JPS6216439A - Production of phosphatidylcholine - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To obtain easily in high yield the titled compound containing a highly unsaturated fatty acid by a simple reaction process, by decomposing egg york phospholipid, taking out selectively a highly unsaturated fatty acids as a raw material and reacting the fatty acids with glycerophosphorylcholine. CONSTITUTION:Egg york phospholipid is brought into contact with an alcohol containing a quaternary alkylammonium hydroxide such as tetrahydroammonium hydroxide, etc., subjected to alcoholysis and decomposed to give a composition containing glycerophosphorylcholine (GPC for short) and highly unsaturated fatty acids. The highly unsaturated fatty acids such as arachidonic acid, docosahexaenoic acid, etc., are taken out from the composition and they are reacted with GPC obtained by the decomposition, to give the aimed compound. EFFECT:Since egg york phospholipid is efficiently decomposed and resynthesized, the aimed compound effectively useful as drugs, foods, etc., having a clear structure and high physiologically active action is obtained.

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は高度不飽和脂肪酸を含有するホスファチジルコ
リン（以下、ＰＣと記す）の新しい製造方法に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION [Industrial Application Field] The present invention relates to a new method for producing phosphatidylcholine (hereinafter referred to as PC) containing highly unsaturated fatty acids.

〔従来の技術〕[Conventional technology]

リン脂質は細胞の生体膜の成分として存在しており、生
体膜では２分子構造を持った二重層膜を形成し、タンパ
ク質、コレステロール等とともに物質の透過１選択的輸
送等の生命現象に欠くことのできない機能を果している
。そして細胞に対して何らかの刺激が与えられると、リ
ン脂質からその結合した不飽和脂肪酸が遊離してプロス
タグランジン等の生理活性物質へと変換される。Phospholipids exist as components of biological membranes of cells, and in biological membranes, they form a bilayer membrane with a bimolecular structure, and together with proteins, cholesterol, etc., they are essential for biological phenomena such as selective transport of substances. It performs functions that cannot be performed. When some stimulus is applied to the cells, the bound unsaturated fatty acids are released from the phospholipids and converted into physiologically active substances such as prostaglandins.

生体中には主にＰＣ，ホスファチジルエタノールアミン
、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール
、スフィンゴミエリン等のリン脂質が存在し、このうち
ＰＣは一般にレシチンと呼ばれ、生体中に最も多く存在
し、特にその重要性が認められている。Phospholipids such as PC, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, and sphingomyelin mainly exist in living organisms. Among these, PC is generally called lecithin, and is the most abundant in living organisms, and its importance is particularly important. is recognized.

天然のリン脂質は工業的には、その界面活性作用を利用
して天然乳化剤として食品、化粧品業界等で利用される
一方、その生理活性作用を利用した医薬、健康食品への
展開が行われている。加えて最近リン脂質は水中で２分
子構造をとった２重層膜を持つリボソームと呼ばれる閉
鎖小胞体を形成することが知られ、その用途が種々考え
られている。たとえば医学、薬学分野においては薬剤運
搬体、人工血液等へ、また工学的分野においては人工細
胞への展開が考えられてい−る。Industrially, natural phospholipids are used as natural emulsifiers in the food and cosmetics industries by taking advantage of their surfactant properties, while they are also being used in pharmaceuticals and health foods by making use of their physiologically active properties. There is. In addition, it has recently been known that phospholipids form closed endoplasmic reticulum called ribosomes, which have a bilayer membrane in a bimolecular structure in water, and various uses for this are being considered. For example, in the medical and pharmaceutical fields, development is being considered into drug carriers, artificial blood, etc., and in the engineering field, development into artificial cells is being considered.

しかしながら、いずれの用途においても現在は天然リン
脂質が用いられており、リン脂質がその脂肪酸あるいは
そのリン酸基部に種々の組成を持った混合物であるため
、再現性が悪く、１ジン脂質本来の機能を工業的に応用
するに至っていない。However, natural phospholipids are currently used for both purposes, and because phospholipids are mixtures with various compositions in their fatty acids or phosphate groups, reproducibility is poor and the original phospholipid Its functions have not yet been applied industrially.

これらの用途に応用するために種々の試みがなされてい
る。たとえばリン脂質を薬剤運搬体用リポソームとして
用いるために、脂肪酸が明確なホスファチジルコリンで
あるジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレイル
ホスファチジルコリンなどが製造されている。Various attempts have been made to apply it to these uses. For example, in order to use phospholipids as liposomes for drug carriers, dipalmitoyl phosphatidylcholine, dioleyl phosphatidylcholine, etc., whose fatty acids are clearly phosphatidylcholines, are produced.

このようなＰＣの合成法としては全合成法、半合成力が
知られているが（Ｂａｅｒら、ＪＡＣＳ　６１　（４）
。Total synthesis method and semi-synthesis method are known as methods for synthesizing such PC (Baer et al., JACS 61 (4)
.

７６１　（１９３９）、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ
、　２３０．’　４４７　（１９５８）。761 (1939), J. Biol, Chew
, 230. '447 (1958).

ＪＡＣＳ　７２．９４２　（１９５０））、全合成法は
工程数が多く工業化は困難である。半合成法はグリセロ
ホスホリルコリン（以下、ＧＰＣと記す）と活性脂肪酸
とからＰＣを合成する方法であり、ＧＰＣとしてはカド
ミウム塩等の重金属塩を使用している。活性化脂肪酸と
しては、（１）脂肪酸を酸クロリド化して用いる方法（
Ｃａｎ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、
　３７゜９５３　（１９５９））、（２）脂肪酸をイミ
ダゾール塩として用いる方法（特開昭５１９１２１３．
　Ｃｈｅｍ、　Ｐｈｙｓ。JACS 72.942 (1950)), the total synthesis method requires a large number of steps and is difficult to industrialize. The semi-synthetic method is a method of synthesizing PC from glycerophosphorylcholine (hereinafter referred to as GPC) and active fatty acids, and a heavy metal salt such as a cadmium salt is used as GPC. Activated fatty acids include (1) a method of converting fatty acids into acid chlorides and using them (
Can, J., Biochem, Physiol,
37°953 (1959)), (2) Method of using fatty acids as imidazole salts (Japanese Patent Application Laid-Open No. 5191213.
Chem, Phys.

Ｌｉｐｉｄｓ　１９８１．２８．１１１）、および（３
）脂肪酸を酸無水物として用いる方法（Ｒｅｇｅｎら、
ＪＡＣＳ　（１９８２）。Lipids 1981.28.111), and (3
) A method using fatty acids as acid anhydrides (Regen et al.
JACS (1982).

１０４、７９１）などが知られている。104, 791), etc. are known.

このうち酸クロリドを用いる方法は脂肪酸をチオニルク
ロリド等でクロリド化するとき二重結合が塩素化される
可能性がある。イミダゾール塩を用いる方法はイミダゾ
ール化試薬が高価な上に金属ナトリウムの使用など不便
なことが多い。これらに比較して酸無水物を原料に用い
る方法は合成がマイルドであり、副生成物も少ない。ま
た穏やかな酸無水物化法としてはＮ、Ｎ’−ジシクロヘ
キシルカルボジイミドを用いる方法（Ｒｉｎｇｓｄｏｒ
ｆら。Among these methods, in the method using acid chloride, double bonds may be chlorinated when fatty acids are chloridized with thionyl chloride or the like. Methods using imidazole salts are often inconvenient, such as the imidazolization reagent being expensive and the use of metallic sodium. Compared to these methods, methods using acid anhydrides as raw materials require milder synthesis and produce fewer by-products. In addition, as a mild acid anhydride method, a method using N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (Ringsdor et al.
f et al.

ＪＡＣＳ　（１９８４）月頃、　１６２７）、エチルク
ロロホルメートを用いる方法（Ｒａｇｅｎら、ＪＡＣＳ
　（１９８２）、　１０４゜７９１）などが知られてい
る。JACS (1984), 1627), method using ethyl chloroformate (Ragen et al., JACS
(1982), 104°791) are known.

〔発明が解決しようとする問題点〕[Problem that the invention seeks to solve]

以上のような方法により構造明確なホスファチジルコリ
ンを脂肪酸およびＧＰＣから合成することができるが、
従来はパルミチン酸、オレイン酸等の入手しやすい脂肪
酸を原料とする場合に限られていた。生理活性作用を持
った脂肪酸として。Although phosphatidylcholine with a clear structure can be synthesized from fatty acids and GPC by the method described above,
Conventionally, it was limited to cases where easily available fatty acids such as palmitic acid and oleic acid were used as raw materials. As a fatty acid with bioactive effects.

リノール酸、γ−リルン酸、ジホモ−γ−リルン酸、ア
ラキドン酸（以下、ＡＡと記す）、エイコサペンタエン
酸、ドコサヘキサエン酸（以下、ＤＭＡと記す）などの
不飽和脂肪酸があり、これらの脂肪酸を原料とすると生
理活性作用をもすＰＣを製造することができるが、これ
らの脂肪酸はリノール酸を除いて天然には少なく、そこ
から分離するには非常に困難なものが多い。特にＡＡは
２型プロスタグランジンの前駆体となる生体にとって非
常に重要な脂肪酸であるが、ＡＡをはじめとする高度不
飽和脂肪酸は生体内においてはリン脂質などの極性脂質
に主に含まれており、これらの脂肪酸を含んだリン脂質
を純度よく取り出すことは困難である。There are unsaturated fatty acids such as linoleic acid, γ-lylunic acid, dihomo-γ-lylunic acid, arachidonic acid (hereinafter referred to as AA), eicosapentaenoic acid, and docosahexaenoic acid (hereinafter referred to as DMA). When used as a raw material, it is possible to produce PC that has physiologically active effects, but these fatty acids, with the exception of linoleic acid, are rare in nature and are often very difficult to separate from them. In particular, AA is a very important fatty acid for living organisms as it is a precursor of type 2 prostaglandin, but polyunsaturated fatty acids including AA are mainly contained in polar lipids such as phospholipids in living organisms. Therefore, it is difficult to extract phospholipids containing these fatty acids with high purity.

従来このような脂肪酸のうちγ−リルン酸は月見草油か
ら、エイコサペンタエン酸およびＤＨＡは魚油から、Ａ
Ａは血液、肝臓などから得られてきたが、複雑な工程を
必要とし、ＰＣの原料とするには難点があった。またこ
れらの中でＡＡは特にその資源が少なく、しかも純粋な
ものを取り出すのは非常に困難であった。Conventionally, among these fatty acids, γ-lylunic acid has been obtained from evening primrose oil, eicosapentaenoic acid and DHA have been obtained from fish oil, and A
A has been obtained from blood, liver, etc., but it requires a complicated process and is difficult to use as a raw material for PC. Furthermore, among these, AA resources are particularly scarce, and it is extremely difficult to extract pure AA.

従って従来は生理活性作用を有する高度不飽和脂肪酸を
原料として、生理活性作用の高いｐｃを工業的に製造す
ることは困難であるという問題点があった。Therefore, there has been a problem in the past that it has been difficult to industrially produce PC with high physiological activity using polyunsaturated fatty acids that have bioactive activity as raw materials.

〔問題点を解決するための手段〕[Means for solving problems]

この発明は上記問題点を解消するためのもので、卵黄リ
ン脂質から高度不飽和脂肪酸を取り出してＰＣの原料と
することにより、容易に高度不飽和脂肪酸を利用でき、
生理活性作用の高いｐｃを簡車な工程で高収率に得るこ
とができるＰＣの製造方法を提案することを目的として
いる。This invention is intended to solve the above problems, and by extracting highly unsaturated fatty acids from egg yolk phospholipids and using them as raw materials for PC, highly unsaturated fatty acids can be easily utilized.
The purpose of this study is to propose a method for producing PC that can produce PC with high bioactivity in a simple process and in high yield.

この発明は、卵黄リン脂質を分解し、得られた高度不飽
和脂肪酸含有組成物から高度不飽和脂肪酸を選択的に取
り出し、これをグリセロホスホリルコリンと反応させる
ことを特徴とするホスファチジルコリンの製造方法であ
る。This invention is a method for producing phosphatidylcholine, which comprises decomposing egg yolk phospholipids, selectively extracting polyunsaturated fatty acids from the resulting polyunsaturated fatty acid-containing composition, and reacting the polyunsaturated fatty acids with glycerophosphorylcholine. .

本発明ではまず卵黄リン脂質を分解して高度不飽和脂肪
酸含有組成物を得る。卵黄リン脂質は卵黄から得られる
リン脂質で、卵黄レシチンなどがある。卵黄リン脂質は
粗のものを使用してもよいが、分離精製によりリン脂質
の純度を高めるのが好ましい。卵黄リン脂質の分離精製
はシリカゲルカラム、活性アルミナカラム等を用い、ク
ロロホルム／メタノール系混合溶媒等で溶出させて行わ
れる。In the present invention, first, egg yolk phospholipids are decomposed to obtain a highly unsaturated fatty acid-containing composition. Egg yolk phospholipids are phospholipids obtained from egg yolks, and include egg yolk lecithin. Although crude egg yolk phospholipids may be used, it is preferable to increase the purity of the phospholipids by separation and purification. Separation and purification of egg yolk phospholipids is carried out using a silica gel column, activated alumina column, etc., and elution with a chloroform/methanol mixed solvent.

卵黄リン脂質の分解は一般にＧＰＣの製造のために行わ
れている操作と同様であり、卵黄リン脂質を分解してＧ
ＰＣを製造すると、一方で高度不飽和脂肪酸であるＡＡ
およびＤＨＡを含む組成物が得られる。卵黄リン脂質の
分解は、テトラブチルアンモニウムヒドロキサイド等の
４級アルキルアンモニウム水酸化物あるいはアルカリ金
属などを含むアルコールと接触させてアルコリーシスし
、脂肪酸エステル組成物として分離すると、ＧＰＣとの
分離が容易で好ましい。また卵黄リン脂質を低濃度のア
／１４カリ等で穏やかに加水分解してもよい。The decomposition of egg yolk phospholipids is similar to the operation generally performed for the production of GPC.
When producing PC, on the other hand, AA, which is a highly unsaturated fatty acid,
and a composition containing DHA is obtained. The decomposition of egg yolk phospholipids can be carried out by bringing them into contact with quaternary alkyl ammonium hydroxides such as tetrabutylammonium hydroxide or alcohols containing alkali metals, resulting in alcoholysis and separating them as fatty acid ester compositions, which can be easily separated from GPC. preferable. Alternatively, egg yolk phospholipids may be gently hydrolyzed with a low concentration of A/14 potash.

こうして得られる組成物はＡＡ、ＤＨＡ等の高度不飽和
脂肪酸以外の成分を含むので、ＡＡ、ＤＨＡ等の高度不
飽和脂肪酸を濃縮して選択的に取出し、ｐｃ製造の原料
とする６ 卵黄リン脂質から高度不飽和脂肪酸を得る好ましい方法
は、まず精製卵黄リン脂質ををメタノール中にて上記方
法によりアルコリーシスし、脂肪酸メチルエステルを得
る。次いでメチルエステルを尿素付加し高度不飽和脂肪
酸混合メチルエステルを得る。次いでオクタデシルシラ
ンまたはスチレン−ジビニルベンゼン樹脂を充てんした
高速液体クロマトグラフィカラムで分離し、次いでけん
化後脂肪酸塩を酸で脂肪酸に戻すことにより高純度のＡ
ＡおよびＤＨＡを得る。Since the composition obtained in this way contains components other than highly unsaturated fatty acids such as AA and DHA, the highly unsaturated fatty acids such as AA and DHA are concentrated and selectively extracted and used as raw materials for PC production.6 Egg yolk phospholipid A preferred method for obtaining highly unsaturated fatty acids is to first alcoholyze purified egg yolk phospholipids in methanol by the method described above to obtain fatty acid methyl esters. Next, urea is added to the methyl ester to obtain a highly unsaturated fatty acid mixed methyl ester. High-purity A is then separated by a high performance liquid chromatography column filled with octadecylsilane or styrene-divinylbenzene resin, and then the fatty acid salt is returned to fatty acid with acid after saponification.
A and DHA are obtained.

こうして得られるＡＡおよびＤＨＡはそれぞれｐｃ製造
の原料として使用できる。AA and DHA thus obtained can each be used as raw materials for PC production.

本発明の他の原料であるＧＰＣは合成される高度不飽和
脂肪酸含有ホスファチジルコリンの骨格となるもので、
前記卵黄リン脂質分解に際して生成するＧＰＣを使用す
るのが好ましい。すなわち卵黄リン脂質を分解して高度
不飽和脂肪酸含有組成物を得ると、一方でＧＰＣが生成
するため、これをｐｃ製造の原料として使用すると、効
率よくＰＣの製造を行うことができる。ＧＰＣはベンゼ
ン、クロロホルム等の非極性溶媒には不溶であるので、
生成した高度不飽和脂肪酸エステル組成物から容易に分
離することができる。またＧＰＣは大豆等の他のリン脂
質から得たものを使用してもよい。GPC, which is another raw material of the present invention, becomes the skeleton of the highly unsaturated fatty acid-containing phosphatidylcholine to be synthesized.
It is preferable to use GPC generated during the decomposition of the egg yolk phospholipid. That is, when egg yolk phospholipids are decomposed to obtain a highly unsaturated fatty acid-containing composition, GPC is produced, so if this is used as a raw material for PC production, PC can be produced efficiently. Since GPC is insoluble in nonpolar solvents such as benzene and chloroform,
It can be easily separated from the produced highly unsaturated fatty acid ester composition. Furthermore, GPC obtained from other phospholipids such as soybean may also be used.

以上により得られた高度不飽和脂肪酸とＧＰＣは従来法
と同様の方法により反応させて高度不飽和脂肪酸含有ｐ
ｃを製造する。この場合、高度不飽和脂肪酸は活性化脂
肪酸としてＧＰＣと反応させる。The polyunsaturated fatty acid and GPC obtained above were reacted with the polyunsaturated fatty acid containing polyunsaturated fatty acid by the same method as the conventional method.
Manufacture c. In this case, the highly unsaturated fatty acid is reacted with GPC as an activated fatty acid.

活性化脂肪酸としては脂肪酸の無水物、クロル化物、ま
たはイミダゾール化物などがあるが、本発明における高
度不飽和脂肪酸の場合は無水物が好ましい。この場合、
Ｎ、Ｎ’−ジシクロへキシルカルボジイミドなどのカル
ボジイミド系縮合剤を用い、穏やかに無水物を合成する
のが好ましい。Activated fatty acids include anhydrides, chlorides, and imidazolates of fatty acids, and in the case of highly unsaturated fatty acids in the present invention, anhydrides are preferred. in this case,
It is preferable to synthesize the anhydride gently using a carbodiimide condensing agent such as N,N'-dicyclohexylcarbodiimide.

高度不飽和脂肪酸無水物を用いてｐｃを製造すると１合
成がマイルドで、副生成物も少ない。When PC is produced using highly unsaturated fatty acid anhydrides, the synthesis process is mild and there are fewer by-products.

ＧＰＣはカドミウムなどの金属塩として、あるいはセラ
イト、活性炭、活性白土、樹脂等の担体に吸着または含
浸させて反応に用いる。カドミウム塩はＧＰＣを塩化カ
ドミウムと反応させ、エタノールで再結晶して得られる
（例えばＣｈｅｍ、　Ｐｈｙ。GPC is used in the reaction as a metal salt such as cadmium, or by being adsorbed or impregnated onto a carrier such as celite, activated carbon, activated clay, or resin. Cadmium salts can be obtained by reacting GPC with cadmium chloride and recrystallizing from ethanol (for example, Chem, Phy.

Ｌｉｐｉｄｓ　４　（１９７０）　１０４．参照）。Ｇ
ＰＣを担体に吸着または含浸させるには、ＧＰＣをメタ
ノール等の適当な溶媒に溶解して担体と接触させ、エバ
ポレーター等で溶媒を除くことにより可能である。Lipids 4 (1970) 104. reference). G
PC can be adsorbed or impregnated into a carrier by dissolving GPC in a suitable solvent such as methanol, bringing it into contact with the carrier, and removing the solvent using an evaporator or the like.

好ましいＰＣの製造方法はＧＰＣ金属塩あるいは担体に
吸着または含浸させたＧＰＣと高度不飽和脂肪酸無水物
とをジクロロメタン等の乾燥溶媒中で触媒の存在下反応
させる方法であり、これによりｐｃが製造される。A preferred method for producing PC is a method in which GPC adsorbed or impregnated on a GPC metal salt or carrier and a highly unsaturated fatty acid anhydride are reacted in the presence of a catalyst in a dry solvent such as dichloromethane, whereby PC is produced. Ru.

反応に使用する触媒はＧＰＣと活性化脂肪酸とを反応さ
せてＰＣを生成させるための触媒であり、二重結合の移
動やＰＣの異性化を生じさせない穏やかなものが好まし
く、例えば、脂肪酸無水物の場合は４−ジメチルアミノ
ピリジン、またはピロリジノピリジン、クロル化物の場
合はピリジン、イミダゾール化物の場合は金属ナトリウ
ムなどがある。The catalyst used in the reaction is a catalyst for producing PC by reacting GPC with activated fatty acids, and is preferably a mild catalyst that does not cause movement of double bonds or isomerization of PC, such as fatty acid anhydride. In the case of 4-dimethylaminopyridine or pyrrolidinopyridine, in the case of a chloride, pyridine, and in the case of an imidazolate, metal sodium etc. are used.

反応に使用する溶媒は上記各成分を溶解または分散でき
るものであればよく、たとえばジクロロメタン、クロロ
ホルム、四塩化炭素、ベンゼン、トルエン、ヘキサン等
が使用できる。これらの溶媒は乾燥して用いるのが好ま
しい。The solvent used in the reaction may be any solvent as long as it can dissolve or disperse the above components, such as dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, benzene, toluene, hexane, etc. It is preferable to use these solvents after drying.

上記の反応生成物は高速液体クロマトグラフィまたはオ
ープンカラムで精製され、高純度高度不飽和脂肪酸ｐｃ
が得られる。The above reaction product is purified by high performance liquid chromatography or open column, and is purified with high purity highly unsaturated fatty acid PC.
is obtained.

以上によって得られるＰＣは構造が明確な高度不飽和脂
肪酸を含有するもので、生理活性作用および再現性が高
い。例えばＡＡは生体内においてほとんどリン脂質部に
結合しており、リン脂質はホスホリパーゼの作用を受け
てＡＡを放出し、ＡＡはプロスタグランジンに変換され
、生体内で非常に重要な機能を果している。医薬的にＡ
Ａを用いる場合もリン脂質の形態で用いるのが好ましい
とされており、本発明において製造されるＰＣは　゛こ
のような使用に適したものである。ＤＨＡも高い生理活
性作用を有しており、本発明ではこれをＰＣの形態で利
用するため、医薬１食品などとしての利用価値が高い。The PC obtained as described above contains highly unsaturated fatty acids with a clear structure, and has high physiological activity and reproducibility. For example, AA is mostly bound to phospholipids in living organisms, and phospholipids release AA under the action of phospholipase, and AA is converted to prostaglandins, which play a very important function in living organisms. . Pharmaceutically A
When using A, it is said to be preferable to use it in the form of a phospholipid, and the PC produced in the present invention is suitable for such use. DHA also has a high physiological activity, and since it is used in the form of PC in the present invention, it has high utility value as a medicine, food, etc.

本発明では卵黄リン脂質から高度不飽和脂肪酸を取り出
すので、容易に高度不飽和脂肪酸を得ることができ、リ
ン脂質分解に際して得るＧＰＣはそのまま一方の原料と
して利用することができ。In the present invention, highly unsaturated fatty acids are extracted from egg yolk phospholipids, so highly unsaturated fatty acids can be easily obtained, and GPC obtained during phospholipid decomposition can be used as is as one of the raw materials.

反応工程を簡素化して構造明確な高度不飽和脂肪酸含有
ＰＣを高収率で得ることができる。By simplifying the reaction process, polyunsaturated fatty acid-containing PC with a well-defined structure can be obtained in high yield.

〔発明の効果〕〔Effect of the invention〕

以上のとおり、本発明によれば、卵黄リン脂質を効率よ
く分解−再合成するようにしたので、構造が明確で生理
活性作用の高い高度不飽和脂肪酸含有ｐｃを簡単な反応
工程によ、す、容易かつ高収率で得ることができ、医薬
、食品などとして効果的に用いることができる。As described above, according to the present invention, egg yolk phospholipids are efficiently decomposed and resynthesized, so PC containing polyunsaturated fatty acids with a clear structure and high physiological activity can be produced through a simple reaction process. can be obtained easily and in high yield, and can be effectively used as medicines, foods, etc.

〔実施例〕〔Example〕

以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明する。実
施例中１％は重量％を示す。Hereinafter, the present invention will be specifically explained based on Examples. In the examples, 1% indicates weight %.

実施例１ 市販卵黄レシチン５０ｇを５００ｍ　Ｑのベンゼンに溶
解し、攪拌しつつテトラブチルアンモニウムヒドロキサ
イド１０％メタノール溶液５０ｇを加えた。沈殿が析出
し始めてから３０分間攪拌を続け、その後３０分静置し
た。底に沈殿した粗ＧＰＣをデカンテーションで回収し
、ベンゼンで洗浄した０次いで−２０℃に冷却したアセ
トン５００＋ａ　Ｑに、メタノールに溶解した粗ＧＰＣ
を投入し、沈殿を得た。これらの操作をくり返し、エス
テルおよび未分解ＰＣを含まない粗ＧＰＣを得た。この
ＧＰＣをメタノールに溶解し、不溶分を遠心分離により
除いた。Example 1 50 g of commercially available egg yolk lecithin was dissolved in 500 mQ of benzene, and 50 g of a 10% methanol solution of tetrabutylammonium hydroxide was added while stirring. Stirring was continued for 30 minutes after precipitation started, and then left to stand for 30 minutes. The crude GPC precipitated at the bottom was collected by decantation and washed with benzene.
was added to obtain a precipitate. These operations were repeated to obtain crude GPC free of ester and undecomposed PC. This GPC was dissolved in methanol, and insoluble matter was removed by centrifugation.

上澄をエバポレーションし、１４．８　ｇの粗ＧＰＣを
得た。この粗ＧＰＣをメタノール＆５．２　ｇに溶解し
。The supernatant was evaporated to obtain 14.8 g of crude GPC. This crude GPC was dissolved in 5.2 g of methanol.

粗ＧＰＣメタノール溶液１００　ｇを得た。100 g of crude GPC methanol solution was obtained.

同時に得られた脂肪酸メチルエステル含有ベンゼン溶液
を濃縮し、３３．８　ｇの脂肪酸メチルエステルを得た
。この脂肪酸メチルエステルの脂肪酸組成はパルミチン
酸２９．２％、パルミトオレイン酸１．５％、ステアリ
ン酸１４．２％、オレイン酸２６．６％、リノール酸１
３．８％、ＡＡ６．４％、ＤＨＡ６．７％、その他２．
４％であった。The fatty acid methyl ester-containing benzene solution obtained at the same time was concentrated to obtain 33.8 g of fatty acid methyl ester. The fatty acid composition of this fatty acid methyl ester is 29.2% palmitic acid, 1.5% palmitoleic acid, 14.2% stearic acid, 26.6% oleic acid, and 1 linoleic acid.
3.8%, AA6.4%, DHA6.7%, other 2.
It was 4%.

この混合脂肪酸メチルエステルをメタノールに溶解し、
尿素５０ｇを飽和させたメタノール溶液に加えた。１時
間かくはんし、析出した結晶をろ別した。ろ液に尿素３
５ｇを加え、４５℃に加温して溶解させた１次いで徐々
に冷却して結晶を析出させ、結晶をろ別してろ液を得た
。ろ液を濃縮し、７．９ｇのメチルエステルを得た。こ
のメチルエステルの脂肪酸組成はパルミトオレイン酸２
．０％、オレイン酸１５．６％、リノール酸２０．９％
、ＡＡ　２３．７％、ＤＨＡ　２５．４％、その他１２
．４％であった。Dissolve this mixed fatty acid methyl ester in methanol,
50 g of urea was added to the saturated methanol solution. The mixture was stirred for 1 hour, and the precipitated crystals were filtered off. Urea 3 in the filtrate
5 g was added and dissolved by heating to 45°C. Then, the mixture was gradually cooled to precipitate crystals, and the crystals were filtered to obtain a filtrate. The filtrate was concentrated to obtain 7.9 g of methyl ester. The fatty acid composition of this methyl ester is palmitoleic acid 2
．． 0%, oleic acid 15.6%, linoleic acid 20.9%
, AA 23.7%, DHA 25.4%, other 12
．． It was 4%.

このＡＡ、ＤＨＡ高含有メチルエステルを高速分取液体
クロマトグラフィにより分離、精製しＡＡおよびＤＨＡ
の純品を得た。すなわちカラム充てん剤としてスチレン
−ジビニルベンゼン共重合体ハイポーラスポリマーゲル
、溶離液としてメタノールを用い分離精製することによ
り、ＡＡメチルエステル１．４ｇおよびＤＨＡメチルエ
ステル１．５ｇを得た。This AA and DHA-rich methyl ester was separated and purified by high-performance preparative liquid chromatography.
I got a pure product. That is, 1.4 g of AA methyl ester and 1.5 g of DHA methyl ester were obtained by separation and purification using a styrene-divinylbenzene copolymer high porous polymer gel as a column packing material and methanol as an eluent.

以上により得られた粗ＧＰＣメタノール溶液１００ｇを
、乾燥した市販スチレン−ジビニルベンゼン樹脂（ビー
ズ状）　１００ｇに加え、エバポレーター中でメタノー
ルを除きつつ、粗ＧＰＣを上記樹脂に含浸させた。次い
でベンゼンを加え、減圧上共沸脱水し、完全に水分とメ
タノールを除いた。この粗Ｇ　Ｐ　Ｃ１２，９％含浸樹
脂と上記ＡＡを反応させ、１．２−ジアラキドイルホス
ファチジルコリンを得た。すなわちＡＡメチルエステル
１．４ｇをメタノール性ＫＯＨで常法に従い加水分解し
、ＨＣｆｉで酸に戻すことによりＡＡ　１．２ｇを得、
これをジシクロヘキシルカルボジイミド０．８９　ｇ、
４−ジメチルアミノピリジン０．１６ｇおよび上記粗Ｇ
ＰＣ含浸樹脂２ｇとジクロロメタン中で、窒素雰囲気下
かくはんしつつ室温で４８時間反応させた。反応終了後
反応混合物ろ別し、析出物および樹脂をよくジクロロメ
タンで洗浄した。洗浄液とる液を合わせ、メタノールで
希釈してイオン交換樹脂アンバーライト（ローム・アン
ド・ハース社製、ｉｌｍ）２００Ｃのカラムに通し、４
−ジメチルアミノピリジンを除いた。流出液を濃縮し、
シリカゲルカラムで溶出剤としてクロロホルム／メタノ
ール／水＝６５／２５／４を用いて精製することにより
、１，２−ジアラキドイルホスファチジルコリン０．３
９　ｇを得た。このＰＣを薄層クロマトグラフィで分析
したところ。100 g of the crude GPC methanol solution obtained above was added to 100 g of dried commercially available styrene-divinylbenzene resin (in the form of beads), and while methanol was removed in an evaporator, the crude GPC was impregnated into the resin. Next, benzene was added and azeotropic dehydration was performed under reduced pressure to completely remove water and methanol. This crude G P C12.9% impregnated resin was reacted with the above AA to obtain 1,2-diarachidoylphosphatidylcholine. That is, 1.4 g of AA methyl ester was hydrolyzed with methanolic KOH according to a conventional method, and 1.2 g of AA was obtained by returning it to acid with HCfi.
This was mixed with 0.89 g of dicyclohexylcarbodiimide,
0.16 g of 4-dimethylaminopyridine and the above crude G
The mixture was reacted with 2 g of the PC-impregnated resin in dichloromethane at room temperature for 48 hours with stirring under a nitrogen atmosphere. After the reaction was completed, the reaction mixture was filtered, and the precipitate and resin were thoroughly washed with dichloromethane. Combine the washing solution and the solution, dilute with methanol, and pass through a column of ion exchange resin Amberlite (ILM, manufactured by Rohm and Haas) 200C.
-Dimethylaminopyridine was removed. Concentrate the effluent;
By purifying with a silica gel column using chloroform/methanol/water = 65/25/4 as the eluent, 1,2-diarachidoylphosphatidylcholine 0.3
9 g was obtained. This PC was analyzed by thin layer chromatography.

ワンスポットで標準１，２−ジアラキドイルホスファチ
ジルコリンのＲｆ値と一致した（展開剤クロロホルム／
メタノール／水＝６５／２５／４）。One spot matched the Rf value of standard 1,2-diarachidoylphosphatidylcholine (developing agent chloroform/
methanol/water = 65/25/4).

実施例２ 実施例１と同様にしてＡＡ、ＤＨＡ高含有メチルエステ
ル１ｓ、３ｇｊ市販卵黄レシチン１００ｇがら得た。こ
のメチルエステルをオクタデシルシラン型シリカゲルカ
ラムを備えた高速分取液体クロマトグラフィにより、溶
離液としてメタノールを用いて分離、精製することによ
り、ＡＡメチルエステル２．７ｇ、およびＤＨＡメチル
エステル２．９ｇを得た。そして実施例１と同様に処理
しＡＡ２．３ｇおよびＤＭＡ２．５ｇを得た。Ｓ：（７
）ＤＨＡ　２．５ｇ、ジシクロへキシルカルボジイミド
１．７ｇ、４−ジメチルアミノピリジン０．３１　ｇお
よび実施例１と同様にして得た粗ＧＰＣ含浸樹脂３．８
ｇをジクロロメタン中で実施例１と同様に反応、精製し
、１，２−シトコサへキサエノイルホスファチジルコリ
ン０．８４　ｇを得た。このＰＣを薄層クロマトグラフ
ィで分析したところワンスポットで標準１，２−シリル
イルホスファチジルコリンのＲｆ値と一致した（展開剤
クロロホルム／メタノール／水＝６５／２５／４）。Example 2 In the same manner as in Example 1, 100 g of commercially available egg yolk lecithin containing AA and DHA-rich methyl ester 1s and 3gj was obtained. This methyl ester was separated and purified by high-performance preparative liquid chromatography equipped with an octadecylsilane type silica gel column using methanol as an eluent to obtain 2.7 g of AA methyl ester and 2.9 g of DHA methyl ester. . Then, it was treated in the same manner as in Example 1 to obtain 2.3 g of AA and 2.5 g of DMA. S: (7
) 2.5 g of DHA, 1.7 g of dicyclohexylcarbodiimide, 0.31 g of 4-dimethylaminopyridine, and 3.8 g of crude GPC-impregnated resin obtained in the same manner as in Example 1.
g was reacted and purified in dichloromethane in the same manner as in Example 1 to obtain 0.84 g of 1,2-cytocosahexaenoylphosphatidylcholine. When this PC was analyzed by thin layer chromatography, the Rf value in one spot matched that of standard 1,2-silylylphosphatidylcholine (developing agent chloroform/methanol/water = 65/25/4).

実施例３ 実施例２で得たＡＡ２．３ｇをジシクロへキシルカルボ
ジイミド１．７ｇ、４−ジメチルアミノピリジン０．３
１　ｇおよびＧ　Ｐ　Ｃ−ＣｄＣｆ１２錯体（シグマ社
製）０．８３　ｇを、乾燥クロロホルム中で窒素雰囲気
下かくはんしつつ室温で４８時間反応させた。反応終了
後反応混合物をろ別し、析出物をよくクロロホルムで洗
浄した。洗浄液とる液を合わせメタノールで希釈して、
アンバーライトＩＲＣ−５０、アンバーライトＩＲＡ−
４５の混合樹脂カラムおよびアンバーライト２００Ｃの
カラムに通し、残存塩化カドミウムと４−ジメチルアミ
ノピリジンを除いた。Example 3 2.3 g of AA obtained in Example 2 was mixed with 1.7 g of dicyclohexylcarbodiimide and 0.3 g of 4-dimethylaminopyridine.
1 g and 0.83 g of G P C-CdCf12 complex (manufactured by Sigma) were reacted in dry chloroform at room temperature for 48 hours with stirring under a nitrogen atmosphere. After the reaction was completed, the reaction mixture was filtered and the precipitate was thoroughly washed with chloroform. Combine the cleaning solution and the solution, dilute with methanol,
Amberlight IRC-50, Amberlight IRA-
The mixture was passed through a No. 45 mixed resin column and an Amberlite 200C column to remove residual cadmium chloride and 4-dimethylaminopyridine.

流出液を濃縮し、実施例１と同様に精製して１゜２−ジ
アラキドイルホスファチジルコリン１．１　ｇを得た。The effluent was concentrated and purified in the same manner as in Example 1 to obtain 1.1 g of 1.2-diarachidoylphosphatidylcholine.

このＰＣを薄層クロマトグラフィで分析したところ、ワ
ンスポットでａｍｌ、２−ジアラキドイルホスファチジ
ルコリンのＲｆ値と一致した（展開剤クロロホルム／メ
タノール／水＝６５／２５／４）。When this PC was analyzed by thin layer chromatography, the Rf value coincided with that of aml, 2-diarachidoylphosphatidylcholine in one spot (developing agent chloroform/methanol/water = 65/25/4).

実施例４ 実施例１で得られた粗ＧＰＣ含浸樹脂１０ｇ、ジシクロ
へキシルカルボジイミド４．６ｇ、４−ジメチルアミノ
ピリジン０．８１　ｇおよびパルミチン酸５．１ｇをジ
クロロメタン中で４８時間室温で反応させ、実施例１と
同様に分離、精製し、１，２−ジパルミトイルホスファ
チジルコリン１．９ｇを得た。この１゜２−ジパルミト
イルホスファチジルコリンを常法に従い蛇毒ホスホリパ
ーゼＡ２で分解し、シリカゲルカラムを用い、溶出剤と
してクロロホルム／メタノール／水＝６／４／１で分離
、精製し１−バルミトイル−リゾホスファチジルコリン
１．０　ｇを得た。このリゾＰＣ０，５０ｇに実施例１
と同様にして得たＡＡ　０．６１ｇ、ジシクロへキシル
カルボジイミド０．４６　ｇおよび４−ジメチルアミノ
ピリジン０．０８２９ｇを加え、ジクロロメタン中で窒
素雰囲下室温で４８時間反応させ、実施例１と同様に分
離、精製し、１−バルミトイル−２−アラキトイルホス
ファチジルコリン０．６４　ｇを得た。このＰＣを薄層
クロマトグラフィで分析したところ、ワンスポットで標
１１！１−バルミトイルー２−アラキトイルホスファチ
ジルコリンのＲｆ値として一致した（展開剤クロロホル
ム／メタノール／水＝６５／２５／４）。Example 4 10 g of the crude GPC-impregnated resin obtained in Example 1, 4.6 g of dicyclohexylcarbodiimide, 0.81 g of 4-dimethylaminopyridine and 5.1 g of palmitic acid were reacted in dichloromethane for 48 hours at room temperature, Separation and purification were carried out in the same manner as in Example 1 to obtain 1.9 g of 1,2-dipalmitoyl phosphatidylcholine. This 1゜2-dipalmitoylphosphatidylcholine was decomposed with snake venom phospholipase A2 according to a conventional method, and separated and purified using a silica gel column with chloroform/methanol/water = 6/4/1 as an eluent. .0 g was obtained. Example 1 to 0.50g of this Rizo PC
0.61 g of AA obtained in the same manner as in Example 1, 0.46 g of dicyclohexylcarbodiimide and 0.0829 g of 4-dimethylaminopyridine were added, and the mixture was reacted in dichloromethane at room temperature under a nitrogen atmosphere for 48 hours. The mixture was separated and purified to obtain 0.64 g of 1-valmitoyl-2-arachitoylphosphatidylcholine. When this PC was analyzed by thin layer chromatography, the Rf value coincided with that of the standard 11!1-valmitoyl-2-arachitoylphosphatidylcholine in one spot (developing agent chloroform/methanol/water = 65/25/4).

上記実施例１〜４により製造されたホスファチジルコリ
ンの元素分析値を表１に示す。Table 1 shows the elemental analysis values of the phosphatidylcholines produced in Examples 1 to 4 above.

表１Table 1

Claims (3)

【特許請求の範囲】[Claims] （１）卵黄リン脂質を分解し、得られた高度不飽和脂肪
酸含有組成物から高度不飽和脂肪酸を選択的に取り出し
、これをグリセロホスホリルコリンと反応させることを
特徴とするホスファチジルコリンの製造方法。(1) A method for producing phosphatidylcholine, which comprises decomposing egg yolk phospholipids, selectively extracting highly unsaturated fatty acids from the resulting composition containing highly unsaturated fatty acids, and reacting this with glycerophosphorylcholine. （２）高度不飽和脂肪酸がアラキドン酸またはドコサヘ
キサエン酸である特許請求の範囲第１項記載のホスファ
チジルコリンの製造方法。(2) The method for producing phosphatidylcholine according to claim 1, wherein the highly unsaturated fatty acid is arachidonic acid or docosahexaenoic acid. （３）グリセロホスホリルコリンが卵黄リン脂質を分解
して取り出されたものである特許請求の範囲第１項また
は第２項記載のホスファチジルコリンの製造方法。(3) The method for producing phosphatidylcholine according to claim 1 or 2, wherein glycerophosphorylcholine is extracted by decomposing egg yolk phospholipids.