However, in order to automatically determine the salt S sequence of a nucleic acid with high accuracy, the entire pattern is often tilted due to misalignment. It is desirable to create a one-dimensional waveform (profile) along the same line, but if there is a meandering lane or an inclined pattern, it is necessary to track each lane when creating it. Since the band and its shape can be determined, IIf moat is a method of suitably performing lane tracking using this result.

そして、検出された真正バンド、さらにはこれに基づく
一次元のプロファイルに対して更に好適な信号処理を行
なうことにより、核酸の塩基配列を簡便かつ高精度で自
動決定することができる。Then, by performing more suitable signal processing on the detected authentic band and the one-dimensional profile based thereon, the base sequence of the nucleic acid can be automatically determined simply and with high precision.

［発明の構ｊ＆］ 本発明において用いられる試料の例としては、放射性標
識が付ケされたＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸の塩基特異的断
片物の混合物を挙げることができる。ここで、核酸の断
片物とは長鎖状の分子−の一部分を意味する。たとえば
、１１！基特異的ＤＮＡ断片物ｔシ合物の一種である塩
基特異的ＤＮＡ切断分解物混合物は、前述のマキサム・
キルパート誌に従って、放射性標識が付ＴされたＤＮＡ
を塩基特異的に切断分解することにより得られる。[Structure of the Invention] Examples of samples used in the present invention include a mixture of base-specific fragments of nucleic acids such as DNA and RNA labeled with radioactive labels. Here, the nucleic acid fragment means a part of a long-chain molecule. For example, 11! The base-specific DNA cleavage degradation product mixture, which is a type of base-specific DNA fragment compound, is the aforementioned Maxam.
Radioactively labeled DNA according to Kilpert
It is obtained by base-specific cleavage and decomposition of .

゛　また、塩基特異的ＤＮＡ合成物混合物は前述のサン
ガー嚇り−ルソン法に従って、ＤＮＡをテンブレー）　
（＃ＰＪ型〕として、放射性標識が付′Ｆされたデオｔ
ジヌクレオシドトリフオスフェートとＤＮＡ合成酵素と
を用いて合成することにより得られる。゛ In addition, the base-specific DNA compound mixture was prepared by arranging DNA according to the Sanger-Luzon method described above.
(#PJ type), a radiolabeled det
It can be obtained by synthesis using dinucleoside triphosphate and DNA synthase.

さらに、塩基特異的ＲＮＡ断片物の混合物も上記と同様
の方法により、切断分解物混合物としてまたは合成物混
合物として得ることができる。なお、ＤＮＡはその構成
中位としてアデニン、グアニン、チミン、シトシンの四
種類の塩基からなるが、　・方ＲＮＡはアデニン、グア
ニン、ウラシル、シトシンの四種類の塩基からなる。Furthermore, a mixture of base-specific RNA fragments can also be obtained as a mixture of cleavage products or a mixture of synthetic products by the same method as above. In addition, DNA consists of four types of bases: adenine, guanine, thymine, and cytosine as its middle structure, while RNA consists of four types of bases: adenine, guanine, uracil, and cytosine.

放射性標識は、これらの物質に適当な方法でコ２ｐ、直
４（：、ｎ５．３Ｈ，１２ＫＩなどの放射性同位元素を
保持させることによって付ｑ−される。A radioactive label is attached to these substances by attaching a radioactive isotope such as 2p, 4(:, n5.3H, 12KI, etc.) to these substances in an appropriate manner.

試料である放射性標識が付午された核酸の塩基特異的断
片物の混合物はゲル状支持媒体など公知の各種の支持媒
体を用いて、電気泳動法、薄層クロマトグラフィー、カ
ラムクロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフィー
など種々の分離展開方法により支持媒体上に分離展開さ
れる。The sample, a mixture of base-specific fragments of nucleic acids to which a radioactive label has been added, is subjected to electrophoresis, thin layer chromatography, column chromatography, and paper chromatography using various known support media such as gel support media. Separation and development are carried out on a support medium by various separation and development methods such as photography.

次に、放射性標識物質が分離展開された支持媒体につい
て、従来の写真感光材料を用いる放射線写真法により、
あるいは蓄積性イケ光体シートを用いる放射線像変換方
法によりそのオートラジオグラフが得られ１次いで適ち
な読取り（読出し）系を介して放射性標識物質のオート
ラジオグラフに対応するデジタル信号が得られる。Next, the support medium on which the radiolabeled substance has been separated and developed is subjected to radiography using a conventional photographic material.
Alternatively, an autoradiograph is obtained by a radiation image conversion method using a stimulable phosphor sheet, and then a digital signal corresponding to the autoradiograph of the radiolabeled substance is obtained via an appropriate readout system.

前者の放射線写真法を利用する場合には、まず支持媒体
とＸ線フィルムＴの写真感光材料とを低温もしくは常温
で長時間（数時間〜数ト時間）重ね合わせて放射線フィ
ルムを感光させたのち、現像して放射性標識物質のオー
トラジオグラフを放射線フィルム１；にｉ＋［親画像化
する０次いで１画像読取装置を用いて放射線フィルムト
に可視化されたオートラジオグラフを読み取る。たとえ
ば、放射線フィルムに光ビームを照射してその透過光ま
たは反射光を光電的に検出することにより、オートラジ
オグラフは電気信号として得られる。さらに、この電気
信（）をＡ／Ｄ変換することにより、オートラジオグラ
フに対応するデジタル信号を得ることができる。When using the former radiographic method, first, the support medium and the photographic light-sensitive material of the X-ray film T are superimposed for a long time (several hours to several hours) at low temperature or room temperature to expose the radiographic film. , develop the autoradiograph of the radiolabeled substance onto a radiographic film 1; For example, an autoradiograph is obtained as an electrical signal by irradiating a radiation film with a light beam and photoelectrically detecting the transmitted or reflected light. Furthermore, by A/D converting this electric signal (), a digital signal corresponding to an autoradiograph can be obtained.

後者の放射線像変換方法を利用する場合には。When using the latter radiation image conversion method.

まず、支持媒体と蓄積性蛍光体シートとを常温で短時間
（ａ秒〜数七分間）重ね合わせて蛍光体シートに放射性
標識物質から放出される放射線エネルギーを、ＶＭさせ
ることにより、そのオートラジオグラフを蛍光体シート
に一種のＷＩ像として記録する。ここで、蓄積性蛍光体
シートは、たとえばプラスチックフィルムからなる支持
体、二価ユーロピウム賦活弗化臭化バリウム（ＢａＦＢ
ｒ：Ｅｕ２°）ｋｇの輝尽性蛍光体からなる蛍光体層、
および透明な保護膜がこの順に積層されたものである。First, the support medium and the stimulable phosphor sheet are superimposed at room temperature for a short time (a second to several seven minutes), and the phosphor sheet receives the radiation energy emitted from the radiolabeled substance by VM. The graph is recorded on a phosphor sheet as a kind of WI image. Here, the stimulable phosphor sheet is made of a support made of, for example, a plastic film, divalent europium activated barium fluoride bromide (BaFB), etc.
r: a phosphor layer made of Eu2°) kg of stimulable phosphor;
and a transparent protective film are laminated in this order.

蓄積性蛍光体シートに含有されている輝尽性蛍光体は、
Ｘ線等の放射線が照射されるとその放射線エネルギーを
吸収して蓄積し、そののち口ｆ視乃至赤外領域の光で励
起すると？Ｓ積していた放射線エネルギーを輝尽光とし
て放出するという特性を有する。The stimulable phosphor contained in the stimulable phosphor sheet is
When radiation such as X-rays is irradiated, the radiation energy is absorbed and accumulated, and then excited by light in the oral or infrared region? It has the property of emitting the radiation energy that was accumulated in S as photostimulated light.

次いで、読出装置を用いて蓄積性蛍光体シートに石積記
録されたオートラジオグラフを読み出す。囲体的には、
たとえば蛍光体シートをレーザー光で走査して放射線エ
ネルギーを輝尽光として放出させ、この輝尽光を光電的
に検出することにより、放射性ｌＩ：！識物質のオート
ラジオグラフは可視画像化することなく直接に電気信号
として得られる。さらに、この電気信号をＡ／Ｄ変換す
ることにより、オートラジオグラフに対応するデジタル
信号を得ることができる。Next, the autoradiograph recorded on the stimulable phosphor sheet is read out using a reading device. In terms of surroundings,
For example, by scanning a phosphor sheet with a laser beam to emit radiation energy as photostimulated light, and detecting this photostimulated light photoelectrically, radioactive lI:! Autoradiographs of sensitive substances can be obtained directly as electrical signals without visual imaging. Furthermore, by A/D converting this electrical signal, a digital signal corresponding to an autoradiograph can be obtained.

Ｌ述のオートラジオグラフ測定操作およびオートラジオ
グラフに対応するデジタル信号を得る方法の詳細につい
ては、前記特開昭５９−８３０５７号、特開昭５９−１
２６５２７号、特開昭５９５９−１２ｓｚ７；７の各公
報上記載されている。For details of the autoradiograph measurement operation described in L and the method of obtaining a digital signal corresponding to the autoradiograph, please refer to the above-mentioned JP-A-59-83057 and JP-A-59-1.
No. 26527 and Japanese Unexamined Patent Publication No. 5959-12sz7;7.

なお、上記においては、支持媒体上に分離展開された放
射性標識物質のオートラジオグラフに対応するデジタル
信５）をずする方法として、従来の放射線写真υ、およ
び放射線像変換方法を利用する方法について述べたが、
これらの方法に限定されるものではなく、それ以外の如
何なる方法により得られたデジタル（−ｉシ）であって
も放射性標識物質のオートラジオグラフと対応関係があ
る限り、本発明の信号処理方法を適用することがｉｒ（
能である。In addition, in the above, as a method of removing the digital signal 5) corresponding to the autoradiograph of the radiolabeled substance separated and developed on the support medium, the method using the conventional radiograph υ and the radiographic image conversion method is described. As mentioned,
The signal processing method of the present invention is not limited to these methods, but any digital (-i) obtained by any other method as long as it has a correspondence with the autoradiograph of the radiolabeled substance. Applying ir(
It is Noh.

また、］−記いずれの方法においてもオートラジオグラ
フの読取り（または読出し）は、放射線フィルム（また
は蓄積性蛍光体シート）の全面に「（って行なう必要は
なく、画像領域のみについて行なうことも勿論口ＨＥで
ある。In addition, in any of the above methods, it is not necessary to read out (or read out) the autoradiograph over the entire surface of the radiation film (or stimulable phosphor sheet), and it is also possible to read out only the image area. Of course it's the mouth HE.

得られたデジタル信号ｏｘｙは、放射線フィルム（また
は蛍光体シート）に固定された座標系で表わされた座標
（ｘ　、　ｙ）とその座標における信号のレベル（２）
とからなり、一つの信号は・つの画素に対応している。The obtained digital signal oxy consists of the coordinates (x, y) expressed in the coordinate system fixed on the radiation film (or phosphor sheet) and the signal level (2) at those coordinates.
One signal corresponds to one pixel.

信号のレベルはその座標における画像Ｃ度、すなわち放
射性標識物質の量を表わしている。従って、一連のデジ
タル信号（すなわち、デジタル画像データ）は放射性標
識物質の二次元的な位置情報を有している。The level of the signal represents the image degree C at that coordinate, ie, the amount of radiolabeled substance. Therefore, the series of digital signals (ie, digital image data) has two-dimensional positional information of the radiolabeled substance.

このようにして得られた支持媒体上の放射性標識物質の
オートラジオグラフに対応するデジタル信号には、以ド
に述べるような本発明の方法により信号処理が施されて
、目的の核酸の塩基配列の決定が行なわれる。The digital signal corresponding to the autoradiograph of the radiolabeled substance on the support medium obtained in this way is subjected to signal processing by the method of the present invention as described below, and the base sequence of the target nucleic acid is A decision will be made.

本発明の信号処理方法の実施の態様を、次の四種類の放
射性標識が付かされた塩基特異的ＤＮＡ断片物の組合せ
により形成された泳動列（分＃展開列）からなる場合に
ついて説明する。An embodiment of the signal processing method of the present invention will be described with reference to a case where the electrophoretic array (separate #development array) is formed by a combination of base-specific DNA fragments labeled with the following four types of radioactive labels.

ｌ）グアニン（Ｇ）特異的ＤＮＡ断片物２）アテニン（
Ａ）特異的ＤＮＡ断片物３〕チミン（Ｔ）特異的ＤＮＡ
断片物 ４）シトシンＣＣ）特異的ＤＮＡ断片物ここで、各１１
！基特異的ＤＮＡ断片物は、塩基特異的に切断分解もし
くは合成された。すなわち末端の塩基を同じくする種々
の長さのＤＮＡ断片物からなる。l) Guanine (G) specific DNA fragment 2) Atenine (
A) Specific DNA fragment 3] Thymine (T) specific DNA
Fragments 4) Cytosine CC) Specific DNA fragments, where each 11
! Base-specific DNA fragments are base-specifically cleaved, degraded, or synthesized. That is, it consists of DNA fragments of various lengths that share the same terminal base.

第１図は、Ｌ：、記憶種類の塩基特異的ＤＮＡ合成物が
それぞれ四つのスロットに電気泳動されてなる泳動パタ
ーンのオートラジオグラフを示す、泳動方向はＸ方向で
ある。FIG. 1 shows an autoradiograph of a migration pattern in which base-specific DNA compounds of the L: and memory type are electrophoresed into four slots, respectively, and the migration direction is the X direction.

このオートラジオグラフに対応するデジタル信号は、信
号処理方法において−ｌメモリ（バッファーメモリ、ま
たは磁気ディスク等の不揮発性メモリ）上記憶される。The digital signal corresponding to this autoradiograph is stored in a -l memory (buffer memory or non-volatile memory such as a magnetic disk) in the signal processing method.

まず第・に、泳動列（レーン）ごとに探索開始点から始
めて泳動方向Ｘに沿った直線（探索線）Ｌで、探索開始
点の信号レベルｆＬｓおよび信号の初期間４／ｆ　ｌ　
ｏに基づいてバンドを探し出す。First of all, for each electrophoresis column (lane), starting from the search start point and using a straight line (search line) L along the electrophoresis direction
Find a band based on o.

ここで、泳動方向は、レーンの蛇行およびパターンの傾
斜が生じている場合に、実際のパターンに完全に一致す
る泳動方向を意味するものではなく、試料を゛ＩＬ！、
気泳動させようとした方向であって通常は支持媒体（す
なわち、東ね合わせられた写真感光材料もしくはｉＷ積
性蛍光体シート）の長袖方向（Ｘ方向）を意味する。Here, the electrophoresis direction does not mean the electrophoresis direction that completely matches the actual pattern when lane meandering and pattern inclination occur; ,
This is the direction in which air migration is intended, and usually means the long direction (X direction) of the support medium (ie, the laminated photographic material or the iW laminated phosphor sheet).

また、探索開始点はレーンごとに泳動方向りの任意の点
を選ぶことができる。／ヘンドの探索は泳動方向に（パ
ターンの上部からド部に向かって）行なうのが好ましい
、初期間４／ｉｌｏは、バンドの有無を判別するための
信号レベルの悶（／ｉ　（基準値）文ｎ（ただし、ｎは
ＯまたはＩＥの整数である）の初期（１であり、比較的
低い値に設定される。バンドの大きさが一定範囲以上で
ある場合には後述するように順次より高い値に設定変更
されうる。Furthermore, any point in the migration direction can be selected as the search starting point for each lane. It is preferable to search for the / hend in the electrophoresis direction (from the top of the pattern toward the do part). The initial interval 4/ilo is the signal level (/i (reference value) The initial value (1, which is set to a relatively low value) of sentence n (where n is an integer of O or IE).If the size of the band exceeds a certain range, the Can be set to a higher value.

具体的には、たとえば次のようにしてバンドを検出する
。Specifically, bands are detected in the following manner, for example.

ｍ２１４（１）は、−・つのレーンについての部分的な
オートラジオグラフであり、バンドｌを平面的にｃ５淡
画像として表示した図である。バンド探索は泳動方向Ｘ
に沿った直線２について行なわれる。m214(1) is a partial autoradiograph for two lanes, and is a diagram in which band l is displayed as a c5 light image in a plane. Band search is performed in migration direction
The calculation is performed on straight line 2 along .

第２図（２）は、この直ｍ２についてＸ方向の位置と信
号レベルとからなる一次元波形を示す。FIG. 2(2) shows a one-dimensional waveform consisting of the position in the X direction and the signal level for this axis m2.

すなわち、バンド探索はこの一次元波形に基づいて行な
われるのであるが、デジタル信−〕は各読取り（読出し
）画素に対応しているから、実際には・次元波形は不連
続点の集合である。In other words, the band search is performed based on this one-dimensional waveform, but since the digital signal corresponds to each readout pixel, the dimensional waveform is actually a set of discontinuous points. .

探索開始点の信号−レベル文Ｓと初期閾値をｌｎ＋Δｌ
＝ｌｎ＋１１文０との関係に基づいて場合分けすると、
第３図に示すような１１通りの場合が起こりうる。なお
、第３図は第２図（２）の・次元波形を部分的に示す図
であり、白点は探索開始点を表わし、黒点はバンド検知
点を表わしている。すなわち、（１）開始レベル文Ｓが
初期田植見。以Ｆ（ｉｓ≦見。）であって、かつ信号レ
ベルが増加する傾向にある場合［第３図（１）］、（２
）開始レベル文Ｓが初期闇値見。以ド（ＵＳ≦Ｊｉｏ）
であって、かつ信号レベルが減少する傾向にある場合［
第３図（２）］、 （３）開始レベル！；Ｌｓが初期１１１Ｌｏより高く（
文Ｓ＞文。）、かつ信号レベルが増加する傾向にある場
合［第３図（３）］、 （４）開始レベル文Ｓが初期闇値２゜より高くＣ１ｓ＞
ｎｏ）、かつ信号レベルが減少する傾向にある（そして
、信号レベルは−・爪間４ｔｌｎｏをド回る）場合［第
３図（４）］　、および（５）開始レベル！Ｌｓが初期
田植す０より高く（ｉｓ＞ｆＬｏ）、かつ信号レベルが
減少する傾向にあるものの闇値ｎｏをＦ回らない場合［
第３図（５）］、 である。The signal-level sentence S at the search starting point and the initial threshold are ln+Δl
=ln+11 If we divide the cases based on the relationship with sentence 0,
Eleven cases as shown in FIG. 3 can occur. Note that FIG. 3 is a diagram partially showing the -dimensional waveform of FIG. 2 (2), with white dots representing search start points and black dots representing band detection points. That is, (1) the starting level sentence S is an initial Tauemi. If F(is≦see.) and the signal level tends to increase [Fig. 3 (1)], (2
) The starting level sentence S is the initial darkness value. (US≦Jio)
and the signal level tends to decrease [
Figure 3 (2)], (3) Starting level! ; Ls is higher than the initial 111Lo (
Sentence S > Sentence. ), and the signal level tends to increase [Figure 3 (3)], (4) the starting level sentence S is higher than the initial darkness value 2° C1s>
no), and the signal level tends to decrease (and the signal level goes around -4tlno) [Figure 3 (4)], and (5) starting level! If Ls is higher than 0 at the initial rice planting (is>fLo) and the signal level tends to decrease but does not go around the darkness value no by F [
Figure 3 (5)].

なお、」−記（５）の場合はバンドが近接していてバン
ドとバンドとの間隔が七分ではないときに生じ、いわゆ
るバンドの融合を表わしている。Note that the case (5) occurs when the bands are close to each other and the interval between the bands is not seven minutes, and represents what is called fusion of the bands.

ト記（１）および（２）の場合（立Ｓ≦見。）は最も弔
純なケースであり、信号レベルが一次元波形りで次に初
めて閾値文０以七となる点をバンド検知点とする。Cases (1) and (2) (standing S≦see) are the simplest cases, and the band detection point is the point where the signal level becomes a one-dimensional waveform and the threshold value is 0 to 7 for the first time. shall be.

Ｌ記（３）の場合（交Ｓ＞文０）には既に開始点が検出
すべきバンドの領域にあるので、信号レベルが次に開始
レベルｉｓ以上となる点をバンド検知点とする。In the case of L (3) (intersection S>statement 0), the start point is already in the region of the band to be detected, so the point where the signal level next becomes equal to or higher than the start level is is set as the band detection point.

Ｌ記（４）の場合Ｃ１ｓ　＞立０）にはまだ開始点が検
出済みのバンドの領域にあるので、信号レベルが・度闇
値文。をド回った後初めて閾値をｌｎ＋Δｌ＝ｌｎ＋ぬ
見。In case of L (4), since the starting point is still in the detected band area (C1s > standing 0), the signal level is . After going around the time, I found the threshold value ln+Δl=ln+nu.

以１−となる点をバンド検知点とする。The point that satisfies 1- is defined as the band detection point.

そして、Ｌ記（５）の場合（！；Ｌｓ　＞文。）にはバ
ンド間で信号レベルが闇値！；Ｌｏ以丁とならないので
１次に初めて開始レベルＵＳ以上となる点をバンド検知
点とする。And in the case of L (5) (!; Ls > sentence.), the signal level between bands is a dark value! ; Since Lo is not reached, the point at which the starting level US is reached or higher for the first time is set as the band detection point.

このように／ヘンド検知点を定めることにより、既に決
定されたバンドを１呼び検出したり１次に検出すべきバ
ンドを探し損なうことなく、バンド検出を行なうことが
できる。By determining the /hend detection point in this way, band detection can be performed without detecting an already determined band one call or failing to search for a band to be detected first.

第ニーに、探し出されたバンドについて闇値文〇に基づ
いてその領域を求め１次いで領域の大きさから該バンド
が真のバンドであるか否かを決定し、真のバンドである
場合にのみ検出すべきバンドとする。Second, the area of the found band is determined based on the dark value statement 〇.Then, it is determined from the size of the area whether or not the band is a true band, and if it is a true band, only the band that should be detected.

まず、バンドは上記バンド検知点に連なっている点の集
合であるとして、バンド検知点を基点としてそれに１−
ド左右斜めのいずれかで連続し、かつ４．１号レベルが
闇値文０以−Ｌである点を求める。First, assuming that a band is a set of points connected to the above band detection point, 1-
Find points that are continuous on either the left or right diagonal and whose level 4.1 is a dark value sentence of 0 or more -L.

得られたバンド検知点を含む連続した領域がバンドの領
域である。A continuous area including the obtained band detection points is a band area.

次いで、バンドの領域の大きさを求める。領域の大きさ
はたとえば、領域のＸ方向の最大距離Ｘ０およびＸ方向
に直角な方向ｙの最大圧ｆｔ　ｙ　。Next, the size of the band area is determined. The size of the region is, for example, the maximum distance X0 of the region in the X direction and the maximum pressure ft y in the direction y perpendicular to the X direction.

で見積ることができる。can be estimated at.

第４図に、探し出されたバンドの領域（斜線部分＝３）
の例を示す。Figure 4 shows the area of the band found (hatched area = 3)
Here is an example.

ｔめ、一つのバンドとして容認できるＸ方向およびＸ方
向の最小の輻ｘｍｉｎ　、　　ｙｍｉｎ　、　並びにＸ
方向およびＸ方向の最大の＠ｘｍａｘ　、　　ｙｍａｘ
を設定しておく、すなわち、ｘ＋ｓｉｎおよびｙｌｎは
真正バンドとノイズを区別するためのｊＱ定定直１あり
、Ｘ　Ｉｌａ！およびＶ　ｌｅａ！は巾−・のバンドと
複数個が併合したバンドを区別するための設定イ１であ
る。t, the minimum convergence in the X direction and the X direction that is acceptable as one band xmin, ymin, and
direction and maximum in the X direction @xmax, ymax
In other words, x+sin and yln have jQ constant 1 to distinguish between the true band and noise, and X Ila! and V lea! is the setting 1 for distinguishing between a band with a width of -. and a band where a plurality of bands are merged.

ａ）距ｆｌｌ　Ｘ　ｏおよび距離ｙｏがいずれも上記最
小幅と最大幅の範囲内にある（　ｘ　ｓｉｎ≦ｘ（、≦
ｘ　ｗａｘかつｙ　ｓｉｎ≦Ｙｏ≦ｙｍａｘ）場合には
、得られたバンドは真のバンドであると決定し、このバ
ンドを検出すべきバンドとする。a) The distance fll X o and the distance yo are both within the range of the above minimum width and maximum width (x sin≦x(,
x wax and y sin≦Yo≦ymax), the obtained band is determined to be a true band, and this band is set as the band to be detected.

ｂ、）距離Ｘｏおよび距離ｙｏのうちの少なくとも・方
が１−記最小幅よりも小さい（ｘＯくｘ　１ｎまたはｙ
Ｏ＜ｙｍｉｎ）場合には、得られたバンドはエクストラ
／へンドであって真のバンドではないと決定したのち、
バンド検知点よりさらにド部の領域についてバンド探索
を行なう。b.) At least one of distance Xo and distance yo is smaller than the minimum width (xO x x 1n or y
O<ymin), after determining that the obtained band is an extra/hendo band and not a true band,
A band search is performed for the region beyond the band detection point.

ｂｚ）ｌ二記ａおよびす、以外の場合であって、距離Ｘ
ｏおよび距離ｙｏのうちの少なくとも−・方が上記最大
幅よりも大きい（Ｘｏ＞Ｘ層ａ！もしくはｙ。＞ｙｍａ
ｘ）場合には、バンドの分離が部分ではないとして、闇
値交０を１．に変更して探索開始点からｌ’Ｔびバンド
探索をやり直す。bz) In cases other than l2-a and s, the distance
o and the distance yo, at least -. is larger than the maximum width (Xo>X layer a! or y.>yma
x), assuming that the band separation is not partial, the dark value intersection 0 is set to 1. , and redo the l'T band search from the search starting point.

ここで、新たな闇植立、は交０に一定の増分Δ交を加え
た値（文、＝見。＋６文）であり、悶イｔ１を高くして
バンドを探索し直すことにより、融合バンドを−・つ一
つに分離して真のバンドを決定し、あるいは相対的に信
号レベルの小さなエクストラバンドを好適に除去するこ
とができる。Here, the new dark planting is the value obtained by adding a constant increment Δcross to the cross 0 (text, = see. +6 sentences), and by increasing the t1 and re-searching the band, the fusion The true bands can be determined by separating the bands one by one, or extra bands with relatively low signal levels can be suitably removed.

一般に、バンド領域が大き過ぎる場合には何度でも１１
１文、をより高い１１見。、！（見。、１＝２゜＋Δ交
；ここで、ｎ＋１は闇値を変更した回数を表わす）に変
更して、探索開始点からバンド探索を綴り返すことがで
きる。この場合に、予め１ｌｌｉの最大植立■ａＸを設
定しておき、変更後の闇値交。、１が最大値以下である
Ｃ１ｎ−１≦皇■ａＸ　）場合にはこのＬ４ｔｉｌ。や
□に基づいて探索開始点からバンドＶｒＲＺ＋？をやり
直すが、闇値ｎｏや、が最大値よりも大きくなるｎｏや
１Σ（Ｌｍａｘ）場合にはバンドの分離は不可ス對であ
るとして、該バンドは真のバンドではないと決定してバ
ンド検知点よりＦ部領域でバンド探索を行なうのが処理
効率および精度の点から好ましい。In general, if the band area is too large, 11
1 sentence, higher than 11 views. ,! (See, 1=2°+Δcross; Here, n+1 represents the number of times the darkness value has been changed.) The band search can be repeated from the search starting point. In this case, the maximum planting ■aX of 1lli is set in advance, and the dark value exchange after the change is made. , 1 is less than the maximum value (C1n-1≦K aX ), this L4til. Band VrRZ+? from the search starting point based on or □? However, if the dark value no or 1Σ (Lmax) is larger than the maximum value, band separation is impossible, and the band is determined not to be a true band and band detection is performed. From the viewpoint of processing efficiency and accuracy, it is preferable to perform the band search in the F region rather than the point.

なお、バンドの大きさの判定はＬ記ｐ段に限られるもの
ではなく、たとえばバンド領域に含まれる信号の数から
判断することも可ｍである。It should be noted that the determination of the band size is not limited to the L p stages, and can also be determined based on the number of signals included in the band area, for example.

このようにして、各レーンについて真のバンドが一つ検
出されるまで（上記ａの場合が起こるまで）バンドの探
索を繰り返す。In this way, the band search is repeated until one true band is detected for each lane (until case a occurs).

このようにして検出された真正バンドを用いて、ＤＮＡ
の塩基配列を自動決定することができる。たとえば、得
られた真正バンドの領域を利用して各レーンを好適に追
尾し、Ｘ方向りの位置と信号゛のレベルとからなる精確
な一次元波形（プロファイルレーン）を得、これに更に
適当な信り処理を施すことにより塩基配列を自動決定す
ることかでさる。Using the authentic bands detected in this way, DNA
It is possible to automatically determine the base sequence of For example, by appropriately tracking each lane using the obtained true band region, an accurate one-dimensional waveform (profile lane) consisting of the position in the X direction and the signal level is obtained, and further appropriate It is possible to automatically determine the base sequence by applying a certain amount of trust processing.

たとえば、レーンの追尾は以下のようにして行なうこと
ができる。For example, lane tracking can be performed as follows.

まず、各レーンで検出されたバンドのうち泳動開始位置
に最も近い、すなわち最もパターンＬ部に位置するバン
ド（これをバンドＡとする）を有するレーンについて、
次の追尾開始点（同時に次のバンドの探索開始点でもあ
る）を決定する。First, among the bands detected in each lane, for the lane having the band closest to the electrophoresis start position, that is, the band located closest to the L part of the pattern (this is referred to as band A),
Determine the next tracking start point (which is also the search start point for the next band).

次の追尾開始点のＸ座標は、第４図に示すように、バン
ドＡの領域３におけるＸ方向の最大距離の中点とする。The X coordinate of the next tracking start point is the midpoint of the maximum distance in the X direction in region 3 of band A, as shown in FIG.

また、Ｘ座標は、バンドＡの領域内でこのＸ座標を有す
る点のうち追尾開始点から最も遠い点のＸ座標とする。Further, the X coordinate is the X coordinate of the point farthest from the tracking start point among the points having this X coordinate within the region of band A.

第４図において、座標（Ｘａ、Ｙａ）が次の追尾開始点
であり、矢印の方向にレーンの追尾（およびバンドの探
索）が行なわれる。In FIG. 4, coordinates (Xa, Ya) are the next tracking start point, and lane tracking (and band search) is performed in the direction of the arrow.

次に、残りの三つのレーンについてそれぞれ、次の追尾
開始点を決定する。Next, the next tracking start point is determined for each of the remaining three lanes.

他ル−ンのバンド（これをバンドＢとする）の領域とバ
ンドＡのＸ方向の領域とが少しでも重なる場合には、座
標Ｘａを次の追尾開始点のＸ座標とし、バンドＢの領域
におけるｙ方向の最大距離の中点を次の追尾開始点のＸ
座標とする。If the area of the band of another rune (this is referred to as band B) and the area of band A in the X direction overlap even a little, the coordinate Xa is set as the X coordinate of the next tracking start point, and the area of band B The middle point of the maximum distance in the y direction is the next tracking start point
Coordinates.

また、他のレーンのバンドＢの領域とバンドＡのＸ方向
の領域とが全く重ならない場合には、座標Ｘａを次の追
尾開始点のＸ座標とし、バンドＡのレーンにおける次の
追尾開始点の座６１　ａと初めの追尾開始点（探索開始
点）ｙｓとの差を、バンドＢのレーンの初めの追尾開始
点ｙｓ゛に加えた値：　　ｙｓ’＋（ｙａ−ｙｇ） を次の追尾開始点のＸ座標とする。In addition, if the area of band B of another lane and the area of band A in the X direction do not overlap at all, the coordinate Xa is set as the X coordinate of the next tracking start point, and the next tracking start point in the lane of band A is The value obtained by adding the difference between the position 61 a and the first tracking start point (search start point) ys to the first tracking start point ys of the band B lane: ys' + (ya - yg) for the next tracking Let it be the X coordinate of the starting point.

そして、レーンごとに新たに設定された追尾開始点から
パターンの下部に向かってＸ方向に沿った直線上で、１
述した方法に交って再びバンドの探索を行なう。Then, on a straight line along the X direction from the newly set tracking start point for each lane toward the bottom of the pattern,
Search for bands again using the method described above.

この際に、悶イメ１交。は常に初期１１文。から始める
。そして悶イ／１文。は！；ＬＩｌａｘ以ドで終わるよ
うにするのが好ましい。At this time, they had one orgasm. is always the first 11 sentences. Start with And agony / 1 sentence. teeth! ; It is preferable to end with LIlax or later.

バンドが・つも検出されなくなるまで１本発明に係るバ
ンド検出操作と上記のレーン追尾操作を順次繰り返す、
これにより、レーンの上端部からド端部までレーン追尾
を完ｒすることができる。Repeating the band detection operation according to the present invention and the lane tracking operation described above sequentially until the band is no longer detected.
Thereby, lane tracking can be completed from the upper end of the lane to the lower end.

以しに述べたレーンの追尾の詳細については、本出願人
による昭和６１年　月　　［１出願の特願昭６１−　　
　　号明細古に配植されている。For details of the lane tracking mentioned above, please refer to the patent application filed in 1986 by the present applicant
It was planted in the old issue number.

このようにして得られたレーンの追尾情報に基づいて、
たとえばレーンに沿った一定幅の信号を抽出して一次元
のプロファイルを得たのち、プロファイルについて信号
レベルが極大となる位置を求めることによりバンドの位
置を決定する。そして、レーン間で決定された真正バン
ドの位置を相〃に比較することにより、直ちにバンドに
序列を付けることができる。このとき、上記四種類の塩
基特異的ＤＮＡ合成物の組合せが排他的な組合せである
ことから、異なるレーン上の回じ泳動位置に二つ以］二
のバンドは存在しえないことを利用して、容易に序列を
決定することができる。上記（１）〜（４）のスロット
はそれぞれ（Ｇ）。Based on the lane tracking information obtained in this way,
For example, after a one-dimensional profile is obtained by extracting a signal with a constant width along a lane, the position of the band is determined by determining the position of the profile where the signal level is maximum. By comparing the positions of authentic bands determined between lanes, it is possible to immediately rank the bands. At this time, since the combination of the four types of base-specific DNA compounds described above is an exclusive combination, it is possible to take advantage of the fact that two or more bands cannot exist at the rotational migration positions on different lanes. You can easily determine the ranking. The slots (1) to (4) above are each (G).

（Ａ）、（Ｔ）、（Ｃ）からなる末端塩基についての情
報を有するから、各バンドの属するスロットに対応する
塩基で２！検することにより、ＤＮＡの塩基配列（例え
ばＡ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ａ−Ｇ−・・・）を得ることが
できる。Since it has information about the terminal bases consisting of (A), (T), and (C), there are 2! bases corresponding to the slots to which each band belongs! By testing, the DNA base sequence (for example, A-G-C-T-A-A-G-...) can be obtained.

このようにして、ＤＮＡの片方の鎖状分子についての塩
基配列を決定することができる。なお、ＤＮＡの塩基配
列についての情報は、上記の表示形態に限られるもので
はなく、たとえば所望により同時に各バンドの強度（２
°）を放射性標識物質の相対量として表示することも可
能である。さらに、ＤＮＡの二本の鎖状分子両方につい
ての塩基配列を表示することもできる。In this way, the base sequence of one chain molecule of DNA can be determined. Note that information about the DNA base sequence is not limited to the above display format; for example, if desired, the information about the intensity of each band (2
°) can also be expressed as the relative amount of radiolabeled substance. Furthermore, it is also possible to display the base sequences of both two stranded molecules of DNA.

あるいはまた、ＤＮＡの塩基配列情報は、上記の信号処
理がなされたデジタル信号に基づいて画像として表示す
ることもできる。すなわち、各バンドの補正後の位置を
オリジナルのオートラジオグラフとともに１４視画像化
して表示することができる。この場合には、最終的な塩
基配列決定を解析者自身がこの表示画像に基づいて行な
うことがＩＩ）俺である。Alternatively, the DNA base sequence information can be displayed as an image based on a digital signal that has been subjected to the above signal processing. That is, the corrected position of each band can be converted into a 14-view image and displayed together with the original autoradiograph. In this case, II) it is up to the analyst to determine the final base sequence based on this displayed image.

なお、上記においては、試料である塩基特異的ＤＮＡ合
成物の混合物として（Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ）の排他的組合せ
を利用した場合について説明したが、本発明の信号処理
方法はこの組合せに限定されるものではなく、例えば（
Ｑ、Ｇ＋Ａ、Ｔ＋Ｃ，Ｃ）などの種々の組合せに適用す
ることができる。また同様に、塩基特異的ＲＮＡ断片物
の混合物（例えば、Ｇ、Ａ、Ｕ、Ｃの組合せ）について
も本発明の方法を適用することができる。さらに、バン
ドの検出は、−組の核酸の塩基特異的断片物の分Ｉ１１
展開列に限定されるものではなく、支持媒体にに同時に
分離展開された全ての分離展開列について行なうことが
可能である。In addition, although the case where an exclusive combination of (G, A, T, C) is used as a mixture of base-specific DNA compounds as a sample has been described above, the signal processing method of the present invention applies to this combination. For example, it is not limited to (
It can be applied to various combinations such as Q, G+A, T+C, and C). Similarly, the method of the present invention can also be applied to a mixture of base-specific RNA fragments (for example, a combination of G, A, U, and C). Furthermore, the detection of bands is based on the fraction of base-specific fragments of a set of nucleic acids.
The process is not limited to the development rows, but can be performed on all separation and development rows that are simultaneously separated and developed on the support medium.

このようにして得られた塩基配列情報についてはこのほ
かにも、たとえば、既上記録保存されている他の核酸の
塩基配列と照合するなどの遺伝言、ＲＨ学的情報処理を
行なうこともｎ１能である。In addition to this, the base sequence information obtained in this way may be subjected to genetic and RH information processing, such as comparing it with the base sequences of other nucleic acids that have already been recorded. It is Noh.

」−述の０壮処理により決定された核酸の塩基配夕１に
ついての情報は、信号処理回路から出力されたのち、次
いで直接的に、もしくは必要により磁気ディスクや磁気
テープなどの記憶保存手段を介して記録装置に伝送され
る。The information about the base sequence 1 of the nucleic acid determined by the above-mentioned 0 process is output from the signal processing circuit, and then directly or, if necessary, stored in a storage means such as a magnetic disk or magnetic tape. is transmitted to the recording device via the recording device.

記録装置としては、たとえば、感光材料りをレーザー光
等で走査して光学的上記録するもの、ＣＲＴ笠に表示さ
れた記号・数値をビデオ−プリンター等上記録するもの
、熱線を用いて感熱記録材料に上記録するものなど種々
の原理に基づいた記録装置を用いることができる。Examples of recording devices include those that optically record by scanning a photosensitive material with a laser beam, etc., those that record symbols and numbers displayed on a CRT screen on a video printer, etc., and those that record thermally using heat rays. Recording devices based on various principles can be used, such as those that record on the material.

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of drawings]

第１図は、泳動パターンのオートラジオグラフの例を示
す部分図である。 第２図の（１）は、一つのレーンについてのオートラジ
オグラフ（濃淡画像）の例を示す部分図であり、（２）
は、直線２についてＸ方向の位置と信号レベルとからな
る一次元波形を示す。 第３図（１）〜（５）は、第２図（２）の−次元波形の
部分拡大図である。 第４図は、検出されたバンドの領域の例を示す図である
。 ｌ：バンド、２：直線（探索線）、 ３：／ヘントの領域。 白点：追尾開始点、黒点：バンド検知点特許出願人　　
富七写真フィルム株式会社代　　理　　人　　　弁理上
　　　柳　　川　　泰　　男第１図 ソ 第２図 第 ア ３図FIG. 1 is a partial diagram showing an example of an autoradiograph of a migration pattern. (1) in FIG. 2 is a partial diagram showing an example of an autoradiograph (shaded image) for one lane, and (2)
shows a one-dimensional waveform consisting of the position in the X direction and the signal level regarding the straight line 2. FIGS. 3(1) to 3(5) are partially enlarged views of the -dimensional waveform of FIG. 2(2). FIG. 4 is a diagram showing an example of a detected band area. l: Band, 2: Straight line (search line), 3: / Ghent's area. White dot: Tracking start point, black dot: Band detection point Patent applicant
Tomishichi Photo Film Co., Ltd. Attorney Yasushi Yanagawa Figure 1 Figure 2 Figure 3

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １、放射性標識が付与された塩基特異的ＤＮＡ断片物も
しくは塩基特異的ＲＮＡ断片物の混合物が支持媒体上に
一次元的方向に分離展開されて形成された複数の分離展
開列のオートラジオグラフに対応するデジタル信号につ
いて信号処理を行なうことにより、核酸の塩基配列を決
定する方法において、 １）分離展開列ごとに分離展開方向ｘに沿った直線上で
、探索開始点の信号レベルｌ＿ｓおよび信号レベルの閾
値ｌ＿ｎ（ただし、ｎは０または正の整数である）に基
づいて探索開始点に最も近いバンドを一つ探し出す工程
、および ２）閾値ｌ＿ｎに基づいて該バンドの領域を求めたのち
、この領域の大きさに基づいて ａ）該バンドは真のバンドであると決定してバンドを検
出する、または ｂ）該バンドは真のバンドではないと決定して上記第一
工程からやり直す、 ことにより、各分離展開列について一つのバンドを検出
する工程、 を含むことを特徴とする核酸の塩基配列決定のための信
号処理方法。 ２、上記第一工程において、探索開始点の信号レベルｌ
＿ｓおよび信号レベルの閾値ｌ＿ｓに関して ａ）ｌ＿ｓ≦ｌ＿ｎであるとき、信号レベルが次に閾値
ｌ＿ｎ以上となる点をバンド検知点とする、または ｂ）ｌ＿ｓ＞ｌ＿ｎであるとき、信号レベルが次に閾値
ｌ＿ｎを下回った後閾値ｌ＿ｎ以上となる点、もしくは
信号レベルが次に閾値ｌ＿ｎを下回ることなく開始レベ
ルｌ＿ｓ以上となる点をバンド検知点とする、 ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の核酸の塩
基配列決定のための信号処理方法。 ３、上記第二工程において、信号レベルが閾値ｌ＿ｎ以
上であるバンド検知点を含む連続した領域を求めたのち
、この領域のｘ方向の最大距離ｘ＿ｎおよびｙ方向の最
大距離ｙ＿ｎに関して、 ａ）ｘｍｉｎ≦ｘ＿ｎ≦ｘｍａｘであり、かつｙｍｉｎ
≦ｙ＿ｎ≦ｙｍａｘであるとき、距離ｘ＿ｎおよびｙ＿
ｎで区切られた領域を真のバンドと決定することにより
バンドを検出する、 ｂ＿１）ｘ＿ｎ＜ｘｍｉｎもしくはｙ＿ｎ＜ｙｍｉｎで
あるとき、距離ｘ＿ｎおよびｙ＿ｎで区切られた領域を
真のバンドではないと決定したのちバンド検知点より探
索方向に第一工程からやり直す、 または ｂ＿２）ｘ＿ｎ＞ｘｍａｘもしくはｙ＿ｎ＞ｙｍａｘで
あるとき、距離ｘ＿ｎおよびｙ＿ｎで区切られた領域を
真のバンドではないと決定したのち閾値をｌ＿ｎ＋Δｌ
＝ｌ＿ｎ＿＋＿１に変更して探索開始点より探索方向に
第一工程からやり直す、 （ただし、ｘｍｉｎ、ｘｍａｘ、ｙｍｉｎおよびｙｍａ
ｘはそれぞれ定数であって、バンドとして認められるｘ
方向の最小幅、ｘ方向の最大幅、ｙ方向の最小幅および
ｙ方向の最大幅であり；Δｌは閾値ｌ＿ｎの一定増分で
ある） ことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の核酸の塩
基配列決定のための信号処理方法。 ４、上記第二ｂ＿２工程において、 ｂ＿２＿１）ｌ＿ｎ＿＋＿１≦ｌｍａｘであるとき、閾
値をｌ＿ｎ＿＋＿１として探索開始点より探索方向に第
一工程からやり直す、または ｂ＿２＿２）ｌ＿ｎ＿＋＿１＞ｌｍａｘであるとき、距
離ｘ＿ｎおよびｙ＿ｎで区切られた領域を真のバンドで
はないと決定したのちバンド検知点より探索方向に第一
工程からやり直す、 （ただし、ｌｍａｘは定数であって閾値ｌ＿ｎがとりう
る最大値である） ことを特徴とする特許請求の範囲第３項記載の核酸の塩
基配列決定のための信号処理方法。 ５、上記第一工程において、分離展開方向にバンドの探
索を行なうことを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
の核酸の塩基配列決定のための信号処理方法。 ６、上記塩基特異的ＤＮＡ断片物の混合物が、 （１）グアニン特異的ＤＮＡ断片物、 （２）アデニン特異的ＤＮＡ断片物、 （３）チミン特異的ＤＮＡ断片物、 （４）シトシン特異的ＤＮＡ断片物、 の四種類からなり、分離展開列が、これら四種類の塩基
特異的ＤＮＡ断片物がそれぞれ支持媒体上に分離展開さ
れて形成された四列の分離展開列からなることを特徴と
する特許請求の範囲第１項記載の核酸の塩基配列決定の
ための信号処理方法。 ７、上記オートラジオグラフに対応するデジタル信号が
、支持媒体と輝尽性蛍光体を含有する蓄積性蛍光体シー
トとを重ね合わせて、支持媒体上の放射性標識物質のオ
ートラジオグラフを該蛍光体シートに蓄積記録したのち
、該蛍光体シートに励起光を照射して該オートラジオグ
ラフを輝尽光として光電的に読み出すことにより得られ
たものであることを特徴とする特許請求の範囲第１項記
載の核酸の塩基配列決定のための信号処理方法。 ８、上記オートラジオグラフに対応するデジタル信号が
、支持媒体と写真感光材料とを重ね合わせて、支持媒体
上の放射性標識物質のオートラジオグラフを該感光材料
に感光記録したのち、該感光材料上に可視化されたオー
トラジオグラフを光電的に読み取ることにより得られた
ものであることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載
の核酸の塩基配列決定のための信号処理方法。[Claims] 1. A plurality of separations formed by separating and spreading a mixture of radioactively labeled base-specific DNA fragments or base-specific RNA fragments in one-dimensional direction on a support medium. In a method for determining the base sequence of a nucleic acid by performing signal processing on a digital signal corresponding to an autoradiograph of a column, 1) for each column of separation and development, on a straight line along the separation and development direction x, the search starting point is 2) finding one band closest to the search starting point based on the signal level l_s and the signal level threshold l_n (where n is 0 or a positive integer); and 2) finding the area of the band based on the threshold l_n. Then, based on the size of this region, a) the band is determined to be a true band and the band is detected; or b) the band is determined not to be a true band and the band is detected. 1. A signal processing method for determining a base sequence of a nucleic acid, comprising the steps of: restarting the process, and detecting one band for each separation and expansion column. 2. In the first step, the signal level l at the search starting point
With respect to _s and the signal level threshold l_s, a) when l_s≦l_n, the next point where the signal level is equal to or higher than the threshold l_n is the band detection point, or b) when l_s>l_n, the signal level is next The band detection point is defined as a point where the signal level becomes equal to or higher than the threshold value l_n after falling below the threshold value l_n, or a point where the signal level becomes equal to or higher than the start level l_s without falling below the threshold value l_n. A signal processing method for determining the base sequence of a nucleic acid as described in Section 3. 3. In the second step, after finding a continuous region including band detection points where the signal level is equal to or higher than the threshold value l_n, regarding the maximum distance x_n in the x direction and the maximum distance y_n in the y direction of this region, a) xmin ≦x_n≦xmax and ymin
When ≦y_n≦ymax, the distances x_n and y_
Detect a band by determining a region separated by n as a true band; b_1) When x_n<xmin or y_n<ymin, determine a region separated by distances x_n and y_n as not a true band. Then, start over from the first step in the search direction from the band detection point, or b_2) When x_n>xmax or y_n>ymax, determine that the area separated by distances x_n and y_n is not a true band, and then set the threshold. l_n+Δl
= l_n_+_1 and start over from the first step in the search direction from the search starting point (however, xmin, xmax, ymin and yma
Each x is a constant, and x is recognized as a band.
Δl is a constant increment of the threshold value l_n). Signal processing method for base sequencing. 4. In the second b_2 step above, b_2_1) When l_n_+_1≦lmax, set the threshold value to l_n_+_1 and start over from the first step in the search direction from the search start point, or b_2_2) When l_n_+_1>lmax, at distances x_n and y_n. After determining that the delimited area is not a true band, the process starts over from the first step in the search direction from the band detection point (however, lmax is a constant and the threshold value l_n is the maximum possible value). A signal processing method for determining the base sequence of a nucleic acid according to claim 3. 5. The signal processing method for determining the base sequence of a nucleic acid according to claim 1, wherein in the first step, a band is searched in the direction of separation and development. 6. The mixture of the base-specific DNA fragments includes (1) a guanine-specific DNA fragment, (2) an adenine-specific DNA fragment, (3) a thymine-specific DNA fragment, and (4) a cytosine-specific DNA. The method is characterized in that the separation and development column consists of four separate and development columns formed by separating and developing these four types of base-specific DNA fragments on a support medium, respectively. A signal processing method for determining the base sequence of a nucleic acid according to claim 1. 7. The digital signal corresponding to the autoradiograph is transmitted to the autoradiograph of the radiolabeled substance on the support medium by superimposing the support medium and the stimulable phosphor sheet containing the stimulable phosphor. Claim 1, characterized in that the autoradiograph is obtained by accumulating and recording on a sheet and then photoelectrically reading out the autoradiograph as photostimulated light by irradiating the phosphor sheet with excitation light. A signal processing method for determining the base sequence of a nucleic acid as described in Section 3. 8. A digital signal corresponding to the autoradiograph is transferred onto the photosensitive material after the autoradiograph of the radiolabeled substance on the support medium is photosensitively recorded on the photosensitive material by superimposing the support medium and the photosensitive material. 2. The signal processing method for determining the base sequence of a nucleic acid according to claim 1, wherein the signal processing method is obtained by photoelectrically reading an autoradiograph visualized in .