JPS62167465A - Electrochemical enzyme measuring method - Google Patents
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。(57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は電気(ヒ学的酵素測定法(enz)・mic
assay)に関するものである。特に本発明は免疫検
定法に有用な技術および装置に関するものであるが、こ
れに眼定されるものではない。特に本発明は例えば人間
または動物に対する広範囲な診断または調査の技術に1
吏用され、あるいは例えば食品化学またはプロセス化学
の調査および監視に1吏用される免疫検定法に関するも
のである。[Detailed Description of the Invention] The present invention is based on the electrical
(assay). In particular, the present invention relates to, but is not limited to, techniques and devices useful in immunoassays. In particular, the present invention is useful in a wide range of diagnostic or investigative techniques, e.g. for humans or animals.
The present invention relates to immunoassays used in research and monitoring, for example in food chemistry or process chemistry.
既知の酵素を標識として用いる測定法の一例はエリザ゛
(ELSI八)(enzyme−1abelled
immunosorbentassay)技術として知
られている不均一免疫検定法(heterogeneo
us immunoassay)である。普通採用され
ているサンドイツチ法において、代表的な例ではこの方
法は洗浄およびすすぎによって分離された次の三つの工
程:
(a) 適当な抗体を支持体表面、例えば重合体ビー
ズまたは場合によってはプラスチック容器壁またはプラ
スチック皿のくぼみの表面上に固定化する工程;
(b)前記固定化酵素を担持する表面と測定すべき試料
とを接触させて、試料中の特定の検体(analyte
)を検体濃度に応じた割合で抗体と結合させる工程;お
よび
(C) さらに前記表面と酵素で標識した抗体とを接
触させ、これによりこの酵素で標識した抗体を抗原のみ
に結合させ、かくして前記表面に試料中の検体濃度に対
応する測定可能濃度の酵素を提供する工程
からなる。An example of a measurement method using a known enzyme as a label is enzyme-1 labeled
Heterogeneous immunoassay (heterogeneo), known as immunosorbentassay technology
US immunoassay). In the commonly employed sandwich method, the method typically involves three steps separated by washing and rinsing: (a) applying the appropriate antibody to the surface of a support, e.g. polymer beads or, in some cases, plastic; immobilization on the surface of a container wall or a recess of a plastic dish; (b) contacting the surface carrying the immobilized enzyme with the sample to be measured to immobilize the specific analyte in the sample;
) is combined with the antibody at a ratio depending on the sample concentration; and (C) further contacting the surface with an enzyme-labeled antibody, thereby causing the enzyme-labeled antibody to bind only to the antigen, thus It consists of providing a surface with a measurable concentration of enzyme that corresponds to the analyte concentration in the sample.
サンドイツチ法にはある限界があり、特にこの方法は少
なくとも2個のエピトープを有する検体分子を固定化抗
体および酵素で標識した抗体の両者と反応させる場合に
しか使用できない点に眼界がある。The Sand-Deutsch method has certain limitations, particularly in that it can only be used when a sample molecule having at least two epitopes is reacted with both an immobilized antibody and an enzyme-labeled antibody.
特定の検体を測定するための別のエリザ競合法では、酵
素で標識した既知濃度の特定の検体を試料に加え、次い
てこの試料と既知濃度の抗体を担持する表面とを接触さ
せ、これにより標識検体および未標識検体を結合位置に
対して比例的に競合させ、次いで酵米濃度の測定によっ
て標識検体/非標識倹体の比を求める。Another ELISA competitive method for measuring specific analytes involves adding a known concentration of the specific analyte labeled with an enzyme to a sample, and then contacting the sample with a surface carrying a known concentration of antibody, thereby Labeled and unlabeled analytes are competed proportionally for binding positions, and the ratio of labeled analyte/unlabeled analyte is then determined by measuring the yeast concentration.
現在のエリザおよび他の酵素測定法の大部分は装置期間
の終りに発色団を放出する色形成基質(colour
forming 5ubstrate)を使用しており
、発色団の濃度は分光光度計によって測定することがで
きる。しかし、色形成基質の使用は、結果を得るのに必
要な時間の長さおよびある発色団の不安定性の点で欠点
を有することがある。従って測定法の改善が必要である
。Most current ELISA and other enzymatic assays use color-forming substrates that release a chromophore at the end of the instrument period.
The concentration of the chromophore can be measured by a spectrophotometer. However, the use of color-forming substrates can have drawbacks in the length of time required to obtain results and the instability of certain chromophores. Therefore, improvement of the measurement method is necessary.
色の検出に代る方法として「アナリティカル・ケミスト
リJ (1984) 56.2355に電気化学的検出
法が記載されており、この方法では測定に用いる酵素標
識によって電気的不活性物質が電気化学的に検出可能な
電気的活性物質に転化する。電気的活性化合物であるフ
ェノールは+750 mVの酸化還元電位を有しており
、この方法はそのままでは一役的には適用できない。そ
の理由は系が750 mVの1δ位で酸化する他の成分
に出会うからである。従ってこの系は実際に血液または
血清の試料には採用できない。As an alternative to color detection, an electrochemical detection method is described in Analytical Chemistry J (1984) 56.2355, in which electrically inert substances are electrochemically activated by the enzyme label used for measurement. The electroactive compound phenol has a redox potential of +750 mV, and this method cannot be applied as is because the system has a redox potential of +750 mV. This is because other components that oxidize at the 1δ mV position are encountered.Therefore, this system cannot be practically adopted for blood or serum samples.
本発明は特に応答の増幅を利用する測定法、特に検体が
特に1氏い濃度でかつ/または潜在的妨害物質との混合
物として存在している成分混合物中の1種または2種以
上の物質の存在を検出するかあるいは前記物質のレベル
を監視するための測定法であって、応答の存在または不
存在が特定の結合反応の程度に結び付いている測定法に
関するものである。The present invention particularly relates to assays that make use of response amplification, in particular the measurement of one or more substances in a component mixture where the analyte is present in a particularly low concentration and/or as a mixture with a potential interfering substance. It relates to an assay for detecting the presence or monitoring the level of said substance, wherein the presence or absence of a response is linked to the extent of a particular binding reaction.
欧州特許第78636号明細書は、酵素が基質における
酸化還元反応に触媒作用を及ぼす場合に、酵素と電極と
の間で電子を移動させるためにフェロセン誘導体のよう
なメディエータ(mediator)化合物を使用する
ことを開示している。かかる方法は主としてレドックス
酵素としてグルコースオキシダーゼを採用することによ
り基質であるグルコースを電気化学的に検出するのに1
吏用されている。EP 78636 uses a mediator compound, such as a ferrocene derivative, to transfer electrons between the enzyme and an electrode when the enzyme catalyzes a redox reaction in a substrate. This is disclosed. This method mainly employs glucose oxidase as a redox enzyme to electrochemically detect glucose as a substrate.
being employed.
比較的最近の欧州特許、例えばεP第125.139号
明細書には、基質濃度を一定とし、使用できるメディエ
ータ化合物の濃度を変動要因とする測定法が開示されて
いる。この方法では、欧州特許第78、636号の方法
とは逆に、レドノタス酵崇と基質との組合せがメディエ
ータの電気化学的検出を可能にしている。Relatively recent European patents, such as εP 125.139, disclose assays in which the substrate concentration is constant and the concentration of the available mediator compound is a variable factor. In this method, contrary to the method of EP 78,636, the combination of Rhodonotus fermentation and substrate allows electrochemical detection of the mediator.
本発明はレドックス酵素およびレドックス基質を使用し
てメディエータレベルを電気化学的に検出することに基
づく一層進歩した測定法に閏するものである。The present invention involves a more advanced measurement method based on electrochemical detection of mediator levels using redox enzymes and redox substrates.
本発明の主目的は酵素を標識として用いる侵れた測定法
を提供することにある。The main objective of the present invention is to provide an invasive assay method using enzymes as labels.
特に本発明の目的は漆れたエリザ法を提供することにあ
る。In particular, it is an object of the present invention to provide a lacquered Elisa method.
本発明の他の目的は酵素を標識として用いる新規な方法
に使用する試薬を提供することにある。Another object of the present invention is to provide reagents for use in new methods using enzymes as labels.
本発明は、レドックス酵素およびレドックス基質を使用
してメディエータレベルを電気化学的に検出することに
より、測定の際に、測定に用いる標識酵素による、メデ
ィエータ作用をしない化合物(non−mediati
ng compound)の有効メディエータへの転化
を検出することを特徴とする電気化学的酵素測定法を提
供する。The present invention electrochemically detects the mediator level using a redox enzyme and a redox substrate.
The present invention provides an electrochemical enzyme assay method characterized by detecting the conversion of ng compound into an effective mediator.
従って、本発明は測定条件下にメディエータでない化合
物から生成する有効メディエータを検出する電気化学的
方法を使用する。有効メディエータは測定法において標
識として用いた酵素によって生成する。従って、検体を
定性的または定量的な意味で測定することができる。ナ
ノモル範囲において比較的高感度で迅速ブよ免疫検定法
を達成することができる。Accordingly, the present invention uses an electrochemical method to detect active mediator generated from non-mediator compounds under measurement conditions. The active mediator is produced by the enzyme used as a label in the assay. Therefore, the analyte can be measured in a qualitative or quantitative sense. Rapid immunoassays can be achieved with relatively high sensitivity in the nanomolar range.
条件は測定に用いる標識酵素に対する基質がメディエー
タとして有効でなく、かつ測定に用いる標識酵素が基質
を有効メディエータに転化させる作用をするように選定
する。メディエータ作用をしない化合物自体は、選定し
た条件下にこの化合物がメディエータとして有効でなく
、従って「メディエータ作用をしない」が、潜在的メデ
ィエータであることができる。Conditions are selected so that the substrate for the labeled enzyme used in the measurement is not effective as a mediator, and the labeled enzyme used in the measurement acts to convert the substrate into an effective mediator. A compound that does not act as a mediator can itself be a potential mediator, such that the compound is not effective as a mediator under the selected conditions and thus is "not a mediator."
従って、本発明は、標識酵素を使用して電気化学的酵素
測定を行うに当り、レドックス酵素およびレドックス基
質を使用し、メディエータ作用をしない基質が前記標識
酵素によって無効メディエータから前記レドックス酵素
と電極との間の電子移動を媒介する有効メディエータに
転化する結果として前記7漂識酵累を電気化学的に検出
することを特徴とする電気化学的酵素測定法を提供する
。Therefore, in performing electrochemical enzyme measurement using a labeled enzyme, the present invention uses a redox enzyme and a redox substrate, and the labeled enzyme converts the substrate that does not act as a mediator from the ineffective mediator to the redox enzyme and the electrode. An electrochemical enzymatic assay method is provided, which comprises electrochemically detecting the 7-dried fermentation product as a result of its conversion into an effective mediator that mediates electron transfer between the enzymes.
測定に用いる標識酵素をメディエータ/レドックス酵素
系と一緒に使用することにより、既知の特定の結合測定
法(binding assay)を従来達成されてい
たレベルより一層高いレベルに拡張することができ、し
かも妨害物質を除去するための試料の予備処理が不要に
なる。By using labeled enzymes for assays together with mediator/redox enzyme systems, known specific binding assays can be extended to levels even higher than previously achieved, yet without interference. Pretreatment of the sample to remove substances is no longer necessary.
本発明方法で[重用する上述の系とPCT/英国(GB
)特許第8600095号明細書に記載されている系と
は、本発明ではレドックス基質が有効メディエータへの
転化前には自由に拡散するが、従来の系では活性成分が
固定化剤の比1校的大きい分子に結合することにより不
活性になる点において異なる。In the method of the present invention, the above-mentioned systems and PCT/GB
) The system described in Patent No. 8,600,095 is that, in the present invention, the redox substrate diffuses freely before being converted into an effective mediator, whereas in the conventional system, the active ingredient is one part of the immobilizing agent. They differ in that they become inactive by binding to large target molecules.
本発明方法は代表的な例では免疫検出法である。The method of the present invention is typically an immunodetection method.
この方法ではサンドイツチ法または競合法を使用するの
が適当である。従って、好ましくは、本発明方法はサン
ドイッチエリザまたは競合エリザである。Suitably, this method uses the Sanderuch method or the competitive method. Therefore, preferably the method of the invention is a sandwich ELISA or a competitive ELISA.
サンドイツチ法の場合には、モノまたはポリクローナル
抗体を固定化し、試料を固定化抗体と接触させ、次いで
この系を酵素で標識した抗体と接触させ、基質をこの基
質がメディエータ作用しないような系の条件下に転化し
、しかる後にレドックス酵素およびレドックス酵素基質
を1吏用して有効メディエータの電気化学的測定を行う
。In the Sand-Deutsch method, a mono- or polyclonal antibody is immobilized, the sample is contacted with the immobilized antibody, the system is then contacted with an enzyme-labeled antibody, and the substrate is subjected to system conditions such that this substrate does not act as a mediator. The redox enzyme and redox enzyme substrate are then used for electrochemical determination of the effective mediator.
競合法の場合には、試料および酵素で標識した検体を固
定化抗体と接触させ、メディエータ作用をしない基質を
添加し、電気化学的測定を行う。In the case of a competitive method, a sample and an enzyme-labeled specimen are brought into contact with an immobilized antibody, a substrate that does not act as a mediator is added, and electrochemical measurements are performed.
普通、電気化学的検出の際には、メディエータ作用をし
ない基質自体がメディエータ作用をしないようになった
潜在低的メディエータであるのが好ましく、これの理由
は操作条件にある。このためには、電極を、レドックス
酵素に対する基質の酸化還元電位と生成物の酸化還元電
位との中間であって、電極に維持されている電位より伐
い酸化還元電位を有する生成物のみが電極で酸化還元反
応を受けることができるような所定の電位に維持する。Normally, for electrochemical detection, it is preferred that the non-mediating substrate itself be a low-potency mediator that has become non-mediating, the reason for this being the operating conditions. To this end, the electrode must be placed between the redox potential of the substrate and the redox potential of the product for the redox enzyme, lower than the potential maintained at the electrode, so that only products with a redox potential are at the electrode. is maintained at a predetermined potential such that it can undergo a redox reaction.
所定電位において電子移動を示す生成物であって、前記
所定電位においてメディエータ活性を示さない基質から
酵素反応によって形成することができる生成物をメディ
エータとして使用することにより、前記基質の前記生成
物への転化程度、従って酵恣の存在または活性を測定す
ることができる。基質の生成物への転化が測定条件下に
おけるメディエータ活性の増大によって達成される種々
の測定法を実施することができる。the transfer of said substrate to said product by using as a mediator a product which exhibits electron transfer at a given potential and which can be formed by an enzymatic reaction from a substrate which does not exhibit mediator activity at said given potential. The degree of conversion and thus the presence or activity of fermentation can be determined. A variety of assays can be performed in which the conversion of substrate to product is achieved by increasing mediator activity under the assay conditions.
標識酵素に対する基質は測定条件下にメディエータ作用
をしないメディエータ誘導体である。この誘導体の性質
は標識酵素の性質に依存する。The substrate for the labeled enzyme is a mediator derivative that does not act as a mediator under the measurement conditions. The nature of this derivative depends on the nature of the labeled enzyme.
基質の基剤を形成することができるメディエータ化合物
の例は、メタロセン;ルテニウム化合物;カルボラン;
TCNQの導電性塩;ハロアニル(haloanil
)およびその誘導体; ビオロゲン; キノン;アルキ
ル置換フェナジン誘導体;遷移金属のビス−シクロペン
タジェニル<C9) 2MX、 錯体: およびヘエロ
センーフェノールおよびインドフェノール化合物を包含
するフェノール誘導体である。かかる化合物は容易に誘
導体化して適当な基質を提供することができる。Examples of mediator compounds that can form the basis of the substrate are metallocenes; ruthenium compounds; carboranes;
Conductive salt of TCNQ; haloanil
) and their derivatives; viologens; quinones; alkyl-substituted phenazine derivatives; transition metal bis-cyclopentadienyl<C9) 2MX, complexes: and phenol derivatives, including heerocene-phenol and indophenol compounds. Such compounds can be easily derivatized to provide suitable substrates.
空気の作用を受は難い水溶性誘導体を使用することによ
り、最小の予備処理を受けた生物学的流体試料について
測定を行うことができる。By using water-soluble derivatives that are not sensitive to air, measurements can be performed on biological fluid samples that have undergone minimal pretreatment.
所定の酵素に対する基質を提供する適当な誘導体は容易
に合成することができる。例えば、ホスフェート誘導体
は酸性またはアルカリ性のホスファターゼによって認め
られている。Appropriate derivatives that provide substrates for a given enzyme can be easily synthesized. For example, phosphate derivatives are recognized by acidic or alkaline phosphatases.
ホスファターゼ標識酵素に対する基質はメタロセン誘導
体であるのが好適台であり、フェロセン誘導体であるの
が好ましい。The substrate for the phosphatase-labeled enzyme is preferably a metallocene derivative, preferably a ferrocene derivative.
フェロセンの適当なホスフェート誘導体の例は次式(I
)および(■):
○
で表される。本発明の特に好ましい例では、レドックス
基質はホスフェート化合物(1)で、この化合物は次式
;
%式%
で表わすこともでき、〔N−フェロセノイル〕−4−ア
ミノフェニルホスフェートと呼ばれる。この化合物は新
規な化合物で、本発明の一部を構成する。An example of a suitable phosphate derivative of ferrocene is represented by the following formula (I
) and (■): Represented by ○. In a particularly preferred embodiment of the invention, the redox substrate is a phosphate compound (1), which can also be represented by the following formula; This compound is a new compound and forms part of the present invention.
化合’IM [N−フエロセノイル〕−4−アミノフェ
ニルホスフェートは標準甘こう電極(rscEJ )に
対して390 mVのE172を有する。この化合物を
ホスファターゼ、例えば酸性またはアルカリ性のホスフ
ァターゼで処理すると、この化合物は次式():
%式%()
で表されるフェノール誘導体に転化し、この化合物はS
CEに対して+180mVの酸化電位を有する。Compound 'IM [N-ferrocenoyl]-4-aminophenyl phosphate has an E172 of 390 mV vs. standard glucose electrode (rscEJ). When this compound is treated with a phosphatase, e.g. acidic or alkaline phosphatase, this compound is converted into a phenol derivative with the following formula (): %formula %();
It has an oxidation potential of +180 mV vs. CE.
従って、電流測定をSCEに対して約+230 mVで
行うと、化合′吻(八)による接触電流のみが検出され
、化合物([)はこの電位において電極応答を示さない
。Therefore, when current measurements are made at about +230 mV vs. SCE, only the contact current due to compound 'proboscis (8) is detected, and compound ([) shows no electrode response at this potential.
本発明の他の好適例では、基質はフェノール誘導1本、
例えば2.6−ジクロロインドフェニルホスフェートで
、この化合物は次式(■):
て表される。In another preferred embodiment of the invention, the substrate is one phenolic derivative;
For example, 2,6-dichloroindophenyl phosphate, this compound is represented by the following formula (■):
ホスファターゼは一例にすぎず、本発明は電気的に活性
な種(species)に結合した任意の酵素基質に適
用することができる。従って、本発明は標識酵素として
ホスファターゼを使用する場合でもかかるホスフェート
化合物に限定されるものではない。メディエータ化合物
は容易に合成して池の酵素系に結合させることができ、
従って測定に用いる標識酵走によって触媒される反応の
性質は重要でない。例えば、酵素はプロテアーゼ、アミ
ダーゼまたはヒドロラーセとすることができる。Phosphatases are only one example; the invention is applicable to any enzyme substrate coupled to electroactive species. Therefore, even when phosphatase is used as a labeling enzyme, the present invention is not limited to such phosphate compounds. Mediator compounds can be easily synthesized and coupled to pond enzyme systems;
Therefore, the nature of the reaction catalyzed by the labeled fermentation used in the measurement is not important. For example, the enzyme can be a protease, amidase or hydrolase.
本発明の他の面において、本発明はは第1酵秦の活性を
検出する系を提供し、この系は:a) 前記第1酵諧に
よってメディエータ活性を示す生成物に転化することが
できて前記生成物の検出を可能にする自由に拡1)kす
る試薬と、b) レドックス酵素、該レドックス酵素に
対する基質、および電極からなる検出手段とを備え、活
性形態の前記第1酵素の存在下に前記試薬が ′前
記生成物に転化し、検出可能な変化が前記電極への媒介
された電子移動中に生じるように構成したことを特徴と
する。主として、前記生成物の特徴あるメディエータ特
性は所定の電極電位における電子移動である。In another aspect of the invention, the invention provides a system for detecting the activity of a first enzyme, which system comprises: a) convertible by said first enzyme into a product exhibiting mediator activity; the presence of said first enzyme in active form, comprising: 1) a freely spreading reagent which allows the detection of said product; and b) detection means consisting of a redox enzyme, a substrate for said redox enzyme, and an electrode. wherein said reagent is 'converted to said product and a detectable change occurs during mediated electron transfer to said electrode. Primarily, the characteristic mediator property of the product is electron transfer at a given electrode potential.
かかる系を使用して第1酵素測定法を提供することがで
き、第1酵素は標識酵素であってもなくてもよい。Such a system can be used to provide a first enzyme assay, where the first enzyme may or may not be a labeled enzyme.
本発明の池の面において、本発明は生物電気化学的電池
(BEC)を提供し、この電池は、測定に用いる標Mf
!に酵素に対する基質が組込まれ、前記測定に用いる標
識酵素が前記基質を消費してBECからの出力に変化を
生じさせることにより前記酵素を検出できるように構成
され、さらに前記基質のメディエータへの転化を介して
電気出力を提供する第2酵素反応系を備えることを特徴
とする。In the pond aspect of the invention, the invention provides a bioelectrochemical cell (BEC), which cell comprises a standard Mf used to measure
! A substrate for the enzyme is incorporated into the BEC, a labeled enzyme used in the measurement is configured to detect the enzyme by consuming the substrate and causing a change in the output from the BEC, and converting the substrate into a mediator. The second enzyme reaction system is characterized in that it includes a second enzyme reaction system that provides electrical output through the second enzyme reaction system.
BECで使用される第2酵素反応では、グルコースとグ
ルコースオキシダーゼとの反応において電子移動を媒介
させるにはフェロセンメディエータが好ましい。かかる
系では、フェロセン化合物のメディエータ作用により、
フェロセン化合物における酸化還元電位の変化の作用が
増幅される。In the second enzymatic reaction used in BEC, a ferrocene mediator is preferred to mediate electron transfer in the reaction between glucose and glucose oxidase. In such systems, due to the mediator action of the ferrocene compound,
The effect of changes in redox potential on ferrocene compounds is amplified.
酵素がフェロセン化合物または他の基質を消費するにつ
れて生ずるフェロセン化合物または他の基質における変
化はメディエータ特性、従ってBECからの出力に著し
い影響を及ぼすことができる。Changes in the ferrocene compound or other substrate that occur as the enzyme consumes it can significantly affect the mediator properties and thus the output from the BEC.
本発明のさらに他の面において、本発明は一定電位に維
持されている少なくとも1個の電極の存在下に非レドッ
クス酵素の活性を検出する方法を提供し、この検出法は
;
a) 前記非レドックス酵素を含有すると思われる試料
を前記電極に維持されている電位より高い酸化還元電位
を有する試薬で処理し、この際前記試薬として、非レド
ックス酵素に対する基質であって、前記レドックス酵素
の活性によってメディエータとして作用しかつ前記電極
に維持されている電位より低い酸化還元電位を有する生
成物に転化することができる基質を使用し、
b) 前記試料をレドックス酵素および該レドックス酵
素に対する基質で処理して、前記電極に維持されている
電位より低い酸化還元電位を有するメディエータ化合物
の存在下に前記電極への測定可能な電子移動を生じさせ
ることを特徴とする。In yet another aspect of the invention, the invention provides a method for detecting the activity of a non-redox enzyme in the presence of at least one electrode maintained at a constant potential, the detection method comprising: a) said non-redox enzyme; A sample suspected of containing a redox enzyme is treated with a reagent having a redox potential higher than the potential maintained at the electrode, wherein the reagent is a substrate for a non-redox enzyme, and the activity of the redox enzyme is b) treating the sample with a redox enzyme and a substrate for the redox enzyme; , characterized in that it causes measurable electron transfer to said electrode in the presence of a mediator compound having a redox potential lower than the potential maintained at said electrode.
本発明は、酸化還元活性を示さないが、本発明の一つの
面においては測定条件下における基質のメディエータ特
性を有する生成物への転化に触媒作用を及ぼすことがで
きる酵素の活性を検出することを可能にする。The present invention detects the activity of an enzyme that does not exhibit redox activity, but is capable of catalyzing the conversion of a substrate to a product having mediator properties under the conditions of measurement. enable.
以下に本発明をホスファターゼ酵素について説明するが
、本発明の範囲は池の測定系および他の試薬に及ぶ。例
えば、試薬と反応してメディエータ特性を有する生成物
を生成することができる池の標識酵素を1吏用すること
ができる。Although the invention is described below with reference to phosphatase enzymes, the scope of the invention extends to Ike assay systems and other reagents. For example, one can use a labeled enzyme that can react with the reagent to produce a product with mediator properties.
なお本発明は抗原の標識付けについて説明されているが
、酢酸の相捕的ストランド間におけるような他のタイプ
の特異的結合反応における標識酵素を使用することがで
きる。Note that although the present invention is described for labeling antigens, the labeling enzyme can be used in other types of specific binding reactions, such as between complementary strands of acetic acid.
第1図において、メディエータ化合物0.1 i )は
例えば化合物(I)である。この化合物は水溶性試薬で
あって、この試薬は、電極をSCEに対して+230
mVの電位に維持した場合にグルコースオキシダーゼ(
COD) とその基質グルコースとの間でメディエー
タ活性を示さない。In FIG. 1, the mediator compound 0.1 i ) is, for example, compound (I). This compound is a water-soluble reagent that makes the electrode +230 relative to SCE.
When maintained at a potential of mV, glucose oxidase (
COD) and its substrate glucose.
標識として存在するホスファターゼ酵素(E)の存在下
に、化合物(1)は化合物(A) に転化する。In the presence of a phosphatase enzyme (E) present as a label, compound (1) is converted to compound (A).
化合物(八)はグルコースオキシダーゼ(COD) と
その基質グルコースとSCEに対し+230mV +、
:維持された電極との間でメディエータ活性(Ledl
oj を示ず。Compound (8) is +230 mV + for glucose oxidase (COD) and its substrate glucose and SCE;
: Mediator activity (Ledl) between maintained electrodes
oj not shown.
従って、第1図の系はホスファターゼ酵素の活性の検出
を可能にする。電極において検出される電流は化合物(
八)の存在のみに起因する。The system of Figure 1 therefore allows the detection of the activity of phosphatase enzymes. The current detected at the electrode is
8) is attributable only to the existence of
xrx を図において、ホスファターゼ酵素は抗体(八
b)に対する標識であり、従ってホスファターゼ酵素の
濃度は抗体とこれに対応する抗原との間の特異的結合反
応の影響を受ける。抗体を抗原にさらす工程および結合
部分と遊離部分とを分離する工程は既知の免疫検定法の
技術によって実施することができる。別法では、ホスフ
ァターゼ酵素を抗原に対する。標識とすることができる
。In the xrx diagram, the phosphatase enzyme is a label for the antibody (8b), so the concentration of the phosphatase enzyme is influenced by the specific binding reaction between the antibody and its corresponding antigen. The steps of exposing the antibody to the antigen and separating the bound and free portions can be performed by known immunoassay techniques. Alternatively, a phosphatase enzyme is directed against the antigen. It can be a sign.
次に本発明を図面を参照して実験例について説明する。Next, the present invention will be described with reference to the drawings and experimental examples.
実験例1
(a)式(A)で表される化合物の製造「ジャーナル・
オブ・オルガニック・ケミストリー」、君、 2−8
0〜281(1959) に記載の方法によりフェロセ
ンモノカルボン酸をフエロセノイルクロリドに転化した
。Experimental Example 1 (a) Production of compound represented by formula (A) “Journal・
Of Organic Chemistry”, You, 2-8
0-281 (1959), ferrocene monocarboxylic acid was converted to ferrocenoyl chloride.
次いでフエロセノイルクロリド(1mM)を5dの水冷
乾燥ピリジン中に溶解した。この溶液に、p−アミノフ
ェアフール(1,1mM)を5mI!の乾燥ピリジンに
溶解した溶液を1回に添加した。反応を4℃で2時間進
行させ、次いで反応溶液を室温まで加温し、さらに2時
間かきまぜた。しかる後に反応溶液を濾過し、溶媒を真
空下に除去した。次いで、残留物を最少量の耐酸エチル
中に溶解し、充填剤としてシリカを使用しかつ溶離剤と
して酢酸エチル/ヘキサン(3: lv/v)を1吏用
してカラムクロマトグラフィを行って化合物を精製した
。精製された化合物は、この化合物を最少量の酢酸エチ
ルに溶解した溶液中にヘキサンを緩徐に拡散させること
により、オレンジ色針状結晶として晶出した。Ferrocenoyl chloride (1 mM) was then dissolved in 5d water-cooled dry pyridine. Add 5 ml of p-aminofairfur (1.1 mM) to this solution! of dry pyridine was added in one portion. The reaction was allowed to proceed for 2 hours at 4°C, then the reaction solution was warmed to room temperature and stirred for an additional 2 hours. Afterwards the reaction solution was filtered and the solvent was removed under vacuum. The residue was then dissolved in a minimum amount of acid-resistant ethyl, and the compound was purified by column chromatography using silica as the packing and one volume of ethyl acetate/hexane (3: lv/v) as the eluent. Purified. The purified compound crystallized out as orange needles by slowly diffusing hexane into a solution of the compound in a minimum amount of ethyl acetate.
質量分光分析によってm/e=321において親イオン
のピークを得た。このピークは所望の化合物(八)に対
応していた。A parent ion peak was obtained at m/e=321 by mass spectrometry. This peak corresponded to the desired compound (8).
(b)式(I)で表され乞化合物の製造アルカリ性ホス
ファターゼ測定法に用いる基質を、「ザ・バイオケミカ
ル・ジャーナルj47,93〜95 (1950) お
よび同33. 1182〜1184 (1939)に記
載されている方法の改良法によって製造した。(b) Production of the compound represented by formula (I) Substrates used in the alkaline phosphatase measurement method are described in The Biochemical Journal J47, 93-95 (1950) and 33.1182-1184 (1939) It was manufactured by an improved method of the previously described method.
化合物(A) (100mg、 0.31m)、4)を
5meの乾燥ピリジンに溶解し、この混合物を水浴中で
冷却した。Compound (A) (100mg, 0.31m), 4) was dissolved in 5me dry pyridine and the mixture was cooled in a water bath.
この溶液に新たに蒸留したオキシ塩化リン(30μ!。Add freshly distilled phosphorus oxychloride (30μ!) to this solution.
0、32mM)を添加し、精製した混合物を0℃におい
て反応が完結するまでかきまぜた。反応後に溶離剤とし
て酢酸エチルを1吏用して薄層クロマトグラフィを行っ
た。0.32mM) was added and the purified mixture was stirred at 0°C until the reaction was complete. After the reaction, thin layer chromatography was performed using 1 portion of ethyl acetate as an eluent.
反応が完結した後に、少量(約5m2)の水を添Jrt
>し、しかる後に飽和水酸化バリウム水溶液を0℃にお
いて溶液がアルカリ性になるまで添加した。After the reaction is completed, add a small amount (about 5 m2) of water.
Then, a saturated aqueous barium hydroxide solution was added at 0° C. until the solution became alkaline.
水酸化バリウムの添加後に、等容積の水冷エタノールを
添加してリン酸エステルのバリウム塩を沈殿させた。こ
のバリウム塩を信過によって捕集し、エタノール洗浄し
、真空下に乾燥した。After the addition of barium hydroxide, an equal volume of water-cooled ethanol was added to precipitate the barium salt of the phosphate ester. The barium salt was collected by filtering, washed with ethanol, and dried under vacuum.
粗バリウム塩は僅かに水溶性であった。これを化学量論
理的分量の1I23O4で処理した。生成した溶液を濾
過し、次いて凍結乾燥して遊離酸を僻だ。The crude barium salt was slightly water soluble. This was treated with a stoichiometric amount of 1I23O4. The resulting solution is filtered and then lyophilized to remove the free acid.
実験例2
式(II)で表される池の基質の製造
ヒドロキシメチルフェロセン(216mg) ヲ5iの
乾燥ピリジンに溶解し、次いで111μβの新鮮なオキ
シ塩化リンを1回に添加した。明るい黄色溶液は直ちに
暗赤色になり、塩化水紫ガスが放出された。この溶液を
約2時間かきまぜた。ヒドロキシメチルフェロセンの反
応は溶ν?i剤として酢酸エチルを[重用する/リカ板
上の薄層クロマトグラフィによって6゛N認された。5
分間の反応後に、この混合物中にヒドロキシメチルフェ
ロセンは撥出てきなかった。Experimental Example 2 Preparation of Pond Substrate of Formula (II) Hydroxymethylferrocene (216 mg) was dissolved in 5i of dry pyridine and then 111 μβ of fresh phosphorus oxychloride was added in one portion. The bright yellow solution immediately turned dark red and aqueous chloride gas was evolved. This solution was stirred for approximately 2 hours. Is the reaction of hydroxymethylferrocene soluble? Ethyl acetate was used as an i agent (6'N was confirmed by thin layer chromatography on a glass plate). 5
After a minute of reaction, no hydroxymethylferrocene was repelled into the mixture.
2時間後に、この溶液に僅かに塩基性の蒸留水(p11
約8)を添加し、次いて酢酸エチルで4回抽出してピリ
ジンを除去した。水性層をクロロホルムでさらに11回
抽出し、次いで回転蒸発器において蒸発乾固した。残留
物を僅かに酸性の蒸留水〈pH5,5)中に4回溶解(
しake up) シ、繰返し蒸発乾固して残留ピリジ
ンを除去した。After 2 hours, the solution was diluted with slightly basic distilled water (p11
8) was added and then extracted four times with ethyl acetate to remove the pyridine. The aqueous layer was further extracted with chloroform 11 times and then evaporated to dryness on a rotary evaporator. The residue was dissolved (4 times) in slightly acidic distilled water (pH 5,5).
Then, the remaining pyridine was removed by repeated evaporation to dryness.
生成物をエタノールに溶解して無機不純物を沈殿させ、
次いでこの不純物を濾別した。Dissolving the product in ethanol to precipitate inorganic impurities;
This impurity was then filtered off.
最後に、この生成物を乾燥するために、生成物を最少量
の蒸留水に溶解し、次いで48時間凍結乾燥した。Finally, to dry the product, it was dissolved in a minimum amount of distilled water and then freeze-dried for 48 hours.
4℃で48時間静置すると、結晶物質である化合物(I
I)が得られた。When left standing at 4°C for 48 hours, the crystalline substance compound (I
I) was obtained.
実験例3
酸化還元電位の測定
化合物(1)および(II)の酸化還元電位を測定した
。Experimental Example 3 Measurement of Redox Potential The redox potentials of compounds (1) and (II) were measured.
全作業電極、飽和けこう照合電極(SEC)および白金
対向電極を1吏用し、ポテンシオスタットに連結して電
気化学的電池を組立てた。この清、浄な電気化学的電池
に、フェロセン誘導体(2mM)およびグルコース(8
0mM)をl Q Q m 1.1のトリスに溶解した
pH10,15の溶液を充填した。最終容積は400μ
βであった。2種の異なる緩衝剤を使用して溶液を作っ
た。しかし、結果には影響が認められなかった。An electrochemical cell was assembled using a total working electrode, a saturated reference electrode (SEC), and a platinum counter electrode and connected to a potentiostat. Ferrocene derivative (2mM) and glucose (8mM) were added to this clean electrochemical cell.
A solution of 0mM) dissolved in lQQm 1.1 of Tris at pH 10.15 was filled. Final volume is 400μ
It was β. Solutions were made using two different buffers. However, no effect was observed on the results.
電圧を5mV/秒の速度でOmVから600mVまで変
えた。得られたポルタモグラムから化合物(I)および
([)の酸化還元電位を計算した。The voltage was varied from OmV to 600mV at a rate of 5mV/sec. The redox potentials of compounds (I) and ([) were calculated from the obtained portamograms.
化合物(I)の場合には、酸化還元電位は約+390m
Vであった。In the case of compound (I), the redox potential is approximately +390 m
It was V.
化合物(II)の場合には、酸化還元電位は約+370
mVであった。In the case of compound (II), the redox potential is approximately +370
It was mV.
化合物(I)および(II)の酸化還元電位は検討した
範囲ではpHとは無関係であった。The redox potentials of compounds (I) and (II) were independent of pH in the range studied.
実験例4
式(III)で表される池の基質の製造I
2.6−ジクロロインドフェノールのナトリウム塩5g
を水に溶解し、塩化水素ガスを深青色沈澱が析出するま
で加えた。生成した固形物を濾別し、ジクロロメタンに
溶解し、硫酸マグネシウム上で乾燥した。この溶液を濾
過し、溶媒を除去して2.6−ジクロロインドフェノー
ルを得た。Experimental Example 4 Production of pond substrate represented by formula (III) I 5 g of sodium salt of 2.6-dichloroindophenol
was dissolved in water, and hydrogen chloride gas was added until a deep blue precipitate was deposited. The resulting solid was filtered off, dissolved in dichloromethane and dried over magnesium sulfate. The solution was filtered and the solvent was removed to yield 2,6-dichloroindophenol.
この2,6−ジクロロインドフェノールを乾燥ピリジン
に溶解し、かきまぜながら1当量のオキシ塩化リンを・
商工した。15分後に氷を加え、溶液を炭酸す) tJ
ウムで中和した。溶媒を除去し、残留物を沸騰エタノー
ルで抽出した。エタノール層を濾過し、蒸発した。残留
物をエタノール洗浄して所望の化合物(III>を得た
。Dissolve this 2,6-dichloroindophenol in dry pyridine and add 1 equivalent of phosphorus oxychloride while stirring.
I did business. Add ice after 15 minutes to carbonate the solution) tJ
Neutralized with um. The solvent was removed and the residue was extracted with boiling ethanol. The ethanol layer was filtered and evaporated. The residue was washed with ethanol to obtain the desired compound (III>).
実騨例5
アルカリ性ホスファターゼの活性の7j、Hl 定2個
の隔室を有する電気化学的電池を1吏用した。Practical Example 5 The activity of alkaline phosphatase was 7j, Hl. An electrochemical cell with two compartments was used.
電池には、直径4 mmのグラファイト円板の作業電極
のほかに、1cm2 白金金網の対向電極および照合電
極である飽和寸こう電極(rscEJ )を入れた。In addition to a working electrode of a graphite disk with a diameter of 4 mm, the cell contained a counter electrode of 1 cm 2 platinum wire mesh and a reference electrode of saturated dimension (rscEJ).
直流における環状ポルクンメトリー実験はビーニーニス
(BΔ5)−100エレクトロケミカルアナライザ(E
lectrochemical Analyser)を
使用して行った。Circular porcunmetry experiments in direct current were performed using a Beanie Nis (BΔ5)-100 Electrochemical Analyzer (E
electrochemical analyzer).
子牛の腸のアルカリ性ホスファターゼ(カルジム((a
lzyme)社から供給されたもの)をpH10,1
5の0.1 M ) +)ス緩衝液中で透升した。最
終蛋白質濃度は0.86 mg / mlであった。Calf intestinal alkaline phosphatase (cardim ((a)
lzyme) at pH 10.1.
5 in 0.1 M) +) buffer. The final protein concentration was 0.86 mg/ml.
MgC(! 210mMおよびNaCj25QmMを含
有する0、1〜1 トリス中のpH10,15の2mM
基質溶液0.6mjl!を電気化学的電池の試料室に入
れ、直流において環状ポルクモグラムを記録した。ピー
ク電流がある場合にはこれを180mVで測定し、次い
で適当に希釈したアルカリ性ホスファクーゼ原液100
μgを添IJI′lシ、電池の内容吻を室温で15分間
温装した。温;1を後に環状ポルタモグラムを■び記’
p、TJ: I、、180mVで電流を測定した。この
操作をアルカリ性ホスファターゼの濃度範囲にわたって
繰返した。MgC (! 2mM at pH 10,15 in 0,1-1 Tris containing 210mM and NaCj25QmM
Substrate solution 0.6mjl! was placed in the sample chamber of an electrochemical cell and the annular polumogram was recorded in direct current. The peak current, if any, was measured at 180 mV and then an appropriately diluted alkaline phosphacuse stock solution of 100 mV was added.
µg was added and the contents of the cell were incubated at room temperature for 15 minutes. Warm; write the circular portamogram after 1'
p, TJ: I, , the current was measured at 180 mV. This operation was repeated over a range of concentrations of alkaline phosphatase.
フェノール性生成物におけるフェロセンの)工IJ ミ
ニラムイオンへの酸化による18θ[IIVにおけるピ
ーク電流を使用してアルカリ性ホスファターゼの活性を
評価した。アルカリ性ホスファターゼ濃度の関数である
180mVにおけるピーク電流は第2図に示す通りであ
る。The activity of alkaline phosphatase was evaluated using the peak current at 18θ[IIV] by oxidation of ferrocene to the phenolic product IJ miniram ion. The peak current at 180 mV as a function of alkaline phosphatase concentration is shown in FIG.
アルカリ性ホスファターゼの電池内(in−cell)
。Alkaline phosphatase in-cell
.
濃度1.23XLO−12モル/!は電気化学的電池中
の酵素8.6X10−16モルに相当した。従って、比
較的穏やかな条件下に環状ボルタンメ) IJ−を使用
し、15分間室温で温置した場合に(少なくとも30分
間37℃で温置するという免疫検定法においてかなり普
通に使用されている条件ではなく)、極少量のアルカリ
性ホスファターゼを測定することができた。Concentration 1.23XLO-12 mol/! corresponded to 8.6×10 −16 moles of enzyme in the electrochemical cell. Therefore, when using a cyclic voltamme under relatively mild conditions (IJ-) and incubation at room temperature for 15 minutes (incubation at 37°C for at least 30 minutes, conditions fairly commonly used in immunoassays) ), it was possible to measure extremely small amounts of alkaline phosphatase.
実験例6
電流測定(amperOmeLry) によるE N
D A B酵素の免疫検定法
電気化学的アルカリ性ホスファターゼ測定法の固有の感
度を示すために、酵素検定法の検出系を検討した。血清
中の非結合(unconjugated)エストリオー
ルのENDAB酵素検定法用のキットをシーエムディー
(CMD)社(英国)から購入した。Experimental Example 6 E N by current measurement (amperOmeLry)
D A B Enzyme Immunoassay To demonstrate the inherent sensitivity of the electrochemical alkaline phosphatase assay, a detection system for the enzyme assay was investigated. A kit for the ENDAB enzyme assay for unconjugated estriol in serum was purchased from CMD (UK).
エストリオールキットを使用した場合の測定接作を第2
抗体沈澱工程まで行い、次いで操作を変更して本発明の
測定法を実施した。50μ!の各エストリオール標準液
(0,1,3,10,20および40ng / me
)をピペットで適当なガラス管に入れた。The second measurement welding when using the Estriol kit.
The antibody precipitation step was performed, and then the measurement method of the present invention was carried out by changing the procedure. 50μ! Each estriol standard solution (0, 1, 3, 10, 20 and 40 ng/me
) into a suitable glass tube.
非特異的結合(rNsBJ)を行わせるために、NSB
管には50μβのQ ng / meの標準液を入れた
。To perform non-specific binding (rNsBJ), NSB
The tubes were filled with 50 μβ of Q ng/me standard solution.
次いで、25μaのエストリオール−酵素結合体(co
n、iugate)をずべてのガラス管に加え、100
μlのエストリオール抗血清を加えた。NSB管にはニ
ス) IJオール抗血清を加えず、代りに100AtR
のバックグラウンド(background)試薬を加
えた。Then, 25 μa of estriol-enzyme conjugate (co
n, iugate) to all glass tubes, and 100
μl of estriol antiserum was added. (varnish to the NSB tube) Do not add IJ all antiserum, instead add 100AtR.
background reagents were added.
これらの試薬を混合し、室温で20分間温温置た。These reagents were mixed and incubated at room temperature for 20 minutes.
次いで1 mlの第2抗体分離試薬をすべての管に加え
た。これらの管を3000rpmで10分間遠心分頭ト
シ、上澄液を廃棄した。次いでこれらの管を吸取紙につ
けて過剰液を除去した。1 ml of second antibody separation reagent was then added to all tubes. The tubes were centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes and the supernatant was discarded. The tubes were then placed on blotting paper to remove excess liquid.
この時点で、分光光度計によるエストリオール測定用の
キットを使用する場合の特定の方法を行う代りに、抗体
に結合させたエストリオール−アルカリ性ホスファター
ゼを含有する遠心ペレットを、フェロセン結合基質を含
有する溶液0.IgCβ21QmMおよびNaCj25
0mMを含有する0、LM)リス中のpH10,15の
2mM溶液0,6me) 中に懸濁させた。At this point, instead of following the specific method of using a kit for spectrophotometric estriol determination, the centrifuged pellet containing the estriol-alkaline phosphatase conjugated to the antibody is replaced with a ferrocene-conjugated substrate. Solution 0. IgCβ21QmM and NaCj25
Suspended in a 2mM solution at pH 10,15 in 0,6me) containing 0mM).
この溶液を室温で15分間温温置た。15分間の温置後
に、溶液を電気化学的電池の試料室に移した。The solution was incubated at room temperature for 15 minutes. After 15 minutes of incubation, the solution was transferred to the sample chamber of the electrochemical cell.
この溶液のポルタモグラムをSCEに対してO〜+65
0mVの電位範囲にわたって記録し、180mVにおけ
るピーク電流を測定した。The portamogram of this solution is O~+65 relative to SCE.
Recordings were made over a potential range of 0 mV and the peak current at 180 mV was measured.
この操作を各血清エストリオール、1% 2%D液、す
なわ’E、O,l、 3.20および4Qng/mfの
前記標2<q液について行った。This operation was performed for each serum estriol, 1% 2% D solution, ie 'E, O, l, 3.20 and 4Qng/mf of the above standard 2<q solution.
アルカリ性ホスファターゼの不存在下における基τ′j
に関ずろ1.80mVにおけるバックグラウンド電流、
ずな4っぢ非特異的結合電流は1.15μ八であった。The group τ′j in the absence of alkaline phosphatase
Background current at 1.80 mV,
Zuna4's non-specific binding current was 1.15μ8.
この(直を、血?n標準液を1吏用して得た結果から引
算した。This value was subtracted from the results obtained using one volume of blood standard solution.
各血清7漂準液に関する180+y+Vにおける補正し
たピーク電流をキットに備えである。標章曲線紙上にプ
ロットした。Corrected peak currents at 180+y+V for each serum 7 standard are provided in the kit. Plotted on marking curve paper.
Nn +/ioをエストリオール濃度(ng/mg>に
対してプロットすると直線(y=0.04X +0.4
3゜r=0.98)となった。When Nn +/io is plotted against the estriol concentration (ng/mg>), a straight line (y=0.04X +0.4
3°r=0.98).
電流測定法により検出を行うかかるENDAB免疫検定
法は、標準キット法より短い温置時間および低い温度を
使用して行うことができた。Such an ENDAB immunoassay with amperometric detection could be performed using shorter incubation times and lower temperatures than the standard kit method.
実験例7
(a)化合物(I)および(I[)の使用実験例3と同
じ装置を使用し、同様に電圧を変えた。Experimental Example 7 (a) Use of Compounds (I) and (I[) The same apparatus as in Experimental Example 3 was used, and the voltage was changed in the same way.
この実験では、175 mg/meの酵素グルコースオ
キシダーゼ(COD)1μlを実験例3と同じ溶液に添
加して最柊容積を0.35mffにした。In this experiment, 1 μl of the enzyme glucose oxidase (COD) at 175 mg/me was added to the same solution as in Experimental Example 3 to give a maximum volume of 0.35 mff.
前回と同様に電圧を変え、その結果である電流と電圧と
の関係を記録した。As before, we changed the voltage and recorded the resulting relationship between current and voltage.
1ヒ合′吻(I)および((I)がグルコースオキ/ダ
ーゼ酵素反応に対するメディエータとして作用すること
、および酸化電位において生ずる電流が増幅されること
が分った。かかる増幅は酵素によるフェリジニウムイオ
ンの接触還元および次いで電極で起るフェロセンの再酸
化に起因する。It was found that the proboscis (I) and ((I) act as mediators for the glucose oxidase enzyme reaction and that the current generated at the oxidation potential is amplified. This is due to catalytic reduction of the ion and then re-oxidation of ferrocene that occurs at the electrode.
450mVの一定電位における時間に対する電流の測定
を三電極系において行い、粗酸性ホスファターゼ溶液の
存在下にフェロセンのホスフェート基の加水分解を検出
する場合には化合物(■)(エタノール中50μM)8
μβおよびpH4,66の100mMクエン酸緩衝液中
のグルコース(I M > 50μβを使用し、最終容
積を400.dとした。実験中試料はすべてかきまぜた
。Current versus time measurements at a constant potential of 450 mV are carried out in a three-electrode system to detect the hydrolysis of the phosphate group of ferrocene in the presence of a crude acid phosphatase solution using compound (■) (50 μM in ethanol) 8
μβ and glucose in 100 mM citrate buffer at pH 4,66 (IM > 50 μβ were used, with a final volume of 400.d. All samples were stirred during the experiment.
次の4組について測定結果を記録した:(イ)化合物(
II)プラス グルコース、酸性ホスファターゼまたは
グルコースオキシダーゼはなし。Measurement results were recorded for the following four groups: (a) Compound (
II) Plus no glucose, acid phosphatase or glucose oxidase.
(ロ)(イ)と同じであるが、化合物(II)およびグ
ルコースを37℃で10分間温装した後に2mMグルコ
ースオキシダーゼ25μβを添加した。この温匿は酸性
ホスファターゼ添加後に起る電流の減少が化合物(IT
)溶液における分解(breakdown)に起因する
ものでないことを示すためであった。(b) Same as (a), except that compound (II) and glucose were incubated at 37° C. for 10 minutes, and then 25 μβ of 2 mM glucose oxidase was added. This preservation is due to the decrease in current that occurs after the addition of acid phosphatase.
) This was to show that this was not caused by breakdown in the solution.
(イ)と(ロ)との間には電流に明瞭な差異が認められ
、この差異はメディエータである化合物(II)を介し
て作用するオキシダーゼ酸累反応に起因する。A clear difference in current is observed between (a) and (b), and this difference is due to the oxidase acid accumulation reaction acting through the mediator compound (II).
(ハ)(ロ)と同じであるが、グルコースオキシダーゼ
添加前に10μβの粗酸性ホスファターセ溶液を化合物
(II)およびグルコースと共に37℃で10分間温コ
レた。(c) Same as (b), but before addition of glucose oxidase, 10 μβ crude acid phosphatase solution was warmed together with compound (II) and glucose at 37° C. for 10 minutes.
上述の(ロ)と比較して電流の減少が認められた。これ
は酸性オキシダーゼが化合物(n)に作用してそのメデ
ィエータ特性を変えたためである。A decrease in current was observed compared to (b) above. This is because acid oxidase acts on compound (n) to change its mediator properties.
(ニ)(ロ)と同じであるが、30μβの酸性ホスファ
ターゼ溶液を添加した。(d) Same as (b), but 30μβ acid phosphatase solution was added.
電流がさらに減少するのが認められた。これは酸性ホス
ファターゼ濃度と接触電流との間に逆比例の関係がある
ことを示す。A further decrease in current was observed. This indicates that there is an inverse relationship between acid phosphatase concentration and contact current.
(b)化合物(III)の使用
実験例7(a)と同様にして、化合物(III)に0.
114グルコースを加えたものの環状ポルタモグラムを
pH7,8において20mV /秒の走査速度を使用し
て測定し、第4図に示す曲線(a)、(b)および(C
)を1等だ。(b) Use of compound (III) In the same manner as in Experimental Example 7(a), compound (III) was added with 0.
The annular portamograms of the 114 glucose-loaded samples were measured at pH 7,8 using a scan rate of 20 mV/s and the curves (a), (b) and (C
) is the first prize.
曲線(a)、(b)および(C)はそれぞれ化合物(■
)、化合物(I)にアルカリ性ホスファターゼを加えて
から5分後、および化合物([[I)にアルカリ性ホス
ファターゼおよびグルコースオキシダーゼを加えたもの
に関するものである。この場合にも増幅は顕著であった
。Curves (a), (b) and (C) are for the compound (■
), 5 minutes after addition of alkaline phosphatase to compound (I), and for compound ([[I) plus alkaline phosphatase and glucose oxidase. Amplification was also significant in this case.
第1図は本発明の測定法の原理を説明する線図、第2図
は本発明方法の一例で得た180mVにおけるピーク電
流とホスファターゼ濃度との関係を示すグラフ、
第3図は本発明方法の池の例で得た180mVにおける
t市正済みピーク電流とエストリオール濃度との関係の
一例を示すグラフ、
第・′1図は本発明方法の池の例で得たボルフモダラム
を比較例と共に示す線図である。
Ab 抗体 E ホスファターゼ酵累G
OD グルコースオキシダーゼ
Mi メディエータ化合物
Mred /。8 メディエータ活性エストリオール
・屓2度(7+f/″J)Flo、3゜Figure 1 is a diagram explaining the principle of the measurement method of the present invention, Figure 2 is a graph showing the relationship between the peak current at 180 mV obtained by an example of the method of the present invention and the phosphatase concentration, and Figure 3 is the method of the present invention. A graph showing an example of the relationship between the t-corrected peak current at 180 mV obtained in the pond example and the estriol concentration. It is a line diagram. Ab Antibody E Phosphatase enzyme G
OD glucose oxidase Mi mediator compound Mred/. 8 Mediator active estriol, 2 degrees (7+f/″J) Flo, 3 degrees
Claims (1)
エータレベルを電気化学的に検出することにより、測定
の際に、測定に用いる標識酵素による、メディエータ作
用をしない化合物の有効メディエータへの転化を検出す
ることを特徴とする電気化学的酵素測定法。 2、免疫検定法である特許請求の範囲第1項記載の方法
。 3、エリザである特許請求の範囲第2項記載の方法。 4、電気化学的検出の際には、電極を、レドックス酵素
に対する基質の酸化還元電位と生成物の酸化還元電位と
の中間であって、電極に維持されている電位より低い酸
化還元電位を有する生成物のみが電極で酸化還元反応を
受けることができるような所定の電位に維持する特許請
求の範囲第1〜3項のいずれか一つの項に記載の方法。 5、レドックス基質がフェノール誘導体である特許請求
の範囲第1〜4項のいずれか一つの項に記載の方法。 6、標識酵素がホスファターゼである特許請求の範囲第
1〜5項のいずれか一つの項に記載の方法。 7、レドックス基質が次式( I ): ▲数式、化学式、表等があります▼( I ) で表される化合物である特許請求の範囲第5項記載の方
法。 8、標識酵素を使用して電気化学的酵素測定を行うに当
り、 レドックス酵素およびレドックス基質を使用し、メディ
エータ作用をしない基質が前記標識酵素によって無効メ
ディエータから前記レドックス酵素ト電極との間の電子
移動を媒介する有効メディエータに転化する結果として
前記標識酵素を電気化学的に検出することを特徴とする
電気化学的酵素測定法。 9、免疫検定法である特許請求の範囲第8項記載の方法
。 10、エリザである特許請求の範囲第9項記載の方法。 11、電気化学的検出の際には、電極を、レドックス酵
素に対する基質の酸化還元電位と生成物の酸化還元電位
との中間であって、電極に維持されている電位より低い
酸化還元電位を有する生成物のみが電極で酸化還元反応
を受けることができるような所定の電位に維持する特許
請求の範囲第8〜10項のいずれか一つの項に記載の方
法。 12、レドックス基質がフェノール誘導体である特許請
求の範囲第8〜11項のいずれか一つの項に記載の方法
。 13、標識酵素がホスファターゼである特許請求の範囲
第8〜12項のいずれか一つの項に記載の方法。 14、レドックス基質が次式( I ): ▲数式、化学式、表等があります▼( I ) で表される化合物である特許請求の範囲第12項記載の
方法。 15、第1酵素の活性を検出する系において、 a)前記第1酵素によってメディエータ活性を示す生成
物に転化することができて前記生成物の検出を可能にす
る自由に拡散する試薬と、 b)レドックス酵素、該レドックス酵素に対する基質、
および電極からなる検出手段とを備え、 活性形態の前記第1酵素の存在下に前記試薬が前記生成
物に転化し、検出可能な変化が前記電極への媒介された
電子移動中に生じるように構成したことを特徴とする第
1酵素の活性を検出する系。 16、生物電気化学的電池において、 測定に用いる標識酵素に対する基質が組込まれ、前記測
定に用いる標識酵素が前記基質を消費して前記生物化学
的電池からの出力に変化を生じさせることにより前記酵
素を検出できるように構成され、さらに前記基質のメデ
ィエータへの転化を介して電気出力を提供する第2酵素
反応系を備えることを特徴とする生物電気化学的電池。 17、一定電位に維持されている少なくとも1個の電極
の存在下に非レドックス酵素の活性を検出するに当り、 a)前記非レドックス酵素を含有すると思われる試料を
前記電極に維持されている電位より高い酸化還元電位を
有する試薬で処理し、この際前記試薬として、非レドッ
クス酵素に対する基質であって、前記レドックス酵素の
活性によってメディエータ活性を有しかつ前記電極に維
持されている電位より低い酸化還元電位を有する生成物
に転化することができる基質を使用し、 b)前記試料をレドックス酵素および該レドックス酵素
に対する基質で処理して、前記電極に維持されている電
位より低い酸化還元電位を有するメディエータ化合物の
存在下に前記電極への測定可能な電子移動を生じさせる
ことを特徴とする非レドックス酵素の活性を検出する方
法。[Claims] 1. When performing electrochemical enzyme measurements, by electrochemically detecting the mediator level using a redox enzyme and a redox substrate, the level of the mediator is detected by the labeled enzyme used in the measurement. , an electrochemical enzyme assay method characterized by detecting the conversion of a compound that does not act as a mediator into an effective mediator. 2. The method according to claim 1, which is an immunoassay method. 3. The method according to claim 2, which is ELISA. 4. For electrochemical detection, the electrode has a redox potential intermediate between the redox potential of the substrate and the redox potential of the product for the redox enzyme, but lower than the potential maintained at the electrode. 4. A method as claimed in any one of claims 1 to 3, in which a predetermined potential is maintained such that only the product can undergo a redox reaction at the electrode. 5. The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the redox substrate is a phenol derivative. 6. The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the labeling enzyme is a phosphatase. 7. The method according to claim 5, wherein the redox substrate is a compound represented by the following formula (I): ▲Mathematical formula, chemical formula, table, etc.▼(I). 8. When performing electrochemical enzyme measurement using a labeled enzyme, a redox enzyme and a redox substrate are used, and the substrate that does not act as a mediator is transferred from the ineffective mediator to the redox enzyme and the electrode by the labeled enzyme. An electrochemical enzyme assay method, characterized in that the labeled enzyme is electrochemically detected as a result of its conversion into an effective mediator that mediates migration. 9. The method according to claim 8, which is an immunoassay method. 10. The method according to claim 9, which is ELISA. 11. For electrochemical detection, the electrode has a redox potential intermediate between the redox potential of the substrate and the redox potential of the product for the redox enzyme, but lower than the potential maintained at the electrode. 11. A method as claimed in any one of claims 8 to 10, in which the product is maintained at a predetermined potential such that only the product can undergo a redox reaction at the electrode. 12. The method according to any one of claims 8 to 11, wherein the redox substrate is a phenol derivative. 13. The method according to any one of claims 8 to 12, wherein the labeling enzyme is a phosphatase. 14. The method according to claim 12, wherein the redox substrate is a compound represented by the following formula (I): ▲A mathematical formula, a chemical formula, a table, etc.▼(I). 15. A system for detecting the activity of a first enzyme, comprising: a) a freely diffusing reagent that can be converted by said first enzyme into a product exhibiting mediator activity, allowing said product to be detected; b) ) a redox enzyme, a substrate for the redox enzyme,
and a detection means consisting of an electrode, such that in the presence of the first enzyme in active form the reagent is converted to the product and a detectable change occurs during mediated electron transfer to the electrode. 1. A system for detecting the activity of a first enzyme, characterized in that the system is configured. 16. In a bioelectrochemical cell, a substrate for a labeled enzyme used in the measurement is incorporated, and the labeled enzyme used in the measurement consumes the substrate and causes a change in the output from the biochemical cell, thereby causing a change in the output from the biochemical cell. 1. A bioelectrochemical cell, further comprising a second enzymatic reaction system configured to detect said substrate and providing electrical output through conversion of said substrate to a mediator. 17. In detecting the activity of a non-redox enzyme in the presence of at least one electrode maintained at a constant potential, a) a sample suspected of containing said non-redox enzyme is placed at a potential maintained at said electrode; treatment with a reagent having a higher redox potential, wherein said reagent is a substrate for a non-redox enzyme which has mediator activity by the activity of said redox enzyme and which is lower than the potential maintained at said electrode. b) treating said sample with a redox enzyme and a substrate for said redox enzyme to have a redox potential lower than the potential maintained at said electrode; A method for detecting the activity of a non-redox enzyme, characterized in that in the presence of a mediator compound, a measurable electron transfer to said electrode occurs.
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB8527777 | 1985-11-11 | ||
GB858527777A GB8527777D0 (en) | 1985-11-11 | 1985-11-11 | Enzymic assay procedures |
GB8619113 | 1986-08-05 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS62167465A true JPS62167465A (en) | 1987-07-23 |
Family
ID=10588052
Family Applications (1)
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JP61266774A Pending JPS62167465A (en) | 1985-11-11 | 1986-11-11 | Electrochemical enzyme measuring method |
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JP (1) | JPS62167465A (en) |
GB (1) | GB8527777D0 (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2003014692A (en) * | 2001-06-25 | 2003-01-15 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | High sensitivity detection method of incretion disturbing substance and high sensitivity detector of incretion disturbing substance employing it |
-
1985
- 1985-11-11 GB GB858527777A patent/GB8527777D0/en active Pending
-
1986
- 1986-11-11 JP JP61266774A patent/JPS62167465A/en active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2003014692A (en) * | 2001-06-25 | 2003-01-15 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | High sensitivity detection method of incretion disturbing substance and high sensitivity detector of incretion disturbing substance employing it |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
GB8527777D0 (en) | 1985-12-18 |
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