JPS6212232B2

JPS6212232B2 -

Info

Publication number: JPS6212232B2
Application number: JP60253344A
Authority: JP
Inventors: Masaru Kotani; Satoshi Yaginuma; Masaki Takada
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Toyo Jozo KK
Priority date: 1985-11-12
Filing date: 1985-11-12
Publication date: 1987-03-17
Also published as: JPS61149095A

Description

【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]

本発明は、新規なβ―ラクタマーゼ・インヒビ
ターM4854―ならびにその製法に関するもので
ある。本発明者らは、静岡県浜北市のトウモロコシ畑
より採取した土壌から分離した真菌M4854株が、
その培養物中に、種々のペニシリン系抗生物質、
セフアロスポリン系抗生物質であるβ―ラクタム
系抗生物質に対してそのβ―ラクタム構造の開裂
を行なわせしめるβ―ラクタマーゼを生産してな
る耐性菌のβ―ラクタマーゼに対して阻害作用を
有する、β―ラクタマーゼ・インヒビター作用を
有する物質を産生することを見い出し、またこの
β―ラクタマーゼ・インヒビター作用を有する物
質は２種類見い出され、かつ後述する通り新規物
質であることから、β―ラクタマーゼ・インヒビ
ターM4854―（以下単にM4854―と称す）、
β―ラクタマーゼ・インヒビタ―M4854―（以
下単にM4854―と称す）と各々命名し、さらに
本真菌M4854株がケトメラ（Chaetomella）属に
属する微生物であることを知つた。本発明は、上記の知見に基いて完成されたもの
であつて、M4854―、またはその塩およびケト
〓〓〓〓〓
メラ属に属するM4854―生産菌を培地に培養
し、その培養物からM4854―を採取することを
特徴とするＭ―4854―の製造法である。その目
的はβ―ラクタム系抗生物質に作用してそのβ―
ラクタム構造の開裂を行なわせしめるラクタマー
ゼを良好に阻害せしめてなる物質およびその製造
法を提供するものである。次に、本発明のM4854―、および参考として
Ｍ―4854―の有する物理化学的性状について
は、以下の通りである。 The present invention relates to a novel β-lactamase inhibitor M4854 and its production method. The present inventors discovered that the fungal strain M4854 isolated from soil collected from a corn field in Hamakita City, Shizuoka Prefecture,
In the culture, various penicillin antibiotics,
β-lactamases that produce β-lactamases that cleave the β-lactam structure of β-lactam antibiotics, which are cephalosporin antibiotics, and have an inhibitory effect on the β-lactamases of resistant bacteria.・We discovered that it produces a substance that has an inhibitory effect, and two types of substances that have a β-lactamase inhibitory effect have been discovered, and as will be described later, it is a new substance. simply referred to as M4854),
They named each strain β-lactamase inhibitor M4854 (hereinafter simply referred to as M4854), and further learned that this fungal strain M4854 is a microorganism belonging to the genus Chaetomella. The present invention has been completed based on the above findings, and includes M4854-, or a salt thereof, and a ketone.
This is a method for producing M-4854, which is characterized by culturing M4854-producing bacteria belonging to the genus Mela in a medium and collecting M4854 from the culture. Its purpose is to act on β-lactam antibiotics and
The object of the present invention is to provide a substance that effectively inhibits lactamase, which causes cleavage of lactam structures, and a method for producing the same. Next, the physicochemical properties of M4854 of the present invention and M-4854 as a reference are as follows.

【表】【table】

【表】さらに本発明のM4854―、および参考例とし
てのＭ―4854―の有するβ―ラクタマーゼ・イ
ンヒビター作用の活性を、種々のβ―ラクタマー
ゼに対して示す。〓〓〓〓〓
[Table] Furthermore, the β-lactamase inhibitor activity of M4854 of the present invention and M-4854 as a reference example against various β-lactamases is shown. 〓〓〓〓〓

【表】なお、このβ―ラクタマーゼ・インヒビター作
用の活性測定法としては、適当な濃度に稀釈した
M4854―、M4854―の溶液0.25mlと、基質と
して使用するβ―ラクタム系抗生物質量の約80％
を分解するβ―ラクタマーゼ含有β―ラクタマー
ゼ生産菌の菌体破砕液（PH7.0、0.1Mリン酸緩衝
液）であるβ―ラクタマーゼ液0.25mlを混合し、
30℃、10分間放置し、これに基質たるβ―ラクタ
ム系抗生物質0.5mgを含むPH7.0、0.1Mリン酸緩衝
液0.5mlを加え、30℃、60分間反応させた後、
0.0166Nヨード―澱粉溶液１mlを添加し、ヨード
澱粉反応を行なわせしめ、残存ヨードを0.0166N
ハイポ溶液にて滴定し、そのβ―ラクタマーゼを
50％阻害するM4854―、M4854―の濃度（μ
ｇ／ml）を求めたものである。また基質として使
用するβ―ラクタム系抗生物質において、セフア
ロリジンの場合はＣ、ベンジルペニシリンの場合
はＰ、として示したものである。さらにまた、こ
の測定法はその活性分画の確認、判定の一手段と
して用いられるものである。以上の通り、本発明のM4854―はβ―ラクタ
マーゼ・インヒビター作用を有するもので、従来
公知のβ―ラクタマーゼ・インヒビター作用を有
する化合物としては、MM4550、M13902、クラ
ブラン酸などの天然由来のβ―ラクタム構造有す
るβ―ラクタム系抗生物質およびその誘導体
〔The Journal of Antibiotics29(6)668―669
（1976）〕、蛋白様の高分子化合物系のラクタマー
ゼ・インヒビター〔The Journal of Antibiotics
25(8)473―474（1972）〕、クロキサシリンなどの半
合成ペニシリンのある種の化合物、などが知られ
ているが、まず本発明のM4854―と、これらを
比較すれば本発明のこれらはβ―ラクタム構造を
有しないことから、MM4550、M13902、クラブ
ラン酸、クロキサシリンなどのβ―ラクタム構造
を有する化合物と明瞭に区別されるもので、また
本発明のこれらはその構成元素において窒素元素
を有してないことから、窒素元素を有している蛋
白様高分子化合物とも明瞭に区別される。一方、
本物質と類似の構造を持ち、β―ラクタマーゼ阻
害作用もあると予想される酵素のインヒビター、
Panosialin〔The Journal of Antibiotics24
（12）860（1971）〕とはその赤外部吸収スペクト
ルの1600〜1800cm^-1の吸収領域でのパターンより
明らかに異なることより、本発明のM4854―
は、公知のいずれのβ―ラクタマーゼ・インヒビ
ター作用を有する化合物とも異なる新規な化合物
である。さらに、本発明の新規なβ―ラクタマーゼ・イ
ンヒビター作用を有するM4854―は、真菌
M4854株の培養により得られるものであるか、本
菌M4854株の肉眼的および顕微鏡的観察に基く各
種培地上における培養の特徴は次に記載する通り
である。Ａ肉眼的観察麦芽エキス寒天培地生育は非常に速く、26℃で７日以内に内径85mm
のペトリ皿全面に生育する。集落表面は平担。培
養初期は白色の空中菌系で覆われるが、柄子穀
（pycinidia）が形成され、成熟するにつれて白色
〓〓〓〓〓
菌糸は退化し、集落表面の色は無数の柄子穀によ
りダークブラウン（Dark Brown：3nl）とな
る。柄子穀は多数形成され、初期には白色〜ライ
ト・タン（Light Tan：3gc）であるが、10日目
を過ぎると、しだいに、ダーク・ブラウンとな
る。裏面の色はダーク・ブラウンである。ジヤガイモ・ブドウ糖寒天培地生育は速く、26℃、10日間で68〜70mmに達す
る。空中菌糸の発育は悪く、ほとんど形成され
ず、白色の菌糸が薄く培地上をはう様に生育する
のみである。集落表面の色は中心部付近はライ
ト・タン〜クローブ・ブラウン（Clove Brown：
3pl）で周辺部は白色に近い。柄子穀はほとんど
形成されない。裏面の色は無色で、中心部付近の
みライト・タンである。ツアペツク寒天培地生育は遅く、26℃、10日間で19〜22mmに達する
にすぎない。菌糸の生育は悪く、白色の菌糸が薄
く培地をはうように生育するのみで、空中菌糸は
形成されない。集落中心部の色はライト・タン。
柄子穀は中心部付近にわずかに形成されるのみで
ある。色はクローブ・ブラウン。裏面の色は無色
で、中心部付近のみライト・タンである。なお、色の標示は、Color Harmony Manual
（Container Corporation of America1958）の標
示法に従つた。Ｂ顕微鏡的観察柄子穀は楕円形ないし腎臓形。大きさ270〜370
×150〜220μ。色は初期に白色ないし、クリーム
色で成熟すると暗褐色ないし黒色となる。160〜
200×100〜150μの短い軸上に形成される。十分
成熟すると頂上に縦の裂け目を生じ、乳白色の分
生胞子（conidia）が噴出してくる。外壁の周囲
に剛毛（setae）を有する。剛毛は直線で、とき
に先端で曲線または輪をえがく。20〜70×25〜６
μで、１〜３個の隔壁を有する。表面は平滑、色
は褐色、先端部は薄い。分生胞子柄
（conidiophors）は細長く、不規則に分岐する。
25〜60×１〜２μ。無色。分生胞子は分生胞子形
成細胞の先端にヒアロスポア型（phialosporae）
で形成される。無色１細胞、５〜７×２〜2.5
μ、紡鍾形または船形。平面は平滑。Ｃ生育条件生育の温度は12〜40℃、PHは１〜10で、最適生
育の温度は28〜30℃、PHは５〜９である。上記の詳しい観察の結果、本菌は柄子穀を形成
し、その内部に無性的に分生胞子を作り、増殖す
ることから不完全菌（Deuteromycotina）のケロ
ミセテス網（Coelomycetes）スフエロプシダレ
ス目（Sphaeropsidales）に属するもので、さら
に柄子穀は楕円または腎臓形で、暗色で、比較的
硬い外壁を有し、成熟すると中央部に縦に裂け目
を生じ、また外壁周辺に剛毛を有することからケ
トメラ属（Chaetomella）に分類される。ケトメ
ラ属は1869年Fuckelによつて設立された属であ
るが、その後、1976年SuttonとSarbhoyにより４
種１変種が認められている。分生胞子、剛毛など
の特徴から本菌はケトメラ・ラフイゲラ
（Chaetomella raphigera）の記載によく似ている
もので、オランダの微生物寄託機関であるCBSよ
りCBS12057株を取り寄せ、比較検討した結果、
一致したことから、本菌はケトメラ・ラフイゲ
ラ・スウイフト（Chaetomella raphigera
Swift）と同定された。なお、ケトメラ・ラフイ
ゲラは1930年Swiftにより設けられた種であり、
比較的近い種としてケトメラ・シルシノセタ・ス
トーク（Chaetomella circinoseta stolk）が有る
が、分生胞子の大きさ、剛毛の形、大きさなどか
ら区別される。以上の通り、本菌はケトメラ・ラ
フイゲラに属する菌と同定されたもので、ケトメ
ラ・ラフイゲラM4854（Chaetomella
raphigeraM4854）と命名し、この菌は工業技術
院微生物工業技術研究所に「微工研菌寄第4277号
（FERM―ＰNo.4277）」として寄託されている。次いで、本発明を実施するに当りその一例を述
べる。まず、本発明における使用菌としては、上記の
ケトメラ・ラフイゲラM4854はその一例であつ
て、この菌のみでなく、本発明のM4854―を産
生する菌で、天然または人工変異株もすべて本発
明において使用することができる。本発明においてケトメラ属に属するM4854―
生産菌を培養するに当つては真菌の培養に関する
一般的知識が適用されるもので、培養の形態は液
体培養でもよいが、工業的には該生産菌の胞子懸
濁液または２〜３日間培養した培養液を生産用培
地に接種し、深部通気撹拌培養を行なつてもよ
い。〓〓〓〓〓
培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用
いられるものが広く使用され得る。炭素源として
は同化可能な炭素化合物であればよく、例えばブ
ドウ糖、シヨ糖、乳糖、麦芽糖、澱粉、デキスト
リン、糖蜜、グリセリンなどが使用される。窒素
源としては利用可能な窒素化合物であればよく、
例えばコーン・スチープ・リカー、大豆粉、綿実
粉、小麦グルテン、ペプトン、肉エキス、酵母エ
キス、カゼイン加水分解物、アンモニウム塩、硝
酸塩などが使用される。その他、リン酸塩、硫酸
塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、ナト
リウム、鉄、亜鉛、マンガンなどの塩類が必要に
応じて使用される。培養温度は菌が発育し、M4854―を生産する
範囲内で適宜変更し得るが、特に好ましくは24〜
28℃程度であり、培養時間は条件によつて異なる
が、通常48〜72時間程度であつて、M4854―が
最高力価に達する時期をみはからつて適当な時期
に培養を終了すればよい。かくして得られるM4854―生産菌の培養中に
おいて、M4854―は大部分その液体部分に含有
されているものである。このようにして得られたM4854―生産菌の培
養物あるいはこれから固形分を除去した培養液
からM4854―を採取するのであるが、M4854―
は水溶性であり、酢酸エチルなどの一部の有機
溶媒に不溶性である性質を利用して分離精製を行
なうが、またこれらは活性炭やスチレン―ジビニ
ルベンゼン共重合体系多好性吸着樹脂（例えばア
ンバーライトXAD―２：ローム・アンド・ハス
社製、ハイポーラス樹脂HP―20，HP―10；三菱
化成社製）に吸着される性質を利用し、この吸着
体を水洗いし、含水アセトンなどにて溶出せしめ
て分解するか、さらに該培養液よりブタノール
にて抽出せしめてもよい。さらに、このようにし
て得られた粗物質は一般的な有機化合物の精製法
であるゲル過やクロマトグラフイーの手段を組
合せて行なうことができるもので、アルミナまた
はシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフイー
による精製が有効である。また、この精製におい
て得られる活性分画を減圧乾燥して目的物を回収
してもよく、さらにこれを再結晶化するか、また
は該活性分画に２―エチルヘキサン酸ナトリウ
ム、カリウム、乳酸ナトリウムカリウムなどの有
機酸アルカリ金属塩溶液を加えて直接そのアルカ
リ金属塩として回収してもよい。このようにして、本発明のM4854―は、上記
の通りの、薄層クロマトグラフイーにおける単一
スポツトを有する純品が得られるものである。さらに、本発明のM4854―は優れたβ―ラク
タマーゼ・インヒビター作用を有しているもので
あつて、有用なβ―ラクタム系抗生物質であるペ
ニシリン系抗生物質、セフアロスポリン系抗生物
質と個別または混合して使用することによりこの
β―ラクタム系抗生物質のβ―ラクタマーゼによ
る劣化を防止するものである。次に実施例を挙げて本発明を具体的に述べる
が、本発明は何んらこれらの実施例により限定さ
れるものではない。実施例１ブドウ糖２％、ポリペプトン１％、コーン・ス
チープ・リカー１％、KH₂PO₄0.2％、MgSO₄0.1
％を含有する培地（PH6.5）100mlを500ml容三角
フラスコに分注し、120℃、15分間加熱殺菌し、
本培地10本に、ケトメラ・ラフイゲラM4854
（FERM―ＰNo.4277）株の斜面培養液よりの１白
金耳を接種し、26℃で48時間振盪培養を行なつ
た。次いで、これを上記と同一組成の加熱殺菌し
た培地20を含有する30容ジヤーフアーメンタ
ーに移植し、26℃、72時間、250rpm、毎分20
の無菌空気の条件下通気撹拌培養し、培養物約15
を得た（β―ラクタマーゼ・インヒビター作用
を有する物質の含量は1000〜1500r／mlであつ
た）。以下、この培養物を、後述実施例２、実施
例３、実施例４、実施例５の如く処理して目的物
を得るものである。実施例２実施例１で得られた培養物約15をバケツト遠
心機にてその菌体を除去して、その液を得、こ
れに200ｇの活性炭を加え、約30分間撹拌して充
分吸着せしめた後活性炭を取し、水洗した後、
これに５の50％含水アセトンを用いて２回溶出
せしめる。得られた溶出液を併合し、減圧濃縮
し、さらに凍結乾燥して黒褐色の粗物質50ｇ（β
―ラクタマーゼ・インヒビター作用を有する物質
の含量は約１％である）を得た。さらに、これ
は、後述実施例の如くして分画し、回収される。実施例３〓〓〓〓〓
実施例１と同様にして得られた培養物約15
を、バケツト遠心機で菌体を除去した後、これに
約６のｎ―ブタノールを加えて、２回抽出し、
得られた抽出液はシラツプ状になるまで濃縮す
る。次いでこのシラツプにエタノールを加え、こ
れを、あらかじめエタノールにて充填したアルミ
ナカラム約１（径7.5×90cm）にチヤージして
吸着せしめた後、約４のエタノールで洗浄し、
次いでエタノール：水（５：３）にて、１フラク
シヨン20ｇにて溶出、分画した。各フラクシヨン
は、β―ラクタマーゼ・インヒビター作用の有無
および薄層クロマトグラフイーにて判定して、粗
M4854―分画（フラクシヨンNo.35〜55）と粗
M4854―分画（フラクシヨンNo.56〜80）を得、
それぞれの分画を濃縮乾固し、さらに凍結乾燥し
て粗M4854―８ｇ（含量約20％）と粗M4854―
６ｇ（含量約15％）を得た。さらに、これら
は、以下の実施例の如くして精製される。実施例４実施例３で得られた粗M4854―1.5ｇを少量
のクロロホルム：メタノール（２：１）混合溶媒
に溶解し、これを、あらかじめ同一組成の溶媒で
充填したシリカゲルカラム150ml（２×50cm）に
チヤージし、次いでクロロホルム：メタノール
（２：１）にて、１フラクシヨン５mlで溶出、分
画し、その活性フラクシヨンNo.85〜95を回収し、
併合し、これを減圧乾固した後、酢酸エチル：メ
タノール（４：１）混合溶媒に溶解し、これに２
―エチルヘキサン酸カリウムの酢酸エチル溶液を
加えてM4854―のカリウム塩を析出、沈澱せし
め、これを取してM4854―・カリウム塩15mg
を得た。本品はまた、薄層クロマトグラフイーな
どにより純品であることが確認された。参考例１実施例３で得られた粗M4854―20ｇを少量の
クロロホルム：メタノール（２：１）混合溶媒に
溶解し、これを、あらかじめ同一組成の溶媒で充
填したシリカゲルカラム150ml（２×50cm）にチ
ヤージせしめ、次いでクロロホルム：メタノール
（２：１）にて、１フラクシヨン20mlで溶出、分
画し、その活性フラクシヨンNo.15〜35を回収し、
併合し、これを濃縮乾固した後酢酸エチル：メタ
ノール（４：１）混合溶媒に溶解し、これに２―
エチルヘキサン酸カリウムの酢酸エチル溶液を加
えてM4854―のカリウム塩を析出、沈澱せし
め、これを取してM4854―・カリウム塩40mg
を得た。本品はまた、薄層クロマトグラフイーな
どにより純品であることが確認された。 [Table] To measure the activity of this β-lactamase inhibitor, dilute to an appropriate concentration.
M4854-, 0.25ml of M4854- solution and approximately 80% of the amount of β-lactam antibiotic used as a substrate.
Mix 0.25 ml of β-lactamase solution (pH 7.0, 0.1M phosphate buffer) of disrupted bacterial cells of β-lactamase-producing bacteria containing β-lactamase that decomposes
After leaving at 30℃ for 10 minutes, add 0.5ml of 0.1M phosphate buffer with pH 7.0 containing 0.5mg of β-lactam antibiotic as a substrate, and react at 30℃ for 60 minutes.
Add 1 ml of 0.0166N iodine-starch solution to perform iodine starch reaction, and reduce residual iodine to 0.0166N.
Titrate with hypo solution to determine the β-lactamase.
Concentration of M4854-, M4854- that inhibits 50% (μ
g/ml). Regarding β-lactam antibiotics used as substrates, cephaloridine is shown as C, and benzylpenicillin is shown as P. Furthermore, this measurement method is used as a means of confirming and determining the active fraction. As mentioned above, M4854 of the present invention has a β-lactamase inhibitor action, and conventionally known compounds having a β-lactamase inhibitor action include naturally occurring β-lactamase such as MM4550, M13902, and clavulanic acid. β-lactam antibiotics with lactam structure and their derivatives [The Journal of Antibiotics 29 (6)668-669
(1976)], Lactamase inhibitors based on protein-like polymeric compounds [The Journal of Antibiotics
25 (8) 473-474 (1972)] and certain semi-synthetic penicillin compounds such as cloxacillin, but first of all, if we compare them with M4854 of the present invention, these of the present invention are Because it does not have a β-lactam structure, it can be clearly distinguished from compounds that have a β-lactam structure, such as MM4550, M13902, clavulanic acid, and cloxacillin, and the compounds of the present invention contain nitrogen as a constituent element. Because it does not contain nitrogen, it is clearly distinguished from protein-like polymer compounds that contain nitrogen. on the other hand,
An enzyme inhibitor that has a similar structure to this substance and is expected to have a β-lactamase inhibitory effect.
Panosialin〔The Journal of Antibiotics 24
(12) 860 (1971)] from the infrared absorption spectrum in the absorption region of 1600 to 1800 cm ^-1 .
is a novel compound different from any known compound having β-lactamase inhibitor action. Furthermore, M4854, which has the novel β-lactamase inhibitor action of the present invention,
Whether it is obtained by culturing the M4854 strain, the characteristics of culturing the M4854 strain on various media based on macroscopic and microscopic observations are as described below. A. Macroscopic observation Malt extract agar medium Growth is very fast, reaching an inner diameter of 85 mm within 7 days at 26°C.
Grows all over the Petri dish. The surface of the village is flat. At the beginning of culture, it is covered with white aerial fungi, but as pycinidia is formed and matures, it becomes white.
The mycelium degenerates, and the color of the colony surface becomes dark brown (3nl) due to the countless stalk grains. A large number of stipe grains are formed and are initially white to light tan (3 gc), but gradually turn dark brown after the 10th day. The color of the back side is dark brown. Potato Glucose Agar Medium Growth is fast, reaching 68-70mm in 10 days at 26℃. The growth of aerial mycelia was poor, with almost no formation, and only thin white mycelia grew as if crawling on the medium. The color of the surface of the village ranges from light tan to clove brown near the center.
3pl) and the periphery is nearly white. Pestiloid grains are rarely formed. The reverse side is colorless, with light tan only near the center. Tuapetsk agar medium Growth is slow, reaching only 19-22 mm in 10 days at 26°C. The growth of hyphae is poor, with only thin white hyphae growing as if crawling on the medium, and no aerial hyphae are formed. The color of the center of the village is light tan.
Only a few petiole grains are formed near the center. The color is clove brown. The reverse side is colorless, with light tan only near the center. The color markings are based on the Color Harmony Manual.
(Container Corporation of America 1958) marking law was followed. B. Microscopic observation The stalks are oval or kidney-shaped. Size 270~370
×150~220μ. The color is initially white or cream-colored, and becomes dark brown or black as it matures. 160～
Formed on a short axis of 200x100-150μ. When fully mature, a vertical fissure appears at the top and milky white conidia emerge. Has setae around the outer wall. The bristles are straight, sometimes with curves or rings at the tips. 20～70×25～6
μ and has 1 to 3 partition walls. The surface is smooth, brown in color, and the tip is thin. Conidiophores are elongated and irregularly branched.
25~60×1~2μ. colorless. Conidia are hyalosporous (phialosporae) at the tip of the conidiogenic cell.
is formed. Colorless 1 cell, 5-7 x 2-2.5
μ, spindle-shaped or boat-shaped. The plane is smooth. C. Growth conditions Growth temperature is 12-40°C, pH is 1-10, optimal growth temperature is 28-30°C, pH is 5-9. As a result of the detailed observation described above, it was found that this fungus forms a petiole and asexually produces conidia inside it and multiplies. It belongs to the order Sphaeropsidales, and the stalks are oval or kidney-shaped, dark in color, and have a relatively hard outer wall, with a longitudinal fissure in the center when mature, and bristles around the outer wall. It is classified into the genus Chaetomella. The genus Chaetomela was established by Fuckel in 1869, and was later expanded by Sutton and Sarbhoy in 1976.
One species and one variety is recognized. Based on characteristics such as conidia and bristles, this bacterium is very similar to the description of Chaetomella raphigera.As a result of a comparative study of strain CBS12057, which was ordered from CBS, a microorganism depository in the Netherlands,
Based on the coincidence, this bacterium was Chaetomella raphigera swift (Chaetomella raphigera swift).
Swift). In addition, Chaetomela lahuigera is a species established by Swift in 1930.
A relatively related species is Chaetomella circinoseta stalk, but it can be distinguished by the size of the conidia, the shape and size of the bristles, etc. As mentioned above, this bacterium was identified as belonging to Chaetomella lahuigera, and Chaetomella lahuigera M4854 (Chaetomella lahuigera).
raphigera M4854), and this bacterium has been deposited with the Institute of Microbial Technology, Agency of Industrial Science and Technology as "FERM-P No. 4277". Next, an example of carrying out the present invention will be described. First, the above-mentioned Chaetomela lahuigera M4854 is one example of the bacteria used in the present invention, and not only this bacteria, but also all natural or artificial mutant strains that produce M4854 of the present invention. can be used. In the present invention, M4854- belonging to the genus Chaetomela
When culturing the producing bacteria, general knowledge regarding fungal culture is applied, and the form of culture may be liquid culture, but industrially, spore suspensions of the producing bacteria or spore suspensions of the producing bacteria are used for 2 to 3 days. The cultivated culture solution may be inoculated into a production medium, and deep aeration agitation culture may be performed. 〓〓〓〓〓
As the nutrient source for the medium, a wide variety of nutrients commonly used for culturing microorganisms can be used. The carbon source may be any assimilable carbon compound, such as glucose, sucrose, lactose, maltose, starch, dextrin, molasses, and glycerin. Any available nitrogen compound can be used as a nitrogen source.
For example, corn steep liquor, soybean flour, cottonseed flour, wheat gluten, peptone, meat extract, yeast extract, casein hydrolyzate, ammonium salts, nitrates, etc. are used. In addition, salts such as phosphates, sulfates, magnesium, calcium, potassium, sodium, iron, zinc, and manganese are used as necessary. The culture temperature can be changed as appropriate within the range that allows the bacteria to grow and produce M4854, but it is particularly preferably 24~24~
The temperature is about 28℃, and the culture time varies depending on the conditions, but it is usually about 48 to 72 hours, and the culture can be terminated at an appropriate time, taking into account the time when M4854- reaches its maximum titer. . During the cultivation of the M4854-producing bacteria thus obtained, most of the M4854 is contained in the liquid portion. M4854 obtained in this way is collected from the culture of the producing bacteria or the culture solution from which the solid content has been removed.
are water-soluble and are insoluble in some organic solvents such as ethyl acetate. Light It may be eluted and degraded, or it may be further extracted from the culture solution with butanol. Furthermore, the crude substance obtained in this way can be subjected to a combination of gel filtration and chromatography, which are common purification methods for organic compounds, and column chromatography using alumina or silica gel. Purification is effective. In addition, the active fraction obtained in this purification may be dried under reduced pressure to recover the target product, and this may be further recrystallized, or the active fraction may be added to sodium 2-ethylhexanoate, potassium, and sodium lactate. Alternatively, a solution of an organic acid alkali metal salt such as potassium may be added to directly recover the alkali metal salt. In this way, the M4854 of the present invention can be obtained as a pure product having a single spot in thin layer chromatography as described above. Furthermore, M4854 of the present invention has excellent β-lactamase inhibitor activity and can be used individually or in combination with penicillin antibiotics and cephalosporin antibiotics, which are useful β-lactam antibiotics. By using this method, the β-lactam antibiotic is prevented from being degraded by β-lactamase. Next, the present invention will be specifically described with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples in any way. Example 1 Glucose 2%, Polypeptone 1%, Corn Steep Liquor 1%, KH ₂ PO ₄ 0.2%, MgSO ₄ 0.1
Dispense 100ml of a medium (PH6.5) containing
In 10 bottles of this culture medium, Chaetomela lahuigera M4854
(FERM-P No. 4277) strain was inoculated with one platinum loop from a slant culture, and cultured with shaking at 26°C for 48 hours. Next, this was transferred to a 30-volume jar fermenter containing heat-sterilized medium 20 with the same composition as above, and incubated at 26°C, 72 hours, 250 rpm, 20 min.
Culture with aeration under sterile air conditions, and culture approximately 15
(The content of the substance with β-lactamase inhibitor action was 1000-1500 r/ml). This culture is then treated as in Examples 2, 3, 4, and 5 to obtain the desired product. Example 2 About 15 cells of the culture obtained in Example 1 were removed using a bucket centrifuge to obtain a liquid. 200 g of activated carbon was added to this and stirred for about 30 minutes to ensure sufficient adsorption. After removing the activated carbon and washing it with water,
This was then eluted twice using 50% aqueous acetone in step 5. The resulting eluates were combined, concentrated under reduced pressure, and further freeze-dried to yield 50 g of a dark brown crude material (β
- The content of substances with lactamase inhibitor action was approximately 1%). Furthermore, this is fractionated and recovered as described in Examples below. Example 3 〓〓〓〓〓
Approximately 15 cultures obtained in the same manner as in Example 1
After removing the bacterial cells using a bucket centrifuge, approximately 6 ml of n-butanol was added to the mixture and extracted twice.
The obtained extract is concentrated until it becomes syrupy. Next, ethanol was added to this syrup, and this was charged to an alumina column (diameter 7.5 x 90 cm) filled with ethanol in advance to adsorb it, and then washed with about 4 parts of ethanol.
Then, the mixture was eluted and fractionated using ethanol:water (5:3) in 1 fraction (20 g). Each fraction was determined to have a β-lactamase inhibitor effect and to determine whether it had a crude
M4854-Fraction (Fraction No. 35-55) and crude
M4854--fraction (fraction No. 56-80) was obtained,
Each fraction was concentrated to dryness and further freeze-dried to obtain 8 g of crude M4854 (content approximately 20%) and crude M4854-.
6 g (content about 15%) was obtained. Furthermore, these are purified as in the following examples. Example 4 1.5 g of the crude M4854 obtained in Example 3 was dissolved in a small amount of chloroform:methanol (2:1) mixed solvent, and this was added to a 150 ml (2 x 50 cm) silica gel column previously filled with a solvent of the same composition. ), then eluted and fractionated with chloroform:methanol (2:1) in 1 fraction of 5 ml, and collected active fractions No. 85 to 95.
After combining and drying under reduced pressure, it was dissolved in a mixed solvent of ethyl acetate and methanol (4:1), and 2
Add a solution of potassium ethylhexanoate in ethyl acetate to precipitate the potassium salt of M4854.
I got it. This product was also confirmed to be pure by thin layer chromatography. Reference Example 1 20g of crude M4854 obtained in Example 3 was dissolved in a small amount of chloroform:methanol (2:1) mixed solvent, and this was placed in a 150ml (2 x 50cm) silica gel column filled with a solvent of the same composition in advance. Then, elute and fractionate each fraction with 20 ml of chloroform:methanol (2:1), and collect the active fractions No. 15 to 35.
After concentrating to dryness, it was dissolved in a mixed solvent of ethyl acetate and methanol (4:1), and 2-
A solution of potassium ethylhexanoate in ethyl acetate was added to precipitate the potassium salt of M4854, and this was collected to give 40 mg of the potassium salt of M4854.
I got it. This product was also confirmed to be pure by thin layer chromatography.

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]

第１図、第２図および第３図は本発明のM4854
―の紫外部吸収スペクトルを示し、第４図は本
発明のM4854―の赤外部吸収スペクトルを示
し、第５図は本発明のM4854―の核磁気共鳴ス
ペクトルを示し、第６図、第７図および第８図は
参考としてのM4854―の紫外部吸収スペクトル
を示し、第９図はM4854―の赤外部吸収スペク
トルを示し、第１０図はM4854―の核磁気共鳴
スペクトルを示す。〓〓〓〓〓
Figures 1, 2 and 3 are M4854 of the present invention.
Figure 4 shows the infrared absorption spectrum of M4854 of the present invention, Figure 5 shows the nuclear magnetic resonance spectrum of M4854 of the present invention, and Figures 6 and 7 show the ultraviolet absorption spectrum of M4854 of the present invention. 8 shows the ultraviolet absorption spectrum of M4854- as a reference, FIG. 9 shows the infrared absorption spectrum of M4854-, and FIG. 10 shows the nuclear magnetic resonance spectrum of M4854-. 〓〓〓〓〓

Claims

【特許請求の範囲】１少なくとも、下記の物理化学的性状を有する
β―ラクタマーゼ・インヒビターM4854―また
はその塩。（カリウム塩として）融点；191.5℃（分解）元素分析；Ｃ＝44.39％、Ｈ＝6.14％、Ｓ＝6.08
％、Ｋ＝11.27％、紫外部吸収スペクトル；λmax266mμ、シヨル
ダーλmax273mμ（水中）、赤外部吸収スペクトル（KBr）；第４図に示す通
り、呈色反応；バニリン硫酸反応、アンモニア性バナ
ジン硫酸反応は陽性、フエーリング反応、モー
リツシユ反応、塩化第二鉄反応、ニンヒドリン
反応は陰性、色性状；白色、溶解性；水、ジメチルスルホキサイドに可溶性、
メタノール、エタノール中程度可溶性、酢酸エ
チルに不溶性、２ケトメラ属に属するβ―ラクタマーゼ・イン
ヒビターM4854―生産菌を培地に培養し、その
培養物からβ―ラクタマーゼ・インヒビター
M4854―を採取することを特徴とするβ―ラク
タマーゼ・インヒビターM4854―の製法。[Claims] 1. β-lactamase inhibitor M4854 or a salt thereof having at least the following physicochemical properties. (As potassium salt) Melting point: 191.5℃ (decomposition) Elemental analysis: C = 44.39%, H = 6.14%, S = 6.08
%, K=11.27%, ultraviolet absorption spectrum; λmax 266 mμ, shoulder λmax 273 mμ (in water), infrared absorption spectrum (KBr); as shown in Figure 4, color reaction; vanillin sulfate reaction, ammonia vanadium sulfate reaction positive , Fehling reaction, Moritsch reaction, ferric chloride reaction, ninhydrin reaction negative, color property: white, solubility: soluble in water, dimethyl sulfoxide,
Moderately soluble in methanol and ethanol, insoluble in ethyl acetate, 2 β-lactamase inhibitor M4854-producing bacteria belonging to the genus Chaetomela was cultured in a medium, and β-lactamase inhibitor was extracted from the culture.
A method for producing β-lactamase inhibitor M4854, which comprises collecting M4854.