JPS62103573A

JPS62103573A - Ｒａｓがコ−ドしているタンパク質の検出用イムノアツセイ

Info

Publication number: JPS62103573A
Application number: JP19512186A
Authority: JP
Inventors: ジヨウジフ・エム・アルバニーズ; フレデリク・エイチ・レイノルズ; ジヨン・アール・ステイーヴンソン
Original assignee: Oncogene Science Inc
Current assignee: OSI Pharmaceuticals LLC
Priority date: 1985-08-21
Filing date: 1986-08-20
Publication date: 1987-05-14

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本願の優先権出願は１９８５年８月２１日出願の米国特
許出願第７６７８６２号の一部継続出願であって、その
内容を参考資料とする。

本願中には種々の刊行物分括弧内にアラビア数字で示し
た。これらの刊行物の完全な文献名は本文の末尾に示し
た。これらの刊行物の開示内容は、本発明の技術分野の
状態をより十分に説明するための参考資料とする。

１弧Δｉ」ある種のＲＮ＾腫瘍ウィルス及びヒト腫瘍細胞は、各種
のヒト及び動物の癌を誘導する原因と見なされる特定の
タンパク質をコードする腫瘍遺伝子と呼称されるゲノム
配列を含んでいる（６．１８＞。本発明は、腫瘍遺伝子
でコードされた一般には細胞内のタンパク質を血清のよ
うな生物体液（流体）内で検出できること、及びこのよ
うな検出を使用して新生（腫瘍）状態（ｎｅｏｐｌａｓ
ｔｉｃ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）を診断又は監視できる
という発見に基づいている。

ウィルス性又は化学的に形質転換された細胞から単離さ
れたＤＮＡは、正常な細胞系（ｃｅｌｌ　１ｉｎｅ）を
トランスフェクションにより形質転換する能力がある。

形質転換性ＤＮＡは、膀胱癌、肺癌、結腸癌、々の形質
転換性ＤＮＡ配列は形質転換された細胞及びし１〜ロウ
イルス双方のＤＮＡ中で同定されており、これらの配列
を腫瘍遺伝子（ｏｎｅｏｇｅｎｅ）と呼称する（１６）
。ＩＮΔ腫瘍ウィルスに由来する腫瘍遺伝子［ＩＮＡ配
列は、正常な非感染細胞からのＤＮＡ配列に対して大き
な相同性を示す（４）。ウィルス及び細胞中に見出ださ
れるこれらの相同配列は、夫々ウィルス性腫瘍遺伝子（
ｙ−ｏｎｃ）及び細胞性腫瘍遺伝子（ｃ−ｏｎｃ　）と
呼称されている。ｃ−ｏｎｅ遺伝子は全個体のＯＮ品い
に普遍的に存在しており、ｖ−ｏｎｅ遺伝子の進化上の
祖先であると考えられる。ＲＮ＾腫瘍ウィルスはレトロ
ウィルスと宿主ゲノムとの間の組換により腫瘍遺伝子を
獲得した（形質導入）ものと考えられている（２６）。

細胞性腫瘍遺伝子は、進化の間に保存された正常遺伝子
であって、細胞中で正常な機能的役割を果たすものと考
えられている＜２）。細胞性腫瘍遺伝子は「非癌誘導状
態」では原腫瘍遺伝子（ｐｒｏｔ。

−ｏｎｃｏｇｅｎｅ）と呼称される。原腫瘍遺伝子は、
何らかの方法で活性化されるまで腫瘍原作又は腫瘍形成
性をもたない。多数の異なる遺伝メカニズムは正常細胞
遺伝子に体細胞突然変異を生じさせ、腫瘍細胞中に見出
だされる活性化された腫瘍遺伝壬子増幅を含み、これら
は化学的又は物理的島形成手段により又は宿主ＤＮＡ中
の原腫瘍遺伝子配列に隣接するウィルス性ゲノムの組込
により誘導され得る（１５）。

約２０種類の腫瘍遺伝子が知られており（３，３２）、
いくつかは特定の形態の癌と関連することが示されてい
る。腫瘍遺伝子は、成長因子、成長因子膜受容体、ＧＴ
Ｐ結合結合タンパクジ特定のタンパク買キナーゼのよう
なタンパク質をコードする正常細胞遺伝子に対して配列
相同性を示す。

各種の腫瘍遺伝子を特定の癌形態に相関させるために種
々の研究が為されている。１５種類の異なる腫瘍遺伝子
の発現は、ウィルスプローブによるＤＮＡ／ＲＮへハイ
ブリダイゼーションにより２０種類の異なる腫瘍型と関
連付けられている（２５）、腫瘍遺伝子（ｃ−ｏｎｃ）
のｃ−ｍｙｃ＋ｃ−４ｏｓ、ｃ−１トｒａｓ及びＣ−に
−ｒａＳはいずれも試験された全ｌｌ！！瘍ｙＡ繊中で
発現されたが、他の腫瘍遺伝子は特定の腫瘍型と相関す
るように思われた。ヒト腫瘍遺伝子の研究で最も重要で
あると認められた腫瘍遺伝子族はｒａｓｌｌＩ瘍遺伝子
である。ｒ　ａ　ｓ　３ｉ！ｌ伝子族は、Ｉｔ−ｒａｓ
、　Ｋ−ｒａｓ及びＮ−ｒａｓの３種類の構造的に類似
の員から構成される。

まず］１−及びに−ｒａｓ形質転換性遺伝子は、ネズミ
の肉腫ウィルス（ＭｕＳＶ）のＩＩ　ａ　ｒ　ｖ　ｅ　
ｙ及びＫｉｒｓｔｅｎ株から単離された。続いて特定の
ヒト腫瘍細胞糸種から（ハイブリダイゼーションにより
）１ト及びに−ｒａｓ腫瘍遺伝子が直接単疏され、クロ
ーン化されたＩト及びに−ｒａｓＪ（天子はｌ・ランス
フエクションＧこよりマウス旧ＩＩ　３７３培養細胞を
形質転換することが発見された（８）。１ト及びＮ−ｒ
ａｓ遺伝子は４個のエキンンから構成されており、　Ｋ
−ｒａｓは別の第１１のエキソンを有する（２４）。第
３までの３１［！ＩＩのエキソンは第４のエキソンより
もより高度に保存され、この第４のエキンンと共に１８
９（因のアミノ酸を古むｐ２１で表される２１０００１
’ル）−ンの夕〉・バク質をコードする。ｐ２１は、グ
アニンヌクレオチド結合タンパク質と構造的及び免疫的
に関連することか示されている（１０．１７）。

ｐ２１タンパク質は、培養細胞のｒａｓ遺伝子形質転換
の直接的な原因となることが遺伝子及び生物学的な実験
により立証されている。ヒト膀胱癌細胞系（Ｔ２４）か
ら単離されたＨ−ｒａｓ腫瘍遺伝子は、アミノ酸配列中
の１２位のグリシンをバリンに置換した単塩基置換（Ｃ
からＴ）により正常なＨ−ｒａｓ遺伝子と異なることが
示された最初の腫瘍遺伝子であった（２７）。形成され
た突然変異タンパク質は形質転換の誘導に強い影響をも
っていた（２８）。その後の研究の結果、１２位及び６
１位のアミノ酸の変化に対応する突然変異は活性化即ち
形質転換性ｒａｓ腫瘍遺伝子をもたらすことがわがった
り２９）。これらのアミノ酸置換は、ＧＴＰａｓｅ活性
の小さいｒａｓにコードされたタンパク質を産生ずる（
２２）、活性化又は構造的に変容されたｒａｓ腫瘍遺伝
子タンパク質は、ヒ１〜の肺及び結腸癌中に見出だされ
ている（９）。

ヒト癌中のｒａｓ遺伝子に関連する実例のほとんどは核
酸ハイブリダイゼーションの研究に由来するが、最近の
いくつかの研究ではヒト腫瘍中におけるｒａｓ　ｐ２１
タンパク質の発現が立証されている。

ｔ！　ａ　ｎ　ｄ他は、ｒａｓ　ｐ２１タンパク質に対
するモノクローナル抗体を使用する免疫ペルオキシダー
ゼ染色により、このタンパク質が乳管癌及び結腸腺癌中
で発現されることを発見した（１３）。同様にＧａｌ　
ｌ　ｉｃｋ他は、免疫プロット法とペルオキシダーゼ染
色とを使用すると新しい初期の転位性ヒ）・結腸直腸腫
瘍中にｒａｓがコードしているｐ２１が発現り、たと報
告している（１２）。この研究は、初期段階の結腸腫瘍
におけるρ２１の発現と、後期段階の腫瘍におけるより
可変性の発現とを示しており、腫瘍の進行が他の腫瘍遺
伝子及び恐らく突然変異したｒａｓ　ｐ２１を補充する
ような成長因子を活性化させ得るという事実を示唆して
いる。

活性化ｒａｓ遺伝子及び他の腫瘍遺伝子と腫瘍形成との
関連を示すために現在使用されている技術として、腫瘍
遺伝子単離とバイオアッセイ、ノーザンブロットーハイ
プリダイゼーション及び組織病理学が挙げられる。ｒａ
ｓ　ｐ２１タンパク質は細胞膜の内面に見出だされてお
り、従って細胞内タンパク質であるが、悪性過程では顕
著な組ｍ破壊が生じるのでｒａｓ　ｐ２１タンパク質は
癌患者の血清中に流れ出すと推論されている。ここに記
載する研究は、正常なヒト血清中よりも著しく高い頻度
で癌患者種の血清中にｒａｓかコードしている（以下、
ｒａｓコード化という）ｐ２１タンパク質を検出するた
めにモノクローナル抗体を使用する高域度血清使用型イ
ムノアッセイに関するものである。このアッセイは尿の
ような他の体液に拡張し、新生状態の存在に関連する全
種ｆｆＩ遺伝子を包含する可能性がある。

４匪へ」法本発明は、活性化された腫瘍遺伝子の存在に関連する新
生状態を被験者（動物を片む。以下同じ）中で診断する
ための方法に係り、該方法は、活性化腫瘍遺伝子により
コードされ一般に細胞内に発生するポリペプチドの少な
くとも一部の存在を被験者からの生物体液（流体）の試
料中に検出する段階を含んでいる。該検出段階は、マト
リックス−第１の抗体−ポリペプチド複合体を形成する
べく、試料をポリペプチドに対して特異的な第１のマト
リックスに結合した抗体と好適な条件下で接触させる段
階と、マトリックスー第１の抗体−ポリペプチド−第２
の抗体から成る第２の複合体を形成するべく、検出可能
なマーカーで標識された第２の抗体と形成された前記複
合体を接触させる段階と、ｉ＆後に腫瘍遺伝子コード化
（腫瘍遺伝子がコードしている）ポリペプチドの存在を
検出するべく、こうして形成された第２の複合体を検出
する段階とを含み得る。

前記検出段１智は更に、抗体−ボリベブチド複合体を形
成するべく、試ｆＥ＋をポリペプチドの部分に対して特
異的な抗体と適当な条件下で接触させる段階と、試料中
における腫ｆＦｆ遺伝子コード化ポリペプチドの存在を
検出するべく、試料からこうして形成された複合体を検
出する段階とを含み得る。

検出段階は更に、マトリックス−抗体−コントロール用
ポリペプチド複合体を形成するべく、検出可能なコント
ロール用ポリペプチドを腫瘍遺伝子コード化ポリペプチ
ドの存在下でボＩＪペプチドの部分に対して特異的なマ
トリックス結合抗体分子と接触さる段階と、こうして形
成された複合体の個数を定量する段階と、こうして定量
された個数と腫瘍遺伝子コード化ポリペプチドの不在下
で形成された複合体の個数とを比較し、形成された複合
体の個数の減少により試料中の腫瘍遺伝子コード化ポリ
ペプチドの存在を確認する段階とを含み得る。

本発明はまた、活性化された腫瘍遺伝子の存在に関連す
る新生状態を被験者中で診断するための方法に係り、該
方法は、検出可能な第１の抗体−ポリペプチド−第２の
抗体複合体を形成するべく、検出すべきポリペプチドの
部分上のエピＩ・−プに対して特異的な第１の抗体と、
検出すべきポリペプチドの部分上の別のエピトープに対
して特異的な第２の抗体とに試料を適当な条件下で接触
させる段階を含んでいる。

本発明はまた、活性化された腫瘍遺伝子の存在に関連す
る新生状態を被験者中で診断するための方法に係り、該
方法は、被験者からの生物体液の試料中で腫瘍遺伝子−
コード化ポリペプチドの量を定量する段階と、こうして
定量されたポリペプチドの足を正常被験者からの試料中
の量と比１￥１し、著しい量の差の存在により新生状態
の存在を確認する段階とを含んでいる。

本発明はまた、被験者中の新生状態の経過を監視するた
めの方法に係り、該方法は、被験者からの生物体液の第
１の試料中で腫瘍遺伝子コード化ポリペプチドの存在を
定量する段階と、こうして定量された量を別の時点で被
験者から採取された第２の試料中に存在している量と比
較しし、定量された量の差から新生状態の経過を確認す
る段階とを含んでいる。

本発明はまた、新生状態の被験者からの生物体液の試料
中で１個以上の腫瘍遺伝子コード化ポリペプチドの量を
定量し、特定量又は相対量の存在により特定の腫瘍の型
を確認することから成る腫瘍の分類方法に係る。

本発明はまた、新生状！ぶの被験者からの生物体液の試
「■中で１個以上の腫瘍遺伝子コード化ポリペプチドの
存在を検出し、これらポリペプチドの特定の組み合わせ
の有無により特定の腫瘍の型を確認することから成る腫
瘍の分類方法に係る。

本発明はまた、活性化された腫瘍遺伝子の検出方法に係
り、該方法は、活性化腫瘍遺伝子によりコードされ細胞
内に発生するポリペプチドの少なくとも一部を生才勿体
消の試料中に検出する段階を含んでいる。

本発明はまた、新生状態の治療用として推定される治療
薬の審査方法に係り、該方法は、新生状態の被験者から
の第１の試料中で当該状態に関連する腫瘍遺伝子コード
化ポリペプチドの量を定量する段階と、治療後の被験者
をもたらすべく当該治療薬を当該状態に関連する新生細
胞と接触させるように治療量の当該治療薬を被験者に投
与する段階と、適当な期間後、治療後の被験者からの試
料中におけるポリペプチドの量を定量する段階と、第１
の試料中で定量されたポリペプチドの量を治療後の被験
者からの試料中で定量された量と比較し、顕著な差によ
り当該治療薬の効果を確認する段階とを含んている。

共有結合したシー１ｆ−ｒａｓ（Ａｂ−２）抗体を含有
する捕捉７１〜リツクスをＡ　Ｉ　−］、　４［胞由来
の細胞抽出物と共に図示したいろいろな時間３７℃でイ
ンキュベートした。それぞれの時間だけ経過した後、マ
トリックスと共にリポータ−抗体１２５Ｉ−標識ｖ−Ｈ
−ｒａｓ（＾ｂ−１）を１５時間４℃でインキュベート
した。共有結合したｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ（＾ｂ−１
）を含有する捕捉マトリックスをコントロールの捕捉マ
トリックスとして使用した。コントロールで得られた値
（ＣＰＭ）をサンプルの値から差し引いてデルタ（Δ）
曲線を得た。

抗原捕捉法の条件は「材料と手法」の項に詳細に記載す
る。

第２図−ｒａＳ　２１′　・　−試　　の　　準　　線
この試験はストレプトアビジンアガロース、ビオチニル
化捕捉抗体、＋′Ｉ標識リポーター抗体、および健康人
の血清０．１ｍに希釈したｒａｓ　ｐ２１抗原を用い、
「材料と手法」の項に記載されるようにして行って標準
曲線を作った。同様にして内部コントロール〈標準）を
調製し、検定した後、−７０℃で保存した。この内部コ
ントロールが含有する亘ｐ２１抗原は八が２３．７５単
位、ＢがＧ、２５単位、Ｃが１．２５単位であった。

２Ｉｎｌ中に含む総タンパクが４■の＾１−１細胞抽出
物を＾Ｃ＾５４　Ｕｌｔｒａｇｅｌ（ＬＫ口）のカラム
にかけ、１０ｍＭＴｒｉｓ−酢酸（ｐＨ７，５）、１ｍ
Ｍ　ｓｇｃｌ□、１０ｍＭ　ＮａＣ１，０，１ｍＭＥＤ
Ｔ＾ナトリウム、１．Ｏｎ＋Ｍ　ＤＴＴおよび０．０５
％オクチルグルコシド＜Ｓｉｇｍａ、　ＳＬ、　Ｌｏｕ
ｉｓ　Ｎｏ、　０−８０００）を含有する緩衝液でカラ
ムを展開しな。４℃で両分（４ｄ）を集め、抗原捕捉と
Ｗｅｓｔｅｒｎブロッティングによって検定した。内部
分子量標準は別々にクロマトグラフィにかけた。その溶
出位置を図示した。

２８０ｎｍでの吸収を実線で、抗原捕捉１２５ＩＣＰＭ
の値は点で示した。

第４図−戸　　のｒａｓ２１　　　　イズ総タンパクが
４１１１ｇの肺癌抽出物は第３図の説明中に記載したよ
うにして分析した。

第５図−コントロール血゛　のｒａＳ２１１ｎｔｅｒｓ
ｔａｔｅ　Ｂｌｏｏｄ　ＢａｎｋとＣｈｅｍｉｃａｌ　
Ｃｏｎｃｅｐｔｓから入手した見掛は上正常なヒト由来
の血清のサンプル（０，１ｆｆｉｉりを、「材料と手法
」の項に記載されているようにストレプトアビジン−ア
ガロースを用いてビオチニル化捕捉抗体、ｒａｓ　ｐ２
１および結合１２５Ｉリポータ−抗体の複合体を沈降せ
しめる溶液−相１九原補捉試験で２度（ｉｎ　ｄｕｐｌ
ｉｃａｔｅ）検定した。

２度の測定の平均をグラフ中の丸で示し、各群の平均値
は実線で示した。

第６図＝ｒ７、血２のｒａＳ２１「。

Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ
または別の腫瘍学者から入手した癌患者血清（０，１ｄ
）を第５図の説明に記載したようにして２度テストした
。破線はＩｎｔｅｒｓｔａｔｅ　Ｂｌｏｏｄ　Ｂａｎｋ
のサンプルの平均を示す。

第７図−ヒト血゛からのｒａＳ２１の口「材料と手法」
の項に記載しであるようにして、抗体アフィニティクロ
マトグラフィーによってヒト血清４０ｍからｒａｓ反応
性を単離した０反応性はすることによってさらに分析し
た。

日　の：　４　ｆ　手　日本発明は、活性化腫瘍遺伝子の存在に関連する新生状態
を被験者中で診断するための方法に係る。

該方法は、活性化腫瘍遺伝子に関連するポリペプチドの
少なくとも一部の存在を例えば動物又はヒトのような被
験者からの生物体液の試料中に検出する段階を含んでい
る。活性化腫瘍遺伝子は、Ｃ−トｒａｓ、　ｃ−に−ｒ
ａｓ＋ｃ−Ｎ−ｒａｓ＋ｃ−ｍｙｃ、　ｃ−Ｎ−ｍｙｃ
＋ｃ−Ｌ−ｍｙｃ−ｃ−Ｒ−ｍｙ３　ｃ−ａｂｌ、ｃ−
「ｏｓ又はポリペプチドｐ５３をコードする腫瘍遺伝子
であり得るが、他の活性化腫瘍遺伝子でもよい、腫瘍遺
伝子によりコードされたポリペブチ１はｃ−１ｔ−ｒａ
ｓ、　ｃ−に’−ｒａｓ又はｃ−Ｎ−ｒａｓのｐ２１で
あり得、あるいはｃ−ＩＩｌｙｃ（ｐ６２．ｐ６５）、
ｃ−Ｎ−ｍｙｃ（ｐ６４．ｐ６６）、ｐｈｌ／ｃ−ａｂ
ｌ（ｐ２１０）、ｃ−Ｌ−ｍｙｃ、ｃ−Ｒ−ｍｙｃ、　
ｃ−ｆｏｓ（ｐ５５）又はｐ５３によりコードされたポ
リペプチドでもよく、あるいは活性化腫瘍遺伝子により
コードされた他の任意のポリペプチドでもよい。更にポ
リペプチドは、腫瘍遺伝子により一部をコードされ且つ
被験者の染色体ＤＮＡにより一部をコードされたポリペ
プチド融合体でもよい。

ポリペプチドは一般に細胞膜の内面又は核と結び付いて
いると見なされ得るが、内在膜タンパク質でもよい。好
適な具体例において生物体液は血清であるが、他の体液
、例えば尿、脳脊髄液、羊膜液、痰、肺洗浄液、腹水液
、唾液、任意の粘液型体分泌物、血液又は血漿を使用し
てもよい。

試料中における腫瘍遺伝子コード化ポリペプチドの存在
を検出するためには、各種の方法が使用され得る。好適
具体例では、マトリックス−抗体−ポリペブー１−ド複
合体を形成するべく、好適な条件下で試料をポリペプチ
ドに対して特異性のマトリックス結合抗体と接触させる
。次にマトリックス−第１の抗体−ポリペプチド−第２
の抗体から構成される第２の複合体を形成するべく、前
記複合体を検出可能なマーカーで標識された第２の抗体
分子と接触させ、腫瘍遺伝子コード化ポリペプチドの存
在を検出するべくこうして形成された第２の複合体を検
出する。使用したモノクローナル抗体は、Ｉｔｏｃｋｖ
ｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ、米国２０８５２に所在
のＡｍｅｒｉ−ｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃ
ｏ１１ｅｃｔｉｏｎから完全に入手可能なハイブリドー
マ細胞系により産生じた。マトリックス結合抗体は、ハ
イブリドーマＹ１３−２５９（＾ＴＣＣＮｏ、　ＣＲＬ
１７４２）により産生されるｖ−１ｆ−ｒａｓ（Δｂ−
１）であり得、第２の抗体はハイブリドーマＹ１３−２
３８（＾ＴＣＣＮｏ、　ＣＲＬ１７４１）により産生さ
れるｖ−ｔｌ−ｒａｓ（Ａｂ−２）であり得る。−具体
例において第１の抗体は、例えばＡｆｆｉ４ｅｌ（登録
商標）１０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　
Ｃ＾）のようなアガロースマトリックスに結合したモノ
クローナル抗体であるが、第１の抗体はポリクローナル
抗体又は選択された抗体の組み合わせ（「カクテル」）
の一つでもよく。

また５ｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標、Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ。

ＬＪ、）マトリックス、管、ビーズ又は多数の支持体マ
トリックスのいずれかに結合してもよい、好適な具体例
において第２の抗体はモノクローナル抗体であるが、ポ
リクローナル抗体でもよく、結合した検出可能なマーカ
ーは、１２５１２．あるいはコハルｌ〜のような他の放
射性ラベル種、あるいは比色定量、蛍光定量又は発光定
量マーカ一種のいずれかであり、あるいは酵素反応生成
物でもよい。

別の具体例において腫瘍遺伝子コード化ポリペプチドの
検出は、試料をポリペプチド部分に対して特異的な抗体
と好適な条件下で接触させ、こうして抗体−ポリペプチ
ド複合体を形成することにより実施する０次にこうして
形成された複合体を検出する。この好適具体例において
抗体はモノクローナル抗体であり、このような抗体は腫
瘍遺伝子コード化ポリペプチドとの接触時に検出可能な
免疫沈降物を形成する。もっとも、抗体はモノクローナ
ル、ポリクローナル又は選択された抗体の組み合わせの
いずれかでもよい。抗体は１２５■のような検出可能な
マーカーで標識してもよいが、マーカーは放射性マーカ
一種の任意の一員でもよく、あるいは比色定量、蛍光定
量又は発光定量マーカーでもよく、あるいは酵素反応の
生成物でもよい。

抗体は、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｃｌ、
米国２０８５２に所在の＾ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　
Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎから完全に入手
可能なハイブリドーマ細胞系Ｙ１３−２５９（＾ＴＣＣ
Ｎｏ、　ＣＲＬ］、７４２）により産生されたｖ−Ｈ−
ｒａｓ（八ｂ−１）であり得る。

更に別の具体例においてポリペプチドの検出は、腫瘍遺
伝子コード化ポリペプチドの存在下で検出可能なコント
ロール用ポリペプチドをポリペプチドの部分に対して特
異的な抗体と接触させ、こうして抗体−コントロール用
ポリペプチドから成る複合体を形成することにより実施
される。こうして形成された複合体の個数を平均的な当
業者に既知の方法により定量する。こうして定量された
個数を腫瘍遺伝子コード化ポリペプチドの不在下で形成
された複合体の個数と比較し、形成された複合体の個数
の減少により試料中における腫瘍遺伝子コード化ポリペ
プチドの存在が確認される。抗体分子はモノクローナル
、ポリクローナル又は選択された抗体の組み合わせであ
り得、アガロース、セファロース（登録商標）、管もし
くはビーズの一部のようなマトリックスに結合させても
よい、コントロール用ポリペプチドは、例えば＋２５１
のような放射性ラベル又は好適な放射性ラベル種のいず
れかで標識してもよく、あるいは比色定量、蛍光定量又
は発光定量マーカーでもよく、あるいは酵素反応生成物
で標識してもよい、抗体は、Ｒｏｃｋ−ｖｉｌｌｅ、　
Ｍａｒｙｌａｎｄ、米国２０８５２に所在の＾ｍｅｒｉ
ｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏ
ｎがら完全に入手可能なハイブリドーマ細胞系Ｙ１３−
２５９（ＡＴＣＣＮｏ、　ＣＲＬ１７４２）により産生
されたｖ−Ｉｆ−ｒａｓ（＾ｂ−１）であり得る。

本発明はまた、活性化腫瘍遺伝子の存在に関連する新生
状態を被験者中で診断するための方法に係り、該方法は
、検出可能な第１の抗体−ポリペプチド−第２の抗体か
ら成る複合体を形成するべく、検出すべきポリペプチド
の部分上のエピトープに対して特異的な第１の抗体と、
検出すべきポリペプチドの部分上の別のエピトープに対
して特異的な第２の抗体とに試料を好適な条件下で接触
させる段階を含んでいる。各抗体はモノクローナル又は
ポリクローナル抗体であり得る。検出は、酵素反応、化
学反応、吸収光の波長シフト又は発光により実施され得
る。使用した抗体は、Ｒｏｃｋ−ｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒ
ｙｌａｎｄ、米国２０８５２に所在の＾ｍｅｒｉｃａｎ
Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎから
完全に入手可能なハイブリドーマ細胞系から産生じた。

第１の抗体はハイブリドーマＹ１３−２５９（ＡＴＣＣ
Ｎｏ、　ＣＲＬ１７４２）により産生されたｖ−Ｈ−ｒ
ａｓ（＾ｂ−１）であり得、第２の抗体はＹ１３−２３
８（ＡＴＣＣ”Ｎｏ、　ＣＲＬ１７４１）により産生さ
れたｖ−ｔｌ−ｒａｓ（八ｂ−２）であり得る。

本発明は更に、活性化腫瘍遺伝子の存在に関連する新生
状態を被験者中で診断するための方法に係る。該方法は
、当業者に既知の方法を使用して被験者からの生物体液
の試料中における腫瘍遺伝子コード化ポリペプチドの量
を定量することから成る。こうして定量された量を正常
な被験者、例えば腫瘍をもたない被験者からの試料中の
量と比較し、著しい量の差の存在により新生状態の存在
が確認される。

本発明は更に、被験者における新生状態の経過を監視す
るための方法に係る。該方法は、当業者に既知の方法に
より被験者からの生物体液の第１の試料中で腫瘍遺伝子
コード化ポリペプチドの存在を定量することから成る。

こうして定量された量を、別の時点、即ち腫瘍の成長又
は退行に十分な時間を経過した時点で被験者から採取さ
れた第２の試料中に存在している量と比較する。定量さ
れた量の差により、例えば成長又は退行のような新生状
態の経過が確認される。

新生状態は、肺癌、膀胱癌、乳癌、子宮癌、前立服癌、
結腸癌、肺服癌、神経芽腫、黒色腫、横紋筋芽細胞腫、
リンパ腫及び白血病を包含するが、これに限定されるも
のではない。

本発明は、更に腫瘍の分類方法に係る。該方法は、例え
ばｃ−Ｎ−ｒａｓ　ｐ２１又はｐ５３のような１種以上
の腫瘍遺伝子コード化ポリペプチドの存在を新生状態の
被験者からの生物体液の試料中で検出することから成る
。特定の組み合わせの有無により特定の腫瘍型が確認さ
れる。

本発明は更に、例えばｃ−Ｎ−ｒａｓ　ｐ２１又はｐ５
３のような１種以上の腫瘍遺伝子コード化ポリペプチド
の量を新生状態の被験者からの生物体液の試料中で定量
することから成る腫瘍の分類方法にも係る。

特異量又は相対量のポリペプチドの存在、例えばｐ５３
の量の著しい増加により特定の腫瘍の型が確認される。

本発明は更に、活性化腫瘍遺伝子によりコードされ細胞
内に発生するポリペプチドの少なくとも一部を生物体液
の試料中で検出することから成る活性化腫瘍遺伝子の検
出方法にも係る。

最後に本発明は、新生状態の治療用として推定される治
療薬を審査するための方法に係る。該方法は、当該状態
に関連する例えばｃ−に−ｒａｓ　ｐ２１のような腫瘍
遺伝子コード化ポリペプチドの量を新生状態の被験者か
らの第１の試料中で定量する段階を含んでいる０次に、
治療後の被験者をもたらすべく、治療薬を当該状態に関
連する新生細胞と接触させるように治療量の治療薬を被
験者に投与する。好適な期間後、例えば腫瘍の著しい成
長又は退行に十分な期間を経て治療後の被験者がらの試
料中におけるポリペプチドの量を定量する。最後に、第
１の試料中で定量されたポリペプチド量を、治療後の被
験者からの試料中で定量された量と比較し、２種類の試
料からのポリペプチドの量の著しい差により当該治療薬
の効果、即ち該治療薬が腫瘍の退行に関連しているが否
がか確認される。

１、ＭＡＪＩＥＬｉＬ１０％の胎児子ウシ血清（Ｍ＾Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ
、　Ｗａｌｋ−ｅｒｓｖｉｌｌｅ、　ＭＤ）を補充した
ＩＨ’ＭＩ　１６４０中にハイブリドーマ系を、保持し
た。大量のイムノグロブリンを得るために、予めブリス
タン（＾１ｄｒｉｃｈ）を注入した蓄歯動物に細胞を注
射し、５〜１０日後に腹水液を採取しな。５％の胎児子
ウシ血清を加えた高グルコース型Ｄｕｌｂｅｃｃｏ変形
Ｅａｇｌｅ培地（ＭＥＮ）にヒト腫瘍細胞系を慣例通り
に保持し、Ｉ−ランスフェクトされたＮ−１Ｋ−又はＨ
−ｒａｓ　ＮＩＨ（３Ｔ３）ＣＩ２．２細胞系に５％の
コロラド子ウシ血清（Ｃｏｌｏｒａｄｏ　Ｓｅｒｕｍ　
Ｃｏ、）を補充した。変形Ｅａ、ｒｌｅ塩（Ｇｉｂｃｏ
、　＃３２０−１３８５＞を含より、Ｉ・ランスフェク
トした細胞系をｒａｓタンパク買精製用として大規模に
拡張することができた。

第１表は、ハイブリドーマ細胞系とそのイムノグロブリ
ン特異性のリスｌ−である。使用したモノクローナル抗
体は、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、米国２
０８５２に所在の八ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１
ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎから完全に入手可能な
ハイブリドーマ細胞系により産生じた。使用した抗体は
、ハイブリドーマＹ１３−２５９（ΔＴＣＣＮｏ、ＣＲ
Ｌ１７４２）により産生したｖ−１１−ｒａｓ（＾ｂ−
１）、及びハイブリドーマＹ１３−２３８（八ＴＣＣＮ
ｏ、　ＣＲＬ１７４１）により産生したｖｌｌ−ｒａｓ
（Δｂ−２）である。第２表は、腫瘍遺伝子タンパク質
発現を検出するために使用したヒト腫瘍細胞系を示して
おり、第３表は、ｒａｓで１ヘランスフエクトした細胞
系、腫瘍遺伝子で形質転換した細胞系、ウィルスで形質
転換した細胞系及びコントロール用補胞系のリストであ
る。

表１：公イーブ２尤氏：゛り鴫胞糸−ζえの逸及グｑズ
旦ン特異作免疫り′ロフ′ｌルＣ３ＪフμＡｋ４１　　　ユイフ′リド′−７１ｕ　　
　　　　　　ｉλＷＩＶ−トｒａｓ　　　Ｙ１３−２５
９　　　ラット　　向汎性　　　Ｆｕｒｔｈ　ｅｔ　ａ
ｔ（１９８２）（＾ｂ−１）　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ　　４３：　　２９４゜ｖ−Ｉｆ−ｒ
ａｓ　　　　　　Ｙ１３−２３８　　　　　ラット　　
　　　Ｉｌｌよυ”Ｋ　　　　　　　Ｆｕｒｔｈ　　ｅ
ｔ　　ａｌ（１９８２）（Δｂ−２）　　　　　　　　
　　　　　ｒａｓ　ｐ２１　　　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ　４３
：　２２９４゜ｖ（ｅｓ　　　　　　　　Ｆ１１３　　
　　　　　　ラ訃　　　　　ｖ−ｆｅｓ　　　　　　　
　Ｖｅｒｏｎｅｓｅ　　ｅｔ　　ａｌ（１９８２）（＾
ｂ−１）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　タンハリ　　　　　　　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ　　
４３：　　８９６゜ｖ４ｍｓ　　　　　　　　３Ｍ３　
　　　　　　　　　テ、ｙ）　　　　　　ｖ（ｍｓ　　
　　　　　　八ｎｄｅｒｓｏｎ　　ｅｔ　　孕↓（１９
８２）く＾ｂ−１）　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　タンバり　　　　　　　Ｊ、Ｖｉｒ
ｏｌ　　４４：　　６９６゜ｖ−ｆｍｓｓＭ５　　　　
　　　　　チット　　　　　ｖ（ｎ＋ｓ　　　　　　　
　Δｎｄｅｒｓｏｎ　　ｅｔ　　ａｔ（Δｂ−２）　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　タン
バり　　　　　　　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ　　４４：　　６９
６゜ｐ５３　　　　　　　　　　ＰＡｂ４２１．　　　
　　　ｖウス　　　　　ｐ５３　　　　　　　　　１１
ａｒｌｏｕ＋　　ｅｔ　　ａｌ（１９８１）（Ａｂ−１
）　　　　　　　　　　　　　腫瘍抗原　　Ｊ、Ｖｉｒ
ｏｌ　３９：　８６１゜ｃｙｔｏｋｅｒａＬｉｎ　　Ｃ
Ｋ−４ｖウス　　　ｃｙｔｏｋｅｒａＬｉｎ−Ｄｅｂｕ
ｓ　　ｅＬ　　ａｌ（１９８２）（Δｂ−１）　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１８　　　
　　　　　　　　　ＥＭ［１０Ｊｏｕｒｎａｌ　　１２
．］、ｇ４１表２：ｔｌ−”。

Ａ４３１　　　　　　陰門扁平上皮癌＾３７５　　　　　　黒色腫（皮下転移）Ａ５４９　　
　　　　肺腺層Ａ２０４　　　　　　横絞筋肉腫Ａ６７３　　　　　　＄ＪＩ紋筋肉腫Ｔ−２４膀胱癌ＨｅＬａ　　　　　　子宮癌に５６２　　　　　　赤白血病表３：トランスフェクトされた細１系、形質板　された
綱ｎ系＋１０−８　　　　　　　　　　　イヌ細胞中の
ｖ−１１−ｒａｓミンクＣＣＩ　６４　　　　　　コン
トロールミンクＧＡ　Ｆｅ５Ｖミンク　　　　　　ｖ−
ｆｅｓＮｌｌｌ　３Ｔ３　Ｃ１２，２）ランスフェクシ
ョンに使用したコントロールマウス細胞系Ａ１１　　　　　　　　　　１２番目にバリンをコード
しているＴ−２４ＩＩ−ｒａｓ遺伝子でトランスフエフ
１〜＋１Ｌ−６０−２６１番目にロイシンをコードして
いる１１Ｌ−６０，Ｎ−ｒａｓ遺伝子でトランスフェク
ト０Ｓ−８−２０−６−２１２番目にシスチンをコード
しているＣａ１ｕｌ、　Ｋ−ｒａｓ遺伝子でトランスフ
ェクト（以下余白） ■、　　　　　の；　１３０ストロークの遊嵌式乳棒を備えるドウーンスホモジ
ェナイザー内で＾１−１、ＨＤ−８及びに５６２細胞を
***させることにより細胞抽出物を調製した。１％のＴ
ｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００（ＰＢＳ−Ｔｒｉｔ
ｏｎ、　Ｒｏｈｍ　＆ｔｌａａｓ、　Ｐｈ１ｌａｄｅｌ
ｐｈｉａ、　Ｐｈ）を含有するリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ
；　１０ｎ＋Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７，２，０，９
％塩化ナトリウム）の存在下で、付着細胞、）ＩＤ−８
及び旧Ｈ３Ｔ３　Ｃ１２，２を１５０ｍｌ１１の組織培
養皿（Ｆａｌｃｏｎ）からゴムポリスマンで掻落とした
。ｌＡ胞油抽出物１５００ＯＲＰＭ（Ｓｏｒｖａｌ　ｌ
　（登録商標）ＲＣ−５８，５Ｓ−３４０−タＩｖａｎ
　５ｏｒｖａｌｌ、　Ｉｎｃ、、　Ｎｏｒｕ＋ａｌｋ、
　ＣＴ）で１０分間遠心分離し、細胞残渣を除去した。

細胞抽出物をＰＢＳで希釈し、Ｌｏｗｒｙ他（２１）の
方法によりタンパク質濃度を測定した。

濃度が低すぎる場合には凍結乾燥及び復元により、濃度
が高すぎる場合にはＰＢＳ−ＴｒｉＬｏｎ（登録商標）
を加えることにより全細胞抽出物を７．０〜／ｄの濃度
に標準化した。これらの細胞抽出物を抗原捕獲手続き（
抗原捕捉法）でｒａｓ　ｐ２１タンパク買のソースとし
て使用した。

１［，３５Ｓメ　　ニンによる　　の　：　；５％の透
析した子ウシ血清（Ｃｉｂｃｏ）を補充したＤｕｌｂｅ
ｃｃｏの培地（メチオニンを含まない）中で付着性細胞
単層を３７℃で１時間インキュベートしな。

培地を除去し、０．２＋ａＣｉ／ａｆの３ｓｓメチオニ
ン（ｍｅｔ）（１０７５Ｃｉ／ｍｍｏｌ　；＾Ｔ＠ｅｒ
ｓｈａｍ　Ｃｏｒｐ、）を含有する新しい培地を細胞に
補充し、従来技術（３ｏ）に従って３７℃で２時間以上
インキュベートした。細胞をリン酸ｔ−ｉｓ溶液（ＰＢ
Ｓ；　１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７，２０，０，
９％塩化ナトリウム）で３７℃で２度洗浄した。１％ノ
Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００，０，５％のデオ
キシコール酸ナトリウム及び０．１％のドデシル硫酸ナ
トリウムを含有するＰＢＳ（ＰＩ３Ｓ　ＴＤＳ）中で細
胞単層を***させた。７０Ｔｉロータを備えるＢｅｃｋ
ｍａｎ（登録商標）遠心ｌ１（Ｌａ−８０８，Ｂｅｃｋ
ｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　Ｉｎｃ、。

Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、　ＣＡ）中で３０００ＯＲＰＭで
遠心分離すること逅により細胞抽出物を清澄化した。

物の血清＃からイムノグロブリンを精製した。血清又は
腹水液は４℃で３０分間１５０００ＲＰＭで遠心分離（
ＳＳ−３４０−夕を備える５ｏｒｖａｌｌ（登録商標）
ＲＣ−５Ｂ型遠心機）シ、ハイブリドーマ細胞系からの
培地は４°Ｃで３０分間３０００ＲＰ阿で遠心分離（Ｈ
−６０００八ロータを備える５ｏｒｖａ　Ｉ　ｌ　（登
録商標）ＲＣ−３８型遠心機）した、容量−を記録し、
２０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７，８及び５０％
の飽和硫酸アンモニウム＜３８５ｇ／ｊ、Ｓｃｈｗａｒ
ｚ／Ｍａｎｎ−酵素板）の最終濃度に溶液を調整した。

溶液を４°Ｃで３時間攪拌し、血清又は腹水液は１５０
００ＲＰＭで３０分間（ＲＣ−５Ｂ＞、細胞培地は３０
００ＲＰＭで１時間＜Ｉｃ−３Ｂ）遠心分離した。

イムノグロブリンを含有する沈降物を、０．０２％のア
ジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ中に溶解し、１５時間
の間にＰＤＳを３回交換して透析し、ＰＢＳで平衡化さ
れたＣト＾ｆｒｉ−Ｇｅｌ（登録商標）ブルー（Ｂｉｏ
−Ｒａｄ。

Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ）の樹脂を収容するカラム（
１，６×２０ｃｍ、Ｐｈａｒｍａｃ　ｉａ）に加えた。

Ｃ型の収集ラックを備える５ｕｐｅｒＲａｃ（ＬＫｆ１
２２１１．　ＬＫＢ、　Ｒｏｅｋｖｉｌｌ、　ＭＤ）を
使用し、ｌＩｎｌＺ分の流量でｌｌｄ！のフラクション
を収集した。

２．０八ＵＦＳの吸収幅に設定された波長２８０ｎｍの
Ｕｖｉ−ｅｏｒｄ（登録商標）Ｓ型（ＬＫＢ　２１３８
）スベクトロフォ１〜メータによりフラクションを監視
し、単ヂＡ・ネルチャート記録器（ＬＫＢ　２２１０）
により記録した。５ＯＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析した処、未結合の
流出フラクション中にイムノグロブリンが認められた。

ピークフラクショ望」ンをプールし、最終濃度５０％飽和硫酸アンモニウムの
存在下で４℃で３時間攪拌することによりイムノグロブ
リンを沈降させた。溶液を４℃で３０分間１５０００Ｒ
ＰＭで遠心分離（Ｓｏｒｖａ　ｌ　ｌ　（登録商標）Ｒ
Ｃ−５８゜５Ｓ−３４０−タ）した、沈降物を最小容量
のＰＢＳ中に溶解し、５ｐｅｃｔｒａｐｏｒ（登録商標
）２型透析管（Ｓｐｅｃｔ−ｒｕｍ　　Ｍｅｄｉｃａｌ
　　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、　　Ｉｎｃ、、　　Ｌｏｓ
　　ＡｎＨｅｌｅｓ。

ＣＡ）内で’　ＤＥＡＥ−緩Ｉ液Δ（０，０２Ｍ　Ｔｒ
ｉｓ−１１ＣＩ、ｐＨ８，５，００２％アジ化すｌ〜リ
ウム含有）を３回交換して４℃で１５時間透析した。部
分的に精製されたイムノグロブリンをＨＰ　Ｌ　Ｃクロ
マトグラフィにかける以前に０．４５ｍｍのＭｉｌｌｅ
ｘ（登録商標）フィルタ（旧１１１ｐｏｒｅＣｏｒｐ、
、　Ｂｅｄｆｏｒｄ、　Ｎ＾）で−過した。１４ｍの試
料ループ（ＵＭ　６に試料インジェクタ、Ｗａｔｅｒｓ
）によりＴＳＫＤＥＡＥカラム（１５０ｘＯ，５ｍｍ　
Ｂｉｏ　Ｒａｄ　ｃａｔ　１５５−０１０４）上に試料
を注入した。Ｗａｔｅｒｓ社の自動式勾配コン１ヘロー
ラ（６８０型）及びポンプシステム（５１０型）を使用
し、２８０　ｎ　ｍに設定された可変波長検出器（Ｗａ
ｔｅｒｓＬａｍｂｄａ−Ｍａｘ、　４８１型）及び伝導
率モニタ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ＃１６７０４４０型）により
カラム溶離を監視した。０．０２ＭＴｒｉｓ−１１ｃＩ
　ｐ）１８．５をＭ衝液Δ、０．３Ｍ　ＮａＣｌ　　ｐ
Ｈ７，ｏを含有する０、０２Ｍ　Ｔｒｉｓ−１１ＣＩを
緩衝液Ｂとして使用する勾配法で試料を溶離した。５Ｏ
Ｓ−ＰＡＧＥによりビークフラクションの純度を分析し
た。

し、予め冷温の蒸留水で洗浄した＾ｆｆ１−Ｇｅ１（登
録商標）１０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ＞を、１ｍｌ１の１ｆｉ
−Ｇｅｔ（登録商標）１０に対してタンパク質７．ＯＷ
Ｉｇの濃度で精製モノクローナル抗体溶液に加えた。一
般に７０■の抗体リガンドを１０ｄの＾［１−Ｇｅｌ　
１０に加えた。溶液をＬａｂ−ｑｕａｋｅ（登録商標）
回転器（Ｌａｂ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ　＃４００−１
０゜Ｌｎｂ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、　Ｂｅｒｋｅｌｅ
ｙ、ＣＡ）上で４°Ｃで４時間緩慢に攪拌した後、未反
応のエステル基を保護するべく最終濃度が０．１Ｍとな
るようにエタノールアミン（Ｅａｓｔｍａｎ　Ｋｏｄａ
ｋ）を加えた。１時間後、２８０ｎｍで吸光度ゼロ（Ｏ
Ｄｚｓ。）となることによりゲルから反応剤がなくなっ
たことが判断されるまで２５０ＯＲＰＭで１０分間遠心
分離することによりゲルマトリックスとＰＢＳで更に洗
浄した。ある実験では、結合用抗体リガンドはｖ−ｔｌ
−ｒａｓ（＾ｂ−１）又はｖ−）！−ｒａｓ（八ｂ−２
）のいずれかから構成し、他の実験では両方の抗体をゲ
ルマトリックスに結合した。シトケラチンナル抗体ｖ−
ｆｍｓ（＾ｂ−２）を調製し、同一のタンパク質／ゲル
比でＡｆｆｉ−Ｇｅｌ（登録商標）１０と結合したコン
トロール用リガンドとした。指定した実験ではコントロ
ール用の非結合＾ｆｆ１−Ｇｅ１（登録商標）１０を使
用した。抗体機能が結合手続き後も維持できるようにす
るために、ｒａｓタンパク質を含有する細胞抽出物で捕
獲ゲルマトリックスをインキュベートし、結合したタン
パク質を５ＯＳ−ＰＡＧＥによる分析用の試料緩衝液で
溶離した。

ＬＫＢ研究所により頒布されているプロトコールに従っ
てモノクローナル抗体をビオチニル化した。

０．５ｄの無水ジメチルホルムアミド（Ｐｉｅｒｃｅ）
に２．０〜の＾ａｔ　ＢＩＯＴＩＮを加えることにより
調製した２００成の＾ａｔ　ＢＩＯＴＩＮ溶液を、０．
１５ＨのＮａＣｌを含有する１０ｄの０．２Ｈ炭酸水素
ナトリウムｐＨ８，８中に１０ＷＩｇのイムノグロブリ
ンを溶解させた溶液に加えた。室温で１５分間反応を進
行させ、ｏ、ｔＩｌｉ！の１．ＯＭ塩化アンモニウムｐ
Ｈ６，０を加えて反応を終了させた。ビオチニル化した
抗体をＰＢＳで透析して他の塩を除去し、１．０−のア
リコートを一２０℃で保存した。

ビオチニル化後に抗体の生物活性が維持されるようにす
るために、腫瘍遺伝子コード化タンパク質を含有する”
Ｓｍｅｔで標識した細胞抽出物の免疫沈降により抗体を
試験した。例えばビオチニル化後のｒａｓ　ｐ２１タン
パク質を免疫沈降させるためにＶ−Ｈ−ｒａｓ（＾ｂ−
１）を使用した。　ｒａｓ　ｐ２１タンパク質を含有す
る減少量の細胞抽出物とｖ−トｒａｓ（＾ｂ−１）（Ｑ
、５ＩＩｇ）とを反応させ、０．０５ｄのストレパビジ
ンーアガロース懸濁液で０．２４１ｎｇ／ｄで免疫沈降
させた。

■、虻、　　　、きで・　される　　イムノｎ予めクロ
ロホルム中に１０〜／ｄの濃度で溶解し、凍結乾燥して
凍結状層に維持した２０ρの１１００Ｏ−ＧＥ〈登録商
標、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｒｏｃｋｆｏｒ
ｄ、ｌ１ｌｉｎｏｉｓ）のアリコートを室温まで暖めた
。　ｌ０ＤＯＧＥＭ（登録商標）を収容している管に、
０．０２５ｄのＢｕｆｆｅｒＩ［（０，４Ｔｒｉｓ−１
１ｃＩ、０．４ｍＭ　ＥＤＴ＾、ｐ１１７．４）、１．
０ａｑ１０．１戒の濃度のモノクローナル抗体及び１．
０ｍＣ１のＮａ１２５１（＾ｍｅｒｓｈａｍ（登録商標
）＃　ＩＭＳ、４０＾ｍ　ｅ　ｒ　ｓ　Ｉｔ　ａ　ｖｓ
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、　ＢｕｃｋｉＢｈａｍｓ
ｈｉｒｅ、英国）を順次加えた。緩慢に震盪しながら１
分間ヨウ素化反応を進行させ、１０ｎ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−
ＨＣＩ、１０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７，８で平衡化した
Ｇ−２５５ｅｐｈａｄｅｘ（登録商標＞ＰＤＩＯカラム
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　Ｎ
、Ｊ、）を使用して混合物をゲルー過クロマトグラフィ
にかけ、未反応の遊離している＋２５１を除去した。０
．５ｄのフラクションを収集し、試料をプールする以前
に１０％のトリクロロ酢酸（ＴＣ＾）で沈降可能なカウ
ントを測定した。

コｓＳメチオニンで標識した細胞抽出物を最終容１ｉＩ
ｎ１につき２０／１１の胎児子ウシ血清と混合し、卓上
冷却遠心機（Ｉｌｅｃｋｍａｎ　（登録商標）ＴＪ−６
，ＢｅｃｋｍａｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ、、
　Ｆｕｌｌｃｒｔｏｎ、　Ｃ＾）中で３００ＯＲＰＭで
１５分間遠心分離した。ｌｄの細胞抽出物を、１■のモ
ノクローナル抗体及び０．１７５１１１ｇのプロティン
八を含有する５０Ｉ１１の１０％（ｖ／ｖ）プロティン
式アガロース（ＢＲＬ）懸濁液と４℃で１５時間反応さ
せた。ラットモノクローナル抗体を使用して沈降させる
ために、ラットイムノグロブリンを会≠暴唯４Ａアガロ
ースと結合させた。免疫複合体をＰＢＳＴＤＳ中で３回
洗浄し、１１０００ＲＰで１０分間遠心分離することに
よりこれを収集した。”Ｓ　ＭｅｔでＦＡ識した免疫沈
降物を、５〜２０％のアクリルアミド５ＤＳ−ＰＡＧＥ
を使用する電気泳動により分析し、オートラジオグラフ
ィにかけた。

ｌＸ、ｓＤｓポリアクリルアミドスーブゲル−泳６．０
Ｍ尿素く旧ｔｒａｐｕｒｅ、　ＢＲＬ）、０．ＩＭ　Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣＩ（Ｓｉｇｍａ；　Ｔ−１５０３）、ｐｌ
＋６．８．１５％グリセロール（Ｋｏｄａｋ；　１１４
−９９３９）、２％ドデシル硫酸ナトリウム（Ｂｉｏ４
ａｄ：　＃１１Ｂ−０３０２）及び５％ｌβ−メルカブ
トエタ（１９）の記載に従って５〜２０％のアクリルア
ミド勾配上で電気泳動させた。試料を２分間煮沸後、Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ　１５５型縦型電気泳動セル（Ｂｉｏ−Ｒ
ａｄ　１６５−１４２０＞内で幅１．５＋ｍのスラブゲ
ルに加え、ゲル当たり４５ボルトの定電圧（Ｉｌｏｅｆ
ｆｅｒ電源、　ＰＳ１２００ＤＣ）下で１５時間泳動さ
せた。使用した標準分子量は、ミオシン２０００００、
β−ガラクトシダーゼ１３００００、ホスホリラーゼＢ
９２０００、ウシ血清アルブミン６８０００、オボアル
ブミン４５０００、炭酸脱水素酵素２９０００、大豆１
〜リプシンインヒビター２１０００、リゾチーム１４４
００、シトクロムＣ１２０００であった。７．０％の酢
酸及び１０％のメタノール中の０．１％のＣｏｏｍａｓ
ｓｉｅ　Ｂｌｕｅ　Ｒ−２５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　＃１
６−０４００）でゲルを５分間染色し、Ｃｏｏｍａｓｓ
ｉｅを含まない同一の溶液で染色を除去した。あるゲル
はＭｅｒｒ　ｉ　ｌ　（２３）の記載に従って銀法（Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ銀染色キット、＃１６１−０４４３）によ
り染色した。Ｂｏｎｎｅｒ及びＬａ５ｋｅｙ（５）の記
載に従ってＥｎｈａｎｃｅ（Ｎｅｕ＋　Ｅｎｇｌａｎｄ
、Ｎｕｃｌｅａｒ）及びＸＲ−２型Ｘ線フイルム（Ｋｏ
ｄａｋ）を使用し、放射性標識試料を含んでいるゲルを
オートラジオグラフィにかけた。標識化試料を含むゲル
で使用した分子！標準は、”Ｃ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ
　Ｎｕｃｌｅａｒ）で予め標識した。

各検定点で、４％のＢＳ＾を有する４ばのＰＢＳを収容
する管にアフィニテイ捕獲マトリックスｖ　−ＩＩ　−
ｒ　ａ、５（Ａｂ４／Ａｂ−２Ａ［１−Ｇｅ１（登録商
標）１０）懸濁液（７）７リコートを加え、３０分〜３
時間免疫阻止し、２８００ＲＰＭで遠心分離によりペレ
ット状とし、その後ＰＢＳで１回洗浄した。免疫阻止し
、洗浄した捕獲マトリックスを使用して１１０８細胞膜
からの抽出物及び癌患者からの血清中のｐ２１をプロー
ブした。アフイニティマトリックスのベレットを収容し
ている容管にｌＩＤ８細胞膜抽出物又は患者血清のいず
れかを加え、１〜２時間反応させた。マトリックスをペ
レット状にし、０．０５％のＴｕ＋ｅｅｎ　（登録商標
）２０を含有する４、０ｄのＰＢＳ中で１回洗浄した。

１ｄのＰＢＳ及びビオチニル化ｖ−Ｈ−ｒａｓ（八ｂ−
１）を容管に加え、３７℃で１時間インキュベートし、
ベレット状とし、そのｔ＆ＰＢＳ−０，５％Ｔｕ＋ｅｅ
ｎ　（登録商ａ　）２０（ＩＣＩ　ＡｍｅｒｉｃａｓＩ
ｎｃ、、　ＷｉｌｍｉＢｔｏｎ、　ＤＥ）中で１回洗浄
した。０，０５％のＴｕ＋ｅｅｎ　（登録商標）２０を
含有する１０．０ｒｎｆ！のＰＢＳ中に２滴の溶液Δ（
ＶｅｃＬａｓＬａｉｎ（登録商標）、アビジン−ビオチ
ン複合体（ＡＢＣ）キット、＃ＰＫ４００４、Ｖｅｃｔ
ｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｂｕｒｌｉｎｇａｍ
ｅ、　ＣΔ）と、２滴の溶液Ｂとを混合することにより
、アビジン−ビオチン−西洋ワサビペルオキシダーゼ複
合体を調製した。３０分後にマｌ〜リックスペレットに
１雁のＡＢＣ溶液を加え、混合し、３７°Ｃで３０〜６
０分間インキュベー）−した。その後マトリックスをペ
レット状とし、４．０ｍｌのＰ［１Ｓ−０，０５％　Ｔ
ｕ＋ｅｅｎ　（登録商標）２０で１回洗浄１−な。展開
溶液は次のように？Ａ製した。溶液Ｉは、１００雇のＰ
［ｌＳに０．０６ｄの３０％過酸化水素を加えることに
より調製した。溶液■は、２０．０ｄの水冷メタノール
に６０〜の西洋ワサビペルオキシダーゼ展開？？Ｉ（Ｂ
ｉｏ　Ｒａｄ）と加えることにより調製した。使用直前
に、５部の溶’ｔｌ　［を１部の溶？ｌ　Ｕと混合し、
１．０ｍｌをマトリックスに加えた。マトリックスは、
ｒａｓ　ｐ２１タンパク質を含有する試料中で青色を答
呈した。

Ｘｌ、ｌ　　モノクロ−ナツト・抗一体−４リポータ−
Ｗｆとして・ｊ用する同ＩＸｉ刷４［■−１−の抗ｒａ
ｓ　ｐ２１モノクローナルｖ−ｌトｒａｓ（＾ｂ−２）
又はシーＨ−ｒａｓ（八ｂ−１）捕獲アフィニティマト
リックス及びコントロール用−とじてシトケラチン（＾
ｂ−１）又はｖ−ｆｍｓ（Ａｂ−２）捕獲マトリックス
を、４．０ｄのＰＩＩＳＴＤＳで２回、０．１％のＢＳ
Ａを含有する４、０−のＰＢＳ（Ｐ１３Ｓ−ＢＳＡ）で
１回洗浄した。細胞抽出物又はヒト血清で使用した捕獲
マトリックスを丸底（１２Ｘ７５＋ｅ＋ｓ。

Ｅｎｋａｙ）又は円錐形ポリプロピレン管（１２Ｘ　７
５ｍｍ　。

Ｅｎｋａｙ）内で夫々インキュベートした。

各実＠（結果）中に示すように細胞抽出物上清の濃度を
変化させながらゲルマトリックスペレットにＰＢＳ−Ｂ
ＳＡを加えた。混合物を４℃で一晩又は３７℃で各種の
時間（経過時間実験）インキュベートし、ｒａｓ　ｐ２
１タンパク質と抗原捕獲マトリックスとの結合を最適化
させた。ＰＢＳで２回洗浄後、ｏ、ｔＩｄの１２５■標
識ｖ−Ｈ−ｒａｓ（＾ｂ−１）又はｖ−Ｈ−ｒａｓ（＾
ｂ−２）モノクローナル抗体（６００００ｃｐｍ、　１
．０ｕＣｉ　１２５ｒ／タンパク質■）を加え、混合物
を３７℃で１．５時間インキュベート・した。ゲルマト
リックスをＰＢＳＴＤＳで１回、ＰＢＳで２回洗浄し、
γカウンタ（ＬＫＢ　＃１２７４　Ｒｉａｇａｍｍａ）
で計数した。

０．１％のアジ化ナトリウムを含有する２倍の容量のＰ
ＢＳ中にゲルマトリックスペレツ）・を懸濁させ、ＴＰ
ＣＫ（Ｓｉｇｍａ）０．００５％、大豆トリプシンイン
ヒビター　（Ｓｉｇｍａ）０．０１％、アジ化ナトリウ
ム０．０１％、フ・フ化ナトリウム０．０１％及びアプ
ロチニン（Ｓｉｇｍａ）２．７５ＪＪ１（０，０５４Ｔ
ＩＵ）（１９，８ＴＩＩＩ／ｄ　＞（７）最終濃度ノ細
菌成長及びプロテアーゼインヒビター溶液（ＢＧＩＰｌ
、。

０．０５ｍ）を収容する丸底管（１２Ｘ　７５ｍ＋ｓ、
　Ｅｎｋａｙ）に０．０１ｒｎ１の前記懸濁液を移した
。１／２ｄの患者又は正常ヒト血清（ＮＩＩＳ）を容管
に加え、試料を４℃で一晩インキユベートした。ゲルマ
トリックスを３．０ｄのＰＢＳで２回洗浄し、約ｏ、ｉ
ｙの容量の液体をゲルマトリックスベレットと共に保存
した。ベレットを０．１ｍの１２５１標識モノクロ一ナ
ル抗体［ｖ−Ｈ−ｒａｓ（＾ｂ−１）又はｖ−１トｒａ
ｓ（＾ｂ−２）−約６００００ＣＰＭ、１．０ｕＣｉ＋
２５７７タンパク質Ｉ４１］と共に３７℃で２時間震盪
し、３゜ＯｄのＰＢＳＴＤＳで１回、３．０戒のＰＢＳ
で２回洗浄し、最後にγカウンタで計数した。

■、注１柾五盃１１１隻本発明の別の具体例として以下に示す改良型溶液相ｒａ
ｓ　ｐ２１抗原捕獲試験をフォーマット化した。

この試験は患者血清を０．１ｒｄ、Ｌか必要とせず、そ
の他の試験成分は、ストレパビジンーアガロース＜１３
ｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ。

ＨＤ、　　ＣａＬａｌｏｇ　　Ｎｏ、　　５９４２Ｓ八
、　　Ｌａｂ　　Ｎｏ、　　％５２１０１）、　ビオチ
ニル化捕獲抗体シーＨ−ｒａｓ（＾ｂ−１）及びリポー
タ−抗体として＋２５１標識ｖ−１１−ｒａｓ（八ｂ−
２）から構成した。抗原捕獲構造を下記に概略的に示す
。

（以下余白）最適性能条件を決定した。血清試料（０，１戒）、３■
のビオチニル化捕獲抗体及び１１０００００ｃｐの１２
５（標識リポータ−抗体を結合し、２５℃で１時間イン
キュベートし、アガロースと共有結合した１６■のスト
レバビジンを加えた。震盪下で２５℃で３０分間インキ
ュベーション後、Ｂｅｃｋｍａｎ（登録商標）冷却遠心
機（ＴＪ−６型）内で２８００ｒｐｍで３分間遠心分離
することにより免疫複合体を収集し、未結合のリポータ
−抗体を含む上清を吸引し、３ｄのＰＢＳ９．１％Ｔｒ
ｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００を加えた。遠心分離、
吸引及び洗浄工程を３回繰り返し、結合した１２５１カ
ウントをＬＫＢγカウンタ（１２７４型）内でＵ＋定し
た。

ＸＩＩ［、組とメ士久疲左ｌフィニーイク口マトグラフ
ィｒａｓ　ｐ２１に対して特異性を有するモノクローナ
ル抗体を、製造業者により記載されているようにＴｒｅ
ｓｙ　ｌ活性化５ｅｐｈａｒｏｓｅ　（登録商標）４Ｂ
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ。

Ｌｏｔ、　ＭＣ０１７７３）に共有結合させた。ｒａｓ
）Ｊ［ｒ液（Ｔｒｉｓ−１１ｃＩ　１０ｍＭ、ｐＨ７，
５，１１１Ｍ塩化マグネシウム、１ｍＭジチオチェオト
ール、０．１ｍＭ、ＧＴＰ、０．１％オクチルグリコシ
ド及び０，１％アジ化ナトリウム）中の生物試料を４℃
にし、２８０ｎｍの吸光度が基線に達するまで、０．５
Ｍの塩化ナトリウムを含有する１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
Ｉ、ｐＨ８，０緩衝液でカラムを洗浄した。ｒａｓタン
パク質を０．１Ｈのクエン酸ナトリウムｐＨ３，５で溶
離し、各フラクション（３ｄ）を固体Ｔｒｉｓ塩基及び
０．３ｄの１ＱＸｒａｓ緩衝液で直ぐに中和させた。

ＸＩＶ、　　　　プロット分析すべき試料を従来技術に従ってまず５〜２０％のア
クリルアミド勾配ゲル上で５ＯＳ−ＰＡＧＥと反応させ
た。電気泳動後、タンパク質からニトロセルロース（Ｓ
ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｈｕｅｌｌ、　ＢΔ８５，
０．４５／ＪＪｎ＞に移した。タンパク質は、７０ポル
Ｉ−で２〜３時間４℃で移動した。移動後にゲルをＣｏ
ｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｌｕｅで染色することにより測定し
た処、９０％を越えるｒａｓタンパク質がゲルから移動
した。ニトロセルロースを０．０２％のアジ化ナトリウ
ムを含有するｐＨ７゜４のリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ＞中
の０，５％脱脂粉乳（Ｃａｒ−ｎａＬｉｏｎ（登録商標
）、５ｏｃｉｅＬｅ　ｄｅｓ　Ｐｒｏｄｕｉｔｓ　Ｎｅ
５ｔｌｅ。

Ｓ、八、、　Ｖｅｖｅｙ、スイス）中で室温で１時間イ
ンキュベートした。次に０．１％のＴｗｅｅｎ　（登録
商標）２０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂ）を含有するＰＢ
Ｓでフィルタを洗浄し、同一の緩衝液に希釈した１２５
■標識モノクロ一ナル抗体（２，ＯＸ　１０’ＣＰＭ／
ｄ　）で３７℃で１．５時間インキュベートシた。フィ
ルタをＰＢＳ−Ｔｕ＋ｅｅｎ　（登録商標）２０で３回
洗浄し、乾燥し、増感スクリーンを使用して一７０℃で
Ｋｏｄａｋ　ＸＲ−２フィルムに当てた。

虻１ ■、モノクローナルル述！ｌＬ員− 材料及び方法の項で記載したような６種類の異なるクロ
ーン化ハイブリドーマ細胞系の腹水液から各種の腫瘍遺
伝子コード化タンパク質に対するモノクローナル抗体を
精製した。ＨＰＬＣ（ＴＳＫ−ＤＥＡＥ）による最終ｆ
Ｗ製後、イムノグロブリンフラクションをプールし、そ
の純度を５ＯＳ−ＰＡＧＥにより査定しな。「材料及び
手法」の項で記載したように腹水液からイムノグロブリ
ンを精製し、５〜２０％の線形アクリルアミド勾配を使
用して５Ｏ５−ＰＡＧＥにより純度を査定した。プール
した各イムノグロブリンフラクションからの試料３０■
を各レーンに加えた。

イムノグロブリンを５ＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液中の最
終濃度５％のＢ−メルカプトエタノールで還元した。

ｖ−ｔｌ−ｒａｓ（Δｂ−１）汎親和性抗ｒａｓ　ｐ２
１、ｖ−１１−ｒａｓ（八ｂ−２）１１及びに特異抗ｒ
ａｓ　ｐ２１、ｖ−ｆｅｓ（八ｂ−１）、ｖ−ｆｍｓ（
＾ｂ−２）、ｐ５３　（八ｂ−１）及びシｌ−ケラチン
く＾ｂ−１）の全モノクローナル抗体はいずれも均買に
なるまで精製し、Ｂ−メルカプトエタノールで還元後、
夫々重いイムノグロブリン鎖（１１鎖）と軽いイムノグ
ロブリン８１（Ｌ鎖）とに分離した。ｖ−ｆｅｓ（Δｂ
−１）イムノグロブリンは重い鎖が７００００ドルトン
で電気泳動したのでＩｇＭクラスに属するが、それ以外
の全イムノグロブリンはＩｇＧクラスであった。

■、腫ｆ遺仁　コード　タンパク　の、ン゛欠腫瘍遺伝
子コード化タンパク貫を検出するために、第２表に示し
た一連のヒト腫瘍細胞系、及びヒトｒａｓ遺伝子をトラ
ンスフエフ１へしたマウス細胞系（第３表）をモノクロ
ーナル抗体で免疫沈降させた。細胞系はｙｓＳ−メチオ
ニンで標識し、「材料及び手法」の項で記載したような
手順で抽出物として調製した。イムノグロブリンモノク
ローナル抗体（Ｍａｂｓ）、抗ｒａｓ　ｐ２１．（ｖ−
１ｔ−ｒａｓ）（八ｂ−１）　、ｐ５３（八ｂ−１）及
び抗−ｖ−ｒｅｓ＜＾ｂ−１）（ハイブリドーマのイム
ノグロブリン特異性については第１表参照）を精製し、
「材料及び手法」の項で記載したような免疫沈降法に使
用した。免疫沈降物を５ＯＳ−ＰＡＧＥで分析し、ゲル
をオートラジオグラフィにかけた。腫瘍からのｙｓＳ−
メチオニン標識細胞抽出物（＾４３１、＾３７５、＾５
４９、八２０４、＾６７３、Ｔ−２４，１ＩｅＬａ）、
トランスフェクト細胞系（＾１−１）、形質転換細胞系
（にＡ　Ｆｅ５Ｖミンク）及びコントロール用細胞系（
ミンクＣＣ１６４ＮＩＨ３Ｔ３　Ｃ１２゜２）（第２表
及び第３表参照）を「材料及び手法」の項で記載したよ
うに調製した。腫瘍遺伝子コード化タンパク質を「材料
及び手法」の項で記載したように免疫沈降させた。５〜
２０％の線形アクリルアミド勾配を使用して５ＤＳ−Ｐ
ＡにＥにより免疫沈降物を分析した。５％のＢ−メルカ
プトエタノールを含有する５ＯＳ−ＰＡＧＥ試料ｕｒ液
の存在下で試料を電気泳動させた。ゲルを染色し、染色
を除去し、Ｅ　ｎ　ｈ　ａ　ｎ　ｃ　ｅで処理し、Ｘ線
フィルムに当てた。

２１０００ドルトンで移動するバンドとして試験した全
細胞系中にｒａｓコード化タンパク質が検出され、＾４
３１外陰癌及び２種類の横紋筋芽細胞腫＾２０４及び＾
６７３中には多量のｐｚｔが見られた。Ｔ−２４膀胱癌
から誘導された（トｒａｓ遺伝子をトランスフェクトし
た＾１−１細胞系では、正常な祖先対応部分冊＋＋　３
　Ｔ　３Ｃ１２，２に比較してｒａｓタンパク質の発現
が著しく高かった。ｐ５３タンパク質は＾４３１、＾３
７５、＾５４９、＾２０４、ＧＡ　Ｆｅ５Ｖミンク及び
コントロール用ミンク細胞（ＣＣＬ６４）中で検出され
たが、試験した他の腫ｆＦＩ細胞系中では該タンパク質
の発現は高くなかった。

形質転換した細胞系ＧＡ　Ｆｅ５ＶミンクはｐＨｏ　ｆ
ｅｓ腫瘍遺伝子タンパク質を発現したが、そのコントロ
ール用非形質転換祖先細胞系ＣＣＬ６４はこれを発現し
なかった。以上の結果は、腫瘍遺伝子コード化タンパク
質の診断用試験の開発及び評価のために天然の抗原ソー
スを提供するように、ヒＩ・腫瘍細胞糸種中で容易に検
出可能なレベルの腫瘍遺伝子タンパク質の発現を示すも
のである。

八１−１、）ＩＬ６０−２及び０Ｓ−８−２０−６−２
（ＯＳ−８）細胞系は、夫々Ｈ−、ト及びに−ｒａｓ遺
伝子をトランスフェクトしたＮ１）１３Ｔ３　Ｃ１２，
２（３Ｔ３）マウス繊維芽細胞系がら取り出した。ｖ−
Ｈ−ｒａｓ（＾ｂ−２）及びｖ−トｒａｓ（八ｂ−１）
モノクローナル抗体の抗体特異性その他の特徴付けは、
異なるｒａｓ遺伝子コード化タンパク質を発現するこれ
らの個々の細胞系を使用して決定した。

モノクローナル抗体ｖ−Ｈ−ｒａｓ（＾ｂ−１）及びｖ
−Ｈ−ｒａｓ（＾ｂ−２）の特異性は、ヒト■、Ｎ又は
に−ｒａｓ遺伝子コード化タンパク質と反応する能力に
より決定した。

Ｈ−ｒａｓ、（＾１−１）、Ｎ−ｒａｓ（ＨＬ６０−２
）及びに−ｒａｓ（ＯＳ−８−２０−６−２）をトラン
スフェクトした旧＋１３Ｔ３　Ｃ１２，２細胞を３５８
−メチオニンで標識し、「材料及び手法」の項で詳細に
記載したように、特異モノクローナル抗体、タンパク質
＾アガロース（Ｐ＾＾）及びヤギ抗ラットイムノグロブ
リンによりｒａｓ　ｐ２１タンパク質を免疫沈降させた
。　ｖ−ｆｅｓ（＾ｂ−１）モノクローナル抗体はコン
トロールとして使用した。５〜２０％の線形アクリルア
ミド勾配を使用して５ＯＳ−ＰＡＧＥにより免疫沈降物
を分析し、オートラジオグラフィにかけた。５％のＢ−
メルカプトエタノールを含有する試料！！衝液の存在下
で試料を電気泳動させた。

ｖ−ｔｌ−ｒａｓ（＾ｂ−１）モノクローナル抗体はＨ
−ｒａｓ（＾１−１）、Ｋ−ｒａｓ（Ｏ３−８）及びＮ
−ｒａｓ（ｔｌＬ−６０−２）ｒａｓｐ２１タンパク質
を免疫沈降し、一方ｖ−Ｈ−ｒａｓ（Ａｂ−２）はＨ−
ｒａｓ（＾１−１）及びに−ｒａｓ（ＯＳ−８＞両者の
ｐ２１タンパク質を特異的に認識したがＮ−ｒａｓ（Ｉ
ＩＬ−６０４）は特異的に認識しなかった。従って、モ
ノクローナル抗体Ｖ−トｒａｓ（Δｂ−１）は異なるｒ
ａｓコード化タンパク質で共通の決定基を認識するとい
う点において汎親和性であるといえる。ｖ−Ｉトｒａｓ
（＾ｂ−２）モノクローナル抗体はＮ−ｒａｓ遺伝子生
成物を沈降しないが、Ｋ−及びＩｆ−ｒａｓに対して特
異性である。コントロールｖ−ｆｅｓ（＾ｂ−１）モノ
クローナル抗体は、ｒａｓ遺伝子をトランスフェクトし
た細胞系の抽出物からｐ２１を全く免疫沈降しなかった
。

モノクローナル抗体のビオチニル化又はモノクローナル
抗体とＡｆｆｉ−Ｇｅｌ（登録商標）１０との結合後、
抗体がこれらの手続きにより損傷したがどうかを決定す
ることが必要であった０例えば、モノクローナル抗体ｖ
−Ｈ−ｒａｓ（＾）〕〜１）をビオチニル化し、ｒａｓ
ｐ２１タンパク質を免疫沈降させる能力を試験した。

修飾した抗体標本の分析を行った。３９Ｓ″′Ｃ″標識
したメチオニン細胞抽出物（Ａｌｌ、Ｔ２４、ＨＤ−８
、イヌ胸腺）中でｒａｓ　ｐ２１を免疫沈降する能力に
より、ビオチニル化後のモノクローナル抗体ｖ−Ｈ−ｒ
ａｓ（Δｂ−１）の機能を査定した。０．５■のビオチ
ニル化抗体と５０成のストレパビジンーアガロース懸濁
液（０，２４■／成）を使用した処、増加量の細胞抽出
物が免疫沈降した。５〜２０％の線形アクリルアミド勾
配及びオートラジオグラフィを使用して５ＯＳ−ＰＡＧ
Ｅにより免疫沈降物を分析した。更に、：１５８−メチ
オニンで標識したＨＤ−８細胞抽出物からのｒａｓ　ｐ
２１タンパク質と結合する能力により、Ａｆｆｉ−Ｇｅ
ｌ（登録商標）１０マｌ−リックスと結合したモノクロ
ーナルｖ−Ｈ−ｒａｓ（八ｂ−２）及びｖ−１１−ｒａ
ｓ（＾ｂ−１）の機能的能力を査定した。増加量のｖ−
Ｈ−ｒａｓ（Ａｂ−１）／ｖ−Ｈ−ｒａｓ（＾ｂ−２）
捕獲マＩ・リックスに１ｍｌのｌＩＤ−８抽出物を加え
、１００度の試料緩衝液で溶離したｒａｓ　ｐ２１タン
パク質に結合させ、５〜２０％の線形勾配及びオートラ
ジオグラフィを使用して５ＯＳ−ＰＡＧＥにより分析し
た。コント７″ 胞抽出物からｒａｓｐ２１タンパク質を免疫沈降させた
。一定量のビオチニル化抗体（０，５／Ｊｇ）が八１−
１、Ｔ２４、ＨＤ　−８及びイヌ胸腺細胞がらのｒａｓ
　ｐ２１を沈降し、検出されたｒａｓ　ｐ２１の量は、
各反応管に加えた３５Ｓメチオニン標識細胞抽出物の容
量に比例していた。細胞型種からのｒａｓ　ｐ２１を濃
度に依存して免疫沈降する能力は、モノクローナル抗体
がビオチニル化手続きにより損傷した可能性を否定する
。同様に、ｖ−１トｒａｓ（Δｂ−１）及びｖ−Ｈ−ｒ
ａｓ　（Ａｂ−２）の混合物の生物活性も、抗体とＡｆ
ｆｉ−Ｇｅｌ（登録商標）１０マトリツクスとの共有結
合による結合手続きによって破壊されず、この事実は、
抗体捕獲マトリックスがＩＩ　Ｄ　−８ｍ胞抽出物から
のｒａｓ　ｐ２１タンパク質と結合する能力により立証
された。更に、コントロールモノクローナル抗体シー１
トｒａｓ　（＾ｂ−１）（２，０７−１ｇ）をＨＤ−８
抽出物に加え、タンパク質へアガロース（５０μｌ）を
加えることによりｒａｓ　ｐ２１タンパク質を免疫沈降
させた。０５〜１１０ｌ１の共有結合抗体を含有する所
定量の捕獲マトリックスを一定量の１．Ｏｄの細胞抽出
物に加えた。捕獲マトリックスの添加量が１．０ｇｇを
越えると、ｒａｓ　ｐ２１タンパク質の結合景は増加し
ないことが確認された。

予価抗原捕獲手続きでは、デテクタ標識システムとして
ビオチニル化ｖ−１！−ｒａｓ（＾ｂ−１）を使用した
。

この実験では、ｒａｓ　ｐ２１タンパク質のソースとし
てＨＤ　−８細胞膜を使用した。材料及び方法の項で述
べたように、ドゥーンスホモジェナイザーを使用して低
張ＰＢＳ（水で１．４に希釈）内で細胞（１，ｘ１０’
）を***させ、１５０００ＲＰＭで４℃で１０分間遠心
分離した。

材料及び方法の項で述べたように、細胞膜を１．Ｏｄ　
Ｌニア）ＰＢＳＴＤＳに懸濁させ、捕獲マトリックス（
ｖ　−ＩＩ　−ｒａｓ　（＾ｂ−１）及びｖ−Ｈ−ｒａ
ｓ（＾ｂ−２）、０．０１ｍ）、続いてビオチニル化ｖ
−１ｔ−ｒａｓ（Δｂ−１）でインキュへ−１−した。

抗原捕獲マトリックスは青色を呈し、コンＩ−ロール以
外のＩＩ　Ｄ　−８ｉ胞の細胞膜を収容している管内に
ｒａｓ　ｐ２１タンパク質が存在していることを示した
。細胞抽出物の添加以前に４．０％のウシ血清アルブミ
ン（ＢＳ八）でケルマトリックスを処理した処、少量の
青色が生じた。従ってこの処理により、ビオチニル化し
た第２のリポータ−抗体の非特異的結合が減少し、従っ
てバックグラウンドが減少する。非結合ゲルマトリック
スでインキュベートした脱油出物のコントロールは陰性
であった。また、第２のリポータ−抗体は、ＰＢＳ又は
ＰＢＳ−ＢＳん単独でインキュベートしたｖ−Ｈ−ｒａ
ｓ（＾ｂ−２）／ｖ−トｒａｓ（＾ｂ−１）抗体結合抗
原捕獲マトリックスと非特異的に結合しなかった。前立
腺癌、原種、結腸癌、乳癌、膀胱癌又は頸管癌の１０人
の癌患者の血清を、「材料及び手法」の項で述べたよう
にｖ−Ｈ−ｒａｓ（＾ｂ−２）及びｖ−Ｈ−ｒａｓ（＾
ｂ−１）モノクローナル抗体と結合した抗原捕獲マトリ
ックスでインキュベートした。わずかに１人の患者（ｐ
ｔ５２１９、乳癌）が青色のマトリックスにより陽性を
示した。正常なヒト血清の試料は陰性であった。

改良されたｒａｓ　ｐ２１検出感度を得るために、リポ
ータ−抗体をヨウ素化した。「材料及び方法」の項で述
べたようにＨＬ−６０，０Ｓ−８、＾１−１．３Ｔ３及
ｖ：１１０−８ＩＩ胞系の細胞抽出物からの上清を調製
した。

各細胞系からの増加量の細胞抽出物を抗原捕獲マトリッ
クス（ｖ−ＩＩ−ｒａｓ（＾ｂ−２）と結合したＡ［１
−Ｇｅ１（登録商標）１０）でインキュベ−１−Ｌ、細
胞抽出物とマトリックスとの結合を最適化させた。「材
料及び方法」の項で述べたように、リポータ−抗体であ
るｖ−ｔ（−ｒａｓ（＾ｂ−１）をＭｉ胞抽出物−７１
〜リツクスでインキュベートした。第４表に示すように
、抗ｒａｓｐ２１捕獲マｊ・リックスは抗シトケラチン
（抗ＣＫ−４）抗体のコントロールマトリックスに比較
して１０〜２０倍の試料（結合しなリポータ−ｖ−１１
−ｒａｓ（＾ｂ−１〉抗体−ＣＰＨにより表示される）
と結合した。コントロール３Ｔ３細胞はｖ−）１−ｒａ
ｓ（Δｂ−２）複合アフィニティマトリックスと結合せ
ず、ｒａｓ　ｐ２１含有抽出物がコントロールマトリッ
クスに対して示した結合量とほぼ同一の量を示しており
、従って、相対量の非特異的結合又はバックグラウンド
を形成する。細胞抽出物の濃度を増加させながらｖ−Ｈ
−ｒａｓ（＾ｂ−２）に加えると結合は増加するが、線
形応答は得られなかった。約０．５ｄの抽出物を使用す
るとほぼ最大の結合が観察されたが、−例を（ＯＳ−８
）除く全鋼で１．Ｏｍｌの抽出物によりやや高い結合が
観察された。抽出物の濃度を増加させながらコントロー
ルマトリックスに加えても結合の増加は観察されず、こ
の場合もコントロールマトリックスとの結合は非特異的
であることが示され、更にシーＨ−ｒａｓ（八ｂ−２）
−マトリックスで得られた結果はｐ２１　ｒａｓタンパ
ク質に対して特異結合を示すことが立証された。

表４：　　、　　゛にお（るｒａＳ２１の′庁＋２５）
の　　　ラント　６２Ｍ８捕捉マトリツクス　　　捕捉マトリックスＨＬ６０−２
　　Ｎ−ｒａｓ　　　　１．０　　　　　　　　５．０
　　　　　　　　　７１１５　　　　　　　　　　６０
２０．５　　　　　　　　２．５　　　　　　　　　５
０９７　　　　　　　　　５４６０．２　　　　　　　
　１．０　　　　　　　　　１３２４　　　　　　　　
　　４４７０．１　　　　　　　　０．５　　　　　　
　　　　６０７０．５　　　　　　　　０．２　　　　
　　　　　　３５５ＯＳ−８Ｋ−ｒａｓ　　　　　　１
．０　　　　　　　　５．０　　　　　　　　　’８５
５５　　　　　　　　　　４９２０．５　　　　　　　
　２．５　　　　　　　　１１２０８　　　　　　　　
　　４６４０．２　　　　　　　　１．０　　　　　　
　　　７９５２　　　　　　　　　　３４１０．１　　
　　　　　　０．５　　　　　　　　　６５９９０．５
　　　　　　　　０．２５　　　　　　　　３４７５＾
１−Ｉ　Ｈ−−生ジ　　　　　１．０　　　　　　　　
２．０　　　　　　　　１３０３２　　　　　　　　　
　５３８０．５　　　　　　　　１．０　　　　　　　
　　５０５２　　　　　　　　　　２６５０．２　　　
　　　　　０．４　　　　　　　　　８５２１　　　　
　　　　　　５８１０．１　　　　　　　　０．２　　
　　　　　　　４２０９０．５　　　　　　　　０．１
　　　　　　　　　３１９６ＨＤ−８１トｒａｓ　　　
　　　１．０　　　　　　　　１．０　　　　　　　　
　７１５４　　　　　　　　　　１９４８屯　　　　ｎ
へ　　　　６７へ９１９９０．２　　　　０．２　　　
　　３８４３　　　　　　３８５０．１　　　　　０．
１　　　　　１９５１０．５　　　　　０．５　　　　
　１４３３ＮＩＨ３Ｔ３　Ｃｌ　２．２１．０　　　　
２．０　　　　　７６１　　　　　１８１０．５　　　
　　］、、０　　　　　３１．８　　　　　　９８０．
２　　　　０．４　　　　　１７２　　　　　　８９０
．１　　　　　０．２　　　　　　１９１０．５　　　
　　０．２　　　　　　２１４ａ）抗原捕捉法は「材料
と手法」の項で細胞抽出物上清について記載したのと同
様にして実施した。

ｂ）　旧、　Ｋ−またはｔ４−ｒａ旦遺伝子で実験的に
形買転換した細胞系については表３参照。

Ｃ）捕捉７１〜リツクスは「材料と手法」の項に記載さ
れているように八ｆｆ１−Ｇｅｔ　１０に共有結合した
ｖ−１ｔ−ｒａｓ（Ａｂ−２）モノクローナル抗体であ
る。使用したリポータ−抗体はヨウ素化したｖ−ＩＩ−
ｒａ旦（＾ｂ−１）モノクローナル抗体である。

ｄ）捕捉マトリックスは＾ｆｆ１−Ｇｅｌ　１０に共有
結合したｃｙｔｏｋｅｒａｔ　ｉｎ（Δｂ−１）モノク
ローナル抗体である。使用したリポータ−抗体はヨウ素
化したｖ−１ｔ−ｒａｓ（八ｂ−１）モノクローナル抗
体である。

Δｌ−１（２，１ｒＩＰｇ／ｄ）細胞（１０（Ｉｌｆ！
　）からの上清抽出物を、ｖ−Ｈ−ｒａｓ（Ａｂ−２）
−捕獲マトリックス及ヒコントロールシトケラチン（八
ｂ−１）捕獲マトリ・ンクスで３０分〜２２時間インキ
ュベー１−した。各時間周期の終わり毎に＋２５１−ｖ
−Ｈ−ｒａｓ（＾ｂ−１）（４００００ＣＰＭ１０．１
ａｆ！　）抗ｒａｓ　ｐ２１を加え、細胞抽出物−マト
リックス混合物で４°Ｃで一晩インキユベートした。第
１図は、細胞抽出物と抗原捕獲マトリックスとの最大結
合量が３０分以内で得られることを示している。更にｖ
−１１−ｒａｓ（＾ｂ−２）捕獲マトリックスは、コン
トロールシトケラチン（Δｂ−１）マトリックスに比較
して約１０〜２０倍の結合を示している。

■、癌、屯者　　痛止　　び正′ｆ′併　者の血清をイ
τ用する抗−原１１土且支「材料及び手法」の項で記載したように、ｖ−１トｒａ
ｓ　（Δｂ−２）捕獲アフィニティマトリックス及び１
２５１−ｖ−１１−ｒａｓ（＾ｂ−１）リポータ−抗体
を使用して抗原捕獲手続きを行った。第５表は、合計７
０人の癌患者の血清に関する４種類の別個の抗原捕獲実
験の要約である。非新生状態の患者から得た血清は同表
の最後にリストした。癌患者からの７０個の血清のうち
２２個に７００より高いカランｌ−（ＣＰＭ）が得られ
たか、非癌患者及び正常供与者からの血清試料はすべて
７００未満であった。ｒａｓ　ｐ２１はタンパク質試験
した患者血清の約３３％で明らかに検出された。

血清試料の採取時に患者の悪性の状態が適切に記録され
ていないため、ｒａｓ　ｐ２１に対して陰性の試料は、
腫瘍摘出又は治療後に採取された血清であったかも知れ
ない。あるいは陰性の結果は、モノクローナル抗ｒａｓ
抗体か任意の癌患者の血清中のｒａｓタンパク質上に存
在している決定基のいずれかとの間に相互反応性をもた
ないためかも知れない。

第５表に示したデータで留意すべき重要な点は、血清試
料の反復試験後に得られる実験結果の一貫性により、抗
原捕獲手続きが信頼性の高い試験と認められるという点
にある。患者の血清（＃５２０５）は最初は最も弱い陽
性であったが、３回の連続実験で陰性になった。コント
ロール捕獲マトリックスとしてシ１−ケラチン（＾ｂ−
１）モノクローナル抗体を使用した抗原捕獲手続きでは
、４個の正常なコントロール血清及び７個の癌患者血清
のうちの６個が陰性であった。最も高い平均カウントＣ
ＰＭ　（第５表）のひとつを示した乳癌患者からの血清
（＃５２１９）は、デテクタ抗体としてビオチニル化ｖ
−）１−ｒａｓ（＾ｂ−１）を使用して陽性と認められ
た患者と同一のものであった。明らかにビオチニル化−
ベルオキシダーゼリポーター抗体システムを使用すると
、ｒａｓタンパク質は高いタンパク質レベルで患者の血
清中に検出できる。このように放射性標識リポータ−シ
ステムは、より低レベルのタンパク質を含有する多数の
患者血清中でｒａｓタンパク譬を検出するのに必要な高
い感度を提供した。血清で得られるカウントにより表さ
れる検出可能な最高レベルのｒａｓタンパク質を有する
特定の型の癌は、上から下に向かって順にＣＭＬ、膀胱
癌、前立腺癌、乳癌、肺癌及び結腸癌である。

ば）峯 υ）　　０１　　もウ　　ロ。

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冑　＝　繋　；　まトクククＮりＱト　！！閃へ一〇トＱ　　　＋＋１〜−　　　−ｍ− ロロロ◇寸Ｎ口ｏｏ　Ｑロロロロロロｚ　ｚ　ｚ　ｍ　Ｎｘ　ｚ　ｃｏ　　ｚ　ｚ　ｚ　ｚ　
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　　　２　　　２１旨■０組口り用−ユを使用　る几原
゛Ｉ　　　きにおけｖ　−ｔｌ−ｒ　ａ　ｓ　（八ｂ−
２〉又はｖ−１１−ｒａｓ（八ｂ−１）の精製抗体ｒａ
ｓ　ｐ２１モノクローナル抗体と結合させた各抗原捕獲
マトリックスと、別々に標識したヨウ素化（１２’１）
ｖ−１１−ｒａｓ（八ｂ−２）及びｖ−ｆｌ−ｒａｓ（
八ｂ−１）抗体とを使用し、最大の検定感度ともたらす
抗体表示の順序を決定する実験を行った。ｖ−）１−ｒ
ａｓ（＾ｂ−２）捕獲７トす’７クス及び１２５１−ｖ
−１１−ｒａｓ（八ｂ−１）リポータ−抗体と「本来の
」抗体表示構造と、ｖ−Ｉｆ−ｒａｓ（八ｂ−１）捕獲
マＩ・リックス及び１２５１−ｖ−１１−ｒａｓ（Δｂ
−２）リポータ−抗体の「逆ｊ構造との両方を使用し、
Ａ１−１．０８−８、ＩＩ　Ｌ　−６０−２及びコンＩ
〜ロールＮｒ１１３Ｔ３　Ｃ１２，２細胞抽出物の上清
抽出物をインキュベ−１〜した。

コンＩ・ロールシトケラチンくΔｂ−１）捕獲マトリッ
クスは、”５ｌ−ｖ−１ｔ−ｒａｓ（Δｂ−２）及び”
５ｌ−ｖ−１１−ｒａｓ（＾ｂ−１）の両抗体でリポー
タ−として別個に使用した。

細胞抽出物を捕獲マトリックスで３７℃で２．５時間イ
ンキュベートし、「材料及び手法Ｊの項で記載したよう
に標準洗浄を実施し、、＋２５１リポータ−抗体を加え
、４℃で一晩インキュベー１−　した。この結果の要約
を第６表に示した。ｖ−ｆｌ−ｒａｓ（八ｂ−１）捕獲
マトリックス、ｖ−１ｔ−ｒａｓ（Δｂ−２）リポータ
−という逆構造の抗体表示を使用すると、従来使用され
ているｖ−Ｈ−ｒａｓ（八ｂ−２）捕獲マトリックス及
びｖ−Ｈ−ｒａｓ（＾ｂ−１）リポータ−モノクローナ
ル抗体の場合に比較して細胞抽出物Δｉｌ、０３−８及
びＨＬ　−６０−Ｚ中におけるｒａｓ　ｐ２１の検出景
は夫々２．１倍、２．４倍及び４．０倍に増加した。こ
のように抗体表示を逆にするとＮ−ｒａｓ　ｐ２１の検
出感度が著しく増加した６コンＩ〜ロール捕獲マトリッ
クスシトケラチン（＾ｂ−１）及び１２５１−ｖ−１１
−ｒａｓ（Δｂ−２）リポータ−抗体を使用すると、同
様に４倍の結合（ＣＰＭ）の増加が観察されたが、試験
試料からコンｌ−ロールバックグラウンドを差し引いた
後も顕著な増加はｉ察された。

３Ｔ３細胞の抽出物と抗ｒａｓ捕獲マトリックスとの結
合はｒａｓ　トランスフェクト対応部分の１７１０〜１
／２゜であった。コントロールとして使用したΔ１−１
ｉ胞結合は、コントロールシトゲラチン（Δｂ−１）ア
フィニティマトリックスとの間に怒知される程度の結合
を示さなかった。

表６：細胞抽出物中のび旦ｐ２１の検出における抗原捕
捉の反転とディーフタ−−・　との　　８ソｙ〕糧しυλ乙ト数μ凋什捕捉マトリックス　　　　　　　　捕捉マトリックスＡ
ｌｌ　　（Ｉｔ−ｒａｓ＞　　　　　　　　１０５　　
　　　　　　　　６９２７　　　　　　　　　　　　　
　１４９０００Ｓ８　　（Ｋ−ｒａｓ）　　　　　　　
　　５００　　　　　　　　　　８１２０　　　　　　
　　　　　　　　１９１５４ＩＩＬ６０−２　　（Ｎ−
ｒａｓ）　　　　　１０００　　　　　　　　　　３７
６０　　　　　　　　　　　　　　１４９２６ＮＩＨ３
Ｔ３　　ＣＬ　　２．２　　　　　２００　　　　　　
　　　　　２８０　　　　　　　　　　　　　　　１１
８５ａ）抗原捕捉法は「材料と手法」の項で細胞抽出物
上清について記載したようにして行った。

ｂ）　Ｈ−、Ｋ−、またはＮ−ｒａ旦遺伝子でトランス
フェクトした細胞膜については表３参照。

Ｃ）捕捉マトリックスをヨウ素化したリポータ−抗体の
製造については「材料と手法」の項に詳細に記載しであ
る。

ＩＸ　、ヒト血ゞを　　　る　Ｊ　　続きにお（るｖ　
−ＩＩ−ｒ　ａ　ｓ　（＾ｂ−２）−マトリックス及び
ｖ−Ｈ−ｒａｓ（八ｂ−１）リポータ−抗体を使用して
予め試験した１８人の癌示（ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｐｒｅ
ｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を使用して再試験した。データを
第７表に示す。逆構造を使用すると血清中のｒａｓ　ｐ
２１検出感度が約３倍に増加し、このように感度が増加
すると従来陰性であった４個の試料は陽性になった。陽
性であった１個の試料は陰性になった。

Δ　　　　　　Δ ｊ　　　　　　Ａ　　　　　Ａ　　　　　”　　　　　
　Ａ　ＩＣ’本来の」抗体表示構造を使用すると従来陰
性っな４個の血清試料中に抗原捕獲反応性が検れな。捕
獲マトリックスとして汎親和性抗血−Ｈ−ｒａｓ（＾ｂ
−１））を使用すると、血清種中に存でいるより広い範
囲のｒａｓハブロタイブをよ般に認識し得るものと推定
できるが、検出のは、使用されるリポータ−抗体による
ｒａｓタク質の認識に最終的に依存する。このように捕
獲手続きは、使用される抗体の特異性及び表示順序に応
じて、特定のｒａｓタンパク質にて特異的であるかある
いはより一般的であるに構成することができる。

原捕獲手続きの試験室及びプロトコールに含る具体的な
内容を理解及び改良するために、の順列の抗体表示を使
用して一連の実験群をした。捕獲マトリックスと結合し
た抗体としｔｌ−ｒａｓ（＾ｂ−１）、　ｖ−Ｈ−ｒａ
ｓ（八ｂ−１）、　ｖ（ｍｓ（Δｂ−２）及びシトケラ
チン（Ａｂ−１）を使用し、リポータ−抗体としてｖ−
Ｉｔ−ｒａｓ（八ｂ−１＞　、ｖ−１ｔ−ｒａｓ（八ｂ
−２）及びｖ−ｆｍｓ（△ｂ−２）を使用した。第８表
に示した抗体構造を使用し、ｒａｓ　ｐ２１タンパク質
のソースとして＾１−１細胞〈総タンパク質ロット　＃
へ１０６のｄ当たり７．０■）からの細胞抽出物０．０
５ｄを含有する正常なヒト血清と一定量のこの同一の血
清（０，５ｍ）を比較した。

このデータから次のような結論を導くことができる。

１　捕獲マトリックス及びリポータ−抗体（５０６ＣＩ
’Ｍ）の両方にシーＩｔ−ｒａｓ（八ｂ−１）を使用す
るとタンパク質を含有する血清中に「ａｓ　ｐ２１タン
パク質は検出されなかったが、ｖ−Ｈ−ｒａｓ（八ｂ−
２）を捕獲マＩ・リックスとし且つｖ−ｆｌ−ｒａｓ（
＾ｂ−１）をリポータ−抗体としと使用するとｒａｓ　
ｐ２１検出レベルの１０倍の増加（５８２５ＣＭＰ）が
観察された。ｙ−）１−ｒａｓ（Ａｂ−１）を捕獲マト
リックス、ｖ−Ｈ−ｒａｓ（Ａｂ−２）をリポータ−抗
体として使用すると、捕獲マトリックス及びリポータ−
抗体の両方にｖ−Ｈ−ｒａｓ（＾ｂ−２）を使用した場
合（１６６０ＣＰＭ）に比較して同様に１０倍のカウン
ト（１０８１０ＣＰＭ）の増加が認められた。２段階手
続き中で唯１個の抗原エピトープに対する同一のモノク
ローナル抗体を使用すると、抗原の全サイトが第１段階
中で別の認識のために結合及び免疫阻止されるので、第
２段階（リポータ−抗体）における該抗体の認識及び抗
原との結合を阻止できると推論できる。更に、２個のエ
ピトープが相互に立体的に連続的に結合しないように物
理的に隣接していないならば、抗原の別のエピトープに
対する別のモノクローナル又はポリクローナル抗体は、
第２段階で認識及び結合することができる。

２、捕獲マ）・リックス及びリポータ−の両者にＶ−Ｈ
−ｒａｓ（＾ｂ−２）モノクローナル抗体を使用すると
、ｖ−Ｈ−ｒａｓ（Ａｂ４）モノクローナル抗体（５０
６）に比較して高いカウント（１６６０）が得られた。

ｖ−Ｈ−ｒａｓ（Δｂ−２）はある程度非特異的な結合
を示し、従って得られるバックグラウンドカウントが増
加する。

３、捕獲マトリックスとしてｖ−Ｈ−ｒａｓ（＾ｂ−１
）及びリポータ−抗体としてｖ−Ｈ−ｒａｓ（＾ｂ−２
）を使用する「逆構造」を使用すると、「本来の」抗体
表示構造（５８２５）に比較して検出されるカウントは
２倍（１０８１０ＣＰＭ）に増加した。従ってこれらの
結果は、「逆」構造の抗体表示で１８人の癌患者からの
血清を使用した第７表中に得られるデータと一致してい
る。

４、捕獲マトリックスとしてｖ−Ｈ−ｒａｓ（＾ｂ−１
）及びリポータ−としてｖ−）！−ｒａｓ（＾ｂ−２）
を使用する「逆」構造を使用すると、マトリックス及び
リポータ−の両者にｖ−トｒａｓ（＾ｂ−１）汎親和性
抗血清を使用した場合（５０６ＣＰＨ）に比較して２０
倍のカウント（１０８１０）が得られた。捕獲マトリッ
クスとしてｖ−１１−ｒａｓ（Ａｂ＝２）及びリポータ
−としてｖ−Ｈ−ｒａｓ（八ｂ−１）を使用する「本来
の」構造では、マトリックス及びリポータ−の両方にｖ
−ｆｌ−ｒａｓ（Ａｂ−２）を使用した場合（１６６０
ＣＰＭ）に比較して５倍のカウント増加（５８２５ＣＰ
Ｍ）が得られた。このように、捕獲マトリックスとして
ｖ−１１−ｒ　ａ　ｓ　（＾ｂ−１）を使用すると、捕
獲マトリックス（第１段階）としてｖ−）１−ｒａｓ＜
＾ｂ−２）を使用する場合に比較して非特異抗体結合の
バックグラウンドが低下するばかりでなく、システムの
感度が著しく増加する。第１段階の捕獲マトリックスと
して汎親和性又はポリクローナル抗血清を使用すること
が抗原捕獲手続きのより優れた高感度のアプローチであ
るか否かを判断するには、更に実験が必要である。

５、コントロール捕獲マトリックスｖ−ｆｍｓ（＾ｂ−
２）（２８２１，２０９）及びシトケラチン（＾ｂ−１
）＜２０７３＞と共にリポータ−抗体としてｖ−Ｈ−ｒ
ａｓ（＾ｂ−２）を使用すると、非特異活性が検出され
た。　ｖ−Ｈ−ｒａｓ（＾ｂ−１）はｖ−ｆｍｓ（八ｂ
−２）捕獲マトリックス（３５９）と反応しないので、
リポータ−抗体及び捕獲マトリックス抗体としてその可
能な優越性を示す別の例となる。

６、リポータ−としていずれかの抗ｒａｓモノクローナ
ル抗体を使用した場合、ｖ−ｆｍｓ（＾ｂ−２）及びシ
トケラチン（Ａｂ−１）を含有するコントロール捕獲マ
トリックスは、正常なヒト血清に対して反応性を示さな
かったが、リポータ−として抗ｆｍｓ（＾ｂ−２）を使
用すると少数のカウント（２０９）が得られた。

また、捕獲マトリックスとしてコントロールシトケラチ
ン（八ｂ−１）、リポータ−として両方の抗ｒａｓ抗体
（１１０６；２０７３）を使用すると少数のカウントが
観察された。血清がシトケラチンタンパク質を含有して
おり、該タンパク質がシトケラチン（八ｂ−１＞捕獲マ
トリックスにより保持されているなら、ｒａｓタンパク
質に対して特異的なリポータ−抗体はシトケラチン抗原
に結合しないので、このような場合の両方でバックグラ
ウンドよりも大きいカウントが観察されるのは恐らくシ
ステムに固有の非特異的結合によるものと考えられる。

各種の悪性症状の患者の血清中のｒａｓ遺伝子コード化
タンパク質の特異的検出用の陽性試験として抗原捕獲手
続きの使用の有効性を立証するためには、正常なヒト供
与者からの多数の血清で陰性の結果を得る必要がある。

４６人の正常なヒト血清試料を、ｖ−）１−ｒａｓ（＾
ｂ−２）捕獲マトリックスとＶ−トｒａｓ　（八ｂ−１
）リポータ−抗体、及びｖ−！Ｉ−ｒａｓ（＾ｂ−１）
捕獲マトリックスとｖ−）ｉ−ｒａｓ（Δｂ−２）リポ
ータ−抗体の両方又はどちらかの抗体表示構造でインキ
ュベートした。陽性コントロールとして正常ヒト血清試
料のいくつかを、Δ１−１細胞（ロット番号＾１０６の
総タンパク質ｍｌ当たり７．０７１ｇ）からの細胞抽出
物０．０５Ｈ１を含有する同一容量の試料（０，５１ｄ
ｌ）と比較した。捕獲マトリックスとしてｖ−ｔｌ−ｒ
ａｓ（＾ｂ−２）を使用すると、４６人の正常血清試料
のうち２個は窩い結果（患者番号５３０３−５及び５３
０３−１３＞を示した。

この捕獲マトリックスを使用すると他の試料の平均は約
３００ＣＰＨであった。加えられた抽出物を含有する同
一量のｒａｓ　ｐ２１を有するこれらの正常なヒト血清
のうち６個は、予想通りに正常な対応部分に比較して４
〜７倍のカウントの増加を示した。

運、パ　　　　　　　　　きによるｒａＳＺｌの　量ｒ
ａｓ　ｐ２１検出の特異性、感度及び再現性を改良する
目的で、溶液相抗原捕獲試験を検定した。この検定は「
材料及び手法」の項で記載したように実施した。第２図
に示すように、溶液相抗原捕獲試験の標準曲線はｐ２１
の１〜５０単位（１単位はｌｎｇの精製したｒａｓ　ｐ
２１にほぼ等しい）の値に関して線形であった。夫々２
３．７５．６．２５及び１．２５単位のｒａｓρ２１反
応物を有する内部標準＾、Ｂ、Ｃを各標準曲線で分析し
た処、常に曲線に該当することが認められた。分析にお
ける内部標準の再現性は、第２世代抗原捕獲試験の検定
間可変性が非常に低いことを示している。示されたデー
タはｐ２１抗原の凍結アリコートを分析することにより
得られたものであるが、凍結乾燥及び復元した標準と内
部標準とを分析しても同様の結果が得られた。標準及び
他の検定成分の安定性を検討した処、１２５■で標識し
たシーＨ−ｒａｓ（八ｂ−２）リポータ−抗体の６０日
間の貯蔵期間中に成分の劣化は何ら認められながった。

■　細　系抽出物中のｒａｓ　ｌ１１２”の溶液相ｒ、
捕１分逝− 溶液相抗原捕獲検定を更に検討するために、細胞系の抽
出物中のｒａｓコード化ｐ２１のレベルを検定した。第
９表に示すように、＾ｌ−１細胞系は総細胞抽出物タン
パク質〜当たり１０００単位のｒａｓ　ｐ２１反応物を
含有しており、この反応物はヒトｃ−Ｈ−ｒａｓ遺伝子
コード化タンパク質に対応する。ヒトｃ−に−ｒａｓ遺
伝子をトランスフェクトしたと見なされるＳ−８細胞系
は、総細胞抽出物タンパク買〜当たり７２５単位のｒａ
ｓ　ｐ２１反応物を有することが認められ、ヒｌへｃ−
Ｎ−ｒａｓ　ｐ２１を発現するＨＬ−６０−２細胞系の
検定結果は、細胞抽出物タンパク質屹当たり１０２単位
であった。＾１−１細胞系におけるｃ−Ｈ−ｒａｓ　ｐ
２ルベルは、精製実験の結果に基づく任意の推定値を表
すものであり、１単位は１ナノグラムのｃ−ｔｌ−ｒａ
ｓｐ２１にほぼ等しい。これらの細胞系から免疫沈降可
能な３５ｇ−メチオニン標識ｐ２１の相対レベルは、＾
１１及び０８−８で等しく　、ｌｌ−６０−２では約５
０％低いと推定される（データは示さず）。これらのデ
ータは、溶液相抗原捕獲試験がｃ−Ｈ−ｒａｓ及びに−
ｒａｓコード化ｐ２１を同一感度で測定するが、ｃ−Ｎ
−ｒａｓ　ｐ２１ではやや感度が劣ることを示している
。

分子量マーカで予め較正した＾ｃ八へ４（ＬＫＢＲｏｃ
ｋｖｉｌｌｅ、　ＮＯ）のカラム上でＡｌ−１ａｌ胞抽
出物をゲル濾過し、抗原捕獲及びウェスタンプロット法
によりフラクションのｒａｓ　ｐ２１含有量３分析した
（第３図）。第４図は代表的な肺癌の同様のデータを示
すものである。どちらの場合もｐ２１抗原捕獲反応物及
びウニトスタンプロット反応物は、分子量２１０００に
対応する位置でカラムから溶離した。

ＸＩＩ［靴改Ａ文グユ韮Ｍ！正常者からの血２を癌検出
又は監視手段として癌患者血清中のｐ２ルベルを測定す
ることの有効性を立証するために、一連のコントロール
実験群で溶液相抗原捕獲試験を使用し、癌患者及びコン
トロールしト血清の両者を試験した。あるコン１〜ロー
ル実験では癌及び正常ヒト血清のｒａｓ　ｐ２１含有量
を比較し、ビオチニル化捕獲抗体（ｖ−１ｔ−ｒａｓ（
Ａｂ−２））を抗ｐ５３及びＶ−ｆｍｓモアツクローナ
ル抗体に置き換えたく第１０表）。

癌患者の血清（０，７）を試験した結果、正常血清の１
７４ｃｐｍのバックグラウンド値との差は１８１５ｃｐ
ｍであり、これは患者血清ｄ当たり６５単位のｒａｓｐ
２１に対応する。捕獲抗体を抗ｐ５３に置換すると、結
合＋２５１標識リポータ−抗体は、バックグラウンドと
の差が１１９ｃｐｍになるまで著しく減少し、抗Ｖ−ｆ
ｎ＋ｓ抗体を使用しても同様に５９ｃｐｍという値が得
られた。別のコン１〜ロール実験群では、癌患者のｒａ
ｓ　ｐ２１の測定値は０．０５〜０．２戒の血清容量範
囲にわたり線形に増加することが認められた。

この試験では外見上ａ！！康なヒトからの血清を検定し
、第５表に示すようにｐ２１のレベルは、２種類のソー
ス即ちＩｎｔｅｒｓｔａｔｅ　Ｂｌｏｏｄ　Ｂａｎｋ（
Ｐ、Ｐ、　１３ｏｘ３９３、　Ｍｅｎｐｈｉｓ、　Ｔｅ
ｎｎｅｓｓｅｅ　３８１０１）及びＣｌ１ｎｉｃａｌＣ
ｏｎｃｅｐｔｓ（６８９ＦｒｏｎＬ　５ｔｒｅｅｔ、　
　Ｔｅａｎｅｃｋ、　　ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ　０７６６
６）のどちらかから得られた非常に多数の試料が３単位
未満のｒａｓ　ｐ２１であることが認められた。一方、
数個の血清は両者の組の試料でｐ２１に対して陽性と見
なされた。これらの値は同一試料を反復検定しとも変化
しなかった。癌患者からの大多数の血清はｒａｓ　ｐ２
１に陽性であった（第６図）。２個の膀胱癌患者直情は
陰性であったが、膀胱癌患者の初期の血清のデータは陽
性であり、結果が治療の成功又は失敗を反映し得ること
がわかる。試験した結腸癌患゛１１血清は１４個の値が
正常血清コントロールの平均を上回り、平均を下回るの
は７個であった。卵巣癌患者血清でも同様の分布が得ら
れ、２２個の試料中１３個が陽性であった。

黒色腫患者は全て陽性であったが、これらの患者はいず
れも進行した癌であった。ｐ２１のレベルは治療の相対
的な成功又は失敗に相関することが認められた。

化学療法を受けた進行した癌患者について、治療前、治
療中及び治療後の多数の時点で血清ｒａｓ＋）２ルベル
を監視した。化学療法に応答した黒色腫患者の初期血清
ｐ２ルベルは４５ｂｇ／蛇であったが、化学療法を受け
て１週間後には１７ｎｇ／ｍｅに低下した。

２箇月以内に患者は再発しｐｚｔレベルは４０ｎｇ／ｍ
に戻った。試験した他の３人の黒色腫患者は治療に応答
せず、血清ｐ２ルベルは高い値のままでいるか又は疾患
の進行と共に増加した。外科、放射線治療及び化学療法
に応答しなかった進行した膀胱癌患者は、死亡するまで
血清ｐ２ルベルが増加した。外科、化学療法及び放射線
治療に応答しなかった卵巣癌患者は血清ｐ２ルベルが増
加した。治療に応答した患者は血清ｐ２ルベルが減少し
た。血清ｐ２ルベルを追跡した他の癌患者でも同様の傾
向か認められ、この試験が癌治療の監視に有効であるこ
とがわかる。

血清からの抗原捕獲反応物をモノクローナルアニティク
ロマトグラフィにより精製し、ウェスタンプロット法で
２１０００ドルトンで溶離することを認めた（第７図）
。精製したｒａｓ反応物を八〇＾５４のカラム上で分子
ふるいにかけ、空のカラム及びＢＳΔＳ−マーカ間クロ
マトグラフィにかけた。データ（図示せず）中で、癌患
者血清のｒａｓ　ｐ２１反応物はウェスタンプロット法
で２１０００ドルトンで溶離した。これらの結果は、ヒ
ト血清中に見出だされるｒａｓ　ｐ２１が約１００００
０ドルトンの非共有複合体中にかまれることを示してい
る。

４隻特定の位置（即ちコドン１２．１３及び１６）の点突然
変異によるｒａｓ腫瘍遺伝子族の員の活性化は、広て今
日までに研究されている全ヒト腫瘍遺伝子のうちで、ｒ
ａｓシステムはヒト癌の初期検出、示差的診断及び監視
用の試験の基礎として最も有望である。今日までこのよ
うな試験を開発するために為されている大多数の主要な
試みは核酸配列に集中しており、より最近では突然変異
したｒａｓ腫瘍遺伝子を直接同定するためのオリゴヌク
リオチド示差的融解ハイブリダイゼーション手続きに集
中している。程度は劣るが今日までに調査されている別
のアプローチとして、アミン組織病理学により高いｒａ
ｓ腫瘍遺伝子発現を測定するためにｒａｓｐｚｔ特異モ
ノクローナル抗体を使用する方法がある。これらの方法
には腫瘍生検材料を必要とするという共通の問題があり
、従って初期癌検出又は腫瘍進行の監視には容易に適用
できない。

ｒａｓ　ｐ２１は細胞膜タンパク質であり従って生理学
的に血液流中に分泌されないが、十分な腫瘍細在し得る
。ｒａｓ　ｐ２１がヒＩ・血清中に存在しているか否か
の決定は、このような決定を他の腫瘍遺伝子システムに
広く適用できるという点で重要である。ヒト血清中にｒ
ａｓ　ｐ２１のような非分泌腫瘍遺伝子コード化タンパ
ク質の発現が検出可能なレベルで示されるなら、現象は
より一般的であり得、血清に基づくイムノアッセイを広
範な腫瘍遺伝子システム又は腫瘍遺伝子コード化タンパ
ク質に適用できることが立証される。

ｒａｓ　ｐ２１の免疫学的試験開発の当初のアプローチ
は、高感度で且つ広範なフォーマット及び用途に適合可
能なシステムを選択することであった。

いくつかの理由から抗原捕獲手続きを選択しな。

このアプローチは、この場合ｒａｓ　ｐ２１である腫瘍
遺伝子コード化タンパク買を細胞抽出物、血清又は他の
生物材料から精製及び濃縮するために固相支持体マトリ
ックスと結合した広く反応性の抗体を使用する。次に、
結合した抗原を示すために、同位体又は非同位体の支持
薬と結合した第２の抗体を使用する。この手続きは、第
１の抗体による抗原濃縮のための広範な手動又は自動フ
ォーマットに適合可能である。更に、デテクタシステム
として結合した第２の抗体を使用すると、比色定量、蛍
光、発光又は同位体システムといった使用可能な広範な
システムのいずれかに試験を適合させることができる。

デテクタとして結合した第２の抗体を使用すると、結合
抗原の性質に関して特異的な決定を形成するための試験
をフォーマット化することができる。例えば、ｒａｓ　
ｐ２１腫瘍遺伝子システムの場合、Ｈ−１Ｎ−及びに−
ｒａｓを識別し、ｒａｓ腫瘍遺伝子生成物の任意の１個
がｒａｓ腫瘍遺伝子活性化に臨界的であると認められる
位置の１つに点突然変異を有するか否かを認識しさえす
るデテクタ反応剤を選択することが可能である。同様に
、腫瘍遺伝子コード化タンパク質の非活性化形態から活
性化形態を識別するデテクタ抗体を選択することにより
、他の腫瘍遺伝子システムにも同一のフォーマットを適
用することができた。

捕獲システムとしてアガロースピードに結合したｒａｓ
　ｐ２１の１個のエビ１−一プに対して特異的なモノク
ローナル抗体と、デテクタとして＋２５ｉと結合したｒ
ａｓ　ｐ２１の別のエピトープに対するモノクローナル
抗体とを使用する上記検定を使用して、発明者らは血清
中にｒａｓρ２１タンパク質を検出することができた。

ｒａｓ　ｐ２１検定の特異性は、ｐ２１発現レベルを明
確に限定して誓書動物及びヒト細胞系の抽出物を分析す
ることにより立証された。これに対して、シトケラチン
１８に対するモノクローナル抗体をコントロールとして
使用した場合、試験の捕獲又はデテクタのどちらの面か
ら見ても検出可能な反応物はほとんど又は全く観察され
なかった。

以上の結果から、ｒａｓ　ｐ２１の血清レベルは個々の
患者間で異なること、及び多くの場合レベルは非癌患者
の血清中よりも著しく高くはないことが明らかである。

一方、多数の正常供与者からの血清中でなく推定癌患者
中のｒａｓ　ｐ２１の検出を相関すると、癌に対して特
異的な診断上の補助として試験の特異性及び信頼性が強
化される。

これらの研究から得られた情報は、捕獲のための第１段
階又はデテクターリポータとしての第２段階で使用され
るモノクローナル抗体を変更することにより検定の感度
を増加できることも立証した。即ち、決定基特異性、ア
フィニティ又は親和性の異なるモノクローナル及び／又
はポリクローナル抗体を種々の表示順序で組み合わせて
使用することにより試験システムを操作した処、ｒａｓ
コード化タンパク質が検出され得る癌患者の数を増加さ
せることができな。ｒａｓ　ｐ２ルベルが低い癌患者は
寛解しているが、又はこれらの患者の癌はｒａｓ腫瘍遺
伝子システムがら独立した遺伝メカニズムにより誘導さ
れている可能性がある。この間題を解決するためには、
明確に限定された臨床病歴て癌患者からの血清中のｒａ
ｓ　ｐ２ルベルを逐次審査することが必要である。同時
に腫瘍組織試料は、活性化に関連するｒａｓ腫瘍遺伝子
中の位置（即ちコドン１２．１３及び６１）で単塩基変
化突然変異を直接分析した患者及びそのＤＮＡから得る
必要がある。このアプローチにより、ヒト癌患者の血清
中に検出されるｒａｓ　ｐ２１の形態が非活性形態から
活性形態に突然変異しているｒａｓ腫瘍遺伝子族の員と
相関しているか否かを判断することも可能になる。以上
の検討結果は、ヒト癌患者の血清中で高レベルの腫瘍遺
伝子コード化タンパク質を最初に発現させた実例であり
、その検出に高感度及び特異的な免疫検定フォーマット
を提供するものである。

側考Ｊｕ上１　、　＾ｎｄｅｒｓｏｎ、　　Ｓ、Ｊ、、　　Ｆｕｒ
ｔｈ、　　Ｍ、　　Ｗｏｌｆｆ、　　Ｌ、。

Ｒｕ５ｃｅｔｔｉ、　Ｓ、に、　ａｎｃｌ　５ｈｅｒｒ
、　Ｃ，Ｊ、　（１９８２）。

Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　　Ｌ
ｏ　　ｔｌ＋ｅ　　ｔｒａｎｓｆｏｒｎａ−ｔｉｏｎ−
ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｎｃ
ｌｄｅｄ　ｂｙしｈｅ　　ｒｅｆｉｎｅ　　ｒｅＬｒｏ
ｖｉｒａｌ　　ｏｎｃｏｇｅｎ　　ｖ−ｆｍｓ。

Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、４４，６９６−７０２゜２、　８ｉｓ
ｈｏｐ、　Ｊ、Ｍ、　　（１９８１）、　　ｉｎ：　　
ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＢｉｏｌｏｇｙ　ｔｌｓｉ
ｎｇ　Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　Ｇｅｎｅｓ、　ｅｄ、　Ｂｒ
ｏｗｎ。

（＾ｃａｄｅｎｉｃ、　　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、）　　ｐ
ｐ、　　５１４−５２５゜３　、　８ｉｓｈｏｐ、　　
Ｊ、Ｈ，（１９８２）、　　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ
　ａｎｄｅａｎｅｅｒ　　ｇｅｎｅｓ、　　＾ｄｖ、ｉ
ｎ　　Ｃａｎｃｅｒ　　Ｒｅｓ、３７゜１−６９゜４　、　　Ｂ１５ｈｏｐ、　　Ｊ、Ｍ、　　（１９８２
）、　　Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ、　　Ｓｃｉ。

＾ｓｅｒ、２４６．８９−９２゜５　、　　Ｂｏｎｎｅｒ、　　ＬＨ，ａｎｄ　Ｌａ５ｋ
ｅｙ、　　Ｒ，＾、　　（１９７４）。

Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　　５ｅｔｈｏｄ　　ｆｏｒ　　丁
ｒｉｔｉｕｍ−１ａｂｅｌｅｄｐｒｔｅｉｎｓ　ａｎｄ
　ｎｕｃｌｅｉｃ　　ａｃｉｄｓ　　ｉｎ　　ｐｏｌｙ
ａｃｒｙｌａｓｉｄｅ　ｇｅｔｓ、　　Ｅｕｒ、　　Ｊ
、　　［ｌｉｏｃｈｅｍ　４６．　８３−８８゜６　、
　　Ｃｏｏｐｅｒ、　Ｇ、　　（１９８２）、　Ｃｅ１
ｌｕｌａｒ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｅｎｅｓ、　
　５ｃｅｉｎｃｅ　２１７．　８０１−８０６゜７　、
　　Ｄｅｂｕｓ、　　Ｅ、、　　Ｗｅｂｅｒ、　　Ｋ、
　　ａｎｄ　０ｓｂｏｒｎ、Ｍ、（１９８２）。

Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　　ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ　　
ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　　ｔｈａｔｄｉｓＬｉＢｕｉｓ
ｈ　　ｓｉｍｐｌｅ　　ｆｒｏｍ　　５ｔｒａｔｉｒｉ
ｅｄｃｐｉ口＋ｅｌｉａ：　　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚ
ａｔｉｏｎ　　ｏｎ　　ｈｕｍａｎｔｉｓｓｕｅｓ、　
　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　　１２．　１６４１−１６
４７゜８　、　　Ｄｅｒ、　　Ｃ，、Ｋｒｏｎｔｉｒｉ
ｓ、　　、Ｔ、、　　ａｎｄ　Ｃｏｏｐｅｒ、　　Ｇ（
１９８２）、　　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｅｎｅ
ｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎｂｌａｄｄｅｒ　　ａｎｄ　　ｌ
ｕｎｇ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　　ｃｅｌｌｌｉｎｃｓ　
　ａｒｅｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｒａｓ
　ｇｅｎｅｓ　ｏｒＩｌａｒｖｅｙａｎｄ　　Ｋｉｒｓ
ｔｅｎ　　５ａｒｃｏ＋ｎａ　　ｖｉｒｕｓｅｓ、Ｐｒ
ｏｃ、ＮａｉΔｃｅｄ、　　Ｓｃｉ、　　７９．　３６
３７−３６４０゜９、　Ｄｅｒ、　ＣＩＪＩ　ａｎｄ　
Ｃｏｏｐｅｒ、　Ｆ、Ｍ、　（１９８３）−＾ＩＬｅｒ
ｅｄ　　ｇｅｎｅ　　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　　ａｒｅ　　
ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ
　ｏｆ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｒａｓ　　ｇｅｎｅｓｉｎ
　　ｈｕｍａｎ　　ｌｕｎｇ　　ａｎｄ　　ｃｏｌｏｎ
　　ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ、　　Ｃｅ１１課、　　２０
１−２０８゜１０、　Ｅｌｌｉｓ、　Ｒ，Ｗ、、　Ｄｅｒｅｏ、　Ｄ
、、　５ｈｉｈ、　Ｔ、Ｙ、。

Ｇｏｎｄａ、　　Ｍ　＾、、　　Ｙｏｕｎｇ、　　Ｉｔ
　＾、、　　Ｔｓｕｃｈｉｄａ、　　Ｎ、。

Ｌｏｗｒｙ、　　Ｄ、Ｒ，、ａｎｃｌ　　５ｃｏｌｎｉ
ｃｋ、　　Ｅｌｆ、　　（１９８１）。

Ｔｈｅ　ｐ２１　ｓｒｅ　ｇｅｎｅ　ｏｆ　Ｈａｒｖｅ
ｙ　ａｎｄ　Ｋｉｒｓｔｅｎｓａｒｃｏｍａ　ｖｉｒｕ
ｓｅｓ　ｏｒｉｇｉｎａｔｅ　ｆｏｒｍ　ｄｉｖｅｒｇ
ｅｎｔｍｅｍｂｅｒｓ　ｏｆ　ａ　ｆａｍｉｌｙ　ｏｒ
　ｎｏｒｍａｌ　　ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｇｅｎｅｓ、
　Ｎａｔｕｒｅ　２９２．　５０６−５１１゜１１、　
Ｆｕｒｔｈ、　Ｍ、Ｅ、、　Ｄａｖｉｓ、　ＬＪ、、　
Ｆｌｅｕｒｄｅｌｙｓ、　Ｂ、。

ａｎｄ　５ｃｏｌｎｉｃｋ、　　Ｅ、Ｍ、　　（１９８
２）、　　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
　ｔｏ　　ｔｈｅ　ｐ２１　　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｏｒ
　　ｔｈｅｔｒａｎｓｆｏｒｎｉＢ　　ｇｅｎｅ　　ｏ
ｆ　　ｌ１ａｒｖｅｙ　　ｍｕｒｉｎｅｓａｒｃｏｍａ
　　ｖｉｒｕｓ　　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　　ａｎｄ　
　ｏｒ　　ｔｈｅｃｅｌｌｕｌａｒ　ｒａｓ　ｇｅｎｅ
　ｆａｍｉｌｙ、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　４３゜２９４
−３０４゜１２、　Ｇａ１ｌｉｃｋ、　Ｇ、Ｅ、、　Ｋｕｒｚｒｏ
ｃｋ、　Ｒ，、Ｋｌｏｅｔｚｅｒ、　Ｗ。

Ｓ、、　　ＡｒＡｒ１１ｎ＋ａｕｓ、　　Ｒ，１３，、
ａｎｄ　　Ｇｕｔｔｅｒｍａｎ、　　Ｊ、Ｖ。

（１９８５）、　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｒ　ｐ２１
　ｒａｓ　ｉｎ　ｆｒｅｓｈｐｒｉｍａｒｙ　ａｎｄ　
ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ　　ｈｕｍａｎ　ｃｏｌｏｒｅｃ
ｔａｌｔｕｎ＋ｏｒｓ、　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａ１１．
　　八ｃａｄ、、　　Ｓｃｉ、　　８２．　１７９５−
１７９９゜１３、　１ｌａｎｄ、　　Ｐ、Ｉｌ、、　　ＴＩ＋ｏｒ
、　　八、、　　Ｗｕｎｄｃｒｌｉｃｈ、　　Ｒ，。

Ｍｕｒａｒｏ、　　Δ、、　　Ｃａｒｕｓｓｏ、　　＾
、、　　ａｎｄ　Ｓｃｈｌｏｍ、　　Ｊ。

（１９８４）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　　ａｎｔｉｂｏ
ｄｉｅｓ　　ｏｆ　　ｐｒｅｄｅ−ｆｉｎｅｄ　　５ｐ
ｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　　ｄｅｔｅｃｔ　　ａｃｔｉｖａ
ｔｅｄ　　ｒａｓｇｅｒ＋ｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　
　ｉｎ　　ｈｕｍａｎ　　ｍａｌａｒｙ　　ａｎｄｃｏ
ｌｏｎ　　ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、　　＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、８１．５２２７−５２３１゜１４、　１Ｉａｒｌｏｕ＋、　　Ｅ、、Ｃｒｏｗｆｏｒ
ｄ、　　Ｌ、Ｖ、、　　Ｐｌｍ、　　Ｄ、Ｃ。

ａｎｄ　　Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ、Ｎ、Ｍ、（１９８１
）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　　５
ｐｅｃｉｆｉｃ　　ｆｏｒ　　５１ｍ１ａｎ　　ｖｉｒ
ｕｓ　　４０ｔｕｍｏｒ　ａｎｔｉｇｅｎｓ、　Ｆ、　
Ｖｉｒｏｌ、　３９．８６１−８６９゜１５、　ｔｌａ
ｙｕ＋ａｒｄ、　１１１．ｓ、、　Ｎｏｅｌ、　Ｂ、Ｇ
、、　ａｎｄ　Ａｓｔｒｉｎ　Ｓ。

Ｍ、　　（１９８１）、　　八ｃｔｉｖａｔｉｏｎ　　
ｏｒ　　ａ　　ｃｅｌｌｕｌａｒ　　ｏｎｅ−ｇｅｎｅ
　　ｂｙ　　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　　１ｎｓｅｒｔｉｏｎ
　　ｉｎ　　ＡＬＶ　　−１ｎｄｕｃｅｄ　　ｌｙｍｐ
ｈｏｉｄ　　Ｉｅｕｋｏｓｉｓ、　　Ｎａｔｕｒｅ　２
９０゜４７５−４８０゜１６、　１ｆｕｅｂｎｅｒ、　　Ｒ，Ｊ、　　ａｎｄ　
　Ｔｏｄａｒｏ、　　Ｇ、　　（１９６９）。

０ｎｃｏ）（ｅｎｃｓ　　ｏｆ　　ＲＮＡ　　ｔｕｍｏ
ｒ　　ｖｉｒｕｓｅｓ　　ａｓ　　ｄｅｔｅｒ−ｍｉｎ
ａｎｔｓ　　ｏｆ　　ｃａｎｃｅｒ、Ｐｒｏｃ、Ｈａｔ
、　　＾ｃａｄ、Ｓｃｅ。

６４．１０８７−１０９４゜１７．１ｌｕｒｌｅｙ、Ｊ、Ｂ、、Ｓｉｍｏｎ、Ｍ、１
．、Ｔｅｐｌｏｕ＋、Ｄ、Ｂ、。

Ｒｏｂｉｓｈａｗ、Ｊ、Ｄ、、ａｎｄ　　Ｇｉｌｍａｎ
、　　＾、Ｇ、（１９８５）。

Ｈｏｍｏｌｏｇｉｅｓ　　ｂｅｔｕ＋ｅｅｎｓｉｇｎａ
ｌ　　ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ　　Ｇｐｒｏｔｅｉｎｓ
　ａｎｄ　ｒａｓ　ｇｅｎｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ、　　
５ｃｉｅｎｃｅ２２６．８６０−８６２゜１８、Ｋｌｅｉｎ、Ｇ、ｅｄ、（１９８０）、ｉｎ：　
　Δｄｖａｎｃｅｓ　　１ｎＶｉｒａｌ　　Ｏｎｃｏｌ
ｏｇｙ、ｖｏｌ、ｌ　　（Ｒａｖｅｎ　　ｐｒｅｓｓ。

Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ）ｐｐ、１−２６２゜１９、Ｌａｅ
ｍｍｌｉ、Ｕ、に、（１９７０）、Ｃｌｅａｖａｇｅ　
　ｏｒｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　　
ｄｕｒｉＢ　　ａｓｓｅｍｂｌｙｏｆ　　ｔｈｅ　　ｈ
ｅａｄ　　ｏｆ　　ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ　　Ｔ
４．Ｎａｔｕｒｅ２２７．６８０−６８５゜２０、　Ｌａｎｃｌ、　　Ｉｆ、、　　Ｐａｒａｄａ、
　　Ｌ　　Ｆ、ａｎｄ　　Ｗｅｉｎｂｅｒｇ、　　Ｒ，
八。

（１９８３）、Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　　ｏｎｃｏｇｅｎｅ
ｓ　　ａｎｄ　　ｍｕｌｔｉｓｔｅｐｃａｒｃｉｎｏＨ
ｅｎｅｓｉｓ、　　５ｃｅｉｎｃｅ　２２２．　７７１
−７７８゜２１　　Ｌｏｗｒｙ、０．１１．、Ｒｏｓｅ
ｂｒｏｕｇｈ、　　■、Ｊ、、Ｆａｒｒ、　　Δ。

Ｌ、、ａｎｄ　　１ｌａｎｄａｌｌ、ＲＪ、（１９５１
）、Ｐｒｏｔｅｉｎｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　　ｗｉｔ
ｈ　　ｔｈｅ　　ｆｏｌｉｎ　　ｐｈｅｎｏｌ　　ｒｅ
−ａＢｎｔ、Ｊ、１３ｉｏ１．Ｃｈｅｍ、１９３，２６
５−２７５゜２２、ＭｃＧｒａＬｈ、ＪＪ、、Ｃａｐｏ
ｎ、Ｄ、Ｊ、、Ｇｏｅｄｄｅｌ、ＤＪ。

ａｎｃｌ　　Ｌｅｖｉｎｓｏｎ、　　＾、Ｄ、（１９８
４）、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
　　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　　ｏｆ　　ｎｏｒｍａｌ　
　ａｎｄａｃｔｉｖａｔｅｄ　　ｈｕｍａｎ　　ｒａｓ
　ｐ２１　　ｐｒｏｔｅｉｎ、　　Ｎａｔｕｒｅ３１０
．６４４−６４９゜２３、Ｍｅｒｒｉｌ、Ｃ，Ｒ，、１にｏｌｄｍａｎ、Ｄ
、、Ｓｅｄｍａｎ、Ｄ、。

ａｎｄ　Ｅｂｅｒｔ、　Ｍ、１１．　（１９８１）、Ｕ
ｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅｓｔａｉｎ　　ｆｏｒ　　
ｐｒｏｔｅｉｎｓ　　ｉｎ　　ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍ
ｉｄｅＨｅｌｓ　　５ｈｏｕｔｓ　　ｒｅｇｉｏｎａｌ
　　ｖａｒｉａしｉｏｎ　　ｉｎ　　ｃｅｒｅ−ｂｒｏ
ｓｐｉｎａｌ　　ｆｌｕｉｄ　　ｐｒｏｔｅｉｎｓ、　
　５ｃｅｉｎｃｅ　　２１１゜１４３７−１４３８゜２４、Ｓｈｉｍｉｚｕ、に、、Ｂｉｒｎｂａｕｍ、Ｄ、
、Ｒｕ１ｅｙ、Ｍ、。

Ｆａｓａｎｏ、０．．５ｕａｒｄ、Ｙ、、Ｅｄｌｕｎｄ
、Ｌ、、Ｔａｐａ−ｒｏｕ＋ｓｋｙ、Ｅ、、Ｇｏｌｄｆ
ａｒｂ、Ｍ、、ａｎｄ　　Ｗｉｇｌｅｒ、Ｍ。

ｏｒ　ｔｈｅ　ｈｕｒａａｎ　ｌｕｎｇ　ｃａｒｃｉｎ
ｏｍａ　ｃｅｌｌｓ　１ｉｎｅＣａｌｕ−１，Ｎａｔｕ
ｒｅ　　３０４，４９７−５００゜２５、Ｓｌａｍｏｎ
、Ｄ、Ｊ、、ｄｅ　　Ｋｅｒｎｉｏｕ、Ｊ、Ｂ、、Ｖｅ
ｒｍａ、Ｉ。

Ｍ、　　ａｎｄ　　Ｃ１１ｎｅ、、Ｍ、Ｊ、　　（１９
８５）、　　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　　ｏｆｃｅｌｌｕ
ｌａｒ　　ｏｎＣｏｇｅｎｅｓ　　ｉｎ　　ｈｕｍａｎ
　　ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ。

５ｃｉｅｎｃｅ　　２２４，２５６−０２６２゜２６．
５ｐｅｃｔｏｒ、Ｄ、ｌｔ、、Ｖａｒｍｕｓ、Ｈ，Ｅ、
、ａｎｄ　　Ｂ１５ｈｏｐ。

Ｊ、Ｍ、（１９７８）、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　　５ｅ
ｑｕｅｎｃｅｓ　　ｒｅｌａｔｅｄｔｏ　　ｔｈｅ　　
ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｅｎｅ　　ｏｒ　　ａｖ
ｉａｎ　　ｓａｒｃｏ−ｍａ　　ｖｉｒｕｓ　　ａｒｅ
　　ｐｒｅｓｅｎｔ　　ＤＮＡ　ｏｆ　　ｕｎｉｎｆｅ
ｃｔｅｄｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、
　　Δｃａｄ、ＳＣｅ、７５゜４＋、０２−４１０６゜２７、Ｔａｂｉｎ、Ｃ，、Ｂｒａｄｌｅｙ、Ｓ、、Ｂａ
ｒｇｍａｎｎ、Ｃ，。

Ｗｅｉｎｂｅｒｇ、Ｒ，、Ｐａｐａｇｅｏｒｇｅ、　　
＾、、５ｃｏｌｎｉｃｋ。

Ｅ、、　　Ｄｈａｒ、　　Ｒ，、ＬｏＩＩｌｙ、　　Ｄ
、、　　ａｎｄ　　Ｃｈａｎｇ、　　Ｅ。

（１９８２）、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　　ｏｆ　　ａｃｔ
ｉｖａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　ａｈｕｍａｎ　　ｏｎｃｏ
ｇｅｎｅ、Ｎａｔｕｒｅ　　３００，１４３−１４８゜
Ｓｂ１ｍ１ｚｚｕ、　　Ｋ、、　　Ｇｏｌｄｆａｒｂ、
　　Ｍ、、　　ｌ’１１ｇ１ｅｒ、　　Ｍ。

（１９８２）　、　　＾ｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｒ　　
ｔｈｅ　Ｔ２４　ｂｌａｄｄｅｒｃａｒｃｉｎｏｍａ　
　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　　ｇｅｎｅ　　ｉｓ　　
１ｉｎｋｅｄ　　ｔ。

ａ　ｓｉｎｇｌｅ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｃｈａｒ＋
ｇｅ、　　Ｎａｔｕｒｅ　３００゜７６２−７６５゜２９、　　Ｔａｐａｒｏｕ＋ｓｋｙ、　　Ｅ、、　　Ｓ
ｈｉｍｉｚｕ、　　Ｋ、、　　Ｇｏｌｄｆａｒｂ　Ｍ、
。

ａｎｄ　Ｗｉｇｌｅｒ　Ｍ、　　（１９８３）、　　５
ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏ
ｆ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　Ｎ−ｒａｓ　ｇｅｎｅ、　Ｃ
ｅ１ｌ　３４゜５８１−５８６．３０、Ｖａｎ　ｄｅ、Ｖｅｎ、、Ｗ、Ｍ、、Ｒｅｙｎｏ
ｌｄｓ、Ｆ、Ｉｌ、Ｊｒ、。

ａｎｄ　　５ｔｅｐｈｅｎｓｏｎ、　　Ｊ、Ｒ，（１９
８０）、　　Ｔｂｅ　　ｎｏｉｎｓＬ−ｒｕｃｔｕｒａ
ｌ　　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　　ｏｒ　　ｐｏｌｙｐｒ
ｏＬｅｉｎｓｅｎｃｏｄｅｄ　ｂｙ　　ｒｅｐｌｉｃａ
ｔｉｏｎ　　−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ　ｍａｍ−ｍａｌｉ
ａｎ　　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ、Ｒｅｔｒｏｖｉｒ
ｕｓｅｓ　　ａｒｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ　ａ
ｎｄ　ｈａｖｅ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏ−ｔｅ
ｉｎ　　ｋｉｎａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ、　　Ｊ、　
　Ｖｉｒｏｌ、　　１０土３１、　　Ｖｅｒｏｎｅｓｅ
、　　Ｆ、、　　Ｋｅｌｌｏｆｆ、　　Ｇ、Ｊ、、　　
Ｒｅｙｎｏｌｄｓ。

Ｊｒ、、　Ｆ、Ｈ，、−Ｈｉｌｌ、Ｒ，Ｗ、、　ａｎｄ
　５ｔｅｐｈｅｎｓｏｎ。

Ｊ、Ｒ，（１９８２）、　　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　　
ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　５ｐｅ−ｃｉｆｉｃ　　ｔｏ　
　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎｓ
　ｅｎｃｏ−ｄｅｄ　ｂｙ　　１ｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ
　　１ｓｏｌａｔｅｓ　ｏｆ　　ｒｅｆｉｎｅｓａｒｃ
ｏｍａ　ｖｉｒｕｓ、　Ｊ、　　Ｖｉｒｏｌ、　４３．
８９６−９０４．３２、　Ｗｅｉｓｓ、　Ｒ，、Ｔｅ１
ｃｈ、　　Ｎ、、　　Ｖａｒ＋＊ｕｓ、　　Ｉｔ、ａｎ
ｄＣｏｆｆｉｎ　Ｊ、　　（１９８４）、　　ＲＮＡ　
Ｔｕｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓｅｓ：　　ＴｂｅＭｏｌｅｃｕ
ｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｔｕ＋＊ｏｒ　Ｖｉｒ
ｕｓｅｓ　ｐａｒｔＩ［１、（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ
　Ｈａｒｂｏｒ　Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ、　１／Ｔｅｘｔ
。

Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ）。

【図面の簡単な説明】

第１図は抗原捕捉反応の動力学を示すグラフ、第２図は
ｒａｓ　ｐ２１溶液−相抗原捕捉試験の標準曲線のグラ
フ、第３図は＾１１細胞由来のｒａｓ　ｐ２１の分子サ
イズ分画分析の結果を示す図、第４図は肺癌由来ｒａｓ
　ｐ２１の分子サイズ分画分析の結果を示す図、第５図
はコントロールの血清中のｒａｇ　ｐ２１反応性を示す
図、第６図は癌患者の血清中の■ユｐ２１反応性を示す
図、第７Ａ図はヒト血清から回収した■互ｐ２１を示し
、第７４図会千牽味はこのひ互ｐ２１の−ｅｓｔｅｒｎ
プロットの結果を示す写真である。ＴＩＭＥＩＮ　ＨＯｕＲ５ビｎエセｓ　　ｐ２１

Claims

【特許請求の範囲】

（１）被験体中の活性化された腫瘍遺伝子の存在に関連
する新生状態を診断するための方法であって、活性化腫
瘍遺伝子によりコードされ一般に細胞内で発生するポリ
ペプチドの少なくとも一部の存在を被験体からの生物流
体の試料中で検出する段階から成る前記方法。
（２）前記被験体がヒトである特許請求の範囲第１項に
記載の方法。
（３）前記被験体が動物である特許請求の範囲第１項に
記載の方法。
（４）前記活性化腫瘍遺伝子がｃ−Ｈ−￥ｒａｓ￥であ
る特許請求の範囲第１項に記載の方法。
（５）前記活性化腫瘍遺伝子がｃ−Ｋ−￥ｒａｓ￥であ
る特許請求の範囲第１項に記載の方法。
（６）前記活性化腫瘍遺伝子がｃ−Ｎ−￥ｒａｓ￥であ
る特許請求の範囲第１項に記載の方法。
（７）前記活性化腫瘍遺伝子がｃ−￥ｍｙｃ￥である特
許請求の範囲第１項に記載の方法。
（８）前記活性化腫瘍遺伝子がｃ−Ｎ−￥ｍｙｃ￥であ
る特許請求の範囲第１項に記載の方法。
（９）前記活性化腫瘍遺伝子がｃ−Ｌ−￥ｍｙｃ￥であ
る特許請求の範囲第１項に記載の方法。
（１０）前記活性化腫瘍遺伝子がｃ−￥ａｂｌ￥である
特許請求の範囲第１項に記載の方法。
（１１）前記活性化腫瘍遺伝子がｃ−￥ｆｏｓ￥である
特許請求の範囲第１項に記載の方法。
（１２）前記活性化腫瘍遺伝子がｃ−Ｒ−￥ｍｙｃ￥で
ある特許請求の範囲第１項に記載の方法。
（１３）前記活性化腫瘍遺伝子がポリペプチドｐ５３で
ある特許請求の範囲第１項に記載の方法。
（１４）前記生物流体が血清である特許請求の範囲第１
項に記載の方法。
（１５）前記生物流体が尿である特許請求の範囲第１項
に記載の方法。
（１６）前記生物流体が脳脊髄液である特許請求の範囲
第１項に記載の方法。
（１７）前記生物流体が羊膜液である特許請求の範囲第
１項に記載の方法。
（１８）前記生物流体が痰である特許請求の範囲第１項
に記載の方法。
（１９）前記生物流体が肺洗浄液である特許請求の範囲
第１項に記載の方法。
（２０）前記生物流体が腹水液である特許請求の範囲第
１項に記載の方法。
（２１）前記生物流体が唾液である特許請求の範囲第１
項に記載の方法。
（２２）前記生物流体が粘液型の身体分泌物である特許
請求の範囲第１項に記載の方法。
（２３）前記生物流体が血液である特許請求の範囲第１
項に記載の方法。
（２４）前記生物流体が血漿である特許請求の範囲第１
項に記載の方法。
（２５）前記活性化腫瘍遺伝子によりコードされたポリ
ペプチドがｃ−Ｈ−￥ｒａｓ￥ｐ２１である特許請求の
範囲第４項に記載の方法。
（２６）前記活性化腫瘍遺伝子によりコードされたポリ
ペプチドがｃ−Ｎ−￥ｒａｓ￥ｐ２１である特許請求の
範囲第６項に記載の方法。
（２７）前記活性化腫瘍遺伝子によりコードされたポリ
ペプチドがｃ−Ｋ−￥ｒａｓ￥ｐ２１である特許請求の
範囲第５項に記載の方法。
（２８）前記活性化腫瘍遺伝子によりコードされたポリ
ペプチドがｃ−￥ｍｙｃ￥ｐ６２及びｐ６５である特許
請求の範囲第７項に記載の方法。
（２９）前記活性化腫瘍遺伝子によりコードされたポリ
ペプチドがｃ−Ｎ−￥ｍｙｃ￥ｐ６４及びｐ６６である
特許請求の範囲第８項に記載の方法。
（３０）前記活性化腫瘍遺伝子によりコードされたポリ
ペプチドがｃ−Ｒ−￥ｍｙｃ￥コード化ポリペプチドで
ある特許請求の範囲第１２項に記載の方法。
（３１）前記活性化腫瘍遺伝子によりコードされたポリ
ペプチドがｃ−Ｌ−￥ｍｙｃ￥コード化ポリペプチドで
ある特許請求の範囲第９項に記載の方法。
（３２）前記活性化腫瘍遺伝子によりコードされたポリ
ペプチドがｃ−￥ｆｏｓ￥ｐ５５である特許請求の範囲
第１１項に記載の方法。
（３３）前記活性化腫瘍遺伝子によりコードされたポリ
ペプチドがｐ５３である特許請求の範囲第１項に記載の
方法。
（３４）前記活性化腫瘍遺伝子によりコードされたポリ
ペプチドが、腫瘍遺伝子により一部をコードされ被験体
の染色体ＤＮＡにより一部をコードされた融合ポリペプ
チドである特許請求の範囲第１項に記載の方法。
（３５）前記活性化腫瘍遺伝子によりコードされたポリ
ペプチドが￥ｐｈｌ￥／ｃ−￥ａｂｌ￥ｐ２１０である
特許請求の範囲第３４項に記載の方法。
（３６）前記活性化腫瘍遺伝子によりコードされたポリ
ペプチドが一般に内細胞膜と関連するポリペプチドであ
る特許請求の範囲第１項に記載の方法。
（３７）前記活性化腫瘍遺伝子によりコードされたポリ
ペプチドが一般に核と関連するポリペプチドである特許
請求の範囲第１項に記載の方法。
（３８）前記検出段階が、マトリックスと第１の抗体と
ポリペプチドとの複合体を形成するべく、前記ポリペプ
チドの一部に対して特異的な第１のマトリックスと結合
された抗体と試料とを好適な条件下で接触させる段階と
、マトリックス−第１の抗体−ポリペプチド−第２の抗
体から成る第２の複合体を形成するべく、検出可能なマ
ーカーで標識した第２の抗体と前記形成された複合体と
を接触させる段階と、腫瘍遺伝子がコードしているポリ
ペプチドの存在を検出するべく、こうして形成された第
２の複合体を検出する段階とを含んでいる特許請求の範
囲第１項に記載の方法。
（３９）前記第２の抗体がモノクローナル抗体である特
許請求の範囲第３８項に記載の方法。
（４０）前記第２の抗体がポリクローナル抗体である特
許請求の範囲第３８項に記載の方法。
（４１）前記第２の抗体がマトリックスに結合されてい
る特許請求の範囲第３８項に記載の方法。
（４２）前記マトリックスがアガロースである特許請求
の範囲第４１項に記載の方法。
（４３）前記マトリックスがセファロース（登録商標）
である特許請求の範囲第４１項に記載の方法。
（４４）前記第１の抗体が管に結合されている特許請求
の範囲第３８項に記載の方法。
（４５）前記第１の抗体がビーズに結合されている特許
請求の範囲第３８項に記載の方法。
（４６）前記第２の抗体が検出可能なマーカーで標識さ
れている特許請求の範囲第３８項に記載の方法。
（４７）前記検出可能なマーカーが放射性ラベルである
特許請求の範囲第４６項に記載の方法。
（４８）前記放射性ラベルが＾１＾２＾５Ｉである特許
請求の範囲第４７項に記載の方法。
（４９）前記検出可能なマーカーが比色定量マーカーで
ある特許請求の範囲第４６項に記載の方法。
（５０）前記検出可能なマーカーが蛍光定量マーカーで
ある特許請求の範囲第４６項に記載の方法。
（５１）前記検出可能なマーカーが発光マーカーである
特許請求の範囲第４６項に記載の方法。
（５２）前記検出可能なマーカーが酵素反応の生成物で
ある特許請求の範囲第４６項に記載の方法。
（５３）前記検出段階が、抗体−ポリペプチド複合体を
形成するべく、検出すべき前記ポリペプチドの一部に対
して特異的な抗体と試料とを好適な条件下で接触させる
段階と、こうして形成された複合体を検出する段階と、
こうして腫瘍遺伝子がコードしているポリペプチドの存
在を検出する段階とを含んでいる特許請求の範囲第１項
に記載の方法。
（５４）前記抗体がモノクローナル抗体である特許請求
の範囲第５３項に記載の方法。
（５５）前記抗体がポリクローナル抗体である特許請求
の範囲第５３項に記載の方法。
（５６）前記抗体が選択された抗体の組み合わせの１つ
である特許請求の範囲第５３項に記載の方法。
（５７）前記抗体が検出可能なマーカーで標識されてい
る特許請求の範囲第５３項に記載の方法。
（５８）前記検出可能なマーカーが放射性ラベルである
特許請求の範囲第５７項に記載の方法。
（５９）前記放射性ラベルが＾１＾２＾５Ｉである特許
請求の範囲第５８項に記載の方法。
（６０）前記検出可能なマーカーが比色定量マーカーで
ある特許請求の範囲第５７項に記載の方法。
（６１）前記検出可能なマーカーが蛍光定量マーカーで
ある特許請求の範囲第５７項に記載の方法。
（６２）前記検出可能なマーカーが発光マーカーである
特許請求の範囲第５７項に記載の方法。
（６３）前記検出可能なマーカーが酵素反応の生成物で
ある特許請求の範囲第５７項に記載の方法。
（６４）前記複合体が検出可能な免疫沈降物を形成する
特許請求の範囲第５３項に記載の方法。
（６５）前記検出段階が、抗体−コントロール用ポリペ
プチド複合体を形成するべく、腫瘍遺伝子がコードして
いるポリペプチドの存在下でポリペプチドの一部に対し
て特異的な抗体と検出可能なコントロール用ポリペプチ
ドとを接触させる段階と、こうして形成された複合体の
個数を定量する段階と、こうして定量された個数を腫瘍
遺伝子がコードしているポリペプチドの不在下で形成さ
れた複合体の個数と比較し、形成された複合体の個数の
減少により試料中に腫瘍遺伝子がコードしているポリペ
プチドの存在を確認する段階とを含んでいる特許請求の
範囲第１項に記載の方法。
（６６）前記抗体がモノクローナル抗体である特許請求
の範囲第６５項に記載の方法。
（６７）前記抗体がポリクローナル抗体である特許請求
の範囲第６５項に記載の方法。
（６８）前記抗体が選択された抗体の組み合わせの１つ
である特許請求の範囲第６５項に記載の方法。
（６９）前記抗体がマトリックスに結合されている特許
請求の範囲第６５項に記載の方法。
（７０）前記マトリックスがアガロースである特許請求
の範囲第６９項に記載の方法。
（７１）前記マトリックスがセファロース（登録商標）
である特許請求の範囲第６９項に記載の方法。
（７２）前記抗体−コントロール用ポリペプチド複合体
が、抗体−コントロール用ポリペプチド複合体の抗体と
結合する第２の抗体により溶液から分離される特許請求
の範囲第６９項に記載の方法。
（７３）前記抗体が管に結合されている特許請求の範囲
第６５項に記載の方法。
（７４）前記抗体がビーズに結合されている特許請求の
範囲第６５項に記載の方法。
（７５）前記コントロール用ポリペプチドが検出可能な
マーカーで標識されている特許請求の範囲第６５項に記
載の方法。
（７６）前記検出可能なマーカーが放射性ラベルである
特許請求の範囲第７５項に記載の方法。
（７７）前記放射性ラベルが＾１＾２＾５Ｉである特許
請求の範囲第７６項に記載の方法。
（７８）前記検出可能なマーカーが比色定量マーカーで
ある特許請求の範囲第７５項に記載の方法。
（７９）前記検出可能なマーカーが蛍光定量マーカーで
ある特許請求の範囲第７５項に記載の方法。
（８０）前記検出可能なマーカーが発光マーカーである
特許請求の範囲第７５項に記載の方法。
（８１）前記検出可能なマーカーが酵素反応の生成物で
ある特許請求の範囲第７５項に記載の方法。
（８２）前記検出段階が、検出可能な第１の抗体−ポリ
ペプチド−第２の抗体複合体を形成するべく、検出すべ
きポリペプチドの一部上のエピトープに対して特異的な
第１の抗体と、検出すべきポリペプチドの一部上の別の
エピトープに対して特異的な第２の抗体とに好適な条件
下で試料を接触させる段階を含んでいる特許請求の範囲
第１項に記載の方法。
（８３）前記第１の抗体がモノクローナル抗体である特
許請求の範囲第８２項に記載の方法。
（８４）前記第１の抗体がポリクローナル抗体である特
許請求の範囲第８２項に記載の方法。
（８５）前記第２の抗体がモノクローナル抗体である特
許請求の範囲第８２項に記載の方法。
（８６）前記第２の抗体がポリクローナル抗体である特
許請求の範囲第８２項に記載の方法。
（８７）酵素反応により検出を実施する特許請求の範囲
第８２項に記載の方法。
（８８）化学的反応により検出を実施する特許請求の範
囲第８２項に記載の方法。
（８９）吸収長の波長シフトにより検出を実施する特許
請求の範囲第８２項に記載の方法。
（９０）発光により検出を実施する特許請求の範囲第８
２項に記載の方法。
（９１）放射能により検出を実施する特許請求の範囲第
８２項に記載の方法。
（９２）被験体中の活性化された腫瘍遺伝子の存在に関
連する新生状態を診断するための方法であって、被験体
からの生物流体の試料中の腫瘍遺伝子がコードしている
ポリペプチドの量を定量する段階と、こうして定量され
たポリペプチドの量を正常被験体からの試料中の量と比
較し、著しい量の差の存在により新生状態の存在を確認
する段階とを含んでいる前記方法。
（９３）被験体中の新生状態の経過を監視するための方
法であって、被験体からの生物流体の第１の試料中の腫
瘍遺伝子がコードしているポリペプチドの存在を定量す
る段階と、こうして定量された量を別の時点で被験体か
ら採取された第２の試料中に存在している量と比較し、
定量された量の差により新生状態の経過を確認する段階
とを含んでいる前記方法。
（９４）新生状態の被験体からの生物流体の試料中の１
個以上の腫瘍遺伝子がコードしているポリペプチドの存
在を検出し、特定の組み合わせの有無により特定の腫瘍
の型を確認することから成る腫瘍の分類方法。
（９５）新生状態の被験体からの生物流体の試料中の１
個以上の腫瘍遺伝子がコードしているポリペプチドの量
を定量し、特定量又は相対量の存在により特定の腫瘍の
型を確認することから成る腫瘍の分類方法。
（９６）新生状態の治療用として推定される治療薬の審
査方法であって、新生状態の被験体からの第１の試料中
で該状態に関連する腫瘍遺伝子がコードしているポリペ
プチドの量を定量する段階と、治療後の被験体をもたら
すべく、当該治療薬を当該状態に関連する新生細胞と接
触させるように治療量の当該治療薬を被験体に投与する
段階と、適当な期間を経て治療後の被験体からの試料中
におけるポリペプチドの量を定量する段階と、第１の試
料中で定量されたポリペプチドの量を治療後の被験体か
らの試料中で定量された量と比較し、顕著な差により治
療薬の効果を確認する段階とを含んでいる前記方法。
（９７）活性化された腫瘍遺伝子によりコードされ細胞
内で発生するポリペプチドの少なくとも一部を生物流体
の試料中で検出することから成る活性化腫瘍遺伝子の検
出方法。
（９８）前記第１のマトリックスと結合した抗体がＡＴ
ＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ１７４２で表されるハイブリドーマ
細胞系により産生される特許請求の範囲第３８項に記載
の方法。
（９９）前記第２の抗体がＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ１７
４１で表されるハイブリドーマ細胞系により産生される
特許請求の範囲第３８項に記載の方法。
（１００）前記抗体がＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ１７４２
で表されるハイブリドーマ細胞系により産生される特許
請求の範囲第５３項に記載の方法。
（１０１）前記抗体がＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ１７４２
で表されるハイブリドーマ細胞系により産生される特許
請求の範囲第６５項に記載の方法。
（１０２）前記第２の抗体がＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ１
７４１で表されるハイブリドーマ細胞系により産生され
る特許請求の範囲第７２項に記載の方法。
（１０３）前記第１の抗体がＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ１
７４２で表されるハイブリドーマ細胞系により産生され
る特許請求の範囲第８２項に記載の方法。
（１０４）前記抗体がＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ１７４１
で表されるハイブリドーマ細胞系により産生される特許
請求の範囲第８２項に記載の方法。