JPS62105047A - Method for fractionating and measuring bilirubin - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To easily fractionate and measure the Bdelta (delta bilirubin) and Bc (conjugate type bilirubin) existing in the body fluid of a living body by measuring the coloration of an azo dye formed by the reaction of the bilirubin and diazonium salt. CONSTITUTION:a) A sample and bilirubin oxidase are first incubated in the presence of a buffer having pH ranging 9-11 to erase the Bc contained in the sample. The unreacted Bdelta and Bu are, therefore, contained in the resultant mixture of reaction. b): The resultant mixture of reaction formed in a) and the diazonium salt are mixed to from the azo dye. The intensity of the coloration of the formed azo dye is proportional to the concn. of Bdelta. c): The sample and the diazonium salt are mixed and the coloration of the azo dye formed in accordance with the reaction of DB (direct type bilirubin) and the diazonium salt is measured. d): The measured value obtd. in b) is substrated from the measured value obtd. in c), by which Bc is calculated.

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はビリルビンを分別測定する方法に関する。さら
に詳しくは、本発明は酵素ビリルビンオキシダーゼ（Ｅ
Ｃ１，３，３，５）およびジアゾニウム塩を用いるデル
タビリルビンおよび抱合型ビリルビンの分別測定法に関
する。ビリルビンは臨床化学検査における重要な測定項
目の一つである。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Field of the Invention The present invention relates to a method for differentially measuring bilirubin. More specifically, the present invention relates to the enzyme bilirubin oxidase (E
C1,3,3,5) and a method for differentially measuring delta bilirubin and conjugated bilirubin using diazonium salts. Bilirubin is one of the important measurement items in clinical chemistry tests.

従来の技術 ビリルビンはヘモグロビンの代謝によって生成する黄色
の物質で、肝臓から胆汁の色素として分泌される。血清
などの生体体液中において、ビリルビンは三種類の形態
で主に存在する。即ち、抱合型ビリルビン（以下Ｂｃと
いう）、非抱合型ビリルビン（以下Ｂｕという）および
デルタビリルビン（以下Ｂδという）の三種類に分類さ
れ、これらの合計がトータルビリルビン（以下ＴＢとい
う）と称される。Ｂｃは、ビリルビンが肝臓中のＵＤＰ
グルクロニルトランスフェラーゼの作用でグルクロン酸
抱合を受けて生成したもので、グルクロン酸が１分子結
合したモノグルクロナイド型または２分子結合したジグ
ルクロナイド型として存在する。Ｂｕは上記の抱合酵素
の作用を受けておらず、遊離型ビリルビンとも称される
。ＢｃおよびＢｕは血清中ではアルブミンと比較的緩く
結合した状態で存在する。第三の形態のＢδは血清アル
ブミンと非可逆的に結合した状態で存在する（Ｊ、　Ｌ
ａｂ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｅｄ、、　６７．２９４−３０
６．　（１９６６）およびＣｌ１ｎ、　Ｃｈｅｍ、、２
８，６２９　６３７．　（１９Ｂ２）　）　、上記の各
形態のビリルビンの分別定量は肝疾患の診断の指標とし
て重要である。Bilirubin is a yellow substance produced by the metabolism of hemoglobin, and is secreted from the liver as a bile pigment. In biological body fluids such as serum, bilirubin mainly exists in three types of forms. That is, it is classified into three types: conjugated bilirubin (hereinafter referred to as Bc), unconjugated bilirubin (hereinafter referred to as Bu), and delta bilirubin (hereinafter referred to as Bδ), and the sum of these is called total bilirubin (hereinafter referred to as TB). . Bc indicates that bilirubin is UDP in the liver.
It is produced through glucuronidation by the action of glucuronyltransferase, and exists as a monoglucuronide type in which one molecule of glucuronic acid is bound or a diglucuronide type in which two molecules of glucuronic acid are bound. Bu is not affected by the above-mentioned conjugating enzymes and is also called free bilirubin. Bc and Bu exist in serum in a relatively loosely bound state to albumin. A third form of Bδ exists irreversibly bound to serum albumin (J, L
ab, Cl1n, Med, 67.294-30
6. (1966) and Cl1n, Chem, 2
8,629 637. (19B2) ), differential quantification of each of the above forms of bilirubin is important as an indicator for the diagnosis of liver diseases.

従来ビリルビンの分別測定法としては、ビリルビンとジ
アゾニウム塩との反応で生ずるアゾビリルビンを比色す
るジアゾ法、ビリルビンオキシダーゼの作用によるビリ
ルビンの黄色の消失を測定する酵素的方法、媒染された
ビリルビンの色を比色するＥＫＴＡＣＨＥＭ法（コダッ
ク社の登録商標）およびカラムクロマトグラフィーによ
る方法（Ｊ、　Ｌａｂ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｅｄ、、　６
７．２８２　２９３．　（１９６６）　）または高速液
体クロマトグラフィーによる方法〔前掲のＪ、　Ｌａｂ
、　Ｃ１ｔｎ、　Ｍｅｄ、、　６７．２９４−３０６゜
（１９６６）およびＪ、　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、、　
２２６．３９１　４０２゜（１９８１）　）が知られて
いる。Conventional methods for differentially measuring bilirubin include the diazo method, which measures the color of azobilirubin produced by the reaction between bilirubin and diazonium salt, the enzymatic method, which measures the disappearance of the yellow color of bilirubin due to the action of bilirubin oxidase, and the color of mordanted bilirubin. EKTACHEM method (registered trademark of Kodak Company) and column chromatography method (J, Lab, Cl1n, Med, 6
7.282 293. (1966)) or a method using high performance liquid chromatography [J. Lab.
, C1tn, Med, 67.294-306° (1966) and J, Chromatogr, .
226.391 402° (1981)) is known.

生体体液中のビリルビンは、ジアゾ法により、メタノー
ルに例示されるようなジアゾニウム塩と非抱合型ビリル
ビンとのカップリング反応を推進する添加剤を必要とす
る間接型ビリルビンおよびそれを必要としない直接型ビ
リルビンに分別される（金井泉著：臨床検査法提要、第
２８版、金属出版、第Ｘｌｌ−２４頁、昭和５３年）。Bilirubin in biological body fluids is produced by the diazo method, including indirect bilirubin, which requires an additive to promote the coupling reaction between a diazonium salt and unconjugated bilirubin, such as methanol, and direct bilirubin, which does not require such an additive. It is separated into bilirubin (written by Izumi Kanai, Summary of Clinical Testing Methods, 28th edition, Kinzoku Publishing, page Xll-24, 1978).

間接型および直接型の呼称はジアゾニウム塩に対するビ
リルビンの反応性の相違による命名である。即ち、間接
反応型のビリルビンはＢｕに相当するが、直接反応型の
ビリルビンにはＢδおよびＢｃが含まれる。The indirect type and direct type are named based on the difference in reactivity of bilirubin to diazonium salts. That is, indirect reaction type bilirubin corresponds to Bu, while direct reaction type bilirubin includes Bδ and Bc.

ジアゾ法を利用したＢδおよびＢｃの分別測定法は本願
出願前には知られていない。A method for differentially measuring Bδ and Bc using the diazo method was not known before the filing of this application.

ビリルビンオキシダーゼを用いる酵素的分別測定法では
、ビリルビンオキシダーゼの直接型および間接型ビリル
ビンに対する反応性の差異を基本的に利用して、即ちビ
リルビンオキシダーゼを単独で使用して直接型ビリルビ
ン（以下ＤＢという）が、そしてビリルビンオキシダー
ゼを陰イオン界面活性剤と共に使用してＴＢが測定され
る〔臨床病理、３０（補）　、　１２３．　（１９８２
）　　；　５ｅｌｅｃｔｅｄＴｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｃ１
１ｎ、　　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　２　＋　９７　１０７
＋（１９８４）および特開昭５９−１７，９９９）。更
に、最近ビリルビンオキシダーゼを使用しより高精度に
ビリルビンを分別定量するだめの条件が報告されている
。例えば、ｐｉ（３，５〜４．５において、または陰イ
オン界面活性剤の存在下ｐＨ６〜９において試料にビリ
ルビンオキシダーゼを作用せしめそれぞれＤＢおよびＴ
Ｂを測定する方法（特開昭５９−１２５．８９９および
同５９−１３０，１９８　）　、ｐＨ４，４で反応を行
いＢｅを測定する方法〔臨床病理、３２（？り。In the enzymatic fractional measurement method using bilirubin oxidase, the difference in reactivity of bilirubin oxidase to direct and indirect bilirubin is basically utilized, that is, bilirubin oxidase is used alone to detect direct bilirubin (hereinafter referred to as DB). , and TB is measured using bilirubin oxidase with an anionic surfactant [Clinical Pathology, 30 (Supplementary), 123. (1982
); 5 selectedTopics in C1
1n, Enzymol, 2 + 97 107
+ (1984) and JP-A-59-17,999). Furthermore, conditions for differentially quantifying bilirubin with higher precision using bilirubin oxidase have recently been reported. For example, a sample is treated with bilirubin oxidase at pi (3.5 to 4.5) or at pH 6 to 9 in the presence of an anionic surfactant, and DB and T
Method for measuring Be (Japanese Patent Application Laid-Open Nos. 59-125.899 and 59-130.198), Method for measuring Be by carrying out reaction at pH 4.4 [Clinical Pathology, 32 (2003).

３７３、　（１９８４）　）　、陰イオン界面活性剤の
存在下ｐＨ５〜６で反応を行いＢｃを測定する方法（特
開昭６０−１５２，９５５　）　、陰イオン界面活性剤
の存在下ｐＨ８以上で反応を行いＢｕを測定する方法（
特開昭６０−１５４，１６２　＞およびグリシン−水酸
化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０，０）の存在下で反応を
行いＢｃを測定する方法〔日本臨床検査自動化学会会誌
。373, (1984)), a method of measuring Bc by conducting a reaction at pH 5 to 6 in the presence of an anionic surfactant (JP-A-60-152,955), a method of measuring Bc by conducting a reaction at pH 8 or above in the presence of an anionic surfactant. Method of measuring Bu (
JP-A-60-154,162> and a method for measuring Bc by conducting a reaction in the presence of a glycine-sodium hydroxide buffer (pH 10,0) [Journal of the Japanese Society of Clinical Laboratory Automation.

１０（補血）　、　１５４．　（１９８５）　）が報告
されている。10 (blood supplementation), 154. (1985)) have been reported.

上述のＢｃの測定に関する先行技術において、最後に述
べたグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液を用いる方法以
外の方法では、得られた測定値にはＢδが一部含まれ、
真のＢｃ値を表しているとはいえない。また、酵素法に
よるＢδの測定法は報告されていない。In the prior art related to the measurement of Bc mentioned above, in methods other than the last mentioned method using a glycine-sodium hydroxide buffer, the obtained measured value partially contains Bδ,
It cannot be said that it represents the true Bc value. Furthermore, a method for measuring Bδ using an enzymatic method has not been reported.

ＥＫＴＡＣＨＥＭ法は、試料中のＢｕおよびＢＣの各々
に作用する特定の媒染剤を反応させ、生成した媒染ビリ
ルビンの各々異なる波長における特異吸収の強度を測定
し、ＢｕおよびＢｃの濃度を求め、これらの合計値をジ
アゾ法で測定したＴＢ値より差し引いてＢｃを求めるも
のである。従って、ＴＢ、ＢｕおよびＢｃをそれぞれ異
なる波長で検出する必要がある（ｃＩｉｎ、　Ｂｉｏｃ
ｈｅ＊、＋　１’Ｌ２２１−２２９．　（１９８４）お
よび特開昭５６−１９．４５４）。The EKTACHEM method involves reacting a specific mordant that acts on each of Bu and BC in a sample, measuring the intensity of specific absorption at different wavelengths of the produced mordant bilirubin, determining the concentrations of Bu and Bc, and calculating the sum of these. Bc is determined by subtracting this value from the TB value measured by the diazo method. Therefore, it is necessary to detect TB, Bu and Bc at different wavelengths (cIin, Bioc
he*, +1'L221-229. (1984) and JP-A-56-19.454).

発明が解決しようとする問題点 前記の従来のジアゾ法によるビリルビンの測定において
は、ＢｃおよびＢｃの分別測定が出来なかった。ビリル
ビンオキシダーゼによる酵素的測定法では、ＤＢ、ＴＢ
およびＢｃをそれぞれ異なるｐＨで測定するため、ｐＨ
の移動によりビリルビンの分子吸光係数が変化すること
、およびｐｔｔの変動により酵素並びに基質ビリルビン
が不安定になるという欠点がある。ＥＫＴＡＣＨＥＭ法
は、三種類の異なる波長で測定しなければならない繁雑
な方法である。また、クロマトグラフィー法は日常の臨
床化学検査の分野では列置採用できない繁雑な方法であ
る。Problems to be Solved by the Invention In measuring bilirubin using the conventional diazo method described above, it was not possible to separately measure Bc and Bc. In the enzymatic measurement method using bilirubin oxidase, DB, TB
and Bc are measured at different pHs, so the pH
The drawbacks are that the molecular extinction coefficient of bilirubin changes due to the movement of , and that the enzyme and substrate bilirubin become unstable due to fluctuations in ptt. The EKTACHEM method is a complicated method that requires measurements at three different wavelengths. Furthermore, the chromatography method is a complicated method that cannot be routinely adopted in the field of clinical chemistry testing.

本発明の目的は、生体体液中に存在するＢｃおよびＢｃ
を簡単かつ高精度に分別測定する方法を提供するもので
ある。より詳しくは、本発明は公知のジアゾ法における
場合と同じ検出方法でＢｃおよびＢｃが分別測定可能な
方法を提供するものである。本発明によれば、公知のジ
アゾ法によるＴＢの測定と同じ波長でＢｃとＢｃの測定
ができる。The object of the present invention is to
The objective is to provide a method to easily and accurately measure fractions. More specifically, the present invention provides a method in which Bc and Bc can be separately measured using the same detection method as in the known diazo method. According to the present invention, Bc and Bc can be measured at the same wavelength as TB measurement by the known diazo method.

問題点を解決するための手段および作用本発明は、ビリ
ルビンオキシダーゼのビリルビンに対する反応性がｐｌ
（によって異なること、即ちｐ１１９乃至１１の範囲に
おいてビリルビンオキシダーゼのＢｃおよびＢｕに対す
る反応性が最小となり、従ってそのｐＨ範囲においてＢ
ｃに対する反応性とＢｃおよびＢｕに対する反応性との
差が最大になるという新たな知見、およびビリルビンは
ジアゾニウム塩とカップリングしてアゾ色素を生成し、
この生成アゾ色素の呈色の強度がビリルビンの濃度に比
例するという公知の知見、を基礎としている。Means and Effects for Solving the Problems The present invention provides that the reactivity of bilirubin oxidase to bilirubin is
(that is, in the range of p119 to p11, the reactivity of bilirubin oxidase to Bc and Bu is minimum, and therefore in that pH range, Bc and Bu
The new finding that the difference between the reactivity towards Bc and the reactivity towards Bc and Bu is greatest, and that bilirubin is coupled with a diazonium salt to form an azo dye;
This method is based on the well-known knowledge that the intensity of coloration of the azo dye produced is proportional to the concentration of bilirubin.

本発明によれば、最終的にビリルビンとジアゾニウム塩
との反応で生成したアゾ色素の呈色を測定することによ
りＢｃと１３ｃを測定することができる。本発明による
ＢｃとＢｃの測定は、それぞれ途中の工程が異なる二種
の手段が提供される。According to the present invention, Bc and 13c can be measured by measuring the coloration of the azo dye finally produced by the reaction between bilirubin and diazonium salt. For the measurement of Bc and Bc according to the present invention, two types of means are provided, each having different intermediate steps.

第一の手段の原理は以下のとおりである。The principle of the first means is as follows.

（ａ）　　ｐ）１９乃至１１の範囲の緩衝剤の存在下試
料とビリルビンオキシダーゼをインキュベートし、試料
中に含まれるＢｃを消去する。従って生成した反応混合
物中には未反応のＢｃとＢｕが含まれる。(a) p) Incubate the sample with bilirubin oxidase in the presence of a buffer ranging from 19 to 11 to eliminate Bc contained in the sample. Therefore, the generated reaction mixture contains unreacted Bc and Bu.

（ｂ）　　上記（ａ）で生成した反応混合物とジアゾニ
ウム塩を混合しアゾ色素を生成せしめる。この生成アゾ
色素の呈色の強度がＢｃの濃度に比例する。(b) The reaction mixture produced in (a) above is mixed with a diazonium salt to produce an azo dye. The intensity of coloring of the azo dye produced is proportional to the concentration of Bc.

（ｃ）　　試料とジアゾニウム塩を混合し、ＤＢとジア
ゾニウム塩の反応に基づいて生成したアゾ色素の呈色を
測定する。(c) Mix the sample and diazonium salt, and measure the coloration of the azo dye produced based on the reaction between DB and the diazonium salt.

（ｄ＞　　上記（ｃ）で得られた測定値より（ｂ）で得
られた測定値を差し引くことによりＢｃを算出する。(d> Bc is calculated by subtracting the measured value obtained in (b) from the measured value obtained in (c) above.

本発明におけるＢｃおよびＢｃの測定法の第二の手段の
原理は以下のとおりである。The principle of the second method for measuring Bc and Bc in the present invention is as follows.

ｌａ）　　ｐＨ９乃至１１の範囲の緩衝剤の存在下試料
とビリルビンオキシダーゼをインキュベートし、試料中
に含まれるＢｃを消去する。生成反応混合物中には未反
応のＢｃとＢｕが残存する。la) Incubate the sample with bilirubin oxidase in the presence of a buffer in the pH range of 9 to 11 to eliminate Bc contained in the sample. Unreacted Bc and Bu remain in the resulting reaction mixture.

Ｔｂ）　　上記（ａ）で生成した反応混合物とジアゾニ
ウム塩およびメタノール、カフェイン−安息香酸塩、グ
イフィリン−酢酸塩で例示されるようなジアゾニウム塩
とＢｕとのカップリング反応を推進しうる添加剤を混合
し、アゾ色素を生成せしめる。Tb) Additives capable of promoting the coupling reaction between the reaction mixture produced in (a) above and diazonium salts and Bu, as exemplified by methanol, caffeine-benzoate, and guiphylline-acetate. Mix to form an azo dye.

この生成アゾ色素の呈色の強度がＢｃとＢｕの合計の濃
度に比例する。The intensity of coloring of the azo dye produced is proportional to the total concentration of Bc and Bu.

（ｃ）　　試料、ジアゾニウム塩および上記添加剤を混
合し、ＴＢとジアゾニウム塩の反応に基づいて生成した
アゾ色素の呈色を測定する。(c) Mix the sample, diazonium salt, and the above additive, and measure the coloration of the azo dye produced based on the reaction between TB and the diazonium salt.

Ｔｄ）　　試料およびジアゾニウム塩を混合し、ＤＢと
ジアゾニウム塩の反応に基づいて生成したアゾ色素の呈
色を測定する。Td) Mix the sample and diazonium salt, and measure the coloration of the azo dye produced based on the reaction between DB and the diazonium salt.

（ｅｌ　　上記（ｂｌで得られた測定値と（ｄｌで得ら
れた測定値の合計より（ｃ）で得られた測定値を差し引
くことによりＢｃを算出する。(el) Calculate Bc by subtracting the measured value obtained in (c) from the sum of the measured values obtained in (bl and (dl) above.

（ｆ）　　上記（ｃ）で得られた測定値よりＴｂ）で得
られた測定値を差し引くことによりＢｃを算出する。(f) Calculate Bc by subtracting the measured value obtained in Tb) from the measured value obtained in (c) above.

上述の二種類の手段で用いられる試薬類は同じであり、
いずれも公知のものが使用できる。The reagents used in the above two types of means are the same,
Any known material can be used.

本発明で用いられる緩衝剤は、ｐｌ＋９乃至１１の範囲
であればその組成は特に限定されないが、その緩衝剤中
においてビリルビンオキシダーゼのＢｃに対する反応性
が高く、その反応性とＢδおよびＢｕに対する反応性と
の差が可能な限り大きい緩衝剤を選択することが好まし
い。好ましい緩衝剤としては、グリシン−水酸化ナトリ
ウム緩衝剤、トリス−水酸化ナトリウム緩衝剤、硼砂−
水酸化ナトリウム緩衝剤、エタノールアミン−水酸化ナ
トリウム緩衝剤、ユニバーサル緩衝剤〔クエン酸、リン
酸−カリウム、硼酸、ジエチルバルビッール酸および水
酸化ナトリウムより成る；　Ａｎａｌｙｓｔ。The composition of the buffer used in the present invention is not particularly limited as long as it has a pl+9 to 11, but the reactivity of bilirubin oxidase to Bc is high in the buffer, and the reactivity to Bδ and Bu is high. It is preferable to select a buffer that has as large a difference as possible. Preferred buffers include glycine-sodium hydroxide buffer, Tris-sodium hydroxide buffer, and borax-sodium hydroxide buffer.
Sodium hydroxide buffer, ethanolamine-sodium hydroxide buffer, universal buffer [consisting of citric acid, potassium phosphate, boric acid, diethylbarbital acid and sodium hydroxide; Analyst.

聾、　４９０　　（１９３９）　）　、炭酸塩−水酸化
ナトリウム緩衝剤、ジェタノールアミン−塩酸緩衝剤お
よびリン酸二ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝剤が挙
げられる。と（に好ましくは、Ｂｃに対するビリルビン
オキシダーゼの反応性とＢδおよびＢｕに対するそれと
の比が大きいグリシン−水酸化ナトリウム緩衝剤および
トリス−水酸化ナトリウム緩衝剤が挙げられる。Deaf, 490 (1939)), carbonate-sodium hydroxide buffers, jetanolamine-hydrochloric acid buffers, and disodium phosphate-sodium hydroxide buffers. and (preferably, glycine-sodium hydroxide buffers and Tris-sodium hydroxide buffers, which have a large ratio of the reactivity of bilirubin oxidase to Bc and that to Bδ and Bu.

本発明で使用されるビリルビンオキシダーゼは黄色のビ
リルビンを酸化して緑色のビリベルジンに転換する反応
を触媒する酵素として知られている。ビリルビンオキシ
ダーゼ類は不完全菌、担子・菌および植物から得られる
が、本発明で最も好ましく用いられるのは不完全菌ミロ
セシウム（Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ　）属に由来する酵
素である。この酵素は市販されており容易に入手可能で
ある。Bilirubin oxidase used in the present invention is known as an enzyme that catalyzes the reaction of oxidizing yellow bilirubin and converting it into green biliverdin. Bilirubin oxidases can be obtained from Deuteromycota, Basidiomyces and plants, but enzymes derived from the Myrothecium genus are most preferably used in the present invention. This enzyme is commercially available and readily available.

本発明で使用されるジアゾニウム塩は、公知のジアゾ法
によるビリルビンの測定で用いられているものを使用す
ることができる。ジアゾニウム塩の例示として、Ｊｅｎ
ｄｒａｓｓｉｋ−Ｇｒｏｆ変法（ｃＩｉｎ。As the diazonium salt used in the present invention, those used in the measurement of bilirubin by the known diazo method can be used. As an example of a diazonium salt, Jen
Drassik-Grof modification (cIin.

Ｃｈｅｍ、、２９．３１　３６　、　（１９８３）　）
　、Ｍａｌｌｏｙ−Ｅｖｅｌｙｎ法（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、
　Ｃｈｅｍ、＋　１１９　、４８１．　（１９３７）　
）で示されるような、スルファニル酸、４−アミノ−１
−ナフタリンスルホン酸、５−アミノ−１−ナフタリン
スルホン酸などのアニリン化合物と亜硝酸塩から生成さ
れるジアゾニウム塩、および安定化ジアゾニウム塩とし
て知られている２、４−ジクロルフェニルジアゾニウム
−１，５−ナフタレンジスルホン酸塩、ｐ−スルファニ
ルヘンゼンジアゾニウム−１，５−ナフタリンスルホン
酸塩、パラニトロベンゼンジアゾニウム四フフ化ホウ酸
塩、ジアゾ化スルファニル酸四フッ化ホウ酸塩が挙げら
れる。更に、ジアゾニウム塩を安定化するためにｐＨ開
開削剤安定剤を添加することもできる。これらの例とし
ては、弗化硼素酸塩、硫酸塩、メタリン酸塩、アリル硫
酸塩などの塩類、スルホサリチル酸、メタリン酸、クエ
ン酸、フタル酸などの緩衝剤が挙げられる。Chem, 29.31 36, (1983))
, Malloy-Evelyn method (J, Biol,
Chem, + 119, 481. (1937)
), sulfanilic acid, 4-amino-1
- Diazonium salts produced from aniline compounds such as naphthalene sulfonic acid, 5-amino-1-naphthalene sulfonic acid and nitrite, and 2,4-dichlorophenyldiazonium-1,5, known as stabilized diazonium salts. Examples include -naphthalene disulfonate, p-sulfanylhenzendiazonium-1,5-naphthalenesulfonate, paranitrobenzenediazonium tetrafluoroborate, and diazotized sulfanilic acid tetrafluoroborate. Additionally, pH trenchant stabilizers can be added to stabilize the diazonium salt. Examples of these include salts such as fluoroborates, sulfates, metaphosphates, allyl sulfates, and buffers such as sulfosalicylic acid, metaphosphoric acid, citric acid, phthalic acid, and the like.

また、ジアゾ反応停止剤としてのアスコルビン酸、アゾ
色素の吸収波長をシフトさせるための酒石酸塩を添加す
ることもできる。Furthermore, ascorbic acid as a diazo reaction terminator and tartrate for shifting the absorption wavelength of the azo dye can also be added.

本発明で用いられるジアゾニウム塩とＢｕとのカップリ
ング反応を推進しうる添加剤としては、公知のジアゾ法
による間接型ビリルビンの測定に用いられる添加剤を用
いることができ、例えばメタノール、カフェイン−安息
香酸塩、ダイフィリン−酢酸塩、ジメチルスルホキシド
が挙げられる。As the additive that can promote the coupling reaction between the diazonium salt and Bu used in the present invention, additives used for indirect bilirubin measurement by the known diazo method can be used, such as methanol, caffeine- Examples include benzoate, dyphyllin-acetate, and dimethyl sulfoxide.

本発明によるＢδおよびＢｃの測定のプロセスについて
さらに詳細に説明する。The process of measuring Bδ and Bc according to the present invention will be explained in more detail.

前述の本発明の測定法における第一の原理によれば、ｐ
Ｈ９乃至１１の範囲の緩衝剤およびビリルビンオキシダ
ーゼを含む第一の試験管を用意し、この試験管にビリル
ビンが含まれる試料を添加し、約２５℃−４５℃におい
てＢｃが酸化されるまでの十分な時間保持する。ビリル
ビンオキシダーゼの使用量は試料１−当り６−２００単
位が好ましい。その後、上記で得られた反応混合物にジ
アゾニウム塩を添加し、生成したアゾ色素の可視部にお
ける吸光度を光度針で測定する。試料として標準のビリ
ルビン溶液を用いて作成した検量線と上記測定値を対比
することにより試料中のＢδ値が得られる。次ぎに、ジ
アゾニウム塩と試料の反応を第二の試験管で行い、生成
したアゾ色素の呈色を測定する。得られた測定値と上記
第一の試験管で得られた測定値との差を検量線と対比す
ることにより試料中のＢｃ値が得られる。According to the first principle of the measurement method of the present invention described above, p
A first test tube containing a buffer ranging from H9 to H11 and bilirubin oxidase is prepared, a sample containing bilirubin is added to this test tube, and the temperature is maintained at approximately 25°C to 45°C for sufficient time until Bc is oxidized. hold for a certain amount of time. The amount of bilirubin oxidase used is preferably 6-200 units per sample. Thereafter, a diazonium salt is added to the reaction mixture obtained above, and the absorbance of the produced azo dye in the visible region is measured with a photometric needle. By comparing the above measurement values with a calibration curve created using a standard bilirubin solution as a sample, the Bδ value in the sample can be obtained. Next, the diazonium salt and the sample are reacted in a second test tube, and the coloration of the azo dye produced is measured. The Bc value in the sample is obtained by comparing the difference between the obtained measured value and the measured value obtained in the first test tube with a calibration curve.

本発明の第二の手段においては、ｐＨ９乃至１１の範囲
の緩衝剤、ビリルビンオキシダーゼ、ジアゾニウム塩お
よび添加剤を含む（Ｂδ＋Ｂｕ）測定用の第一の試験管
、ジアゾニウム塩および添加剤を含むＴＢ測定用の第二
の試験管、およびジアゾニウム塩を含むＤＢ測定用の第
三の試験管を用意し、それぞれ試料と反応させる。得ら
れた測定値を前述の原理に従って処理することによりＢ
ｃとＢｃが得られる。In the second means of the present invention, a first test tube for measuring (Bδ+Bu) containing a buffer in the pH range of 9 to 11, bilirubin oxidase, a diazonium salt and an additive, a TB measurement tube containing a diazonium salt and an additive; A second test tube for DB measurement and a third test tube for DB measurement containing a diazonium salt are prepared and reacted with the sample, respectively. By processing the obtained measurements according to the principles described above, B
c and Bc are obtained.

本発明法は溶液状態での分析または乾燥状態での分析（
いわゆるドライケミストリー）のいずれの方法でも実施
できる。ドライケミストリーは、試薬が乾燥状態で含ま
れた試験片を用いる分析方法をいう。乾燥試験片は公知
の方法により調製することができる（特公昭５３−２８
１１９　、特開昭５４−３３０９４　、同５５−４４９
９２　、同５６−１０２５５　、同５６−３０５０３、
同５７−２３８５９　、同５９−４４６６１　、同５９
−１７１８６４、同５９−２３０１６０）。試験片とし
ては、ろ紙、ガラス繊維、プラスチック素材よりなる不
織布、酢酸セルロース、ポリエチレンテレフタレート、
ポリカーボネート、ポリスチレン、ガラスなどの担体に
前述の試薬を吸収、含浸または被覆したものが用いられ
る。試験片は、さらに湿潤剤としてアルキルピリジニウ
ムクロライド、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エ
ステル、ドデシルベンゼンスルホン酸塩などの界面活性
剤および試薬または試料を担持または拡散するための酢
酸セルロース、ゼラチン、デキストラン、デンプン、ヒ
ドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシエチルメタク
リレート、Ｎ−（ヒドロキシアルキル）アクリルアミド
、二酸化チタンなどを含むこともできる。The method of the present invention can be used for analysis in solution state or analysis in dry state (
It can be carried out by any method (so-called dry chemistry). Dry chemistry refers to an analytical method that uses test pieces containing dry reagents. Dry test pieces can be prepared by a known method (Japanese Patent Publication No. 53-28
119, JP 54-33094, JP 55-449
92, 56-10255, 56-30503,
57-23859, 59-44661, 59
-171864, 59-230160). Test pieces include filter paper, glass fiber, nonwoven fabric made of plastic material, cellulose acetate, polyethylene terephthalate,
A carrier such as polycarbonate, polystyrene, glass, etc. that has been absorbed, impregnated with, or coated with the above-mentioned reagent is used. The specimens are further coated with surfactants such as alkylpyridinium chloride, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, dodecylbenzene sulfonate as wetting agents and cellulose acetate, gelatin, dextran, starch, hydroxyl for supporting or diffusing reagents or samples. It can also include ethyl acrylate, hydroxyethyl methacrylate, N-(hydroxyalkyl)acrylamide, titanium dioxide, and the like.

本発明においては、複数の試薬層からなる多層分析試験
片を用いることができる。例えば、ｐＨ９乃至１１の範
囲のＢｆｆｉ剤およびビリルビンオキシダーゼからなる
層、およびジアゾニウム塩からなる層を少なくとも含む
多層分析試験片によりＢｃが測定される。In the present invention, a multilayer analytical test strip consisting of a plurality of reagent layers can be used. For example, Bc is measured by a multilayer analytical test strip that includes at least a layer consisting of a Bffi agent with a pH range of 9 to 11 and bilirubin oxidase, and a layer consisting of a diazonium salt.

以下実験例、実施例および参考例をもって本発明をさら
に詳細に説明するが、本発明は何等これらによって限定
的に解釈されるものではない。The present invention will be explained in more detail below using experimental examples, examples, and reference examples, but the present invention should not be construed as being limited by these in any way.

使用した試薬、ビリルビン標準試料の調製、並びにビリ
ルビンオキシダーゼの活性の定義は以下のとおりである
。The reagents used, preparation of bilirubin standard sample, and definition of bilirubin oxidase activity are as follows.

ビリルビンオキシダーゼ溶液は、ビリルビンオキシダー
ゼ（天野製薬社！！りを５ｍＭｔ−リス塩酸緩ｉｈ液に
１５単位／ｍｔ’となるように溶解した。The bilirubin oxidase solution was prepared by dissolving bilirubin oxidase (Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) in a 5 mM t-Lis hydrochloric acid slow ih solution at a concentration of 15 units/mt'.

ジアゾ化試薬溶液は、４．８８ｇ　／　ｌのスルファニ
ル酸および０．１２ｇ／ｌの亜硝酸ナトリウムよりなる
。The diazotization reagent solution consists of 4.88 g/l sulfanilic acid and 0.12 g/l sodium nitrite.

カフェイン／安息香酸塩溶液は、３７ｇ／Ｊのカフェイ
ン、５６ｇ／／の安息香酸ナトリウム、５６ｇ／ｅの無
水酢酸ナトリウムおよび１　ｇ　／　Ｑのエチレンジア
ミン四酢酸よりなる。The caffeine/benzoate solution consists of 37 g/J caffeine, 56 g/J sodium benzoate, 56 g/e sodium acetate anhydride and 1 g/Q ethylenediaminetetraacetic acid.

酒石酸塩溶液は、２６３ｇ／Ｊの酒石酸す）　ＩＪウム
・２水塩および７５ｇ　／　７！の水酸化ナトリウムよ
りなる。The tartrate solution contains 263 g/J of tartaric acid) IJum dihydrate and 75 g/7! of sodium hydroxide.

Ｂｃの標準溶液は、１ｍＭｍクジロビリルビン・２ナト
リウム塩（ＵＳバイオケミカル社製）と１ｍＭヒト血清
アルブミン（シグマ社製）を１：４の割合（容量比）で
混合して調製した。A standard solution of Bc was prepared by mixing 1mM dilobilirubin disodium salt (manufactured by US Biochemical Co., Ltd.) and 1mM human serum albumin (manufactured by Sigma) at a ratio of 1:4 (volume ratio).

１３ｕの標準溶液は、上記Ｂｃの標準溶液の調製と同じ
ように結晶ビリルビン（シグマ社製）をヒト血清アルブ
ミンと混合して調製した。The 13u standard solution was prepared by mixing crystalline bilirubin (manufactured by Sigma) with human serum albumin in the same manner as in the preparation of the Bc standard solution.

Ｂｃの標準溶液は、Ｌａｕｆｆらの方法（ｃＩｉｎ。A standard solution of Bc was prepared according to the method of Lauff et al. (cIin.

ＣｈｅｒＲ，、２８，６２９６３７，（１９Ｂ２）　）
に準じてヒト血清より分離したＢδ試料を用いて調製し
た。即ち、高直接型ビリルビン患者の血清１００−を用
意し、これにリン酸でｐＨ２，０に調整したメタノール
を４００ｒＩＩｌ加え、生成したグロブリン分画の沈澱
を一１０℃で遠心分離し、除去した。得られた上清をポ
リエチレングリコールを用いて１１５量まで濃縮し、純
水に対して透析した後、カフェイン（３７ｇ／ｌ　、安
息香酸ナトリウム（５６ｇ　／　ｊ！　）　、エチレン
ジアミン四酢酸・２ナトリウム（１ｇ／ｌおよび無水酢
酸ナトリウム（５６ｇ／β）からなるアルブミン解離剤
を加えて可逆的にヒト血清アルブミンと結合しているビ
リルビンを解離させ、次いでこの溶液を中空糸膜（旭化
成社製Ｃ５Ｐ型。CherR, 28, 629637, (19B2))
It was prepared using a Bδ sample separated from human serum according to . That is, 100ml of serum from a patient with high direct bilirubin was prepared, 400ml of methanol adjusted to pH 2.0 with phosphoric acid was added thereto, and the resulting precipitate of the globulin fraction was centrifuged at -10°C and removed. The resulting supernatant was concentrated to a volume of 115 using polyethylene glycol and dialyzed against pure water, followed by caffeine (37 g/l), sodium benzoate (56 g/j!), disodium ethylenediaminetetraacetic acid ( An albumin dissociating agent consisting of 1 g/l and anhydrous sodium acetate (56 g/β) was added to reversibly dissociate bilirubin bound to human serum albumin, and then this solution was applied to a hollow fiber membrane (C5P type manufactured by Asahi Kasei Corporation).

０．８１φＸ１．２ｍ）に通し遊離状態のビリルビンお
よびその他の低分子物質を除去した。得られた非透過性
の両分に水を加え、上記の膜ろ過を更に続は低分子物質
を十分除去した。得られた水溶液を分離用高速液体クロ
マトグラフィーに供し、８６画分を分取し、透析した後
、凍結乾燥した。得られたＢδ紙試料前記Ｂｃの標準溶
液の＃製の項と同様にヒト血清アルブミンと混合し、Ｂ
δ標準溶液とした。上記の高速液体クロマトグラフィー
の操作は、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ　３００−７Ｃ１８カラ
ム（１０φ×２５０　ｍｍ；　Ｍ・ナーゲル社製）をセ
ットしたクロマトグラフィー装置（島津製作所製ＬＣ−
４Ａ型）を使用し、溶媒としてメタノール（ｐＨ２，０
）　　ニジメチルスルホキシド：水コ１モル／ｌ硫酸水
素テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムを（４０：　１９：
　４０：　１　）から（８０：１９：Ｏ：１）にグラジ
ェントで流す逆相分配法で行った。0.81φ x 1.2m) to remove free bilirubin and other low molecular weight substances. Water was added to both of the obtained non-permeable fractions, and the above-mentioned membrane filtration was further carried out to sufficiently remove low-molecular substances. The resulting aqueous solution was subjected to high-performance liquid chromatography for separation, and 86 fractions were collected, dialyzed, and freeze-dried. The obtained Bδ paper sample was mixed with human serum albumin in the same manner as in the section # of the Bc standard solution, and
This was used as the δ standard solution. The above high-performance liquid chromatography operation was performed using a chromatography apparatus (LC-Shimadzu Corporation) equipped with a Nucleosil 300-7C18 column (10φ x 250 mm; manufactured by M. Nagel).
4A type), and methanol (pH 2.0) was used as the solvent.
) Nidimethyl sulfoxide: water 1 mol/l hydrogen sulfate tetra-n-butylammonium (40: 19:
The reaction was carried out using a reverse phase distribution method in which a gradient was applied from (40:1) to (80:19:O:1).

以下の実施例のＢδおよびＢｃの測定で用いた検量線は
、試料としテｏ、５．１．０．２−０．５．０．１０．
０および２０．０■／ｄ１のビリルビンを含む前述のＢ
ｕの標／＄溶液を用い、後述の実施例２におけるＴＢの
測定に準じて作成した。The calibration curve used in the measurement of Bδ and Bc in the following examples is the sample Teo, 5.1.0.2-0.5.0.10.
The aforementioned B containing bilirubin of 0 and 20.0 ■/d1
It was prepared according to the measurement of TB in Example 2 described later using a standard solution of u/$.

ビリルビンオキシダーゼの単位は、０．０２■／−の結
晶ビリルビンおよび１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸・
２ナトリウムを含む０．２Ｍ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ
８，４）中で、３７℃においてビリルビンオキシダーゼ
を作用させ、４４０　ｎｍにおける吸光度の減少を測定
したとき、１分間に１マイクロモルのビリルビンを酸化
する酵素量を１単位とした。The unit of bilirubin oxidase is 0.02/- crystalline bilirubin and 1mM ethylenediaminetetraacetic acid.
0.2M) Lis-HCl buffer containing disodium (pH
8,4), when bilirubin oxidase was applied at 37°C and the decrease in absorbance at 440 nm was measured, one unit was defined as the amount of enzyme that oxidized 1 micromole of bilirubin per minute.

実験例１ ビリルビンオキシダーゼのビリルビンに対する反応性と
ｐＨの関係は次の実験により示される。Experimental Example 1 The relationship between the reactivity of bilirubin oxidase to bilirubin and pH is shown by the following experiment.

各種ｐＨの０．１Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液
または０．１　Ｍユニバーサル緩衝液１．６−１試料と
して前述のＢｃ、ＢｕまたはＢδの各々の標準溶液０．
０５−およびビリルビンオキシダーゼ溶液０．１−を混
合し、３７℃で５分間インキュベートし、４５０ｎＩＩ
＋における吸光度の減少を測定した。ブランクテストは
酵素溶液の代わりに５ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８
，０）を用い上記と同様に操作した。得られた試料とブ
ランクの反応液の吸光度の差、即ちビリルビンオキシダ
ーゼの反応性（相対値）と使用した緩衝液のｐｉ（並び
にその種類との関係を第１図に示す。0.1 M glycine-sodium hydroxide buffer or 0.1 M universal buffer at various pHs.
05- and bilirubin oxidase solution 0.1- were mixed, incubated at 37°C for 5 minutes, and 450 nII
The decrease in absorbance at + was measured. For the blank test, 5mM Tris-HCl buffer (pH 8) was used instead of the enzyme solution.
, 0) was operated in the same manner as above. FIG. 1 shows the relationship between the difference in absorbance between the obtained sample and the blank reaction solution, that is, the reactivity (relative value) of bilirubin oxidase, and the pi of the buffer used (as well as its type).

第１図から分かるように、ビリルビンオキシダーゼはＢ
ｃに対しｐＨ４〜５付近およびｐＨｌｏ付近に活性の極
大値を有し、一方、Ｂｕに対する活性はｐＨ５〜６に極
大を有するもののＢｃに対する活性よりも著しく低い。As can be seen from Figure 1, bilirubin oxidase is B
It has a maximum activity against c at around pH 4-5 and near pHlo, while its activity against Bu has a maximum at pH 5-6 but is significantly lower than the activity against Bc.

Ｂδに対する活性はｐＨが低い程高いが、Ｂｕに対する
活性よりも更に低い。結局ｐＨｔｏ付近においてビリル
ビンオキシダーゼのＢＵとＢδに対する反応性がいずれ
も最小となり、このｐＨ付近で反応を行えばＢｃだけが
特異的に酸化されることが分かった。緩衝液の種類は、
グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液の方がＢｃに対する
反応性とＢｕおよびＢδに対するそれとの比がより大で
あるため好ましい。The activity against Bδ is higher as the pH is lower, but it is even lower than the activity against Bu. In the end, it was found that the reactivity of bilirubin oxidase to BU and Bδ was at its minimum at around pH to, and that only Bc was specifically oxidized when the reaction was carried out at around this pH. The type of buffer solution is
Glycine-sodium hydroxide buffer is preferred because it has a higher reactivity to Bc and a higher ratio of reactivity to Bu and Bδ.

実験例２ 実験例１において、緩衝液として第１表に示す０．１Ｍ
の各種緩衝液（ｐＨｌｏ、ｏ）を使用した以外は同様に
操作した。得られた測定値（相対値）を第１表に示す。Experimental Example 2 In Experimental Example 1, 0.1M shown in Table 1 was used as the buffer solution.
The same procedure was performed except that various buffer solutions (pHlo, o) were used. The obtained measured values (relative values) are shown in Table 1.

第１表から分かるように、ｐＨ１０，０のグリシン−水
酸化ナトリウム緩衝液またはトリス−水酸化ナトリウム
緩衝液を使用した場合、Ｂｃに対するＢＵおよびＢδの
交叉はいずれも２％以下であることが分かる。その他の
緩衝液を使用した場合でも、Ｂｃに対するＢｕの交叉は
約７％以下、同じくＢδの交叉は約４％以下であった。As can be seen from Table 1, when a glycine-sodium hydroxide buffer or a Tris-sodium hydroxide buffer at pH 10.0 is used, the crossover of BU and Bδ with respect to Bc is both 2% or less. . Even when other buffers were used, the crossover of Bu to Bc was about 7% or less, and the crossover of Bδ was also about 4% or less.

実施例１ 血清または胆汁試料０．０５ｍｅ、０．１Ｍグリシン−
水酸化ナトリウム緩衝液（ｐ！１１０．０）　０．１−
およびビリルビンオキシダーゼ溶液０．０５−を混合し
、３７℃において５分間インキュベートした。得られた
反応混合物に０．０５Ｍ塩酸０．２５−およびジアゾ化
試薬溶液０．２−を加え、室温にて１０分間放置した後
、さらに４０ｇ／ｌのアスコルビン酸溶ｆｉｏ、０５ｍ
ｅ、酒石酸塩溶液０．４−およびカフェイン／安息香酸
塩溶液０．５−を添加し、６００　ｎｍにおける吸光度
を測定して測定値Ａを得た。Example 1 Serum or bile sample 0.05me, 0.1M glycine-
Sodium hydroxide buffer (p! 110.0) 0.1-
and bilirubin oxidase solution were mixed and incubated at 37°C for 5 minutes. To the resulting reaction mixture were added 0.25-M hydrochloric acid and 0.2-M diazotization reagent solution, and after leaving it for 10 minutes at room temperature, 40 g/l of ascorbic acid-soluble fio, 0.5M
e, 0.4 - of the tartrate solution and 0.5 - of the caffeine/benzoate solution were added and the absorbance at 600 nm was measured to obtain measurement value A.

次ぎに、上述した操作において、ビリルビンオキシダー
ゼ溶液の代わりに５　ｍ　Ｍ　）リス塩酸緩衝液（ＰＨ
８，０）の０．０５−を用いた以外は同じ操作を行い、
測定値Ｂを得た。Next, in the procedure described above, 5mM) lithium-hydrochloride buffer (PH
Perform the same operation except using 0.05- of 8,0),
Measured value B was obtained.

測定値Ａおよび計算値（Ｂ−Ａ）を検量線と対比するこ
とにより、それぞれ試料中のＢδおよびＢｃ濃度を求め
た。得られたＢδおよびＢｃの値を第２表に示す。また
、比較のため、前述のＢδ紙試料ｖ１４製の項の高速液
体クロマトグラフィーにおいて４．６φＸ　２５０　ｍ
ｍＯカラムを使用した以外は同じ方法により上記試料を
分析し、得られた値を第２表のＨＰＬＣ法の欄に示す。By comparing the measured value A and the calculated value (B-A) with a calibration curve, the Bδ and Bc concentrations in the sample were determined, respectively. The obtained values of Bδ and Bc are shown in Table 2. In addition, for comparison, in the high performance liquid chromatography section of the above-mentioned Bδ paper sample v14, 4.6φX 250 m
The above sample was analyzed by the same method except that an mO column was used, and the values obtained are shown in the HPLC method column of Table 2.

本発明法で得られた値とＨＰＬＣ法で得られた値とは極
めて相関関係が高いことが分かる。It can be seen that the values obtained by the method of the present invention and the values obtained by the HPLC method have an extremely high correlation.

第２表 （単位　■／ｄ１） 参考例１ 実施例１において、試料としてそれぞれ０．５−２０、
　Ｏｎｇ　／　ｄｌのビリルビンを含むＢｕの標準溶液
またはＢｃの標準溶液を用いた以外は同じ操作を行った
。ＢδまたはＢｃとして得られた測定値を第３表に示す
。本発明法で得られたＢδ値およびＢｃ値はＢｕをほと
んど測り込まず、また本発明法で得られたＢδ値はＢｃ
をほとんど測り込まないことが分かる。Table 2 (Unit ■/d1) Reference Example 1 In Example 1, the samples were 0.5-20,
The same procedure was performed except that a standard solution of Bu or a standard solution of Bc containing Ong/dl bilirubin was used. The measured values obtained as Bδ or Bc are shown in Table 3. The Bδ value and Bc value obtained by the method of the present invention contain almost no Bu, and the Bδ value obtained by the method of the present invention does not include Bc
It can be seen that it is hardly measured.

第３表に示すように、Ｂｃ標準溶液を実施例１の方法で
測定した場合のビリルビンの測定値は現実の濃度よりも
低い。このことは、Ｂｃ標準として使用したジ抱合型ビ
リルビンはこれを直接ジアゾ法で測定した場合、その回
収率はわずか７０±５％であるとのり、　ｔｌ、　Ｌｏ
およびＴ−Ｗ、　Ｗｕの報告〔前掲のＣｌ１ｎ、　Ｃｈ
ｅｍ、、２９．３１−３６　、　（１９８３）　）によ
り説明される。。As shown in Table 3, the measured value of bilirubin when the Bc standard solution was measured by the method of Example 1 was lower than the actual concentration. This means that when the diconjugated bilirubin used as the Bc standard is directly measured by the diazo method, the recovery rate is only 70 ± 5%.
and T-W, Wu's report [cited above, Cl1n, Ch.
Em., 29.31-36, (1983)). .

第３表 （単位　増／ｄ１） 実施例２ 実施例１で用いたと同じ血清または胆汁試料０．０５ｍ
ｆｆ、　０．１　Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液
（ｐｆｌｌＯ，ｏ）　Ｏ，Ｌ−およびビリルビンオキシ
ダーゼ溶液０．０５ｍｅを混合し、３７°Ｃにおいて５
分間インキュベートした。得られた反応混合物にカフェ
イン／安息香酸塩溶液０，５−およびジアゾ化試薬溶液
０．２−を加え、室温にて１０分間放置した後、さらに
４０ｇ　／　ｌのアスコルビン酸溶液０．０５ｍｅ、酒
石酸塩溶液０．４−および０．０５Ｍ塩酸０．２５−を
添加し、６００　ｎｍにおける吸光度を測定して測定値
Ａを得た。Table 3 (unit increase/d1) Example 2 0.05 m of the same serum or bile sample used in Example 1
ff, 0.1 M glycine-sodium hydroxide buffer (pfllO,o) O,L- and 0.05 me of bilirubin oxidase solution were mixed and incubated at 37 °C for 5
Incubated for minutes. Caffeine/benzoate solution 0.5- and diazotization reagent solution 0.2- were added to the resulting reaction mixture, and after standing for 10 minutes at room temperature, an additional 0.05 me of 40 g/l ascorbic acid solution, 0.4- of tartrate solution and 0.25- of 0.05M hydrochloric acid were added and the absorbance at 600 nm was measured to obtain measurement value A.

上述した操作において、ビリルビンオキシダーゼ溶液の
代わりに５ｍＭＩ−ＩＪス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）の
０．０５１ｎｆ！を用いた以外は同じ操作を行い測定値
Ｂを得た。In the above operation, 0.051nf of 5mMI-IJS hydrochloric acid buffer (pH 8,0) was used instead of the bilirubin oxidase solution. Measurement value B was obtained by performing the same operation except that .

上記と同じ試料０．０５ｍｅ、０．１Ｍグリシン−水酸
化ナトリウム緩衝液（ｐｆｌｌＯ，０）　０．１−およ
び５ｍＭ　ｌ−ＩＪ　ス塩酸緩衝液（ｐｆｌ　８．０）
　０．０５ｍｔ’を混合し、３７°Ｃにおいて５分間イ
ンキュベートした。得られた反応混合物に０．０５Ｍ塩
酸０．２５−およびジアゾ化試薬溶液０．２ｄを加え、
室温にて１０分間放置した後、さらに４０ｇ／ａのアス
コルビン酸溶液０．０５ｍｆ、酒石酸塩溶ｄ　Ｏ，４−
およびカフェイン／安息香酸塩溶液０．５−を添加し、
６００　ｎｍにおける吸光度を測定して測定値Ｃを得た
。Same sample as above 0.05me, 0.1M glycine-sodium hydroxide buffer (pflO,0), 0.1- and 5mM l-IJ sulphate buffer (pfl 8.0)
0.05 mt' was mixed and incubated for 5 minutes at 37°C. Add 0.25-d of 0.05 M hydrochloric acid and 0.2 d of diazotization reagent solution to the obtained reaction mixture,
After standing for 10 minutes at room temperature, a further 0.05 mf of 40 g/a ascorbic acid solution, tartrate solution d O,4-
and adding 0.5- of caffeine/benzoate solution,
Measurement value C was obtained by measuring the absorbance at 600 nm.

上記で得られた測定値を計算処理し、即ち（Ａ＋（、−
Ｂ）および（Ｂ−Ａ）を算出し、検量線と対比すること
により、それぞれ試料中のＢｃおよびＢｃ１度を求めた
。得られたＢｃおよびＢｅの値、および前記ＨＰＬＣ法
の値を第４表に示す。The measured values obtained above are calculated, i.e. (A+(, -
By calculating B) and (B-A) and comparing them with the calibration curve, Bc and Bc1 degree in the sample were determined, respectively. The obtained Bc and Be values and the values obtained by the HPLC method are shown in Table 4.

本発明法で得られた値とＨＰＬＣ法で得られた値とは極
めて相関関係が高いことが分かる。It can be seen that the values obtained by the method of the present invention and the values obtained by the HPLC method have an extremely high correlation.

第４表 参考例２ 実施例２において、試料としてＢｕの標準溶液またはＢ
ｃの標準溶液を用いた以外は同じ操作を行った。得られ
たＢｃ値およびＢｃ値はＢｕをほとんど測り込まず、ま
た得られたＢｃ値はＢｃをほとんど測り込まないことが
確認された。Table 4 Reference Example 2 In Example 2, the standard solution of Bu or B
The same operation was performed except that the standard solution of c was used. It was confirmed that the obtained Bc values and Bc values hardly measured Bu, and that the obtained Bc values hardly measured Bc.

発明の効果 本発明に従えば、生体体液中のＢｃおよびＢｃを簡単な
方法で、高精度に分別測定することができる。本発明に
よれば、ＢｃとＢｃの測定が、従来のジアゾ法によるＴ
Ｂの測定と共通の、単一の波長で測定することができる
。Effects of the Invention According to the present invention, Bc and Bc in living body fluids can be separately measured with a simple method and with high precision. According to the present invention, Bc and Bc can be measured by T by the conventional diazo method.
It can be measured at a single wavelength, which is common to the measurement of B.

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of drawings]

第１図はビリルビンオキシダーゼのＢｃ、ＢｕおよびＢ
ｃに対する反応性とｐｌ！および用いた緩衝液の種類と
の関係を表す図面である。Figure 1 shows Bc, Bu and B of bilirubin oxidase.
Reactivity to c and pl! FIG.

Claims (16)

【特許請求の範囲】[Claims] （１）液体試料中のビリルビンを分析する方法において
、 （ａ）ｐＨ９乃至１１の範囲の緩衝剤の存在下試料とビ
リルビンオキシダーゼをインキュベートすること； （ｂ）上記（ａ）で生成した反応混合物とジアゾニウム
塩を混合し生成したアゾ色素の呈色を測定すること； の各工程より成ることを特徴とするデルタビリルビンの
測定法。(1) A method for analyzing bilirubin in a liquid sample, which includes: (a) incubating the sample and bilirubin oxidase in the presence of a buffer with a pH range of 9 to 11; (b) incubating the reaction mixture produced in (a) above; A method for measuring delta bilirubin, comprising the steps of: mixing a diazonium salt and measuring the coloration of an azo dye produced; （２）緩衝剤がグリシン−水酸化ナトリウム緩衝剤、ト
リス−水酸化ナトリウム緩衝剤、硼砂−水酸化ナトリウ
ム緩衝剤、エタノールアミン−水酸化ナトリウム緩衝剤
、ユニバーサル緩衝剤および炭酸塩−水酸化ナトリウム
緩衝剤より成るグループから選択される緩衝剤である特
許請求の範囲第１項記載のデルタビリルビンの測定法。(2) Buffers include glycine-sodium hydroxide buffer, Tris-sodium hydroxide buffer, borax-sodium hydroxide buffer, ethanolamine-sodium hydroxide buffer, universal buffer, and carbonate-sodium hydroxide buffer The method for measuring delta bilirubin according to claim 1, wherein the buffering agent is selected from the group consisting of agents. （３）工程が溶液状態で行われる特許請求の範囲第１項
記載のデルタビリルビンの測定法。(3) The method for measuring delta bilirubin according to claim 1, wherein the step is performed in a solution state. （４）工程が乾燥試験片を用いて行われる特許請求の範
囲第１項記載のデルタビリルビンの測定法。The method for measuring delta bilirubin according to claim 1, wherein the step (4) is performed using a dry test piece. （５）液体試料中のビリルビンを分析する方法において
、 （ａ）試料とジアゾニウム塩を混合し生成したアゾ色素
の呈色を測定すること； （ｂ）ｐＨ９乃至１１の範囲の緩衝剤の存在下試料とビ
リルビンオキシダーゼをインキュベートした後、生成し
た反応混合物とジアゾニウム塩を混合し生成したアゾ色
素の呈色を測定すること； （ｃ）上記（ａ）で得られた測定値より（ｂ）で得られ
た測定値を差し引くこと； の各工程より成ることを特徴とする抱合型ビリルビンの
測定法。(5) In a method for analyzing bilirubin in a liquid sample, (a) measuring the coloration of an azo dye produced by mixing the sample and a diazonium salt; (b) in the presence of a buffer with a pH range of 9 to 11; After incubating the sample and bilirubin oxidase, mixing the generated reaction mixture with a diazonium salt and measuring the coloration of the generated azo dye; (c) Based on the measured value obtained in (a) above, the coloring obtained in (b) is A method for measuring conjugated bilirubin, comprising the following steps: subtracting the measured value obtained. （６）緩衝剤がグリシン−水酸化ナトリウム緩衝剤、ト
リス−水酸化ナトリウム緩衝剤、硼砂−水酸化ナトリウ
ム緩衝剤、エタノールアミン−水酸化ナトリウム緩衝剤
、ユニバーサル緩衝剤および炭酸塩−水酸化ナトリウム
緩衝剤より成るグループから選択される緩衝剤である特
許請求の範囲第５項記載の抱合型ビリルビンの測定法。(6) Buffers include glycine-sodium hydroxide buffer, Tris-sodium hydroxide buffer, borax-sodium hydroxide buffer, ethanolamine-sodium hydroxide buffer, universal buffer, and carbonate-sodium hydroxide buffer 6. The method for measuring conjugated bilirubin according to claim 5, wherein the buffering agent is selected from the group consisting of agents. （７）工程が溶液状態で行われる特許請求の範囲第５項
記載の抱合型ビリルビンの測定法。(7) The method for measuring conjugated bilirubin according to claim 5, wherein the step is performed in a solution state. （８）工程が乾燥試験片を用いて行われる特許請求の範
囲第５項記載の抱合型ビリルビンの測定法。(8) The method for measuring conjugated bilirubin according to claim 5, wherein the step is performed using a dry test piece. （９）液体試料中のビリルビンを分析する方法において
、 （ａ）ｐＨ９乃至１１の範囲の緩衝剤の存在下試料とビ
リルビンオキシダーゼをインキュベートした後、生成し
た反応混合物とジアゾニウム塩およびジアゾニウム塩と
非抱合型ビリルビンとのカップリング反応を推進しうる
添加剤を混合し生成したアゾ色素の呈色を測定すること
； （ｂ）試料およびジアゾニウム塩を混合し生成したアゾ
色素の呈色を測定すること； （ｃ）試料、ジアゾニウム塩およびジアゾニウム塩と非
抱合型ビリルビンとのカップリング反応を推進しうる添
加剤を混合し生成したアゾ色素の呈色を測定すること； （ｄ）上記（ａ）で得られた測定値と（ｂ）で得られた
測定値の合計より（ｃ）で得られた測定値を差し引くこ
と； の各工程より成ることを特徴とするデルタビリルビンの
測定法。(9) In a method for analyzing bilirubin in a liquid sample, (a) after incubating the sample and bilirubin oxidase in the presence of a buffer in the pH range of 9 to 11, the resulting reaction mixture is diazonium salt and non-conjugated with the diazonium salt. (b) Measuring the color development of an azo dye produced by mixing a sample and a diazonium salt; (b) Measuring the color development of an azo dye produced by mixing a sample and a diazonium salt; (c) Measuring the coloration of the azo dye produced by mixing the sample, a diazonium salt, and an additive capable of promoting the coupling reaction between the diazonium salt and unconjugated bilirubin; (d) Measuring the coloration of the azo dye obtained in (a) above; subtracting the measured value obtained in (c) from the sum of the measured value obtained in step (b) and the measured value obtained in step (b); （１０）緩衝剤がグリシン−水酸化ナトリウム緩衝剤、
トリス−水酸化ナトリウム緩衝剤、硼砂−水酸化ナトリ
ウム緩衝剤、エタノールアミン−水酸化ナトリウム緩衝
剤、ユニバーサル緩衝剤および炭酸塩−水酸化ナトリウ
ム緩衝剤より成るグループから選択される緩衝剤である
特許請求の範囲第９項記載のデルタビリルビンの測定法
。(10) the buffer is a glycine-sodium hydroxide buffer;
A claim that is a buffer selected from the group consisting of Tris-sodium hydroxide buffer, borax-sodium hydroxide buffer, ethanolamine-sodium hydroxide buffer, universal buffer, and carbonate-sodium hydroxide buffer The method for measuring delta bilirubin according to item 9. （１１）工程が溶液状態で行われる特許請求の範囲第９
項記載のデルタビリルビンの測定法。(11) Claim 9 in which the step is carried out in a solution state
Method for measuring delta bilirubin as described in Section 1. （１２）工程が乾燥試験片を用いて行われる特許請求の
範囲第９項記載のデルタビリルビンの測定法。(12) The method for measuring delta bilirubin according to claim 9, wherein the step is performed using a dry test piece. （１３）液体試料中のビリルビンを分析する方法におい
て、 （ａ）ｐＨ９乃至１１の範囲の緩衝剤の存在下試料とビ
リルビンオキシダーゼをインキュベートした後、生成し
た反応混合物とジアゾニウム塩およびジアゾニウム塩と
非抱合型ビリルビンとのカップリング反応を推進しうる
添加剤を混合し生成したアゾ色素の呈色を測定すること
； （ｂ）試料、ジアゾニウム塩およびジアゾニウム塩と非
抱合型ビリルビンとのカップリング反応を推進しうる添
加剤を混合し生成したアゾ色素の呈色を測定すること； （ｃ）上記（ｂ）で得られた測定値より（ａ）で得られ
た測定値を差し引くこと； の各工程より成ることを特徴とする抱合型ビリルビンの
測定法。(13) In a method for analyzing bilirubin in a liquid sample, (a) after incubating the sample and bilirubin oxidase in the presence of a buffer in the pH range of 9 to 11, the resulting reaction mixture is diazonium salt and non-conjugated with the diazonium salt. measuring the coloration of the azo dye produced by mixing an additive capable of promoting the coupling reaction with type bilirubin; (b) promoting the coupling reaction between the sample, diazonium salt, and the diazonium salt and unconjugated bilirubin; (c) subtracting the measured value obtained in (a) from the measured value obtained in (b) above; A method for measuring conjugated bilirubin, characterized in that: （１４）緩衝剤がグリシン−水酸化ナトリウム緩衝剤、
トリス−水酸化ナトリウム緩衝剤、硼砂−水酸化ナトリ
ウム緩衝剤、エタノールアミン−水酸化ナトリウム緩衝
剤、ユニバーサル緩衝剤および炭酸塩−水酸化ナトリウ
ム緩衝剤より成るグループから選択される緩衝剤である
特許請求の範囲第１３項記載の抱合型ビリルビンの測定
法。(14) the buffer is a glycine-sodium hydroxide buffer;
A claim that is a buffer selected from the group consisting of Tris-sodium hydroxide buffer, borax-sodium hydroxide buffer, ethanolamine-sodium hydroxide buffer, universal buffer, and carbonate-sodium hydroxide buffer The method for measuring conjugated bilirubin according to item 13. （１５）工程が溶液状態で行われる特許請求の範囲第１
３項記載の抱合型ビリルビンの測定法。(15) Claim 1 in which the process is performed in a solution state
The method for measuring conjugated bilirubin according to item 3. （１６）工程が乾燥試験片を用いて行われる特許請求の
範囲第１３項記載の抱合型ビリルビンの測定法。(16) The method for measuring conjugated bilirubin according to claim 13, wherein the step is performed using a dry test piece.