JPS62108157A - 抗体 - Google Patents
抗体Info
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- JPS62108157A JPS62108157A JP60248639A JP24863985A JPS62108157A JP S62108157 A JPS62108157 A JP S62108157A JP 60248639 A JP60248639 A JP 60248639A JP 24863985 A JP24863985 A JP 24863985A JP S62108157 A JPS62108157 A JP S62108157A
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- JP
- Japan
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- antibody
- glu
- leu
- pro
- erbb
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- Granted
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
この発明は抗体に関し、更に詳しくは、発癌に関与して
いるといわれているＣ−・ｒｂＢ−２遺伝子の産物に対
する抗体に関する。このような抗体は、癌の診断薬とし
て使用できる。
いるといわれているＣ−・ｒｂＢ−２遺伝子の産物に対
する抗体に関する。このような抗体は、癌の診断薬とし
て使用できる。
従来の技術
Ｃ−＠ｒｂＢ−２遺伝子は赤芽球症ウィルスの発癌遺伝
子Ｖ−ｅｒｂＢ 及び上皮増殖因子レセプターときわめ
て類似した構造をもつ細胞性遺伝子で、増殖因子のレセ
プターをコードしていると考えられている。
子Ｖ−ｅｒｂＢ 及び上皮増殖因子レセプターときわめ
て類似した構造をもつ細胞性遺伝子で、増殖因子のレセ
プターをコードしていると考えられている。
この遺伝子は、ヒト顎下腺の腺癌、胃癌、乳癌等で遺伝
子増幅や再配列をおこしており、これらの癌で多量に遺
伝子産物を発現していることが明らかとなっている。
子増幅や再配列をおこしており、これらの癌で多量に遺
伝子産物を発現していることが明らかとなっている。
また、神経／膠芽腫から見出されｎ６ｕと名づけられた
発癌遺伝子はＣ−ｅｒｂＢ−２であることが明らかとな
っている。従って、このようなＣ−＠ｒｂＢ −２遺伝
子産物に対する抗体はヒトの癌の診断に使用できる。
発癌遺伝子はＣ−ｅｒｂＢ−２であることが明らかとな
っている。従って、このようなＣ−＠ｒｂＢ −２遺伝
子産物に対する抗体はヒトの癌の診断に使用できる。
この発明の目的は従って、Ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子産物
に対する抗体を得ることにある、Ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝
子産物に対する抗体は癌の診断薬として使用できる。
に対する抗体を得ることにある、Ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝
子産物に対する抗体は癌の診断薬として使用できる。
このような状況下において、本発明者らは。
Ｃ−＠ｒｂＢ−２遺伝子産物のカル−キシル−末端の下
記のアミノ酸配列（以下「抗原ペグチド」と記す）を抗
原としてＣ−５ｒｂＢ−２遺伝子度物に対する抗体を得
ることに成功した。
記のアミノ酸配列（以下「抗原ペグチド」と記す）を抗
原としてＣ−５ｒｂＢ−２遺伝子度物に対する抗体を得
ることに成功した。
抗原ペプチド：
Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−ＧＩｕ−’
ｒｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇ１ｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐ
ｒｏ−Ｖａ１抗原（デチドを用いて抗血清を得るには、
抗原ペプチドと適当なキャリヤー蛋白と結合せしめて後
、抗原として用いる。
ｒｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇ１ｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐ
ｒｏ−Ｖａ１抗原（デチドを用いて抗血清を得るには、
抗原ペプチドと適当なキャリヤー蛋白と結合せしめて後
、抗原として用いる。
キャリヤー蛋白としては、キーホールリンベクトヘモシ
アニｙ （ＫＬＨ） 、ウシ血清アルブミン等、従来知
られているもののいずれも使用できる。キャリヤー蛋白
と抗原ペプチドとを結合せしめるにはサインニイミドを
用いる方法（Ｔ、 Ｋｉｔａｇａｗａ ａｔａｌ、 Ｊ
、 Ｂｉｏｃｈｓｍ、 ７９，２３３（１９７６））Ｙ
用いればよい。
アニｙ （ＫＬＨ） 、ウシ血清アルブミン等、従来知
られているもののいずれも使用できる。キャリヤー蛋白
と抗原ペプチドとを結合せしめるにはサインニイミドを
用いる方法（Ｔ、 Ｋｉｔａｇａｗａ ａｔａｌ、 Ｊ
、 Ｂｉｏｃｈｓｍ、 ７９，２３３（１９７６））Ｙ
用いればよい。
キャリヤー蛋白と抗原（グチドとの結合物を用いて、マ
ウス、ウサギ、ラット、ヒツジ等の動物を免疫する。免
疫方法も又通常の方法でよい。
ウス、ウサギ、ラット、ヒツジ等の動物を免疫する。免
疫方法も又通常の方法でよい。
得られた抗血清より本発明の抗体を得る方法も従来知ら
れているいずれの方法も採用できる。具体的には、例え
ば、採血後、抗血清を作成する、Ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝
子が多量に発現しているヒト胃癌細胞ＭＫＮ７を３５８
−Ｍａｔでラベルした後、細胞を可溶化し、採取した抗
血清で免疫沈降を行なう。沈降した物質を５ＤＳ−電気
泳動で解析し、分子量１８５．０００のＣ−５ｒｂＢ−
２蛋白が検出できるか１で、Ｃ−ｅｒｂ−２遺伝子産物
に対する抗体があるか否かが判定できる。
れているいずれの方法も採用できる。具体的には、例え
ば、採血後、抗血清を作成する、Ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝
子が多量に発現しているヒト胃癌細胞ＭＫＮ７を３５８
−Ｍａｔでラベルした後、細胞を可溶化し、採取した抗
血清で免疫沈降を行なう。沈降した物質を５ＤＳ−電気
泳動で解析し、分子量１８５．０００のＣ−５ｒｂＢ−
２蛋白が検出できるか１で、Ｃ−ｅｒｂ−２遺伝子産物
に対する抗体があるか否かが判定できる。
あるいは上記のように免疫した動物のリンパ球とミエロ
ーマとを融合させ１本発明の抗体を特異的に産生ずるハ
イプリドーマを得、これによってモノクローナル抗体と
して１本発明の抗体を得ることもできる。
ーマとを融合させ１本発明の抗体を特異的に産生ずるハ
イプリドーマを得、これによってモノクローナル抗体と
して１本発明の抗体を得ることもできる。
このようにして得られた免疫グロブリンは、以下のよう
な性質を有するものである。
な性質を有するものである。
１）免疫グロブリンの種類 ：１ｇＧ
２）分子ｔ： １５０Ｘ１０ ｄａｌｔｏｎ３〕 分子
吸光係数 ： Ｅ” ２８０ｎｍ＝１４．０ｍ ４〕 得られた抗体は、Ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子産物と
反応する。
吸光係数 ： Ｅ” ２８０ｎｍ＝１４．０ｍ ４〕 得られた抗体は、Ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子産物と
反応する。
作用
本発明の抗体は癌の診断薬として使用できるほか、癌の
治療薬として使用できる可能性がある。
治療薬として使用できる可能性がある。
実施例
（１） 抗原蛋白の調製
抗原性が高い一２７″チドは、Ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子
構造から、Ｔｈｒ−Ａｉｍ−Ｇｌ ｕ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ
−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−
Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａ’ｌ とした。本（プチドの合
成はペックマン社９９０Ｂ自動ペグチド合成装置を用い
固相法で行なった。
構造から、Ｔｈｒ−Ａｉｍ−Ｇｌ ｕ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ
−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−
Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａ’ｌ とした。本（プチドの合
成はペックマン社９９０Ｂ自動ペグチド合成装置を用い
固相法で行なった。
合成されたペプチドを、７５係）、化水素／２５係アニ
ソール中で３０分間Ｏ℃で加温することにより樹脂から
脱離した。合成された一ｅグチドは、ｓｐ−セフアゾ、
クスカラム（２，５ｍＭＸ５０ｃｒ１１）（０，０５Ｍ
酢酸アンモニウム、ｐＨ７，０及び１ｍＭジチオスライ
トールで平衡化）に吸着させた。５００ｄの同緩衝液と
、０．５Ｍ酢酸アンモニウム及び１ｍＭジチオスライド
−ルーア、０，５００ＷＬｌのグラジェントで目的の一
！グチドを分画精製した。各画分をフルオロレスカミン
でペプチドを検出し、ペプチド含有画分を集め、濃縮し
た。３０係酢酸で平衡化したセファデックスＧ−１０カ
ラム（１０ｃｍＸ５０画）に上記濃縮液を加え蛋白画分
を集めた。得られた４プチド画分を濃縮乾固した。ペプ
チドの構成アミノ酸組成は、ペプチドをＩＮ塩酸で１２
０℃１晩の加水分解によシ調ぺた。加水分解物はアミノ
酸アナライザーを用いて測定した。
ソール中で３０分間Ｏ℃で加温することにより樹脂から
脱離した。合成された一ｅグチドは、ｓｐ−セフアゾ、
クスカラム（２，５ｍＭＸ５０ｃｒ１１）（０，０５Ｍ
酢酸アンモニウム、ｐＨ７，０及び１ｍＭジチオスライ
トールで平衡化）に吸着させた。５００ｄの同緩衝液と
、０．５Ｍ酢酸アンモニウム及び１ｍＭジチオスライド
−ルーア、０，５００ＷＬｌのグラジェントで目的の一
！グチドを分画精製した。各画分をフルオロレスカミン
でペプチドを検出し、ペプチド含有画分を集め、濃縮し
た。３０係酢酸で平衡化したセファデックスＧ−１０カ
ラム（１０ｃｍＸ５０画）に上記濃縮液を加え蛋白画分
を集めた。得られた４プチド画分を濃縮乾固した。ペプ
チドの構成アミノ酸組成は、ペプチドをＩＮ塩酸で１２
０℃１晩の加水分解によシ調ぺた。加水分解物はアミノ
酸アナライザーを用いて測定した。
（プチドのアミノ酸組成は以下の通りでありた１゜Ａｓ
ｎ Ｏ，９；Ａｓｐ １．０ ：Ａｌｍ １．０ ：Ｇ
ｌｙ Ｏ，９；Ｇｌｕ ２．０ ；Ｌ＠ｕ １．９ ：
Ｔｈｒ １．０ ；Ｔｙｒ Ｏ，９；Ｐｒｏ １．９
： Ｖａｌ ２．０ このペプチドにキャリヤー蛋白を以下のように付加させ
た。１ｏｍｐ／ゴ（１０ｍＭリン酸・々ツファーｐＨ７
，０）にとかしたキーホールリンベットヘモシアニンと
６３μｌの１５ ｍ９７ａｔ ｍ−マレイミド−Ｎ−ハ
イドロキシサクシミドエステルとを混合し、３０分間室
温に保持反応した。反応液を４℃で、０．１Ｍ燐酸バッ
ファー（Ｐ）１６．０）で平衡化した「セファデックス
Ｇ−２５４を用いて、カラムクロマトグラフィを行り九
。２，３コの活性化したキーホールリンベットヘモシア
ニンとｇ、１ｍの合成した当該ペプチド（１０η／ｄに
リン酸・々ツフ了−ＰＨ７，３＋ ５ ｍ！ｌ／Ｉ Ｅ
ＤＴＡ ）を混合し、−を６．５にあわせ混合した。４
時間室温で混合し、キーホールリンペットヘモシアニン
と合成した当該間デチドな結合させた。結合したかいな
かを５ＤＳ−電気泳動により確認した。
ｎ Ｏ，９；Ａｓｐ １．０ ：Ａｌｍ １．０ ：Ｇ
ｌｙ Ｏ，９；Ｇｌｕ ２．０ ；Ｌ＠ｕ １．９ ：
Ｔｈｒ １．０ ；Ｔｙｒ Ｏ，９；Ｐｒｏ １．９
： Ｖａｌ ２．０ このペプチドにキャリヤー蛋白を以下のように付加させ
た。１ｏｍｐ／ゴ（１０ｍＭリン酸・々ツファーｐＨ７
，０）にとかしたキーホールリンベットヘモシアニンと
６３μｌの１５ ｍ９７ａｔ ｍ−マレイミド−Ｎ−ハ
イドロキシサクシミドエステルとを混合し、３０分間室
温に保持反応した。反応液を４℃で、０．１Ｍ燐酸バッ
ファー（Ｐ）１６．０）で平衡化した「セファデックス
Ｇ−２５４を用いて、カラムクロマトグラフィを行り九
。２，３コの活性化したキーホールリンベットヘモシア
ニンとｇ、１ｍの合成した当該ペプチド（１０η／ｄに
リン酸・々ツフ了−ＰＨ７，３＋ ５ ｍ！ｌ／Ｉ Ｅ
ＤＴＡ ）を混合し、−を６．５にあわせ混合した。４
時間室温で混合し、キーホールリンペットヘモシアニン
と合成した当該間デチドな結合させた。結合したかいな
かを５ＤＳ−電気泳動により確認した。
（２）抗体の調製
得られたキャリヤーと４グチド結合物１■をフロイント
の完全アジュバントと共にウサギの指掌部に注射した。
の完全アジュバントと共にウサギの指掌部に注射した。
以後３週間間隔で２００μＩづつ４回つサギ背皮下に免
疫した。最終免疫の後１０日目に採血し血清を得た。血
清を遠心（１００００ＸＩｉ。
疫した。最終免疫の後１０日目に採血し血清を得た。血
清を遠心（１００００ＸＩｉ。
５分）した上清に飽和硫安溶液（ｐ）１７．４）を加え
て４０％飽和とした。−晩水冷下で攪拌した後、１１０
０００Ｘにて５分間遠心し、沈殿物を得た。沈殿物を蒸
留水に溶かし、２００倍量の０．１５ ＭＮａＣＬに対
し、３６時間透析した。得られた抗血清２Ｉｔｌを１９
ｍＭリン酸緩衝液（ｐ）１７．２）で平衡化したＤＥＡ
Ｅ−セルロース（ワットマンＤＥ３２）カラム（１ｃｍ
Ｘ １５ ｃｍ ）に添加した。免疫グロブリンＩｇ
Ｇ画分は素通りして溶出されるので、この画分を回収し
た。２ｄの抗血清から２４■のＩｇＧが得られた。集め
たＩｇＧを０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，０
）に透析した。
て４０％飽和とした。−晩水冷下で攪拌した後、１１０
０００Ｘにて５分間遠心し、沈殿物を得た。沈殿物を蒸
留水に溶かし、２００倍量の０．１５ ＭＮａＣＬに対
し、３６時間透析した。得られた抗血清２Ｉｔｌを１９
ｍＭリン酸緩衝液（ｐ）１７．２）で平衡化したＤＥＡ
Ｅ−セルロース（ワットマンＤＥ３２）カラム（１ｃｍ
Ｘ １５ ｃｍ ）に添加した。免疫グロブリンＩｇ
Ｇ画分は素通りして溶出されるので、この画分を回収し
た。２ｄの抗血清から２４■のＩｇＧが得られた。集め
たＩｇＧを０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，０
）に透析した。
次ニキャリャー蛋白に用いたキーホールラン（ットヘモ
シアニンに対する抗体を除去するため、キャリヤー蛋白
−結合セファロース４Ｂカラムを用いてキャリヤー蛋白
抗体を結合させた。すなわチ、ＣＮＢｒ−活性化セファ
ロース４Ｂ（ファルマシア製１７−０４３１−０１）０
．５．９を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐ）１９．ｏ）５ｍＫ
投入し、ただちに、キーホールランベットヘモシアニン
２５ダを加工、氷冷しながら２４時間攪拌した。このよ
うにしてできたキャリヤー蛋白結合セファロース４Ｂを
０、５ ｃｍ Ｘ ２０ ａｎのカラム忙つめ、このカ
ラムにＩｇＧ画分２ゴをのせた。洗浄用緩衝液（０，１
５ＭＮａＣＡ／ ０．０２ Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液ｔ
ＰＨ８，０）で洗浄し、未結合のまま溶出した蛋白をす
べて集め念、得られたＩｇＧはさらにペグチドを結合さ
せたセファロース４Ｂカラムで精製した。ペプチド結合
セファロース４Ｂカラムの作成方法は前述の通り、この
（プチド結合セファロース４Ｂカラム（０，５ｃｍ Ｘ
２０ ｃｍ ）に上記で得られたＩｇＧ画分をのせ、
洗浄用緩衝液（０，１５Ｍ ＮａＣｔ／ ｏ、ｏ ２
Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液ｔＰＨ８，０）で十分洗浄し、
０１７Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２，３）でカラム
に吸着した抗ペプチド抗体を溶出させた。集めた溶出液
を０．１５ Ｍ ＮａＣ２に対して透析し、限外濾過で
濃縮した。このようにして２゜５ダ／ｍｌのＩｇＧ溶液
０．５ゴを得九。
シアニンに対する抗体を除去するため、キャリヤー蛋白
−結合セファロース４Ｂカラムを用いてキャリヤー蛋白
抗体を結合させた。すなわチ、ＣＮＢｒ−活性化セファ
ロース４Ｂ（ファルマシア製１７−０４３１−０１）０
．５．９を０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐ）１９．ｏ）５ｍＫ
投入し、ただちに、キーホールランベットヘモシアニン
２５ダを加工、氷冷しながら２４時間攪拌した。このよ
うにしてできたキャリヤー蛋白結合セファロース４Ｂを
０、５ ｃｍ Ｘ ２０ ａｎのカラム忙つめ、このカ
ラムにＩｇＧ画分２ゴをのせた。洗浄用緩衝液（０，１
５ＭＮａＣＡ／ ０．０２ Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液ｔ
ＰＨ８，０）で洗浄し、未結合のまま溶出した蛋白をす
べて集め念、得られたＩｇＧはさらにペグチドを結合さ
せたセファロース４Ｂカラムで精製した。ペプチド結合
セファロース４Ｂカラムの作成方法は前述の通り、この
（プチド結合セファロース４Ｂカラム（０，５ｃｍ Ｘ
２０ ｃｍ ）に上記で得られたＩｇＧ画分をのせ、
洗浄用緩衝液（０，１５Ｍ ＮａＣｔ／ ｏ、ｏ ２
Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液ｔＰＨ８，０）で十分洗浄し、
０１７Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２，３）でカラム
に吸着した抗ペプチド抗体を溶出させた。集めた溶出液
を０．１５ Ｍ ＮａＣ２に対して透析し、限外濾過で
濃縮した。このようにして２゜５ダ／ｍｌのＩｇＧ溶液
０．５ゴを得九。
（３） Ｃ−ｅｒｂ１３−２遺伝子産物抗体ノ性質（
３） −１ＩｇＧであることの証明 精製したＣ−ｅｒｂＢ−２蛋白抗体がＩｇＧクラスであ
ることは、抗体のクラス別に作成された抗Ｉｇ抗体で免
疫沈降するかどうかで判定できる、すなわち抗つサギＩ
ｇＧ抗体（カッイル社製Ａ０２１２−０１２４）、抗つ
サギＩｇＭ抗体（カッイル社！１１０２１２−０２１０
）、抗ウサギＩｇＡ＋ ＩｇＭ＋ ＩＫＧ抗体（カッベ
ル社製黒０２１２−０２３４）を用いて免疫沈降した。
３） −１ＩｇＧであることの証明 精製したＣ−ｅｒｂＢ−２蛋白抗体がＩｇＧクラスであ
ることは、抗体のクラス別に作成された抗Ｉｇ抗体で免
疫沈降するかどうかで判定できる、すなわち抗つサギＩ
ｇＧ抗体（カッイル社製Ａ０２１２−０１２４）、抗つ
サギＩｇＭ抗体（カッイル社！１１０２１２−０２１０
）、抗ウサギＩｇＡ＋ ＩｇＭ＋ ＩＫＧ抗体（カッベ
ル社製黒０２１２−０２３４）を用いて免疫沈降した。
方法はオフタロニー法を用いた。すなわち、１チの寒天
中にあけた穴の中心に抗つサギＩｇ抗体３種を入れ、ま
わシの穴には抗体に対して１／２０ｔから２倍づつ希釈
した精製Ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子産物抗体を入れる。０
℃で１晩放置後形成された沈降線を観察した所、精製Ｃ
−・ｒｂＢ−２蛋白抗体は抗つサギＩｇＧ抗体及び抗ウ
サギＩｇＡ ＋ ＩｇＭ ＋ ＩｇＧ抗体とのみ沈降し
たことがらＩｇＧであると確認できた。
中にあけた穴の中心に抗つサギＩｇ抗体３種を入れ、ま
わシの穴には抗体に対して１／２０ｔから２倍づつ希釈
した精製Ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子産物抗体を入れる。０
℃で１晩放置後形成された沈降線を観察した所、精製Ｃ
−・ｒｂＢ−２蛋白抗体は抗つサギＩｇＧ抗体及び抗ウ
サギＩｇＡ ＋ ＩｇＭ ＋ ＩｇＧ抗体とのみ沈降し
たことがらＩｇＧであると確認できた。
（３） −２分子量
精製したＣ−ｅｒｂＢ−２遺伝子産物抗体の分子量はセ
ファデックスＧ−１００を用いるｒル濾過法により求め
た。すなわち０．０２Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液で平衡化
させたセフアゾ、クスＧ−１００（１ｃｍ Ｘ １００
ｃｍ ）カラムに１叩の精製Ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子
産物抗体なのせ、同緩衝液で展開した。
ファデックスＧ−１００を用いるｒル濾過法により求め
た。すなわち０．０２Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液で平衡化
させたセフアゾ、クスＧ−１００（１ｃｍ Ｘ １００
ｃｍ ）カラムに１叩の精製Ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子
産物抗体なのせ、同緩衝液で展開した。
２８０ ｎｍの吸光度で溶出蛋白を検出し、分子量測定
スタンダード（バイオラッド社製Ａ １５１−１９０１
、チログロブリン分子量６７００００．γ−グロデリ：
／１５８０００． 卵白アルラミ７４４０００゜ミオ
グロピｙ１７０００．ピタミｙＢ−１２１３５０）の溶
出・母ターンと比較した所分子量１５００００の所にＣ
−ｅｒｂＢ−２遺伝子産物抗体が溶出した。
スタンダード（バイオラッド社製Ａ １５１−１９０１
、チログロブリン分子量６７００００．γ−グロデリ：
／１５８０００． 卵白アルラミ７４４０００゜ミオ
グロピｙ１７０００．ピタミｙＢ−１２１３５０）の溶
出・母ターンと比較した所分子量１５００００の所にＣ
−ｅｒｂＢ−２遺伝子産物抗体が溶出した。
（３） −３分子吸光係数
１ダの精製Ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子産物抗体を炭酸すト
リウム緩衝液（ｐＨ９，０）ｌＩｒＬｌに溶解し、２８
０ｎｍの吸光度を測定した所、１．４０を示したので、
本蛋白の分子吸光係数Ｅ”＝１４．０である。
リウム緩衝液（ｐＨ９，０）ｌＩｒＬｌに溶解し、２８
０ｎｍの吸光度を測定した所、１．４０を示したので、
本蛋白の分子吸光係数Ｅ”＝１４．０である。
ｃｒ１１
（３） −４抗体の免疫特異性
Ｃ−ａｒｂＢ−２遺伝子の発現しているヒト胃癌ＭＫＮ
７細胞を１００μＣＩ〜の Ｓ−メチオニンでラベルす
る。ラベルされた細胞を洗浄した後、ＲＩＰＡ緩衝液（
１係ＮＰ−４０、Ｏ１１係デオキシコール酸−Ｎａ塩−
０，１５Ｍ ＮａＣ２ｅ ｉ ｒｒＭｉフェニルエチ／
ｌ／スルフォニールフルオライド＝ ５０ ｍＭＴｒｉ
ｓ −ＨＣ２ｐＨ７，４）に懸濁し、０℃にて２０分溶
解させた。
７細胞を１００μＣＩ〜の Ｓ−メチオニンでラベルす
る。ラベルされた細胞を洗浄した後、ＲＩＰＡ緩衝液（
１係ＮＰ−４０、Ｏ１１係デオキシコール酸−Ｎａ塩−
０，１５Ｍ ＮａＣ２ｅ ｉ ｒｒＭｉフェニルエチ／
ｌ／スルフォニールフルオライド＝ ５０ ｍＭＴｒｉ
ｓ −ＨＣ２ｐＨ７，４）に懸濁し、０℃にて２０分溶
解させた。
溶出液を１００，０００）ｌにて３０分間遠心後、上澄
液を得た。この上澄液１５０μｔと前に得られた抗体１
０μｔを１時間０℃反応させた、抗原−抗体複合体はプ
ロティンＡセファロースＣＬ−４Ｂ （ファルマシア製
１７−０７８０−０１ ）であつめた。
液を得た。この上澄液１５０μｔと前に得られた抗体１
０μｔを１時間０℃反応させた、抗原−抗体複合体はプ
ロティンＡセファロースＣＬ−４Ｂ （ファルマシア製
１７−０７８０−０１ ）であつめた。
抗原−抗体複合体沈殿物をＬａｅｍｍｌｉの方法に従ｌ
い１０４ ＳＤＳ−ｇ＠ｔにて電気泳動した。得られた
ゲルを常法に従ってラジオオートグラフィーにより分析
した。
い１０４ ＳＤＳ−ｇ＠ｔにて電気泳動した。得られた
ゲルを常法に従ってラジオオートグラフィーにより分析
した。
表１より明かなように、抗Ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子産物
血清はヒト胃癌ＭＫＮ７細胞から分子量１８５０００の
蛋白を沈降した。Ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子の発現してい
ない正常細胞ではこの蛋白は沈降しない。また抗Ｃ−・
ｒｂＢ−２遺伝子産物抗体を免疫に用いた４ｆチドで吸
収してから同様の実験をおこなうと、この蛋白は沈降し
ないことがわかった。したがってＣ−ａｒｂＢ−２遺伝
子産物抗体はＣ−５ｒｂＢ−２遺伝子産物を認識してい
ることが明らかである。
血清はヒト胃癌ＭＫＮ７細胞から分子量１８５０００の
蛋白を沈降した。Ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子の発現してい
ない正常細胞ではこの蛋白は沈降しない。また抗Ｃ−・
ｒｂＢ−２遺伝子産物抗体を免疫に用いた４ｆチドで吸
収してから同様の実験をおこなうと、この蛋白は沈降し
ないことがわかった。したがってＣ−ａｒｂＢ−２遺伝
子産物抗体はＣ−５ｒｂＢ−２遺伝子産物を認識してい
ることが明らかである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 下記のペプチドを抗原として得られる抗体 【遺伝子配列があります】
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60248639A JPH076982B2 (ja) | 1985-11-06 | 1985-11-06 | 抗 体 |
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Non-Patent Citations (1)
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