【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]
［産業上の利用分野］
本発明は遺伝子に関し、詳しくはベンゼンまたはその誘
導体からカテコール類を生産しうる微生物の保持する遺
伝子に関する。
［従来の技術とその問題点］
本発明者らは、カテコールの製造に関する研究過程にお
いて、カテコール生産菌、たとえばシュードモナス・エ
スピー１３６Ｒ−３（ＦＥＲＭ Ｐ−１３９７０）より
ベンゼンオキシゲナーゼおよびベンゼングリコールデヒ
ドロゲナーゼ遺伝子を少なくとも含む遺伝子領域を組換
え体ＤＮＡにより単離した（特願昭５９−２７０１３５
３）。しかし、該遺伝子の詳細な構造などは不明であっ
た。
そこで、さらに研究を重ねた結果、その遺伝子領域のＤ
ＮＡ配列の詳細な構造を特定することに成功したのであ
る。
配列をコードする領域Ｉ 、 ＩＩ 、 ｍおよび■を
含む遺伝子に関する。
領域工[Industrial Application Field] The present invention relates to genes, and more particularly to genes carried by microorganisms capable of producing catechols from benzene or its derivatives. [Prior Art and its Problems] In the course of research on the production of catechol, the present inventors isolated at least benzene oxygenase and benzene glycol dehydrogenase genes from catechol-producing bacteria, such as Pseudomonas sp. 136R-3 (FERM P-13970). The gene region containing the gene was isolated using recombinant DNA (Japanese Patent Application No. 59-270135
3). However, the detailed structure of this gene was unknown. As a result of further research, we found that the D
They succeeded in identifying the detailed structure of the NA sequence. It relates to a gene containing the sequence encoding regions I, II, m and ■. area engineering
【遺伝子配列があります】[There is a gene sequence]
【遺伝子配列があります】[There is a gene sequence]
領域ＩＩ
Area II
【遺伝子配列があります】[There is a gene sequence]
領域■
Area■
【遺伝子配列があります】[There is a gene sequence]
【遺伝子配列があります】[There is a gene sequence]
領域■
Area■
【遺伝子配列があります】[There is a gene sequence]
本発明の遺伝子は少なくとも上記４個の領域を含んでい
ればよく、その配列順序は問わない。また、この遺伝子
は第５の領域として下記の酵素蛋白のアミノ酸配列をコ
ードする領域を含むこともある。
領域ＶThe gene of the present invention only needs to contain at least the above four regions, and the sequence order thereof does not matter. Additionally, this gene may include a region encoding the amino acid sequence of the enzyme protein described below as a fifth region. Area V
【遺伝子配列があります】[There is a gene sequence]
本発明の遺伝子の塩基配列の例を第１図に示す。
こ（７） ＤＮＡは、そ（７） ＤＮＡ釦中に制限酵素
ＥｃａＲＩ。
５ａｌＩ 、 ＰｓｔＩ 、 Ｈｉｎｄｌｌｌで切断
される個所があり、たとえば５ａｌＩによる切断部位は
１８２９番日のＧと１８３０番日のＴの間であり、Ｐｓ
ｔＩによる切断部位は２１３３番日のＣと２１３４番口
のＴの間、 ４０２５番１゛ｌのＣと４０２６番口のＴ
の間および５２６９番口のＣと５２７０番ＩＩのＴとの
間である。また、Ｈｉｎｄｍによる切断部位は２１７２
番口のＡと２１７３番日のＡの間である。
本発明の遺伝子は、次のようにして調製することができ
る。ベンゼンオキシゲナーゼおよびベンゼングリコール
デヒドロゲナーゼ遺伝子を右するカテコール類生産閑、
たとえばシュードモナス属に属し、カテコール類の分解
酵素が欠失もしくは低活性化した変異株（たとえばシュ
ードモナス・エスピー１３８Ｒ−３，ＦＥＲＮ Ｐ−８
９７０）から上記両遺伝子を含む遺伝子領域を常法（た
とえばＪ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 ８９．１０８５（
１９８５）など）により取出し、制限酵素Ｓａｕ ３Ａ
で部分的に切断して必要なりＮＡ断片（分子量約３０Ｋ
ｂ）を得る。一方、広宿主域プラスミドＲ５ＦＩＯＩＯ
由来のコスミドｐＭＭ８３３（Ｇｅｎｅ ２４．２９９
（１９８３））等をプラスミドベクターとして用い、こ
れを制限酵素ＳｍａＩ、 ＨｐａＩで別々に切断し、
混合後、 ＢａｍＨＩで切断し、前記ＤＮＡ断片と混合
し゛てＴ４ ＤＮＡリガーゼで連結する。
次いで、これを大１揚菌（エシェリヒア・コリ）に感染
するウィルス、ラムダ・ファージの殻に包み込み（ｉｎ
ｖｉｔｒｏ ｐａｃｋａｇｉｎｇ） 、大１！！菌に
感染させ、染色体ＤＮＡを組込んだコスミドをもつ大腸
菌クローンを取得する（たとえば大１揚菌５Ｉ−１００
゜ＦＥＲＭ Ｐ−８００７）。
この大腸菌が保持するコスミドｐＧＲ３００を制限酵素
ＥｃｏＲＩで切断して得たＤＮＡ断片を、制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩテ切断したプラスミドｐｌＪｃ ８（Ｇｅｎｅ
ＩＪ ２５９（１９８２））に連結し、大腸菌ＪＭ８３
株に形質転換し、カテコール類生産能を保持する大腸菌
を選択する。
この大腸菌形質転換体よりプラスミドを抽出し、種々の
制限酵素による切断解析を行ない、制限酵素地図を作成
する０次いで、これに基づき制限酵素による切断および
エキソヌクレアーゼＢａ Ｉ −３１を用いて欠失誘導
体を作成し、各欠失プラスミドを保持する大ＩＩ！菌Ｊ
Ｍ８３株を用いて目的とする遺伝子を含む領域を求める
。
このようにして得た遺伝子領域の塩基配列をＭ１３ファ
ージ・ジデオキシ法により決定した。
領域工
第６１７〜６１９番１１のＡＴＧ配列から第１９８１−
１！３８３番目のＴＧＡ配列までの配列ベースを有する
分子量５０．２０８ （４４８アミノ酸）の領域領域！
■
第２０７０〜２０７２番口のＡＴＧ配列から第２６３１
〜２６３３番口のＴＡＧ配列までの配列ベースを有する
分子量２２．１０３ （１８７アミノ酸）の領域領域ｍ
第２９６３〜２９６５番口のＡτＧ配列から第４１９０
〜４１９２番口の↑ＧＡ配列までの配列ベースを有する
分子量４２．８１９ （４０９アミノ酸）の領域領域■
第４５１９〜４５２１番口のＡＴＧ配列から第５０１４
〜５０１６番口のＴＧＡ配列までの配列ベースを有する
分子量１７．２２１ （１６５アミノ酸）の領域領域Ｖ
第２６８８〜２６９０番口のＡＴＧ配列から第２９６１
〜２９６３番口のＴＧＡ配列までの配列ベースを有する
９１アミノ酸の領域
［発明の効果］
上記酵素蛋白のアミノ酸配列をコードする領域１ 、
ＩＩ 、 ｍおよび■を少なくとも含む遺伝子は、＋ｕ
ＩＫＩ伝子を担ったプラスミドを保持する原核生物細
胞（たとえば大腸菌）の造成に用いられ、該細胞を使用
してベンゼン類（ベンゼンのはかアルキル基、置換アル
キル基、カルボキシル基、アルデヒド基、ハロゲン原子
などが導入された置換ベンゼン）からカテコールまたは
その誘導体を製造することができる。このカテコール類
は合成中間体としての利用のほか酸化防止剤、殺菌剤、
消７１２剤、香料、現像剤１分析用試薬などとして有用
である。
［実施例］
次に、本発明を実施例により説明する。
実施例
（１）ベンゼンオキシゲナーゼおよびベンゼングリコー
ルデヒドロゲナーゼ遺伝子をコードする遺伝子領域の特
定
ベンゼンオキシゲナーゼおよびベンゼングリコールデヒ
ドロゲナーゼ遺伝子を担ったコスミドｐＧＲ３００（大
１揚菌５Ｉ−３００，ＦＥＲＮ Ｐ−８００７が保持し
ている）を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断した。得られたＤ
ＮＡ断片を、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断したプラスミド
ｐＵｃ ８ （Ｇｅｎｅ １９．２５９（１９８２））
に連結し、大腸菌」ＭＢ２株に形質転換し、カテコール
類生産能を保持する大腸菌を選択した。なお、上記制限
酵素切断条件、連結反応条件、形質転換等の組換えＤＮ
Ａ技術は常法（たとえばＴ、 Ｍａｎｉａｔｉｓ、 Ｅ
、 Ｆ、 Ｆｒ１ｔｓｈ。
Ｊ、 ５ａｌＩｌｂｒｏｏｋ、 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ、 Ｃｏ１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｅ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｌ’ｌＪ 、’ １９８２
年）にしたがった。
上記の如くして得られた大１１ｇ菌形質転換体よりプラ
スミドを抽出し、種々の制限酵素による切断解析を行な
い、制限酵素地図を作成した。この地図に基いて制限酵
素による切断およびエキソヌクレアーゼＢａ Ｉ −３
１を使用することによって欠失誘導体を作成した（第２
図）。
各欠失プラスミドを保持する大腸菌ＪＭ８３株を１００
μｓ／ａｊ）のアンピシリンを含むＬＢＪＢ地１０ｊ）
中で３７°Ｃにて１２時間培養した。しかる後、集菌し
。
５０ＩＩＩＭリン酸緩衝液（ｐ８７．３ ） ｌ ｒ
ｓｌ！に懸濁し、ベンゼン０．５％を加え、３０°Ｃで
１２時間休体［菌体反応を行ない、蓄積したカテコール
をアミノアンチピリンノ人（Ｂｉｎｃｈｅｍ、 Ｊ、、
７３． Ｉｆ３（１９５９））により定入（シた。結
果をド表に示す。
保持プラスミド 蓄積カテコール品（ｍｇ／ｊｌｌ）
ｐＧＲＩＯ２２１５
ｐＧＲ＋１５ ３５０
ｐｌＥＲ１０Ｂ ＜ １
ｐａＲ１０５＜ １
上記の結果よりカテコール生産遺伝子はｐＧＲ１！５上
の約５．３Ｋｂに含まれると推定した。
（２）カテコール生産遺伝子の構造解析前記（１）にお
いて特定した遺伝子領域の塩基配列をＭ１３ファージ・
ジデオキシ法（宝酒造株製キット使用）により決定した
。その結果を第１図に示す。
この塩基配列に基づいて酵素蛋白質をコードする遺伝子
領域を検索したところ、少なくともＦ記の４つの領域の
存在を確認した。
領域工
第６１７〜６１９番［１のＡＴＣ配列から第１９８１−
１９８３番口のＴＣＡ配列までの配列ベースを有する分
子−一５０．２０８ （４４８アミノ酸）の領域
−領域ＩＩ
第２０７０〜２０７２番［１のＡＴＧ配列から第２６３
１〜２６３３番１１のＴＡＧ配列までの配列ベースをイ
ｆする分子量、２２．１０３ （＋８７アミノ酸）の領
域領域■
：１Ｓ２９６３〜２９６５番１−１のＡＴＧ配列から第
４１９０〜４１９２番１１のＴＧＡ配列までの配列ベー
スを有する分子量４２．８＋９ （４０９アミ／Ｍ）の
領域領域■
第４５１９〜４５２１番１１のＡＴＧ配列から第５０１
４〜５０１６番［］のＴＧＡ配列までの配列ベースを右
する分子量１７．２２１ （ＩＥ１５アミノ酸）の領域
（３）カテコール生産遺伝子のコードする蛋白質の同定
り記遺伝子を含むプラスミドおよび制限酵素を利用した
欠失誘導体を用いてプラスミドＤＮＡからｉｎ ｖ己ｒ
ｏ翻訳系（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製＋ ント）により蛋白
質を合成させ、５ＩＩＳポリアクリルアミド電気泳動し
１分イー呈４］１ｊ定およびそのブッピングを行なった
。その結果、ド記の如（，１１！基配列から推定される
蛋白質コード領域とほぼ一致した。
領 域An example of the base sequence of the gene of the present invention is shown in FIG. This (7) DNA is (7) The restriction enzyme EcaRI is in the DNA button. There are sites that are cleaved with 5alI, PstI, and Hindll; for example, the cleavage site with 5alI is between G on day 1829 and T on day 1830, and Ps
The cleavage site by tI is between C at 2133rd and T at 2134th, C at 1゛l at 4025th and T at 4026th.
and between Exit 5269 C and Exit 5270 II. In addition, the cleavage site by Hindm is 2172
It is between the number A and the 2173rd day A. The gene of the present invention can be prepared as follows. Catechol production with benzene oxygenase and benzene glycol dehydrogenase genes,
For example, mutant strains belonging to the genus Pseudomonas in which catechol-degrading enzymes are deleted or have low activity (for example, Pseudomonas sp. 138R-3, FERN P-8
970) to the genetic region containing both of the above genes using conventional methods (for example, J, Bacteriol, 89.1085 (
(1985) etc.), and the restriction enzyme Sau 3A
to partially cleave the necessary NA fragment (molecular weight approximately 30K)
b) obtain. On the other hand, broad host range plasmid R5FIOIO
cosmid pMM833 (Gene 24.299
(1983)) etc. as a plasmid vector, which was cut separately with restriction enzymes SmaI and HpaI.
After mixing, it is cut with BamHI, mixed with the DNA fragment, and ligated with T4 DNA ligase. This is then wrapped in the shell of lambda phage, a virus that infects Escherichia coli.
vitro packaging), large 1! ! E. coli clones containing cosmids incorporating chromosomal DNA are obtained by infecting bacteria (for example, E. coli clones containing cosmids containing chromosomal DNA
゜FERM P-8007). The DNA fragment obtained by cutting the cosmid pGR300 held by E. coli with the restriction enzyme EcoRI was digested with the restriction enzyme EcoRI.
Plasmid plJc 8 (Gene
IJ 259 (1982)) and E. coli JM83.
E. coli that retains the ability to produce catechols is selected. A plasmid is extracted from this E. coli transformant, subjected to cleavage analysis with various restriction enzymes, and a restriction enzyme map is created.Next, based on this, deletion derivatives are created using restriction enzyme cleavage and exonuclease Ba I-31. and hold each deletion plasmid. Fungus J
A region containing the gene of interest is determined using the M83 strain. The base sequence of the gene region thus obtained was determined by the M13 phage dideoxy method. 1981- from the ATG array of area engineering No. 617-619 No. 11
1! A region with a molecular weight of 50.208 (448 amino acids) that has a sequence base up to the 383rd TGA sequence!
■ No. 2631 from the ATG array of No. 2070-2072
Region m with a molecular weight of 22.103 (187 amino acids) having a sequence base up to the TAG sequence at positions 2633 and 4190 from the AτG sequence at positions 2963 to 2965
A region with a molecular weight of 42.819 (409 amino acids) that has the sequence base up to the ↑GA sequence at position 4192■ From the ATG sequence at positions 4519 to 4521 to position 5014
Region V with a molecular weight of 17.221 (165 amino acids) having the sequence base up to the TGA sequence at positions 5016 and 2961 from the ATG sequence at positions 2688 to 2690
A region of 91 amino acids having a sequence base up to the TGA sequence at position 2963 [Effects of the invention] Region 1 encoding the amino acid sequence of the above enzyme protein,
The gene containing at least II, m and ■ is +u
It is used to create prokaryotic cells (e.g. E. coli) that carry a plasmid carrying the IKI gene, and the cells are used to generate benzenes (benzene's short alkyl groups, substituted alkyl groups, carboxyl groups, aldehyde groups, halogens). Catechol or its derivatives can be produced from substituted benzene (substituted benzene into which atoms etc. have been introduced). In addition to being used as synthetic intermediates, these catechols are used as antioxidants, bactericidal agents, and
It is useful as a 712 eraser, a fragrance, a reagent for developer 1 analysis, etc. [Example] Next, the present invention will be explained with reference to an example. Example (1) Identification of the gene region encoding benzene oxygenase and benzene glycol dehydrogenase genes Cosmid pGR300 carrying the benzene oxygenase and benzene glycol dehydrogenase genes (held by Da. 1 Yangbacterium 5I-300, FERN P-8007) was cut with the restriction enzyme EcoRI. Obtained D
Plasmid pUc 8 (Gene 19.259 (1982)) in which the NA fragment was cut with the restriction enzyme EcoRI
MB2 strain was transformed into E. coli strain MB2, and E. coli that retained the ability to produce catechols was selected. In addition, the above-mentioned restriction enzyme cleavage conditions, ligation reaction conditions, transformation, etc. of recombinant DNA
A technique is a conventional method (for example, T, Maniatis, E
, F, Fr1tsh. J, 5alIlbrook, Mo1ecular
Cloning, Co1d SpringHarbe
r Laboratory l'lJ,' 1982
year). Plasmids were extracted from the 11g bacterial transformant obtained as described above, and cleavage analysis using various restriction enzymes was performed to create a restriction enzyme map. Based on this map, restriction enzyme cleavage and exonuclease Ba I-3
Deletion derivatives were created by using 1 (second
figure). 100 E. coli JM83 strains carrying each deletion plasmid
LBJB ground 10j) containing ampicillin of μs/aj)
The cells were cultured for 12 hours at 37°C. After that, collect the bacteria. 50IIIM phosphate buffer (p87.3) l r
sl! 0.5% of benzene was added, and the cells were incubated at 30°C for 12 hours.
73. If3 (1959)), the results are shown in Table 1. Retention plasmid Accumulated catechol product (mg/jll)
pGRIO2215 pGR+15 350 plER10B < 1 paR105 < 1 From the above results, it was estimated that the catechol production gene was contained in approximately 5.3 Kb on pGR1!5. (2) Structural analysis of catechol-producing genes The base sequence of the gene region identified in (1) above was analyzed using M13 phage.
Determined by the dideoxy method (using a kit manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.). The results are shown in FIG. When we searched for gene regions encoding enzyme proteins based on this base sequence, we confirmed the existence of at least four regions listed in F. Area engineering No. 617-619 [1981- from ATC array of 1
A region of molecule-150.208 (448 amino acids) having a sequence base up to the TCA sequence at position 1983
- Region II No. 2070 to 2072 [from ATG sequence 1 to No. 263
Molecular weight, 22.103 (+87 amino acids) based on the sequence base of the TAG sequence from No. 1 to No. 2633 (+87 amino acids): 1S ATG sequence from No. 1-1 from No. 2963 to No. 2965 to TGA sequence from No. 4190 to No. 4192 No. 11 A region with a molecular weight of 42.8+9 (409 ami/M) having a sequence base of up to
A region with a molecular weight of 17.221 (IE15 amino acids) that corresponds to the sequence base up to the TGA sequence of numbers 4 to 5016 [ ] (3) Identification of the protein encoded by the catechol production gene Description Using a plasmid containing the gene and a restriction enzyme Deletion derivatives were used to generate in v cells from plasmid DNA.
The protein was synthesized using an o translation system (manufactured by Amersham Inc.), subjected to 5IIS polyacrylamide electrophoresis, and subjected to 1 minute elongation and blotting. The results were almost identical to the protein coding region deduced from the base sequence.
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明の遺伝子の塩基配列であり、第２図は欠
失誘導体の制限酵素地図である。BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 shows the base sequence of the gene of the present invention, and FIG. 2 shows a restriction enzyme map of the deletion derivative.