JPS62118878A

JPS62118878A - 細胞培養装置

Info

Publication number: JPS62118878A
Application number: JP60258269A
Authority: JP
Inventors: Yoshiaki Matsuda; 松田　義章; Shinjiro Mitsuda; 満田　伸二郎
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1985-11-18
Filing date: 1985-11-18
Publication date: 1987-05-30
Also published as: JPH0585156B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は動物細胞（接着性細胞）を培養皿上に特殊な方
法により増殖させ、連続的に生理活性物質を産生させる
細胞培養装置に関するものである。

（従来技術）従来接着性細胞の培養に当たっては大量培養装置として
（Ａ）細胞の接着面積を大きくするために容器内に多数
の板を平行に設けたものがあり、そのうちの１つの型は
液封方式ともいうべきもので板に細胞を付着させた後ｐ
Ｈ１口０（溶存酸素）を制御しながら培養液を循環させ
る形式、他の１つはレコード板のようなものを平行に円
筒中に並べ、まず始めに垂直に立て（板は水平になる）
細胞懸濁液を流し込み、細胞を板に接着させ、次いで横
にして回転方式で培養する形式である。

以上のようなものの他（、Ｂ）プラスチックフィルムを
渦巻状にしたものを円筒におさめたもので細胞培養はロ
ーラー培養と同様に行い、次いで垂直に立て、空気等を
送り込むことにより培養液を循環させる形式がある。

更に（Ｃ）重箱構造のもので（Ａ）と異なる点は気相が
存在することである。この方式は原理的にはルーピンと
同じで静置培養であり、培養液を循環させる必要はない
。マルチトレ一方式と呼ばれるものである。

次は（Ｄ）酸素あるいは炭酸ガスの透過性のプラスチッ
クバッグを消防ホースのようにまき込んだスタイルのも
ので、ＤＯやｐｎ制御を容易にしている。培養液はホー
ス内に通ずるプラスチックバッグ形式である。中空繊維
（ホローファイバー）形式は（Ｅ）人工腎臓などで用い
られている透析用の中空繊維の表面に細胞を接着、増殖
させようとするもので栄養の供給を細胞層の裏側からも
行うことができる。

又、（Ｆ）容器に充填したガラスピーズ表面に細胞を接
着、増殖させるものでｐＨやＤＯを調整した培養液を循
環させるガラスピーズ充填カラム形式の他（Ｇ）ガラス
ピーズではなく２０〜４０回転／分位のゆるい攪拌下で
培養液に浮遊する程度の比重の微少ビーズ表面に細胞を
培養、増殖させるもの、すなわちマイクロキャリア方式
がある。しかしながら、これは剪断力のダメージを受は
易く、かつコロニー形成率の低い細胞にとって、マイク
ロキャリア培養は非常に困難である。

（発明が解決しようとする問題点）以上述べたようにそれぞれ特徴をもったし）ろいろな装
置あるいは方法が接着性細胞の大量培養化のために考案
されているが実用的な細胞生産物の量産システムとして
はまだあまり用も）られていなく試験用段階で終わって
しまったものが多い。

現在でもこの種の細胞の大量培養そしてインターフェロ
ンやワクチンの量産などのためにまだローラーびん方式
が使用されているという手工業的なレベルに近い状況に
ある。

（問題点を解決するための手段）したがって本発明の技術的課題は接着性細胞の大量培養
のできる実用的な細胞培養装置を提供することを目的と
するものでこの技術的課題を解決する本発明の技術的手
段は多段式トレー培養システムを採用するものである。

すなわち、底面が外周に向かって下向きに傾斜し、かつ
外周に断面山形の立縁を形成した培養皿を一定の間隔を
隔てて培養槽内に多段に設け、かつ各培養皿の中央部分
には焼結金属フィルターを設けてここから培地が供給さ
れるように構成し、更に培養槽底面にはオーバーフロー
培地出口を設けたものである。

（発明の効果）この技術的手段によれば培地供給口から培地を各培養皿
に設けて焼結金属フィルターを介して供給するもので、
細胞の増殖によって培地成分を消費した培地は山伏にな
っている培養皿の周囲からオーバーフローして回収され
る。回収された培地は廃液又は新鮮培地と混合すること
により再利用できるし、培養皿の底面は勾配があり、培
地が供給されると培養皿にたまっていた培地は中心部よ
り押し出され、山状の立縁からオーバーフローするけれ
ども皿の周囲は山伏となっているのでオーバーフローし
た培地は周囲に飛散し、下段の皿に混入しない。

したがって本発明のものは連続培養が可能であり、また
細胞は攪拌されることなく、培地は坦体上に増殖した細
胞の間を焼結金属フィルターを介して、放射状に７１出
、循環されるためマイクロキャリア法と比較して細胞の
剪断力によるダメージは極めて小さく、細胞増殖を最適
条件で行える。

しかして、培養皿の液深は小さく、またヘッドスペース
も大きくとれることから、ガス移動は行われ易く、また
マルチトレ一方式とは異なって全てのステップを自動化
することが可能である。又、高密度培養が可能であり、
蒸気滅菌の可能な坦体の利用により、一連の生産プロセ
スをインラインで蒸気滅菌でき、それにより汚染の危険
性は極めて少ないものとなる。

（実施例）以下図面に示す実施例について説明する。

第１図において（１）は培養槽であり、（２）は培養槽
（１）の中央に立設された中心軸筒であり、（３）はこ
れに一定間隔へだて゛Ｃ取付けられた培養皿である。

培養皿は底面（３ａ）が外周に向かって下向きに（Ｌｌ
ｌ糾し、かつ外周に断面山形の立縁（３ｂ）が形成され
ている。この培養皿（３）に面する中心軸筒（２）の開
口部（２ｄ）には焼結金属フィルター（４）がある。

（２ａ）は中心軸筒（２）の培地入口であり、（２ｂ）
は中心軸筒（２）の培地出口である。

（５）は培養槽（１）の蓋体でこれに気相入口（６）と
気相出口（７）がある。（８）は培養槽（１）の底部に
開口したオーバーフロー培地出口、（９）は培養槽（１
）の覗窓である。

以上のような培養槽（１）には培地供給口（２ａ）から
培養皿（３）に設けた焼結金属フィルター（４）を介し
て培地を供給する。

細胞の増殖によって培地成分を消費した培地は山伏にな
っている培養皿（３）の周囲を立縁（３ｂ）からオーバ
ーフローし、培地出口（８）から排出され回収される。

回収された培地は廃液又は新鮮培地と混合することによ
り再利用される。

培養皿（３）の底面（３ａ）は下向きに傾斜しているの
で培地が供給されると培養皿（３）にたまっていた培地
は中心部より前述した如く押し出され立縁（３ｂ）から
オーバーフローする。

立縁（３ｂ）は山伏となっているためオーバーフローし
た培地は周囲に飛散して下段の皿には混入することはな
い。

焼結金属フィルター（４）のポアサイズは１００μｍで
動物細胞の大きさは１０〜１００μｍであり、十分この
焼結金属フィルターを通過することができる。又、金属
イオンの溶出から細胞により増殖阻害を起こすので焼結
金属フィルター、培養皿および装置は全て５ＵＳ３１６
製とする。一般に動物細胞装置は５ＵＳ３１６．５ＯＳ
３１６Ｌが使用される。

以上のような装置を用いての培養方法について述べると
培養皿（３）には、細胞接着性のある　■微細な網状フ
ィルターを張る。

■多孔性セラミックフラグメントを敷き詰める。

等の方法によりＳ／Ｖ値を大きくすることができる。因
にＳは表面積であり、■は培地量である。すなわち、Ｓ
／Ｖ値はマイクロキャリヤーには劣るものの、マルチト
レー、プラスチックバッグ、スパイラルバッグ、ガラス
ピーズ等を大きく上回り、ホローファイバーに匹敵しう
るちのができる。

■については培養皿（３）の勾配部分と同じ大きさを有
するフィルターを円盤状に張り、その上に同材質ででき
ているフィルターをヒダ状に折り曲げ組み立てる。第２
図の（１０）はこれを示す。

このようにすることによりフィルター表面積は７０００
ｃＪとなる。特殊フィルターの表面積は見かけの表面積
の約７倍あり、１０ｃｍ四方の表面積はｌ０ＸＩＯＸ　
７　＝　７００ｃｎｌとなる。

一枚のディスクで７０００ｃｎｉあるのでこれは通常用
いられているローラーボトル（８５０ｃｏりの８本分に
相当する。つまり本装置は５段あるので３５．０００ｃ
ｎ（（ｏ−ラーホトル４１本分）トナル。

■についても多孔性セラミックフラグメントを敷き詰め
たことにより相当量の表面積となる。

以下に本装置の、他の装置と比較した場合の優位性につ
いて述べる。

動物細胞ことに接着性細胞の培養装置として、種々のも
のが考案、また一部は実用化されている現状にある。中
でも、微少のビーズ（１００〜２００μｍ）への細胞の
接着を利用したマイクロキャリヤー用培養装置は、トン
クラスのものが実用化されている。

しかしながら、剪断力のダメージを受けやすく、かつコ
ロニー形成率の低い細胞にとって、マイクロキャリヤー
培養は非常に困難である。剪断力による影習を低減化す
るためには、静置法のように細胞自身は接着表面に固定
され、かつ培地交換が〃１率的に行えるシステムが望ま
しい。

その意味において、ガラス平板を多段にしたマルチトレ
ー法や中空繊維に細胞を接着させるホローファイバー法
が実用化されている。マルチトレー法はコンパクトで簡
便な方法であるが、細胞接種、培地交換、生産物回収等
を手作業で行う部分が多く、商業的生産には不適である
。

また、ホローファイバー法は培地容積当たりの接着表面
積、すなわちＳ／Ｖ値が高く、高密度培養の可能なもの
であるが、現状ではホローファイバー自体高価であり、
再使用も難しく、かつ蒸気滅菌が不可能であることから
、商業生産する上で大きな障害となるものと思われる。

しかるに、本培養装置は上記方法の欠点を補うものであ
る。すなわち、本装置では、細胞は各ディスク上の坦体
に接着、増殖し、その間を培地が循環し、かつ焼結金属
フィルターより培地は放射上に滲出されるため、剪断力
は極めて小さい。

また、マルチトレ一方式とは異なって、すべてのステッ
プを自動化することが可能である。

トレーやディスクにかかわらず、多段システムに培地を
’ｔｉｌｉ環供給する場合、各段に順次、培地を供給し
ていくと、新鮮培地は入口に近い段でその栄養分の消費
は進み、出口近くの段では逆に細胞自身の生産する乳酸
、アンモニア等の生育阻害物質の濃度が高くなる。その
結果、入口に近い段では良好な増殖はみられるものの、
出口に近い段において、増殖は阻害されることになる。

本装置では、培地は焼結金属フィルターを介して各段に
均等に分配され、かつフィルターの細かな目を通して、
放射上に移動するため、股間、また一つの段においても
増殖の局在化はおこりにくい。

本装置を用いた各段への均一な培地の供給は、培地が滲
出する金属フィルタ一部分の長さを調節することによっ
ても可能ではあるが、各段への培地供給速度をより均等
に制御するために第５図に示すような方法に改善するこ
とができる。

本装置のディスク上に細胞の接着しうる坦体、すなわち
ガラス、プラスチックフィルム、特に三次元構造をもつ
多孔性セラミックフラグメント、繊維状フィルムを装填
することによりＳ／Ｖはマイクロキャリヤーには劣るも
のの、マルチトレー、プラスチックバッグ、スパイラル
フィルム、ガラスピーズカラム等を大きく上回り、ホロ
ーファイバーに匹敵しうるちのとなる。

また、蒸気滅菌の可能な坦体の利用により、一連の生産
プロセスをインラインで蒸気滅菌でき、それにより汚染
の危険性は極めて少ないものとなる。

さらに、本装置ディスク内の液深は小さく、またヘッド
スペースも大きくとれることからガス移動は行われ易（
なり、充填カラム式にみられる培地の酸素不足をふせぐ
ことができる。

又、フィルターの再利用は難しいがセラミックは酸、ア
ルカリによる再生処理や蒸気滅菌が可能でありホローフ
ァイバーやマイクロキャリアと比較して安価に入手する
ことができる。ホローファイバー、マイクロキャリアは
酸、アルカリによる再生処理や蒸気滅菌が不可能で高価
なものである。

第３．４図は変形実施例で培地は各培養皿（３）に対応
して配置された培地供給管（１１）から供給され、焼結
金属フィルター（４）を介して各培養皿（３）に供給さ
れる。

培養槽（１）の底部にはオーバーフロー培地出口（８）
があり、各培養皿（３）における培地量を検出するため
のセンサー用として更に又、サンプリング用としての孔
（１２）がある。

（１３）　　（１４）は蓋体に取付けた安全弁と隔膜式
圧力計を示す。又、（９）は覗窓である。

第１図に示すものによれば培地が下方から供給されるた
めヘッド圧によって各培養皿（３）に供給される培地の
量が均一でなく、したがって各培養皿（３）において調
整する必要があるが、第３図のものによれば各培養皿（
３）ＩｒｆＪ々に供給管（１１）を介して供給されるの
でその必要はない。

第５図のものは前述した如く培養皿への培地供給量を調
節するもので、焼結金属フィルター（４）の開口度をリ
ング（１５）の遮蔽度によって調節する。リング（１５
）の取付具（１５ａ　）にはてこ杆（１６）の一端が取
付けられ、他端は蓋体（５）の懸吊杆（１８）にピン止
め（１８ａ　）されている。そして、てこ杆（１６）の
中間は培養皿（３）の支持具（１７）に支点（１７ａ　
）止めされている。

そこで懸吊杆（１８）のナソ）　（１９）の蝮合度によ
り広吊杆（１８）は昇降し、これによって、てこ杆（１
６）の一端（１８ａ　）は昇降するのでてこ杆（１６）
の他端は逆の昇降を行い、リング（１５）を昇降させ焼
結金属フィルター（４）の開口度を調節する。

てこ杆（１６）と取付具（１５ａ　）との連結は次のよ
うになっている。すなわち、てこ杆（１６）の内孔（２
０）にスプリング（２１）が介装され、このスプリング
（２１）で押圧されるスライド自在なピン（２２）が取
付具（１５ａ　）にピン止めされている。したがってリ
ング（１５）はスプリング（２１）によって緩衝される
。

図示のものは中実軸筒（２）に取付けられた培養皿（３
）のボス（３ｃ）上にリング（１５）が位置している。

中実軸筒（２）内の焼結金属フィルター（４）はリング
状をなし、中実軸筒（２）の拡大径部（２ｃ）のスリッ
ト部（２ｄ）に臨んでいる。

したがってリング（１５）内部形状もこれに対応した形
状となっている。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明培養装置の切断面図第２図は特殊なフィルターをヒダ状にした使用する場合
の斜面図第３．４図は他の実施例にかかる本発明装置の切断面図
と平面図第５図は培地供給量調節装置を示す切断面図箱６．７図
は焼結金属フィルタ一部分の切断面図と正面図第８．９図はリングの切断面図と正面図第１０．１１図
は焼結金属フィルタ一部にリングを取付けた状態の切断
面図と正面図である。（１）・・・・培養槽（２）・・・・中実軸筒（３）・・・・培養皿（４）・・・・焼結金属フィルター（５）・・・・蓋体（６）（７）　　・気相出入口（８）・・・・オーバーフロー培地出口（９）・・・・
覗窓第　１　図第２図第４図・第　６　図第８図

Claims

【特許請求の範囲】

底面が外周に向かって下向きに傾斜し、かつ外周に断面
山形の立縁を形成した培養皿を一定の間隔を隔てて培養
槽内に多段に設け、かつ各培養皿の中央部分には焼結金
属フィルターを設けてここから培地が供給されるように
構成し、更に培養槽底面にはオーバーフロー培地出口を
設けたことを特徴とする細胞培養装置。