JPS62169054A

JPS62169054A - 固相免疫測定法

Info

Publication number: JPS62169054A
Application number: JP1178986A
Authority: JP
Inventors: Makoto Takashina; 誠高階
Original assignee: Sumitomo Electric Industries Ltd
Current assignee: Sumitomo Electric Industries Ltd
Priority date: 1986-01-22
Filing date: 1986-01-22
Publication date: 1987-07-25

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】、産業上の利用分野本発明は、反応溶液、洗浄液等の分注・排出操作を容易
にした固相免疫測定法に関する。

従来の技術免疫学的測定法は、それぞれの抗原物質に、対応する抗
体が選択的に反応するという抗原抗体反応の特異性を応
用した測定法であり、検出感度も高く、様々な物質の同
定、定量に用いられてきた。

また、各種診断に応用される免疫学的診断法としても広
く用いられている。

この様な現状において、免疫学的測定を、正確かつ簡単
に行うべく、種々の改良、開発が行われている。例えば
、この方法で最も手間がかかり、かつ困難なのは、抗原
抗体反応物を未反応物と分離する操作であり、この問題
を解決するために、抗原または抗体を不溶性の物質また
は反応容器の壁面に付着させ、抗原抗体反応物の分離お
よび洗浄をより容易とする固相免疫測定法が開発されて
いる。

この方法は、応用範囲がきわめて広く、例えば、抗原抗
体反応物を検出するだめの標識物質により、放射性同位
元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、あるいは酵素免疫測定法
（ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法）等に分類できる。また、測
定操作において、抗原抗体反応物質を標識する手順によ
り、間接法、二抗体サンドイツチ法、競合法等に分類で
きる。

固相免疫測定法においては、間接法、二抗体サンドイツ
チ法、競合法等と上記二種類の標識方法のいずれかとを
組合せることにより、種々の固相免疫測定を行うことが
できるが、感度、特異性、迅速性、正確性においてすぐ
れ、かつ自動化可能なものが好ましい。固相放射性同位
元素免疫測定法は、上記特性のほとんどを満たすが、放
射性同位元素の汚染に注意が必要である。

固相酵素免疫測定法は、特異的な抗原抗体反応と鋭敏な
酵素反応を組み合わせることにより、極く微量の抗原も
しくは抗体を検出定予できるばかりでなく、放射性同位
元素による汚染の心配がないため（酵素免疫測定法：医
学書院列、１９７６年）、広く免疫学の研究分野のみな
らず、医学の臨床診断の分野においても、その有用性は
近年ますます高まっている。

従来の固相酵素免疫測定法では９６穴マイクロタイタ−
トレイを用いる方法が一般的であり、そのための専用の
光度計も開発されている。固相酵素免疫測定法の内、最
も良く利用されている９６穴マイクロクイタートレイを
用いた間接法について、その÷既略を説明すると、まず
９６穴マイクロタイタートレイの各穴（ウェル）の底部
内壁に抗原（あるいは抗体）Ａをコーディングし、さら
に、該内壁Ａによって被覆されなかった部分を別の蛋白
質でブロッキングすることにより完全に該底部内壁を被
覆し、次いで各穴にその抗原（あるいは抗体）Ａに特異
的に反応する濃度の不明な抗体（あるいは抗原）Ｂの溶
液、さらにその抗体くあるいは抗原）Ｂに特異的に反応
する酵素標識抗体溶液を順次入れ替えて反応させる。未
反応の抗原あるいは抗体は溶液を入れ替える度に緩衝液
で良く洗い流す。最後に酵素と反応して発色する基質を
含む溶液を各穴に加えて一定時間反応させた後、強酸等
で反応を停止させ、発色の程度、即ち酵素標識抗体と結
合した濃度不明の抗体（あるいは抗原）Ｂの塁を吸光度
で測定定量する。

上記の間接状以外にも、酵素標識抗体を反応させる前に
、濃度不明の抗体（あるいは抗原）已に特異的に反応す
る抗体Ｃを反応させてから、その特異抗体Ｃに反応する
酵素標識抗体を最後に反応させる２抗体サンドイッチ法
や、コーティングした抗原（あるいは抗体）Ａに濃度不
明な抗体（あるいは抗原）Ｂを反応させ、さらに抗体（
あるいは抗原）Ｂと同様にＡに反応する酵素標識抗体（
あるいは抗原）を反応させる競合法等がある。

また、固相さしてはプラスチック製の９Ｇ穴マイクロタ
イクートレイの他に、２〜５　ｍｍ径の粒状体を容器の
中に入れて用いることもある。

また、他の標識物質、例えば放射性同位元素を用い、放
射性同位元素標識抗体と抗原抗体反応物とを結合せしめ
、放射性同位元素の放射線量で定性・定量することも、
もちろん可能である。

いずれの方法も、固相となる穴内壁にコーティングした
抗原（あるいは抗体）に順次特異的に抗体や抗原を反応
させて行き、未反応のものは洗い流すことにより抗原抗
体反応を起したもののみを検出することを特徴とする。

これら従来の固相免疫測定法は、抗原溶液、抗体溶液あ
るいは基質溶液を容器に分注・排出する操作と、溶液を
入れ換える際に未反応の抗原あるいは抗体を緩衝液で洗
い流す洗浄操作との繰り返しで単調なものであるが、以
下の様な不具合があった。

発明が解決しようとする問題点即ち、分注操作はマイクロピペットもしくはマイクロデ
ィスペンサーを多数回操作し、しかもそれらの操作は反
応時間を揃えるため短時間のうちに手早く行う必要があ
り、疲労の大きいものであった。

また、洗浄操作に就いては、９６穴マイクロタイタート
レイを用いる場合は、洗浄液が隣接する穴に入らない様
に注意して洗浄液の注入・排出を繰り返す必要があり、
しかも反応相である底面を傷つけない様に気を付けて操
作しなければならず大変であった。

そのため、自動的に各穴への洗浄液の注入及び各穴から
の洗浄液の排出を行う装置も幾つか開発されてはいるが
、底面を傷つける恐れがあるため排出用のチューブを穴
の底まで着けられず、液穴の底あるいは隅に廃液が残り
、分析の精度を悪くするという欠点があった。

固相として粒状体を用いる場合も、同様に粒状体表面を
傷つけない様に、洗浄液の注入・排出を行わなければな
らず、この反応溶液および洗浄液の注入排出操作は手間
のかかるものだった。

問題を解決するための手段本発明はこれらの従来の固相免疫測定法の問題点を解決
すると同時に、更に従来の固相免疫測定法にない長所を
有する、反応固相として作用する毛管部を有する細管を
用いることを特徴とする固相免疫測定法を提供するもの
である。

即ち、本発明による固相免疫測定法は、反応容器および
固相として、内径２ｍｍ以下の毛管部を有する透明な細
管内壁を用い、該内壁面に抗原または抗体を付着せしめ
、さらに被験溶液中の抗体または抗原と反応させること
を特徴とする。

本発明の固相免疫測定法に用いられる細管は、毛管力に
より所定量の溶液を該細管内部に保持できる様な毛管部
を有するものであればよく、例えば、全体にわたって一
定の内径を持つ毛管であってもよい。また、添付第１図
に示す様に、細管全体を毛管１とし、該毛管１の下端に
該毛管１の内径よりも小さな孔径を有する透水性の隔壁
２を備えることで、より多くの溶液３を毛管１内部に保
持することも可能である。

本発明において、透水性とは、毛管１に該隔壁２を取り
付けた場合、毛管１の内部を陽圧あるいは陽圧とするこ
とにより容易に溶水を流通させ得る特性と理解されるべ
きである。該隔壁２は、例えば膜状、海綿状あるいは網
目状のいずれであっても良い。

更に、添付第２図に示す様に、毛管１の下端を、他の部
分上り小さな内径の開口部４を有する形状とすることに
よっても、毛管１内部に保持される溶液３の量を増加さ
せることができる。

また、添付第３図に示す様に、上記細管５の固相として
用いる部分の上端部および下端部の少なくとも１方、好
ましくは両方を毛管部６とし、この２ケ所の毛管部６の
毛管力により、中央部の細管部７に一層多くの溶液３を
保持する形状とすることができる。

また、上記細管の材質としては、抗原あるいは抗体、即
ち蛋白質を付着しやすい材質であることが好ましく、例
えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、
ポリ塩化ビニルおよびポリカーボネート等のポリマーあ
るいは、ガラス等を例示できる。

更に、一定量の溶液を吸上げるために、上記細管に液１
測定用の目盛を付けることが好ましい。

上記の様な細管を用いた、本発明の固相免疫測定法は、
標識物質として、酵素または放射性同位体等を用いた、
間接法、二抗体サンドイツチ法、または競合法等を、有
利に適用することが可能である。

本発明の固相酵素免疫測定法の操作手順を、最も良く使
われる前記の間接法を例に説明する。

透明で表面に蛋白質を封着する材質から成る細管を必要
数量用意し、コーティングする抗原（あるいは抗体）Ａ
溶液を一定滑、即ち、例えばそれぞれの細管の内径が同
一ならば細管の同じ高さまで、また、細管の外面に液量
を示す目盛が付いていればこの目盛まで、該細管の下端
より吸い上げる。その後、そのままの状態、あるいは該
細管を寝かせて、一定時間静置し、抗原（あるいは抗体
）Ａを細管内壁に付着させる。

上記操作により、細管内壁に抗原（あるいは抗体）Ａを
付着させた後、細管の下端を洗浄液に浸し、細管の上端
よりアスピレータ−等で吸引することにより洗浄液を細
管中に流し、細管内部を洗浄する。−足車の洗浄液を流
して細管内壁を洗浄した後、細管の下端を洗浄液から取
り出し細管の内部に残った洗浄液を抜き取る。

この洗浄液の排出操作は、毛管を束ねて底に吸水性の紙
等を詰めた遠沈管に詰めて低速の遠心分離により脱水す
るか、毛管の上端から陽圧を加えるか下端から陽圧を加
えて毛管の下端より洗浄液を抜き取るか、もしくは洗浄
液を流すのと同じように毛管の上端から残液も吸い取る
ことによって行うことができる。

上記の洗浄操作が終了後、ブロッキング溶液を、抗原（
あるいは抗体）Ａがコーティングされた反応固相部分よ
り上の位置まで、細管下端より吸い上げ、一定時間静置
する。上記と同様に、細管内部の洗浄を行った後、コー
ティングした抗原（あるいは抗体）Ａに特異的に反応す
る抗体くあるいは抗原）Ｂを含む被験溶液を、抗原（あ
るいは抗体）八をコーティングした位置まで、細管の下
端より吸い上げる。細管の上部に細管のナンバーを表す
数字もしくはバーコード等が付いていると、試料のナン
バーとの照合が容易であるばかりでなく、自動化を行う
場合には機械にナンバーを認識させることができるので
、便利である。

抗原（あるいは抗体）Ａと抗体くあるいは抗原）Ｂを細
管内壁面で一定時間反応させた後、上記と同じ方法で細
管内部の洗浄を行う。

次に、抗体（あるいは抗原）已に特異的に反応する酵素
標識抗体Ｃの溶液を、抗原（あるいは抗体）Ａをコーテ
ィングした位置まで、細管の下端より吸い上げる。一定
時間反応させた後、同様にして細管内部の洗浄を行う。

最後に標識酵素に反応して発色する基質溶液を一定量、
抗原（あるいは抗体）Ａをコーティングした反応固相部
分より上の位置まで、細管下端より吸い上げる。

必要であれは遮光して、一定時間反応させた後、基質液
の発色の程度を測定する。強酸溶液等を一定量細管中に
吸い上げて、反応を停止させてから、基質液の吸光度測
定を行っても良い。

基質液の吸光度測定は、従来の９６穴マイクロタイター
トレイ用のアナライザーを用いる場合は、細管の上端よ
り陽圧を加え、下方に受けた９６穴マイクロタイタート
レイの穴の中に基質液を移し換えて、アナライザーで測
定する。細管をセットできる様に特別に改良を加えた分
光光度計を用いれば、細管中の溶液の発色を直接測定す
ることが可能である。

上記間接法で、放射性同位元素により標識した場合、上
記と同様の反応操作を行い、最終的に基質溶液の変りに
、アルカリ性溶液等を細管下端より吸入し、蛋白質を分
解した後、管上端より陽圧を加え、排出する操作を複数
回くり返し、回収された排出液の放射線量を測定するこ
とにより、抗原抗体反応物の量を測定できる。

２抗体サンドイッチ法、競合法等も、用いる試薬や操作
回数が異なるだけで、各操作の内容は間接法で説明した
のと同じであるので、本発明の固相免疫測定法を用いて
のそれらの操作手順についての説明は省略する。

作用本発明の固相免疫測定法は、内径が２ｍｍ以下の毛管部
を有し、表面に蛋白質、即ち抗原や抗体を付着する透明
な材質から成る細管を反応容器とし、該細管の内壁を反
応固相として用いる、新規な固相免疫測定法であり、毛
管部を有する細管を用いることにより、以下に示すよう
な特性を有する。

即ち、本発明の固相免疫測定法に反応容器および固相と
して用いられる、毛管部を有する細管は、該毛管部の毛
管力により、細管内部にかなりの量の溶液を保持するこ
とかできる。さらに、全体にわたって同一内径を有する
毛管とする、全体を毛管とし該毛管の下端に膜状、海綿
状あるいは網目状の隔壁を備える、全体を毛管とし該毛
管の下端を他の部分の内径より小さな内径を有する様に
すぼめる、あるいは溶液を保持する部分の上端部および
下端部の少なくとも１方を毛管部とする等により、適宜
その保持溶液量を変化させ得る。

しかも、上記管の全体を内径の小さな毛管とした場合、
少量の抗原（あるいは抗体）溶液でも正確に定量でき、
さらに十分な面積の固相上で反応を行わせることが可能
となった。

また、本発明の固相免疫測定法では、従来の方法では手
間のかかった分注操作が、毛管そのものがマイクロピペ
ットとしての機能を持つため、簡単に行える。また、同
様に手間がかかり時間のかかった洗浄操作も、毛管中に
洗浄液を流す方法により、反応固相を傷つけることなく
短時間で簡単に行える。さらに、反応溶液の世を毛管が
自然に吸い上げる世として適当な溶液濃度に調整する、
多数の毛管をまとめてアスピレータにセットして一度に
洗浄操作を行う等の工夫により自動化が容易に行えると
言った長所がある。

実施例細管状の容積１００μ！のガラス製マイクロピペット（
内径的１．３ｍｍ）の下端にスポンジを１〜２ｍ１Ｔｌ
の厚さに詰め、下端から３０μβ及び５０μ！の位置に
目盛を付は第１図に示す如き形状の固相用毛管を使用し
た。

ウサギ抗マウス免疫グロブリンを、０．（１１Ｍ燐酸緩
衝食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ　；　０．（１１Ｍ　Ｎａ２ＨＰ
○、−Ｎａ８２Ｐ○４．０、１５　Ｍ　　ＮａＣｌ　；
　ｐ　Ｈ７，２）により５ｔ−ｔｇ／ｍｆｌに希釈し、
該溶液を、上記マイクロピペットの下端より、３０μβ
の目盛まで吸い上げた後、該マイクロピペットを、温度
３７度で１時間、静置した。

次に、該マイクロピペットの上端にアスピレータに接続
した吸引チューブを取り付け、更に下端を洗浄液（０，
０５％Ｔｗｅｅｎ　２０．０．ＯＬＭ　　ＰＢＳ）に浸
漬し、該洗浄液をマイクロピペットの下端より連続して
吸い上げ洗浄した。約１ｍｎの洗浄液を流した後、下端
を洗浄液より引き上げ、更に吸引を続は該マイクロピペ
ット内の洗浄液をアスピレータで全て吸い取った。

ブロッキング溶液として、１％牛血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）および０，１％ＮａＮ：＋を含む０．ＯＩＭＰＢＳ
を用い、該ＰＢＳを該マイクロピペットの下端より、５
０μβの目盛まで吸い上げた後、マイクロピペットを温
度３７℃で３０分間静置し、ブロッキングを行い、更に
、上記と同様にして、マイクロピペットの内部を洗浄し
た。

次に、硫安塩析法及びプロティンＡアフィニティカラム
で精製したマウス免疫グロブリン（Ｉ　ｇＧ）を１％Ｂ
ＳＡ−０，（１１’Ｍ　　ＰＢＳで４倍段階希釈した溶
液を各々、上記マイクロピペットの下端より、３０μβ
の目盛まで吸い上げ、該マイクロピペットを、温度４℃
で１時間、静置し、抗原抗体反応を起し、再度上記と同
様にして、該マイクロピペットの内部を洗浄した。

次に、ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ　）　４Ｍ識ウつキ゛
抗マウス免疫グロブリン（ダコバッツ（ＤＡＫ１３ＰＡ
ＴＴＳ）社）を１％　Ｂ　Ｓ　Ａ−０，ＯＬＭ　Ｐ　Ｂ
　Ｓで５００倍に希釈した溶液を、上記マイクロピペッ
トの下端より、３０μ！の目盛まで吸い上げた後、該マ
イクロピペットを、温度４℃で１時間静置し、更に上記
と同様にして、マイクロピペットの内部を洗浄した。

更に、基質溶液（４ｍｇ　　Ｏ−フェニレンジアミン、
４μβ　３０％過酸化水素水／１０ｍ１　クエン酸−燐
酸緩衝液）を、マイクロピペットの下端より、５０μβ
の目盛まで吸い上げ、室温で３０分間、暗所に静置した
。

次に、９６穴マイクロタイタートレイの各穴に２規定硫
酸溶液を５０μβずつ分注し、その上に上記マイクロピ
ペット内の基質溶液を、該マイクロピペット”下端より
全量滴下し、９６穴マイクロタイクートレイ用アナライ
ザー（東洋測器ｅ））で、各大穴の基質溶液の４９０　
ｎ　ｍの吸光度（ＯＤ、、、）を測定した。

測定の結果を第４図に示す。第４図から明らかな様に、
本発明の固相酵素免疫測定法では、少量の抗原あるいは
抗体溶液を用いて、従来の固相酵素免疫測定法と同様の
精度の高い分析結果を得られることがわかった。

発明の効果以上述べてきた様な細管部を有する管を反応容器および
固相として用いることにより、本発明による固相免疫測
定法は、次に挙げる様な利点を有する。

即ち、抗原あるいは抗体溶液の注入排出操作および、未
反応物質の洗浄操作等が、簡単かつ確実に短時間で行え
る。

また、少量の抗原（あるいは抗体）溶液の測定も可能で
ある。

さらに９６穴マイクロタイタートレイでは、検体数が９
６の倍数である場合を除いて、使われない無駄な穴がで
きるが、本発明にかかる固相免疫測定法では検体数が何
検体で行っても無駄がでない。

また、多量の検体数でも場所を取らずに手早く操作でき
る。

以上の特性により、本発明の固相免疫測定法は全操作を
自動化することが可能である。

【図面の簡単な説明】

添付第１図は本発明の固相免疫測定法で用いる細管の好
ましい一態様を示す縦断面図を表し、添付第２図は本発
明の固相免疫測定でもちいる細管の好ましい別の態様を
示す縦断面図を表し、添付第３図は本発明の固相免疫測
定でもちいる細管の好ましい更に別の態様を示す縦断面
図を表し、また第４図は実施例の結果を示したものである。（主な参照番号）１・・毛管、　　２・・隔壁、３・・溶液、　　４・・毛管下端の開コ部、５・・細管
、　　６・・毛管部、７・・細管部

Claims

【特許請求の範囲】

（１）内径２ｍｍ以下の透明な毛管部を有する細管の内
壁面に、抗原または抗体を付着せしめ、該内壁面に付着
された抗原または抗体と、被験溶液中の抗体または抗原
とを抗原抗体反応せしめることを特徴とする固相免疫測
定法。
（２）上記細管の全体が、内径２ｍｍ以下の毛管であっ
て、下端に透水性の隔壁を備えることを特徴とする特許
請求の範囲第１項に記載の固相免疫測定法。
（３）上記隔壁が、膜状であることを特徴とする特許請
求の範囲第２項に記載の固相免疫測定法。
（４）上記隔壁が、海綿状であることを特徴とする特許
請求の範囲第２項に記載の固相免疫測定法。
（５）、上記隔壁が、網目状であることを特徴とする特
許請求の範囲第２項に記載の固相免疫測定法。
（６）上記細管の全体が内径２ｍｍ以下の毛管であって
、下端が該細管の他の部分より小さな内径の開口部を有
することを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の固
相免疫測定法。
（７）上記細管の下端部と、上記抗原または上記抗体が
付着する内壁面上端部の少なくとも１方が内径２ｍｍ以
下の毛管であることを特徴とする特許請求の範囲第１項
に記載の固相免疫測定法。
（８）上記細管が、ポリマーであることを特徴とする特
許請求の範囲第１項ないし第７項のいずれか１項に記載
の固相免疫測定法。
（９）上記ポリマーが、ポリスチレン、ポリエチレン、
ポリプロピレン、ポリ塩化ビニルおよびポリカーボネー
トから選択されることを特徴とする特許請求の範囲第８
項に記載の固相免疫測定法。
（１０）上記細管が、ガラスであることを特徴とする特
許請求の範囲第１項ないし第７項のいずれか１項に記載
の固相免疫測定法。
（１１）上記細管が、液量測定用の目盛を付けられてい
ることを特徴とする特許請求の範囲第１項ないし第１０
項のいずれか１項に記載の固相免疫測定法。
（１２）さらに、標識付きの抗体と反応せしめることを
特徴とする特許請求の範囲第１項ないし第１１項のいず
れか１項に記載の固相免疫測定法。
（１３）上記標識が、酵素であることを特徴とする特許
請求の範囲第１２項に記載の固相免疫測定法。
（１４）上記標識が、放射性同位元素であることを特徴
とする特許請求の範囲第１２項に記載の固相免疫測定法
。
（１５）上記固相免疫測定法が、間接法によって行なわ
れることを特徴とする特許請求の範囲第１２項ないし第
１４項のいずれか１項に記載の固相免疫測定法。
（１６）上記固相免疫測定法が、二抗体サンドイッチ法
によって行われることを特徴とする特許請求の範囲第１
２項ないし第１４項のいずれか１項に記載の固相免疫測
定法。
（１７）上記固相免疫測定法が、競合法によって行われ
ることを特徴とする特許請求の範囲第１２項ないし第１
４項のいずれか１項に記載の固相免疫測定法。