JPS62169799A - Substance promoting differentiation and multiplication of macrophage - Google Patents

Substance promoting differentiation and multiplication of macrophage

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JPS62169799A
JPS62169799A JP61012850A JP1285086A JPS62169799A JP S62169799 A JPS62169799 A JP S62169799A JP 61012850 A JP61012850 A JP 61012850A JP 1285086 A JP1285086 A JP 1285086A JP S62169799 A JPS62169799 A JP S62169799A
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JP
Japan
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agr
activity
fraction
substance
chromatography
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Application number
JP61012850A
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Japanese (ja)
Inventor
Masayuki Takahashi
真行 高橋
Satoru Nakai
中井　哲
Hidemitsu Ko
洪　英満
Naomi Kono
河野　尚美
Yoshikatsu Hirai
嘉勝 平井
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
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Publication date
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Abstract

NEW MATERIAL:A substance of glycoprotein having activity to promote differentiation and multiplication of macrophane through action on a marrow cell, having 33,000-43,000daltons molecular weight measured by SDS polyacrylamide gel electrophoresis under non-reducing condition and 23,000-40,000daltons measured by gel filtration under non-reducing condition and having a protein part of N-terminal aminoacid sequence expressed by the formula. USE:A preventive and remedy for infective diseases and a remedy for marrow transplantation. PREPARATION:For example, a cultured and established cell strain of human T cell: AGR-ON is cultured in newborn calf serum and the culture fluid is centrifuged to obtain a supernatant liquid of the culture fluid. Then the supernatant liquid is concentrated by such as ultrafiltration and purified by gel-filtration, affinity chromatography, ion-exchange chromatography, etc., to obtain the aimed glycoprotein substance promoting differentiation and multiplication of macrophage.

Description

【発明の詳細な説明】 Ｌｌ」３へ机」１口し 本発明は、骨髄細胞に作用してマクロファージの分化増
殖を促進させる活性を有する新規な物質に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to a novel substance having the activity of acting on bone marrow cells and promoting the differentiation and proliferation of macrophages.

従　　来　　の　　技　　術 従来より、感染症その他の種々の原因により、骨髄細胞
が変化をうけて白血球が減少する疾病は知られている（
白血球減少症）。また制癌剤を投与された癌患者におい
ても、殆んどの場合に共通した副作用として、造血臓器
障害に起因する白血球の減少が認められる。このような
疾病に対して、白血球の減少を阻止する目的で、正常な
骨髄細胞に作用してその増殖分化を促進する活性を有す
る物質であるコロニー　ステイミュレイテイングファク
ター（Ｃｏｌｏｎｙ　ＳｔｉｍｕｌａｔｉｎｇＦａｃｔ
ｏｒ　。Conventional technology It has been known for some time that diseases in which bone marrow cells undergo changes resulting in a decrease in white blood cells due to infections and other causes (
Leukopenia). Furthermore, a common side effect in most cases of cancer patients receiving anticancer drugs is a decrease in white blood cells due to hematopoietic organ damage. In order to prevent the decrease in white blood cells from such diseases, colony stimulating factors, which are substances that have the activity of acting on normal bone marrow cells and promoting their proliferation and differentiation, are used.
or.

以下Ｃ８Ｆと呼ぶ）の有効性が検討されつつある。The effectiveness of C8F (hereinafter referred to as C8F) is being studied.

該Ｃ８Ｆは、また正常骨髄細胞に作用して顆粒球マクロ
ファージ等の分化増殖を促進させる生物活性を有してお
り、従って種々の感染症の予防及び治療薬としてや骨髄
移植治療用薬剤としても有効である。C8F also has biological activity that acts on normal bone marrow cells to promote the differentiation and proliferation of granulocytes and macrophages, and is therefore effective as a preventive and therapeutic drug for various infectious diseases and as a drug for bone marrow transplant therapy. It is.

しかして、Ｃ８Ｆは例えば胎児細胞、牌細胞等の培養液
、人尿、種々の株化培養細胞の培養液等にその活性が認
められ、該活性画分として分離、利用されているが、い
ずれの起源のものも該起源に由来する夾雑物質等の混在
及びＣ８Ｆ活性物質自体の濃度の低さが障害となり、そ
の単離及び構造の解明は未だなされるには至っていない
。　−発明が解決しようとする問題点 従って、本発明の目的は、上記の通り各種の疾病等に対
する予防及び治療薬として有用なＣ８Ｆを単離し、その
構造を解明し、純粋な物質としてのＣ８Ｆを提供する点
にある。C8F has been found to have activity in culture fluids of fetal cells, tile cells, etc., human urine, culture fluids of various cultured cell lines, etc., and has been isolated and used as an active fraction. Even those originating from C8F are hindered by the presence of contaminants originating from the origin and the low concentration of the C8F active substance itself, and its isolation and structure elucidation have not yet been achieved. -Problems to be Solved by the Invention Therefore, the purpose of the present invention is to isolate C8F, which is useful as a prophylactic and therapeutic drug for various diseases, etc., as described above, elucidate its structure, and obtain C8F as a pure substance. It is in the point of providing.

本発明の共同研究者は、先にＣ８Ｆを常時均質な状態で
多量産生することのできる、ヒト白血病Ｔ細胞由来の培
養株化細胞であるｒＡＧＲ−ＯＮＪを確立し、該細胞に
係わる発明を特許出願したく特開昭５（１１６９４８９
号公報）。The co-researchers of the present invention previously established rAGR-ONJ, a cultured cell line derived from human leukemia T cells, which can constantly produce large amounts of C8F in a homogeneous state, and developed the invention related to this cell. I would like to apply for a patent.
Publication No.).

本発明者らは、上記ＡＧＲ−ＯＮの産生ずるＣ８Ｆにつ
き、更にその精製を重ねた結果、該Ｃ８Ｆを純粋な形で
簡単にしかも高収率で収得する方法を開発し、またかく
して得られるＣ８Ｆの構造的特徴及び理化学的特徴を解
明し、ここに本発明を完成するに至った。As a result of further purification of the C8F produced by AGR-ON, the present inventors have developed a method for obtaining the C8F in pure form easily and in high yield, and the C8F produced in this way has been developed. The present invention has been completed by elucidating the structural and physical and chemical characteristics of

問題点を解決するための手段 本発明は、正常骨髄細胞に作用してマクロファージの分
化増殖を促進させる活性を有する糖蛋白質であって、下
記の理化学的性質を有することを特徴とする物質（以下
この本発明物質をＡＧＲ−ＯＮ−Ｃ８ＦＪと呼ぶ）に係
わる。Means for Solving the Problems The present invention is directed to a glycoprotein having the activity of acting on normal bone marrow cells to promote the differentiation and proliferation of macrophages, and which is characterized by having the following physicochemical properties (hereinafter referred to as This invention substance is referred to as AGR-ON-C8FJ).

ａ）分子量： 非還元条件下でＳＯＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
により、３３０００〜４３０００ダルトンであり、 非還元条件且つＳＯ８存在下でのゲルか過て、２３００
０〜４００００ダルトンである、ｂ）蛋白質部分のＮ端
アミノ酸配列： 次の一次構造式で表わされる配列を有する。a) Molecular weight: 33,000-43,000 Daltons by SOS polyacrylamide gel electrophoresis under non-reducing conditions; 2,300 Daltons by electrophoresis on a SOS polyacrylamide gel under non-reducing conditions;
b) N-terminal amino acid sequence of protein portion: It has a sequence represented by the following primary structural formula.

Ｖ　ａｔ　−Ｓ　ｅｒ−Ｇ　ｌｕ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｃｙ
ｓ　−Ｓ　ｅｒ−Ｈｉｓ　−Ｍｅｔ−１ｌｅ　−Ｇ　ｌ
ｙ　−Ｓｅｒ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｈｉｓ　−Ｌｅｕ　−Ｇ
Ｉｎ−８ｅｒ　−Ｌ　ｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｒａ−Ｌｅｕ−
１ｌｅ　−Ａ　Ｓ＋１−　Ｓ　ｅｒ−Ｇ　ｌｎ−Ｍ　ｅ
ｔ　−Ｇ　ｌｕ−Ｔ　ｈｒ本明細書において、ペプチド
及びアミノ酸の表示は、ＩＵＰＡＣにより採択されてい
るアミノ酸命名法における略号乃至当該分野で慣用され
ているそれに従うものとする。V at -Ser-Glu-Tyr-Cy
s -S er-His -Met-1le -G l
y -Ser -G ly -His -Leu -G
In-8er-Leu-Gln-Ara-Leu-
1le -A S+1- S er-G ln-M e
t -G lu-T hr In this specification, peptides and amino acids are indicated according to the abbreviations in the amino acid nomenclature adopted by IUPAC or those commonly used in the field.

本発明ＡＧＲ−ＯＮ−Ｃ８Ｆは、上記生物活性、理化学
的特徴及び構造的特徴を有する他に、下記特性を有する
ことによっても特徴付けられる。AGR-ON-C8F of the present invention is characterized by having the following properties in addition to the above-mentioned biological activity, physicochemical characteristics, and structural characteristics.

Ｃ）ヒトＴ細胞培養株化細胞ＡＧＲ−ＯＮにより生産さ
れ、後記実施例に示す方法により単離端製される。C) Produced by the human T cell culture cell line AGR-ON, and isolated and purified by the method shown in the Examples below.

ｄ）りＯマドフォーカシングによる等電点（ｐＩ）が４
．０〜４．６である。d) The isoelectric point (pI) due to RiO mado focusing is 4
．． It is 0 to 4.6.

ｅ）その蛋白質部分が、後記実施例に示されるアミノ酸
組成を有している。e) The protein portion has the amino acid composition shown in the Examples below.

以下、本発明ＡＧＲ−ＯＮ−Ｃ８Ｆにつき、これを製造
法より詳述する。Hereinafter, the AGR-ON-C8F of the present invention will be explained in detail from the manufacturing method.

本発明物質は、ＡＧＲ−ＯＮの培養により誘導産生され
る。ここで起源細胞として利用するＡＧＲ−ＯＮは、特
開昭５９−１６９４８９号公報に記載された特性を有す
るヒト白血病Ｔ細胞由来のヒト培養株化細胞であり、こ
れはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（
ＡＴＣＣ）にｒＡＴｃｃ受託Ｎｏ、ＣＲＬ−８１９９Ｊ
として受託されている。The substance of the present invention is induced and produced by culturing AGR-ON. The AGR-ON used here as the source cell is a human cultured cell line derived from human leukemia T cells having the characteristics described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 169489/1989, and is a human cultured cell line derived from the American Type Culture Collection. (
rATcc accession No. CRL-8199J to ATCC)
It has been entrusted as a contract.

上記ＡＧＲ−ＯＮの培養は、この種細胞培養に通常使用
される培地を用いて実施される。該培地としては、例え
ば、ＯＥＭ培地、ＣＭＲＬ−１０６６培地、ＤＭ−１６
０培地、イーグルの最小必須培地（Ｅａｇｌｅ’ｓ　　
ＭＥＭ）　、オートクレーブ可能ＭＥＭ、フィッシャー
の培地（Ｆ　１ｓｈｅｒ’ｓＭｅｄｉｕｍ　）　、Ｆ　
−１０，Ｆ　−１２培地、Ｌ−１５培地、ＮＣＴＣ−１
０９培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地等を単独で用いるか
又は必要に応じて２等培地に牛脂児面清（Ｆｅ２）等の
血清やアルブミン等の血清成分を添加して利用できる。The above AGR-ON culture is carried out using a medium commonly used for culturing this type of cell. Examples of the medium include OEM medium, CMRL-1066 medium, DM-16 medium,
0 medium, Eagle's minimum essential medium (Eagle's
MEM), autoclavable MEM, Fisher's Medium, F
-10, F -12 medium, L-15 medium, NCTC-1
09 medium, RPMI-1640 medium, etc. can be used alone, or if necessary, serum components such as serum such as beef tallow face serum (Fe2) or serum components such as albumin can be added to a secondary medium.

ＡＧＲ−ＯＮの上記培地に対する使用量は、特に制限は
ないが、通常約ｌＸ１０４〜１×１０７個／鵬の濃度範
囲とするのがよい。培養条件も特に限定はなく、通常の
炭酸ガス培養法等と同様のものとすることができる。一
般には、約３０〜４０℃程度、好ましくは約３７℃前後
で１〜５日間を要して培養すればよい。上記培養により
、培養上清中に本発明物質が生産蓄積される。The amount of AGR-ON to be used in the above medium is not particularly limited, but it is generally preferable to keep the concentration in the range of about 1.times.10.sup.4 to 1.times.10.sup.7 cells/peng. There are no particular limitations on the culture conditions, and they can be the same as those for normal carbon dioxide culture methods. Generally, the culture may be carried out at about 30 to 40°C, preferably at about 37°C for 1 to 5 days. Through the above culture, the substance of the present invention is produced and accumulated in the culture supernatant.

培養上清の分離は、常法に従い例えば遠心分離等の手段
により行ない得る。かくして得られる培養上清からの本
発明物質の分離は、基本的には、この種バイオロジカル
物質からの蛋白様物質の分離に利用される方法に準じて
、例えば目的とする物質の物理的性質、化学的性質等を
利用した各種の操作に従い実施できる（［生化学データ
ーブックＩ［Ｊ、第１１７５〜１２５９頁、第１版第１
刷、１９８０年６月２３日、株式会社東京化学同人発行
参照）。該方法としては、具体的には例えば通常の蛋白
沈澱剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラ
フィー（ゲルか過）、吸着クロマトグラフィー、イオン
交換クロマトグラフィー、アフイニテイクロマトグラフ
イー、高速液体クロマトグラフィ＝（ＨＰＬＣ）等の各
種液体クロマトグラフィー、透析法、之等の組合せ等を
採用できる。The culture supernatant can be separated according to conventional methods, for example, by means such as centrifugation. The separation of the substance of the present invention from the culture supernatant thus obtained is basically carried out in accordance with the method used to separate proteinaceous substances from such biological substances, for example, by determining the physical properties of the substance of interest. can be carried out according to various operations using chemical properties, etc. ([Biochemical Data Book I [J, pp. 1175-1259, 1st edition, 1st
Printed on June 23, 1980, published by Tokyo Kagaku Dojin Co., Ltd.). Specifically, the method includes, for example, treatment with a normal protein precipitant, ultrafiltration, molecular sieve chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, and high performance liquid chromatography. Various liquid chromatography methods such as (HPLC), dialysis methods, and combinations thereof can be employed.

特に好ましい分離方法においては、まず培養上清より予
め目的とする物質を部分精製する。この部分精製は、例
えば硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリ
ウム等の塩析剤を用いる処理及び／又は透析膜、平板膜
、中空繊維膜等を用いる限外濾過処理等により行なわれ
る。之等の各処理の操作及び条件は、通常のこの種方法
のそれらと同様のものとすればよい。In a particularly preferred separation method, the target substance is first partially purified from the culture supernatant. This partial purification is carried out, for example, by treatment using a salting-out agent such as ammonium sulfate, sodium sulfate, or sodium phosphate, and/or by ultrafiltration treatment using a dialysis membrane, flat plate membrane, hollow fiber membrane, or the like. The operations and conditions for each of these treatments may be the same as those for ordinary methods of this type.

次いで上記で得られた粗精製物を、吸着クロマトグラフ
ィー、アフイニテイクロマトグラフイー、ゲル濾過、イ
オン交換りＯマドグラフィー、逆相クロマトグラフィー
等に付すことにより、又は之等各操作の組合せにより、
目的物質の活性が認められる両分を収得し、かくして目
的物質を均質な物質として単離することができる。Then, by subjecting the crude product obtained above to adsorption chromatography, affinity chromatography, gel filtration, ion exchange O-chromatography, reversed phase chromatography, etc., or by a combination of these operations,
Both components exhibiting the activity of the target substance are obtained, and thus the target substance can be isolated as a homogeneous substance.

上記吸着クロマトグラフィーは、例えばフェニル−セル
ロース、オクチル−セルロース等を担体として実施でき
る。The above adsorption chromatography can be carried out using, for example, phenyl cellulose, octyl cellulose, or the like as a carrier.

アフイニテイクロマトグラフイーは、例えばＣ０ｎＡ−
セルロース、レンチルレクチン−セファロース（ファル
マシア社製）等の担体を利用し、Ｃ８Ｆのレクチンに対
する親和性を利用したクロマトグラフィーにより実施で
きる。Affinity chromatography can be used, for example, with C0nA-
This can be carried out by chromatography using a carrier such as cellulose or lentil lectin-sepharose (manufactured by Pharmacia) and utilizing the affinity of C8F for lectin.

ゲル濾過は、例えばデキストランゲル、ポリアクリルア
ミドゲル、アガロースゲル、ポリアクリルアミド−アガ
ロースゲル、セルロース等を素材として用いて実施でき
る。上記ゲル濾過剤の具体例としては、セファデックス
Ｇタイプ、セファロースタイブ、セファクリルタイプ（
以上、ファルマシア社製）、セルロファイン（チッソ社
製）、バイオゲルＰタイプ、同Ａタイプ（バイオラド社
製）、ウルトロゲルＡｃ　Ａ　（ＬＫＢ社製）、ＴＳＫ
−Ｇタイプ（東洋曽達社製）等の市販品を例示できる。Gel filtration can be carried out using, for example, dextran gel, polyacrylamide gel, agarose gel, polyacrylamide-agarose gel, cellulose, or the like as a material. Specific examples of the above gel filtration agents include Sephadex G type, Sepharose type, Sephacryl type (
(manufactured by Pharmacia), Cellulofine (manufactured by Chisso), Biogel P type, Biogel A type (manufactured by Biorad), Ultrogel Ac A (manufactured by LKB), TSK
Commercially available products such as -G type (manufactured by Toyo Soda) can be exemplified.

イオン交換クロマトグラフィーは、例えばジエチルアミ
ノエチル（ＤＥＡＥ）等を交換基とする陰イオン交換体
を利用したクロマトグラフィーにより実施できる。Ion exchange chromatography can be performed, for example, by chromatography using an anion exchanger having diethylaminoethyl (DEAE) or the like as an exchange group.

逆相クロマトグラフィーは、例えばＣ１、Ｃ３、Ｃ４等
のアルキル基、シアノプロピル基、フェニル基等の官能
基がシリカゲル等の基体に結合された担体を用いて実施
できる。より具体的には例えばＣ４ハイボア一逆相ＨＰ
ＬＣカラム（ＲＰ−３０４、バイオラド社製）を用いて
、移動相としてアセトニトリル、トリフルオロ酢酸（王
ＦＡ）、水等及び之等の混合溶媒を用いて実施できる。Reversed phase chromatography can be carried out using a carrier in which a functional group such as an alkyl group such as C1, C3, or C4, a cyanopropyl group, or a phenyl group is bonded to a substrate such as silica gel. More specifically, for example, C4 high bore - reverse phase HP
It can be carried out using an LC column (RP-304, manufactured by Bio-Rad) and a mixed solvent such as acetonitrile, trifluoroacetic acid (Ou FA), water, etc. as a mobile phase.

上記方法によれば、容易に高収率、高純度で所望の本発
明物質ＡＧＲ−ＯＮ−Ｃ８Ｆを、工業的規模で製造でき
、かくして得られる物質は、前記ａ）〜ｅ）に示した特
徴を有している。According to the above method, the desired substance of the present invention AGR-ON-C8F can be easily produced in high yield and with high purity on an industrial scale, and the substance thus obtained has the characteristics shown in a) to e) above. have.

上記方法に従い得られる本発明物質は、その生物活性を
利用して、種々の感染症その弛の白血球減少を伴う疾病
の予防及び治療薬として、医薬分野で有用である。特に
本発明のＡＲＧ−ＯＮ・Ｃ８Ｆは、毒性が低く、しかも
その精製工程等での活性低下もなく、従って、上記医薬
として特に有効である。The substance of the present invention obtained according to the above method is useful in the pharmaceutical field as a prophylactic and therapeutic agent for various infectious diseases and diseases accompanied by leukopenia by utilizing its biological activity. In particular, the ARG-ON•C8F of the present invention has low toxicity and does not lose its activity during purification steps, etc., and is therefore particularly effective as the above-mentioned medicine.

本発明物質を医薬として用いるに当り、該物質はその有
効量を、薬理的に許容される通常の無毒性担体と共に含
有する薬理組成物の形態に調製され該形態に応じた各種
投与経路で投与される。その製剤形態としては、液状形
態例えば溶液、懸濁液、乳濁液等が通常採用され、之等
は一般に経口、静脈内、皮下、陵内、筋肉的投与される
が、特に之等の形態及び投与経路に限定されず、上記本
発明物質は、他の通常採用される経口、非経口投与等に
適した各種の製剤形態に調製することもでき、また使用
前に適当な担体の添加により液状となし得る乾燥品とす
ることもできる。各種形態の製剤の投与量は、所望の薬
理効果、疾病の種類、患者の年齢、性別、疾患の程度等
に応じて適宜決定され、特に限定はないが、通常有効成
分とする本発明物質を蛋白量として約０．００１〜１１
１１（＋／ｋ（１／日となる量で１日に１回乃至数回に
分けて投与すればよい。When the substance of the present invention is used as a medicine, the substance is prepared in the form of a pharmacological composition containing an effective amount thereof together with a normal pharmacologically acceptable non-toxic carrier, and administered by various administration routes depending on the form. be done. Liquid forms such as solutions, suspensions, emulsions, etc. are generally adopted as the formulation form, and these forms are generally administered orally, intravenously, subcutaneously, intramuscularly, and intramuscularly; The substance of the present invention can also be prepared into various other commonly used formulations suitable for oral, parenteral administration, etc., and is not limited to the route of administration. It can also be a dry product that can be in liquid form. The dosage of various forms of preparations is appropriately determined depending on the desired pharmacological effect, type of disease, patient's age, sex, degree of disease, etc., and is not particularly limited. Approximately 0.001 to 11 as protein amount
It may be administered in an amount of 11(+/k(1/day) once or in divided doses several times a day.

実　　　施　　　例 以下、本発明ＡＲＧ−ＯＮ−Ｃ８Ｆの製造法及び得られ
る物質の特徴を、実施例を挙げて更に詳述する。EXAMPLES Hereinafter, the method for producing ARG-ON-C8F of the present invention and the characteristics of the obtained substance will be further described in detail by giving examples.

尚、各個で得られる試料のＣ８Ｆ活性は以下の方法によ
り測定されるものとする。The C8F activity of each sample shall be measured by the following method.

＜Ｃ８Ｆの活性測定法〉 牛胎児血清（ＦＣ８）２０ｍｌｌ！、α−培地３０鵬及
び２倍濃度α−培地２０−を混和して得られる溶液を３
７℃にて保温し、その２３．３１１１０を予め５０℃に
保温した１％寒天（ディフコ社製）溶液１０ｍＱと混合
して３７℃に保温する。<C8F activity measurement method> Fetal bovine serum (FC8) 20ml! , a solution obtained by mixing α-medium 30 Peng and double concentration α-medium 20-
The mixture was kept warm at 7°C, and the 23.31110 was mixed with 10 mQ of 1% agar (manufactured by Difco) solution previously kept at 50°C and kept at 37°C.

一方ＢＡＬＢ／Ｃ系マウス大腿骨より採取した骨髄細胞
（ＢＭＣ）を、ハンクス液で２回洗浄後、α−培地にて
ｍ胞Ｉｌ痕が１０７個／鵬となるように調製し、その１
鵬を上記３７℃に保温しである寒天培地に加え、よく混
和した後、３７℃に保温し、次いでその０．５ｍＧを、
予め５０μＱの供試試料を入れたウェル（ティッシュカ
ルチャークラスター１２、コスタ−社製）に加えて手早
く混和して室温に放置する。各ウェルの寒天が固型化す
るのを待って炭酸ガスインキュベーターに移し、更に３
７℃で７日間培養する。On the other hand, bone marrow cells (BMC) collected from the femur of a BALB/C mouse were washed twice with Hank's solution, and then prepared in α-medium so that the number of m-cell Il marks was 107/Peng.
Peng was added to the above-mentioned agar medium kept at 37°C, mixed well, kept at 37°C, and then 0.5 mG of it was added to the agar medium.
It is added to a well (Tissue Culture Cluster 12, manufactured by Costa) containing 50 μQ of a test sample in advance, mixed quickly, and left at room temperature. Wait for the agar in each well to solidify, transfer to a carbon dioxide incubator, and then
Culture at 7°C for 7 days.

かくして生じたコロニー数を実体顕微鏡を用いて計測し
、Ｃ８Ｆ活性の指標とする。尚、上記で生じるコロニー
は、形態学的観察の結果いずれもマクロファージコロニ
ーであった。The number of colonies thus generated is counted using a stereomicroscope and is used as an index of C8F activity. In addition, as a result of morphological observation, all of the colonies generated above were macrophage colonies.

実施例１ ■　ＡＧＲ−ＯＮ培養液の調製 ヒトＴ細胞培養株化細胞ＡＧＲ−ＯＮ （ＡＴＣＣ受託Ｎｏ、ＣＲＬ−８１９９）を、５％新生
子牛血清（ＮＣ８＞　、２０ｍ　Ｍ　　Ｎ−２−ヒドロ
キシエチルピペラジン−Ｎ’　−２−エタンスルホン酸
（ＨＥＰＥＳ）　、１００μｇ／或ストレプトマイシン
、１００単位／噌ペニシリンＧ１５０μｇ／ｍｆ２ゲン
タマイシン、５ｘ１０−５Ｍ２−メルカプトエタノール を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（フローラボラトリー社
製）にて、約２〜４Ｘ１０５個／戚の細胞濃度に調製し
、その２Ｑを、２Ｑ容カルチコアフラスコ（柴田バリオ
硝子社製）にて、３７℃で培養し、約１〜２×１０６個
／誦の細胞濃度に到達するまで約４日間培養した。Example 1 ■ Preparation of AGR-ON culture solution Cultured human T cell cell line AGR-ON (ATCC Entrustment No., CRL-8199) was mixed with 5% newborn calf serum (NC8>, 20mM N-2-hydroxyethyl In RPMI-1640 medium (manufactured by Flow Laboratory) containing piperazine-N'-2-ethanesulfonic acid (HEPES), 100 μg/streptomycin, 100 units/penicillin G150 μg/mf2 gentamicin, and 5x10-5M2-mercaptoethanol. The cell concentration was adjusted to about 2 to 4 x 10 cells/cell, and the 2Q was cultured at 37°C in a 2Q capacity cultico flask (manufactured by Shibata Vario Glass Co., Ltd.) to a cell concentration of about 1 to 2 x 10 cells/cell. The culture was continued for about 4 days until the concentration was reached.

次いで上記で培養された２Ｑ容力ルチユアフラスコ４本
内の細胞を遠心（　１　０００ｐｐｍ　、　５分）にて
洗浄分離後、ＮＣＳを含まない上記ＲＰＭＩー１６４０
培地８Ｑを入れた８Ｑ容カルチユアフラスコ（柴田バリ
オ硝子社製）にて、更に３７℃で４日間培養した。得ら
れた培養液を、遠心（１　００００ｐｐｍ　、５分）し
て目的とする培養上清を得た。Next, the cells in the four 2Q-capacity routine flasks cultured above were washed and separated by centrifugation (1,000 ppm, 5 minutes), and then washed with the above-mentioned RPMI-1640, which does not contain NCS.
The cells were further cultured at 37° C. for 4 days in an 8Q culture flask (manufactured by Shibata Vario Glass Co., Ltd.) containing medium 8Q. The obtained culture solution was centrifuged (10,000 ppm, 5 minutes) to obtain the desired culture supernatant.

上記と同一操作を繰返し行なって得られる培養上清的１
９２９を、ペリコンカセットシステム（ミリポア社製、
分子量カットオフ：　１　００００）を用いて濃縮し、
濃縮液約１６Ｑを得た。以下この濃縮液を原料液とする
。Culture supernatant 1 obtained by repeating the same operation as above
929 using a Pellicon cassette system (manufactured by Millipore,
Molecular weight cutoff: 10000)
Approximately 16Q of concentrated liquid was obtained. Hereinafter, this concentrated liquid will be referred to as a raw material liquid.

■　ＡＧＲ−ＯＮ　−　ＯＳＦの分離、精製（１）フェ
ニルセファロースクロマトグラフィー上記■で得た原料
液５Ｑに、硫酸アンモニウムを終濃度が１モルとなるよ
うに加えて溶解後、１ＮＮＨ４０Ｈにてｐｌ−１６．８
に調整した。■ Separation and purification of AGR-ON-OSF (1) Phenyl Sepharose chromatography Ammonium sulfate was added to the raw material solution 5Q obtained in step (1) above to give a final concentration of 1 mol, and after dissolving, the mixture was purified with 1N NH40H in pl-16. 8
Adjusted to.

一方、フェニルセファロース（ファルマシア社製）約１
Ｑを直径５．１ｃｍのカラムに充填し、０、００５％ポ
リエチレングリコール（分子量６０００）及び１Ｍ硫酸
アンモニウム含有０、００５Ｍナトリウムリン酸緩衝液
（ｐＨ６６８）約５Ｑで平衡化後、上記で調整された原
料液をアプライした（流速的２４０ｒｔｌ／ｈｒ）。全
サンプルをアプライし終えた後、更に上記平衡化用緩衝
液約１９にて洗浄し、濃度勾配作成装置としてウルトラ
ブラッド（ＬＢＫ社製）を用いて、以下の条件で硫酸ア
ンモニウムの直線濃度勾配で溶出を行なった。On the other hand, phenyl sepharose (manufactured by Pharmacia) approx.
Q was packed into a column with a diameter of 5.1 cm, and after equilibration with about 5Q of 0,005M sodium phosphate buffer (pH 668) containing 0,005% polyethylene glycol (molecular weight 6000) and 1M ammonium sulfate, the raw material prepared above was The liquid was applied (flow rate: 240 rtl/hr). After applying all the samples, wash with the above equilibration buffer solution (approx. I did it.

溶離液Ａ：０．００５％ポリエチレングリコール（分子
量６０００）及び１Ｍ硫酸アンモニウム含有０．００５
Ｍナトリウムリン酸緩衝液（ｐｌ−１６．８） 溶離液Ｂ：０．００５％ポリエチレングリコール（分子
量６０００）含有０．００５Ｍナトリウムリン酸緩衝液
（ｐ　Ｈ６．８＞流　　速　　：２４０ｍＱ／ｈｒ フラクション容積：６００ｍＱ／チューブ１度勾配：第
１図に示す。Eluent A: 0.005% polyethylene glycol (molecular weight 6000) and 1M ammonium sulfate containing 0.005%
M sodium phosphate buffer (pl-16.8) Eluent B: 0.005M sodium phosphate buffer containing 0.005% polyethylene glycol (molecular weight 6000) (pH 6.8>Flow rate: 240 mQ/hr Fraction volume :600 mQ/1 degree tube gradient: Shown in Figure 1.

溶出部の結果を第１図に示す。図において縦軸は、グラ
フ（１）で示されるＣＳＦ活性（コロニー数／プレート
）、曲線（２）で示される２８０ｎｍにおける蛋白の吸
光度（Ａ　２８０）及び線（３）で示される硫酸アンモ
ニウムの濃度勾配を各々示し、横軸はフラクションＮＯ
．を示す。The results for the elution area are shown in Figure 1. In the figure, the vertical axes are CSF activity (number of colonies/plate) shown in graph (1), protein absorbance at 280 nm (A280) shown in curve (2), and concentration gradient of ammonium sulfate shown in line (3). are shown, and the horizontal axis is the fraction NO.
．． shows.

第１図より明らかなようにＣＳＦ活性は、フラー１アー クジョンＮＯ．７〜１３にかけて認められる。As is clear from Figure 1, CSF activity is Kujeong No. It is recognized from 7 to 13.

上記■で得た原料液の残りについても同様に処理し、Ｃ
ＳＦ活性画分を一括してプールし、引続く（２）の方法
に供した。The rest of the raw material liquid obtained in step ① above was treated in the same way, and C
The SF active fractions were pooled together and subjected to the subsequent method (2).

（２）ＣｏｎＡ−セファロースクロマトグラフィーＣ　
ｏｎＡ−セファロース（ファルマシア社製）約２００ｍ
Ｇを、直径５．１０１１１のカラムに充填し、０、００
５％ポリエチレングリコール及び０、０２％Ｎａ　Ｎ３
含有リン酸塩緩衝生理食塩液（ＰＢＳ−”）約２９にて
平衡化した後、上記（１）で得られたＡＧＲ−ＯＮ−Ｃ
ＳＦ活性画分をアプライした。全試料をアプライし終え
た後、カラム通過液の２８０ｎｌでの紫外吸収が０．０
３以下に低下するまで、平衡化に用いた上記緩衝液にて
洗浄を行なった。次いで０．５Ｍメチル−α−Ｄ−マン
ノシドを含む上記平衡化用緩衝液を溶出用緩衝液として
用いて、流速２ｍＧ／分、フラクション容積１５ＷｆＪ
／チユーブの条件で溶出を行なった。(2) ConA-Sepharose chromatography C
onA-Sepharose (manufactured by Pharmacia) approximately 200m
G was packed into a column with a diameter of 5.10111, and 0,00
5% polyethylene glycol and 0.02% Na N3
After equilibration with phosphate buffered saline (PBS-) containing about 29% of the AGR-ON-C obtained in (1) above,
SF active fraction was applied. After applying all the samples, the ultraviolet absorption of the column-passing liquid at 280 nl was 0.0.
Washing was performed with the above buffer used for equilibration until the concentration decreased to 3 or less. Then, using the above equilibration buffer containing 0.5 M methyl-α-D-mannoside as the elution buffer, the flow rate was 2 mG/min and the fraction volume was 15 WfJ.
Elution was performed under the following conditions: /tube.

ＡＧＲ−ＯＮ−Ｃ８Ｆ活性は、フラクションＮｏ、１１
〜２１をピークとして、フラクションＮ０．１１〜１３
０にわたって認められた。該活性を有する全フラクショ
ンをプールした。AGR-ON-C8F activity was determined in fraction No. 11.
Fraction No. 11 to 13 with a peak of ~21
Approximately 0 were observed. All fractions with the activity were pooled.

（３）ウルトロゲルＡＣＡ４４クロマトグラフィー 上記（２）で得た活性画分を、ＹＭ−１０膜（アミコン
社製）を用いて限外濾過濃縮し、その濃縮液を２回に分
けて、以下の条件でウルトロゲルＡｃ　Ａ４４　（ＬＢ
Ｋ社製）を用いたゲル濾過に供した。(3) Ultrogel ACA44 chromatography The active fraction obtained in (2) above was concentrated by ultrafiltration using a YM-10 membrane (manufactured by Amicon), and the concentrated solution was divided into two parts under the following conditions. Ultrogel Ac A44 (LB
It was subjected to gel filtration using a filter (manufactured by K Company).

カラム：　８７０ｍＸ４．４０ｍＢ径 溶離液：０．００５％ポリエチレングリコール、０．０
２％ＮａＮ３及び０．３Ｍ Ｎａ　ＣＱ含有リン酸塩緩衝生理食塩液流　速：１較／
分 フラクション容積：１５ｍＱ／チューブ上記クロマトグ
ラフィーの結果（１回目）を第２図に示す。図において
縦軸は、グラフ（１）で示されるＣ８Ｆ活性（コロニー
数／プレート）及び曲１ｊｌ　（２）で示される２　８
０　ｎｍにおける蛋白の吸光度（Ａ　２８０）を各々示
し、横軸はフラクションＮｏ、を示す。但し、Ｃ８Ｆ活
性は各フラクションノの２１倍希釈液についてのもので
ある。また、第２図には、スタンダードとして牛血清ア
ルブミン（６，７万）、卵白アルブミン（４，３万）、
キモトリプシノーゲン（２，５万）及びチトクロム−〇
（１，２４万）を用いることにより決定された分子量を
矢印を付して示しである。Column: 870mX4.40mB diameter Eluent: 0.005% polyethylene glycol, 0.0
Phosphate buffered saline containing 2% NaN3 and 0.3M NaCQ Flow rate: 1 comparison/
Minute fraction volume: 15 mQ/tube The results of the above chromatography (first time) are shown in Figure 2. In the figure, the vertical axis is C8F activity (number of colonies/plate) shown in graph (1) and 2 8 shown in song 1jl (2).
The absorbance (A280) of the protein at 0 nm is shown, and the horizontal axis shows the fraction number. However, the C8F activity is for a 21-fold dilution of each fraction. Figure 2 also shows bovine serum albumin (60,700,000), ovalbumin (430,000) as standards,
The molecular weights determined using chymotrypsinogen (2,500,000) and cytochrome-0 (1,240,000) are indicated with arrows.

上記の結果、２回ともＡＧＲ−ＯＮ−Ｃ８ＦＷＩ性は、
分子量約２．５万〜１３万の広い範囲に亙って認められ
たが、主な活性は約３万〜５万の分子量領域に認められ
た。このうち、比活性の高いフラクションＮｏ、５５〜
６１をプールして、これを以下の方法に使用した。As a result of the above, the AGR-ON-C8FWI characteristics were as follows for both times.
It was observed over a wide range of molecular weights from about 25,000 to 130,000, but the main activity was observed in the molecular weight range from about 30,000 to 50,000. Among these, fraction No. 55 with high specific activity
61 were pooled and used in the following method.

（４）ＤＥＡＥ−５ＰＷ高速液体クロマトグラフィー（
ＤＥＡＥ−５ＰＷ　　ＨＰＬＣ）上記（３）で得られた
フラクションＮ０．５５〜６１を、ＹＭ−１０膜を用い
て限外濾過濃縮し、５回に分けて以下の条件で陰イオン
交換の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供し
た。(4) DEAE-5PW high performance liquid chromatography (
DEAE-5PW HPLC) Fractions N0.55 to 61 obtained in (3) above were concentrated by ultrafiltration using a YM-10 membrane, and divided into 5 times and subjected to anion exchange high performance liquid chromatography under the following conditions. It was subjected to graphography (HPLC).

カラム：ＴＳＫゲルゲルＡＥ−５ＰＷ　（７，５ｃｍＸ
７．５ｍｍ直径、東洋曽達工業社製）溶離液Δ：０．０
０５％ポリエチレングリコール含有０．０２Ｍトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ８，０） 溶離液Ｂ：０．００５％ポリエチレングリコール及びＩ
Ｍ　　ＮａＣａ含有０．０２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐ　
１−１８．０） 流速：０．８ｍＱ／分 フラクション容積：０．８１１１２／チユ一ブ／分濃度
勾配：　　　時間（分）　　％Ｂ Ｏ〇 各回とも、同じ結果が得られたが、その１回目の結果を
第３図に示す。図において、縦軸は、グラフ（１）で示
される各フラクションの５１倍希釈液についてのＣ８Ｆ
活性（コロニー数／プレート）、曲線（２）で示される
２　８０　ｎｍにおける蛋白の吸光度（Ａ　２８０）及
び線（３）で示される塩（１−←トリウム濃度（Ｍ）を
各々示し、横軸はフラクションＮｏ、を示す。Column: TSK Gelgel AE-5PW (7.5cmX
7.5mm diameter, manufactured by Toyo Sodatsu Kogyo Co., Ltd.) Eluent Δ: 0.0
0.02M Tris-HCl buffer containing 0.05% polyethylene glycol (pH 8,0) Eluent B: 0.005% polyethylene glycol and I
0.02M Tris-HCl buffer containing M NaCa (p
1-18.0) Flow rate: 0.8 mQ/min Fraction volume: 0.81112/tube/min Concentration gradient: Time (min) %BO〇 The same results were obtained each time, but the first time The results are shown in Figure 3. In the figure, the vertical axis represents C8F for the 51-fold dilution of each fraction shown in graph (1).
activity (number of colonies/plate), protein absorbance at 280 nm (A280) shown by curve (2), and salt (1-←thorium concentration (M) shown by line (3), respectively; horizontal axis indicates the fraction number.

第３図よりＡＧＲ−ＯＮ　−Ｃ８Ｆ活性は、フラクショ
ンＮｏ、２２〜４０にかけた広い範囲に亙り認められる
ことが判る。これらの活性フラクションの内、Ｎｏ、２
６〜３６をプールし、以下の方法に供した。From FIG. 3, it can be seen that AGR-ON-C8F activity is observed over a wide range from fraction No. 22 to 40. Among these active fractions, No. 2
6 to 36 were pooled and subjected to the following method.

−２２＝ （５）逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬ
Ｃ） 上記（４）Ｔ−１？られるＡＧＲ−ＯＮ−Ｃ８Ｆ活性画
分を、ＹＭ−１０膜を用いて限外濾過濃縮後、２回に分
けて以下の条件でＲＰ−ＨＰＬＣを行なった。-22= (5) Reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPL
C) Above (4) T-1? The AGR-ON-C8F active fraction obtained was concentrated by ultrafiltration using a YM-10 membrane, and then divided into two parts and subjected to RP-HPLC under the following conditions.

カラム二０４ハイボアー逆相カラム（ＲＰ−３０４、バ
イオラド社製、２５０　ｍｍｘ４．６ｍｍ直径） 溶離液Ａ：０．１％ＴＦＡ 溶離液Ｂニアセトニトリル：１％ＴＦＡ＝９　：　１流
　速：１ｍ１２／分 フラクション容積：１ｍＱ／チューブ／分濃度勾配：　
　　時間（分）　　％Ｂ ２回とも、同じ結果が得られたが、その１回目の結果を
第４図に示す。図において、縦軸は、グラフ（１）で示
される各フラクションの５１倍希釈液についてのＣ８Ｆ
活性（コロニー数／プレート）、曲線（２）で示される
２８０ｎｍにおける蛋白の吸光度（Ａ２８０）及び線（
３）で示される溶離液Ｂの濃度（％）を各々示し、横軸
はフラクションＮｏ、を示す。Column 204 high-bore reverse phase column (RP-304, manufactured by Bio-Rad, 250 mm x 4.6 mm diameter) Eluent A: 0.1% TFA Eluent B Niacetonitrile: 1% TFA = 9: 1 Flow rate: 1 m12/min Fraction volume: 1 mQ/tube/min Concentration gradient:
Time (minutes) %B The same results were obtained both times, and the results of the first time are shown in FIG. In the figure, the vertical axis represents C8F for the 51-fold dilution of each fraction shown in graph (1).
Activity (number of colonies/plate), absorbance of the protein at 280 nm (A280) shown in curve (2) and line (
The concentration (%) of eluent B shown in 3) is shown, and the horizontal axis shows the fraction number.

第４図より明らかなように、活性はフラクションＮ０．
２９〜３８にかけて認められた。この内フラクションＮ
０．３２〜３５を集め、減圧下に濃縮乾固した後、０．
００５％ポリエチレングリコール含有リン酸ｍｌ衝生理
食塩液に溶解し、以下の方法に供した。As is clear from FIG. 4, the activity is higher in fraction N0.
It was recognized from 29 to 38. Of this fraction N
0.32 to 35 were collected and concentrated to dryness under reduced pressure.
The sample was dissolved in 0.005% polyethylene glycol-containing phosphoric acid-enriched physiological saline solution and subjected to the following method.

（６）ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷ　　）ＩＰＬｃ上記（
５）で得られた活性画分を、セントリコン−１０（アミ
コン社製）を用いて遠心濃縮した後、これに等量のサン
プルバッファー（蒸留水５或、０．５Ｍトリス塩酸緩衝
液（ｐ　Ｈ６，８）１戒及び１０％ドデシル硫酸ナトリ
ウム（ＳＤＳ）１．６ｍ１２の混液）を加え、３７℃で
３０分間処理し、以下の条件でゲル濾過のＨＰＬＣを行
なった。(6) TSK Gel G3000SW) IPLc above (
The active fraction obtained in step 5) was concentrated by centrifugation using Centricon-10 (manufactured by Amicon), and then mixed with an equal volume of sample buffer (distilled water 5 or 0.5 M Tris-HCl buffer (pH 6)). , 8) 1 precept and 1.6 ml of 10% sodium dodecyl sulfate (SDS) was added, treated at 37° C. for 30 minutes, and gel filtration HPLC was performed under the following conditions.

カラム：　ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷ、６０ｃｍｘ７．
５ｍｍ直径、東洋曹達工業社製） 溶離液：０．０５％ＳＤＳ含有０．１Ｍナトリウムリン
酸緩衝液（Ｉ））−１７，０＞ 流　速：０．２ｍＧ／分 フラクション容積：０．２５ｍ１ｌ！／チユ一ブ／１分
１５秒 結果を第５図に示す。図において、縦軸は、グラフ（１
）で示されるＣ８Ｆ活性（コロニー数／プレート）及び
曲線（２）で示される２　８　Ｏｎ１１における蛋白の
吸光度（Ａ　２８０）を各々示し、横軸はフラクション
Ｎｏ、を示す。但し、グラフ（１）で示されるＣ８Ｆ活
性は、各フラクションの１００倍希釈液については−・
−で表わし、同フラクションの２００倍希釈液について
は一〇−で表わす。Column: TSK Gel G3000SW, 60cmx7.
5 mm diameter, manufactured by Toyo Soda Kogyo Co., Ltd.) Eluent: 0.1 M sodium phosphate buffer (I) containing 0.05% SDS -17.0> Flow rate: 0.2 mG/min Fraction volume: 0.25 ml! /Tube/1 minute 15 seconds The results are shown in Figure 5. In the figure, the vertical axis is the graph (1
) and the protein absorbance (A 280) in 2 8 On11 shown by curve (2) are shown, respectively, and the horizontal axis shows the fraction number. However, the C8F activity shown in graph (1) is -・ for the 100-fold dilution of each fraction.
-, and a 200-fold dilution of the same fraction is expressed as 10-.

また図には、分子量マーカーとしてフォスフォリラーゼ
ｂ　　（９，４万）、牛血清アルブミン（６，７万）、
卵白アルブミン（４，３万）、カーボニックアンヒドラ
ーゼ（３，Ｏ万）、ソイビーントリプシンインヒビター
（２，０１万）及びα−ラクトアルブミン（１，４４万
）を用いて、同様に処理した場合の分子量値を各々矢印
を付して示す。Also shown in the figure are phosphorylase b (94,000), bovine serum albumin (67,000), and molecular weight markers.
When treated in the same way using ovalbumin (4,300,000), carbonic anhydrase (3,000,000), soy bean trypsin inhibitor (2,010,000) and α-lactalbumin (14,440,000). The molecular weight values of each are shown with arrows.

上記各マーカーの分子量を基準とすれば、ＡＧＲ−ＯＮ
−Ｃ８Ｆ活性は、分子量２．３〜４万の両分（フラクシ
ョンＮｏ、５９〜６６）にかけて、２８０　ｒ＋ｍの吸
収ピークと一致する形で認められた。Based on the molecular weight of each marker above, AGR-ON
-C8F activity was observed in both fractions with a molecular weight of 23,000 to 40,000 (fraction Nos. 59 to 66) in a form consistent with the absorption peak at 280 r+m.

このピークを集めることにより、本発明ＡＧＲ−ＯＮ　
−Ｃ８Ｆを得た。By collecting these peaks, the present invention AGR-ON
-C8F was obtained.

■　ΔＧＲ−ＯＮ−Ｃ８ＦのＳ［）Ｓ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）レムリの方法（
Ｌａｅｍｍｌｉ、　ＩＪ、　Ｋ、、Ｎａｔｕｒｅ　。■S[)S-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) of ΔGR-ON-C8F Laemmli method (
Laemmli, I. J., K., Nature.

２７７．６８０　（１９７０））に従い、上記■の（６
）で得たフラクションＮｏ、６２の１０μＱを、乾固し
た後、レムリのサンプルバッファー（２−メルカプトエ
タノールを含まない）に溶解し、３７℃で３０分間処理
した後、以下の条件で５ＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。277.680 (1970)), the above (6)
) was dried, dissolved in Laemmli's sample buffer (not containing 2-mercaptoethanol), treated at 37°C for 30 minutes, and then subjected to 5DS-PAGE under the following conditions. I did it.

ゲ　ル：厚さ０．７５ｎ＋ｍの１２％ポリアクリルアミ
ドゲル 電気泳動装置：モデル３６０ミニ垂直スラブセル（バイ
オラド社製）を用いた。Gel: 12% polyacrylamide gel with a thickness of 0.75 nm+m Electrophoresis apparatus: Model 360 mini vertical slab cell (manufactured by Bio-Rad) was used.

泳動条ｆｌ：：定電流２０ｍＡで約１時間泳動させた。Electrophoresis was carried out for about 1 hour at a constant current of 20 mA.

染　色ニジルバースティンキット（バイオラド社製）を
用いた。A staining kit (manufactured by Bio-Rad) was used.

分子量マーカー：分子量測定用キット（ＬＭＷＫ　ｉｔ
Ｅ　、ファルマシア社製）を用いた。Molecular weight marker: Molecular weight measurement kit (LMWK it)
E, manufactured by Pharmacia) was used.

上記５ＤＳ−ＰＡＧＥの結果、本発明ＡＧＲ−ＯＮ−Ｃ
８Ｆは、分子量３．３万〜４．３万にわたるバンドとし
て認められた。As a result of the above 5DS-PAGE, the present invention AGR-ON-C
8F was recognized as a band ranging in molecular weight from 33,000 to 43,000.

なお、上記において、サンプルとして前記■の（６）で
得たフラクションＮｏ、６４を用い、５％２−メルカプ
トエタノールを含む上記サンプルバッファーを使用した
以外は同様の条件を採用して、還元条件での５ＤＳ−Ｐ
ＡＧＥを行なったところ、分子量２万〜２．４万にわた
るバンドを与えた。In the above, the same conditions were adopted except that fraction No. 64 obtained in (6) of above (■) was used as the sample, and the above sample buffer containing 5% 2-mercaptoethanol was used, and the same conditions were used under reducing conditions. 5DS-P
When AGE was performed, a band with a molecular weight ranging from 20,000 to 24,000 was obtained.

■　ＡＧＲ−ＯＮ−Ｃ８Ｆのクロマトフオーカシング 上記■の（５）で得られた活性画分の一部を、０．００
５％ポリエチレングリコール含有リン酸塩緩衝生理食塩
液に溶解した後、以下の条件でＨＰＬＣによるクロマト
フオーカシングに供した。■ Chromatofocusing of AGR-ON-C8F A part of the active fraction obtained in (5) of (■) above was
After dissolving in phosphate buffered saline containing 5% polyethylene glycol, it was subjected to chromatofocusing by HPLC under the following conditions.

カラムニーＥ／　（Ｍｏｎｏ　）　Ｐ　　ｌ」Ｒ５／２
０　（ファルマシア社製） 溶離液Ａ：０．００５％ポリエチレングリコール含有０
．０２５Ｍヒストリスーイミノニ酢酸緩衝液（ｐＨ７，
１） 溶離液Ｂ：０．００５％ポリエチレングリコール含有１
０％ポリバッファー７４−−イミノニ酢酸緩衝液（ｐＨ
１４，０＞ 流　速二０．８較／分 フラクション容積：０．８＋１１２／チユ一ブ／分溶出
プログラム　　　時間（分）　　％８５．１　　１００ ６０、１　　　　０ 結果を第６図に示す。図において、縦軸は、グラフ（１
）で示される各フラクションの６倍希釈１（７）Ｃ８Ｆ
活性（コロニー数／プレート）及び曲線（２〉で示され
るｐＨを各々示し、横軸はフラクションＮｏ、を示す。Columnney E/ (Mono) P l” R5/2
0 (manufactured by Pharmacia) Eluent A: Contains 0.005% polyethylene glycol 0
．． 025M histris-iminodiacetic acid buffer (pH 7,
1) Eluent B: 0.005% polyethylene glycol containing 1
0% Polybuffer 74--Iminoniacetic acid buffer (pH
14,0> Flow rate 20.8 comparison/min Fraction volume: 0.8+112/tube/min Elution program Time (min) %85.1 100 60,10 The results are shown in FIG. In the figure, the vertical axis is the graph (1
) 6-fold dilution of each fraction 1(7)C8F
The activity (number of colonies/plate) and the pH indicated by the curve (2>) are shown, respectively, and the horizontal axis shows the fraction number.

尚、上記ｐＨは各フラクションをＩ）−Ｈメーターで測
定した。Note that the above pH was measured for each fraction using an I)-H meter.

コノ結果より、ＡＧＲ−ＯＮ　−Ｃ３Ｆ（７）Ｉ電点は
、ｏ　Ｉ＝４．０〜４．６であると認められた。From the results, it was confirmed that the AGR-ON-C3F(7) I electric point was o I = 4.0 to 4.6.

■　ＡＧＲ＝ＯＮ−Ｃ３Ｆのアミノ酸組成比上記■の（
６）で得られたＡＧＲ−ＯＮ・Ｃ８Ｆ活性画分のフラク
ションＮ０．６２の一部を試料として、加水分解（４Ｎ
　　メタンスルホン酸、２４時間）後、オルトフタルア
ルデヒド（ＯＰＡ）法により、アミノ酸アナライザー（
日立製作断裂）を用いてアミノ酸組成比の分析を行なっ
た。■ Amino acid composition ratio of AGR=ON-C3F (
A part of fraction N0.62 of the AGR-ON・C8F active fraction obtained in step 6) was used as a sample and subjected to hydrolysis (4N
Methanesulfonic acid for 24 hours), then an amino acid analyzer (
The amino acid composition ratio was analyzed using a Hitachi-produced rupture system.

その結果、ＡＧＲ−ＯＮ−Ｃ８Ｆは、Ｐｈｅを基準（１
１個含まれると仮定して）として、下記第１表に示すモ
ル比で各アミノ酸を含有するものであることが確認され
た。As a result, AGR-ON-C8F is based on Phe (1
It was confirmed that each amino acid was contained in the molar ratio shown in Table 1 below.

尚、上記分析条件下においては、ｐｒｏ及びＣｙｓは測
定されない。またＳｅｒ及びＴｈｒは同条件下で約５〜
１０％程度分解することが知られている。Note that pro and Cys are not measured under the above analysis conditions. Also, Ser and Thr are about 5 to 5 under the same conditions.
It is known that it decomposes by about 10%.

第　　１　　表 ア　　　ミ　　　ノ　　酸　　　　　　　　　　　　モ
　　ル　　比ＡＳＤ及び／又はＡｓｎ　　　　　　２５
．６Ｔｈｒ　　　　　　１０．８ Ｓｅｒ　　　　　　１４．１ Ｇ１１】及び／又はＧｌｎ　　　　　　３０．１Ｇｌｙ
　　　　　　５．２ Ａｌａ　　　　　　８・６ Ｖａｌ　　　　　　１０．５ Ｍｅｔ　　　　　　５．３ Ｉｌｅ　　　　　　８．３ Ｌｅｕ　　　　　　２２．０ Ｔｙｒ　　　　　　５．２ Ｐｈｅ　　　　　　（１１） Ｌｙｓ　　　　　　１５．２ Ｈｉｓ　　　　　　４・３ Ｔｒｐ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　あ　
　リＡｒｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　７．
５■　Ａ　Ｇ　Ｒ−ＯＮ　−ＣＳ　Ｆのアミノ酸配列上
記■の（６）で得られたＡＧＲ−ＯＮ・Ｃ８Ｆ活性画分
くフラクションＮｏ、６２及び６３）を混合後、気相シ
ークエンサー（アプライドバイオシステム社製）を用い
て、そのＮ端アミノ酸配列を決定した。Table 1 Amino acid molar ratio ASD and/or Asn 25
．． 6Thr 10.8 Ser 14.1 G11] and/or Gln 30.1Gly
5.2 Ala 8・6 Val 10.5 Met 5.3 Ile 8.3 Leu 22.0 Tyr 5.2 Phe (11) Lys 15.2 His 4・3 Trp A
Re-Aro 7.
5. Amino acid sequence of AGR-ON-CSF After mixing the AGR-ON/C8F active fractions obtained in (6) of (6) above, mix them using a gas phase sequencer (Applied Biosystems). The N-terminal amino acid sequence was determined using the following method (manufactured by Seiko Co., Ltd.).

その結果、ＡＧＲ−ＯＮ−Ｃ３ＦのＮ端２７個のアミノ
酸配列は、以下のものであることが明らかとなった。As a result, it was revealed that the N-terminal 27 amino acid sequence of AGR-ON-C3F is as follows.

Ｖ　ａｌ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｇ　ｌｕ　−Ｔ　ｙｒ　−Ｃ
ＶＳ−８ｅｒ　−ｔ−１ｉｓ　−Ｍｅｔ　−Ｉ　１ｅ−
Ｇｌｙ−８ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｇ　
Ｉｎ−８ｅｒ　−Ｌ　ｅｕ　−Ｇ　Ｉｎ−Ａｒｇ　−Ｌ
ｅｕ　−１ｌｅ　−Ａ　Ｓｔ）　−Ｓ　ｅｒ　−Ｇ　Ｉ
ｎ　−Ｍ　ｅｔ　−Ｇ　Ｉｕ　−Ｔ　ｈｒ尚、Ｎ末端よ
り５番目のアミノ酸は、ＰＴＩ−１アミノ酸として検出
されなかったことがらＣｙｓと推定した。V al -S er -G lu -T yr -C
VS-8er -t-1is -Met -I 1e-
Gly-8er-Gly-His -L eu -G
In-8er -L eu -G In-Arg -L
eu -1le -A St) -S er -G I
n -M et -G Iu -T hrThe fifth amino acid from the N-terminus was presumed to be Cys since it was not detected as a PTI-1 amino acid.

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of drawings]

第１図乃至第６図は、各々本発明実施例に従う方法にお
けるフェニルセファロースクロマトグラフィーの溶出部
の結果、ウルトＯゲルＡｃＡ４４クロマトグラフィーの
結果、ＤＥＡＥ−，５ＰＷ高速液体クロマトグラフィー
（ＤＥＡＥ−５ＰＷＨＰＬＣ）の結果、逆相高速液体ク
ロマトグラフィー（ＲＰ−Ｈ’ＰＬＣ）の結果、ＴＳＫ
ゲルＧ３０００ＳＷ　　ＨＰＬＣの結果及びクロマトフ
オーカシングの結果を示すものである。 （以　上）Figures 1 to 6 show the results of the elution portion of phenyl Sepharose chromatography, the results of Wurth O gel AcA44 chromatography, and the results of DEAE-,5PW high performance liquid chromatography (DEAE-5PWHPLC) in the method according to the example of the present invention, respectively. Results, reverse phase high performance liquid chromatography (RP-H'PLC) results, TSK
The results of gel G3000SW HPLC and chromatofocusing are shown. (that's all)

Claims (1)

【特許請求の範囲】[Claims] （１）骨髄細胞に作用してマクロファージの分化増殖を
促進させる活性を有する糖蛋白質であつて、下記理化学
的性質を有する物質。 ａ）分子量： 非還元条件下でＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動
により、３３０００〜４３０００ダルトンであり、 非還元条件且つＳＤＳ存在下でのゲルろ過で、２３００
０〜４００００ダルトンである、ｂ）蛋白質部分のＮ端
アミノ酸配列： 次の一次構造式で表わされる配列を有する。 【遺伝子配列があります】(1) A glycoprotein having the activity of acting on bone marrow cells to promote the differentiation and proliferation of macrophages, and having the following physicochemical properties. a) Molecular weight: 33,000-43,000 Daltons by SDS polyacrylamide gel electrophoresis under non-reducing conditions; 2,300 Daltons by gel filtration under non-reducing conditions and in the presence of SDS.
b) N-terminal amino acid sequence of protein portion: It has a sequence represented by the following primary structural formula. [There is a gene sequence]
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH03501382A (en) * 1987-09-22 1991-03-28 カイロン　コーポレイション Use of recombinant colony stimulating factor-1
US5650297A (en) * 1986-09-17 1997-07-22 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. DNA encoding human colony-stimulating factors

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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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JPH03501382A (en) * 1987-09-22 1991-03-28 カイロン　コーポレイション Use of recombinant colony stimulating factor-1

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