JPS6197224A - 新規なリンホカイン - Google Patents
新規なリンホカインInfo
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- JPS6197224A JPS6197224A JP59218643A JP21864384A JPS6197224A JP S6197224 A JPS6197224 A JP S6197224A JP 59218643 A JP59218643 A JP 59218643A JP 21864384 A JP21864384 A JP 21864384A JP S6197224 A JPS6197224 A JP S6197224A
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- JP
- Japan
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- activity
- human
- cell
- cells
- natural killer
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- Pending
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はヒトT細胞ないしはヒトT細胞ハイブリドーマ
が産生じ、新規薯ζ見出されたリンホカインlζ間する
。
が産生じ、新規薯ζ見出されたリンホカインlζ間する
。
リンホカインとは、抗原あるいはマイトゲンによって活
性化されたリンパ球より放出される種々の生物学的活性
を有する非抗体性可溶性物質の総称である。リンホカイ
ンは、狭義には、活性化T細胞から産生され細胞性免疫
の一次的媒体として ゛作用するものを指すが、そ
のほかに免疫応答における細胞間相互作用に関与する一
群の因子があり。
性化されたリンパ球より放出される種々の生物学的活性
を有する非抗体性可溶性物質の総称である。リンホカイ
ンは、狭義には、活性化T細胞から産生され細胞性免疫
の一次的媒体として ゛作用するものを指すが、そ
のほかに免疫応答における細胞間相互作用に関与する一
群の因子があり。
今日では両者を含めてリンホカインと呼ばれることが多
い。前者には、マクロファージ遊走阻止因子(MIF)
、マクロファージ活性化因子(MAF)、リンホトキシ
ン、(LT)などが、後者には抗体産生の抑制因子、ヘ
ルパー因子、T細胞増殖因子(IL−2)などが含まれ
る。
い。前者には、マクロファージ遊走阻止因子(MIF)
、マクロファージ活性化因子(MAF)、リンホトキシ
ン、(LT)などが、後者には抗体産生の抑制因子、ヘ
ルパー因子、T細胞増殖因子(IL−2)などが含まれ
る。
リンホカインは通常のリンパ球培養上清中からはきわめ
て限られた量#よび純度でしか得られず。
て限られた量#よび純度でしか得られず。
そのため多くのリンホカインはその役割について確定的
な結果が得られていない。しかしながら。
な結果が得られていない。しかしながら。
リンホカインの中には大量に得られるなら臨床応用の可
能性をもつものがあるため、数多(の研究者がリンホカ
インを産生ずるT腫瘍味の検索、T細胞ハイブリドーマ
の樹立に携わってきている。
能性をもつものがあるため、数多(の研究者がリンホカ
インを産生ずるT腫瘍味の検索、T細胞ハイブリドーマ
の樹立に携わってきている。
その結果1例えば、IL−2に関してはそれを産生ずる
ヒトT腫瘍味(Jurkat−FHCRC)の発見。
ヒトT腫瘍味(Jurkat−FHCRC)の発見。
モノクローナル抗IL−2抗体の作成とそれを用いたT
細胞増殖、アロキラーT細胞分化誘導におけるIL−2
(7)役割の確定、mRNAとcDNAの分離同定がす
でに終了しようとしている。これはインターフェロンと
同様の研究方向であり、このようにして遺伝子工学の助
けを借りて大量かつ純粋基ζ得られたリンホカインを用
いることにより、臨床応用はもとよりその構造と機能の
関係2作用機構の解析、 18σi#Oでの役割の確
定が順次可能となることが十分に予想される。
細胞増殖、アロキラーT細胞分化誘導におけるIL−2
(7)役割の確定、mRNAとcDNAの分離同定がす
でに終了しようとしている。これはインターフェロンと
同様の研究方向であり、このようにして遺伝子工学の助
けを借りて大量かつ純粋基ζ得られたリンホカインを用
いることにより、臨床応用はもとよりその構造と機能の
関係2作用機構の解析、 18σi#Oでの役割の確
定が順次可能となることが十分に予想される。
さて、ある種の癌細胞に対して破壊的に作用する細胞と
してナチュラルキラー細胞の存在が知られており、当該
細胞の活性に影響のあるリンホカインに関心が寄せられ
ている。例えばインターロイキン−2詔よびインターフ
ェロンはナチュラルキラー細胞の活性の増大を誘導する
ことが示されている。またナチュラルキラー細胞から癌
細胞に対して毒性のある因子が産生され、これがナチュ
ラルキラー細胞の活性を発揮している可能性が大きいと
いうことが提示されており、そしてこの因子が実はリン
ホトキシンの成る形態であるかもしれないということが
示されている。他方、ヒトリンパ球と癌細胞とを接触せ
しめるとリンパ球の細胞毒性を強化する因子が遊離され
てきて、この因子が一種のリンホトキシンであると考え
られた。
してナチュラルキラー細胞の存在が知られており、当該
細胞の活性に影響のあるリンホカインに関心が寄せられ
ている。例えばインターロイキン−2詔よびインターフ
ェロンはナチュラルキラー細胞の活性の増大を誘導する
ことが示されている。またナチュラルキラー細胞から癌
細胞に対して毒性のある因子が産生され、これがナチュ
ラルキラー細胞の活性を発揮している可能性が大きいと
いうことが提示されており、そしてこの因子が実はリン
ホトキシンの成る形態であるかもしれないということが
示されている。他方、ヒトリンパ球と癌細胞とを接触せ
しめるとリンパ球の細胞毒性を強化する因子が遊離され
てきて、この因子が一種のリンホトキシンであると考え
られた。
さらにまたリンホトキシンは癌細胞のナチュラルキラー
細胞に対する感受性を高めることも報告されている。こ
れらの結果を総合するとナチュラルキラー細胞の活性に
影響のあるリンホカインとしてりンホトキシンが直接的
にも間接的にも重要な役割を演じている可能性があるこ
とが示唆されるのである。
細胞に対する感受性を高めることも報告されている。こ
れらの結果を総合するとナチュラルキラー細胞の活性に
影響のあるリンホカインとしてりンホトキシンが直接的
にも間接的にも重要な役割を演じている可能性があるこ
とが示唆されるのである。
ナチュラルキラー細胞およびリンホトキシンについての
以上の知見をさらに詳細に説明するための資料として下
記文献1)〜8)を列挙する。
以上の知見をさらに詳細に説明するための資料として下
記文献1)〜8)を列挙する。
1) Herberman、 R,B、、 Djeu、
J、Y、 、 Kay、 H,D、。
J、Y、 、 Kay、 H,D、。
0rtaldo、 J、 R,、Riccardi 、
C,、Bonnard、 G、 D、 、 Ho1−
den、 H,T、 、 Fagnani 、 R,、
5antoni 、 A、 and Puccet−t
i、P、 、 Immunol、 Rev、 1979
.44: 43゜2) Voje、 B、 M、 、
Riccardi、 C,、Bonnard、G、 D
。
C,、Bonnard、 G、 D、 、 Ho1−
den、 H,T、 、 Fagnani 、 R,、
5antoni 、 A、 and Puccet−t
i、P、 、 Immunol、 Rev、 1979
.44: 43゜2) Voje、 B、 M、 、
Riccardi、 C,、Bonnard、G、 D
。
and Herberman、 R,B、、 J、 I
mmunol 、 1983.130ニア68゜ 3) Domzig、児、 5tadler、 B、
M、 and Herber−man、R,B、、 J
、Tmmurrol、 1983.130: 1970
゜4) Wright、S、 C,、Weitzeu、
M、 L、、 Kahle、 R,。
mmunol 、 1983.130ニア68゜ 3) Domzig、児、 5tadler、 B、
M、 and Herber−man、R,B、、 J
、Tmmurrol、 1983.130: 1970
゜4) Wright、S、 C,、Weitzeu、
M、 L、、 Kahle、 R,。
Granger、 G、 A、 and Bonavi
da、 B、 J、 Immunol。
da、 B、 J、 Immunol。
1983、130: 2479.
5) Kedar、 E、、 Ikejiri、 B、
L、、 5redni、 B、。
L、、 5redni、 B、。
Bonavida、 B、 and Herberma
n、 R,B、 、 Ge11.Imm−unol、1
982.69: 305゜5) Weitzen、
M、 L、 、 Yamamoto 、 R、S、 a
ndGranger、G、 A、、 Ce11. Im
munol 、 1983.77: 30゜7) P
eter、H,H,、Eife、 R,F、 and
Kaldeu、 J。
n、 R,B、 、 Ge11.Imm−unol、1
982.69: 305゜5) Weitzen、
M、 L、 、 Yamamoto 、 R、S、 a
ndGranger、G、 A、、 Ce11. Im
munol 、 1983.77: 30゜7) P
eter、H,H,、Eife、 R,F、 and
Kaldeu、 J。
R,、J、rmmunol、1976.116: 34
2゜8) Ransom、 J、 H,and Ev
ans、 C,H+、 Int、 J。
2゜8) Ransom、 J、 H,and Ev
ans、 C,H+、 Int、 J。
Cancer 1982.29: 451゜上記した
状況にかんがみ本発明者はナチュラルキラー細胞を活性
化するリンホカインの存在を想定して種々の検討をおこ
なった。すなわち9本発明者は下記文献9)〜11)に
示されるとと(リンホカイン産生ヒトT細胞ハイブリド
ーマについて数種のセルラインを樹立し、MIF(マク
ロファージ遊走阻止因子)、MAF(マクロファージ活
性化因子)等のリンホカインの存在を明らか番こしてき
たが、これらに詔けるとは異なる特別の処理を施すこと
によってナチニラルキラー細胞活性化因子産生h)7細
胞ハイブリドーマを特別に取得することを試みた。その
結果、ヒトT細胞をスカシ貝ヘモシアニンによって処理
し、これを出発細胞としてヒトT細胞ハイブリドーマを
取得すれば。
状況にかんがみ本発明者はナチュラルキラー細胞を活性
化するリンホカインの存在を想定して種々の検討をおこ
なった。すなわち9本発明者は下記文献9)〜11)に
示されるとと(リンホカイン産生ヒトT細胞ハイブリド
ーマについて数種のセルラインを樹立し、MIF(マク
ロファージ遊走阻止因子)、MAF(マクロファージ活
性化因子)等のリンホカインの存在を明らか番こしてき
たが、これらに詔けるとは異なる特別の処理を施すこと
によってナチニラルキラー細胞活性化因子産生h)7細
胞ハイブリドーマを特別に取得することを試みた。その
結果、ヒトT細胞をスカシ貝ヘモシアニンによって処理
し、これを出発細胞としてヒトT細胞ハイブリドーマを
取得すれば。
当該ハイブリドーマはナチュラルキラー細胞活性化因子
を産生ずるものであることを知り9本発明を完成するに
至った。
を産生ずるものであることを知り9本発明を完成するに
至った。
以上より明らかなごとく本発明の目的は新規なナチュラ
ルキラー細胞活性化因子の提供であり。
ルキラー細胞活性化因子の提供であり。
本発明は該目的の達成のためにスカシ貝ヘモシアニンで
処理したヒトT細胞を出発細胞とするヒトT細胞ハイプ
リビー1番ζよって産生され、下記の理化学的性質を有
するりンホカ゛インを開示する。
処理したヒトT細胞を出発細胞とするヒトT細胞ハイプ
リビー1番ζよって産生され、下記の理化学的性質を有
するりンホカ゛インを開示する。
(1)分子量 約15.000および30,000(1
1)酸性領域で化学的に不安定であるrun)ナチュラ
ルキラー細胞活性化活性を有するQV) インターロ
イキン−2活性を示さない(V) インターフェロン
活性を示さないj・ ホカイン産生ヒトT細胞
ハイブリドーマ6ζ関するものであり1本発明の参考の
ために列挙する。
1)酸性領域で化学的に不安定であるrun)ナチュラ
ルキラー細胞活性化活性を有するQV) インターロ
イキン−2活性を示さない(V) インターフェロン
活性を示さないj・ ホカイン産生ヒトT細胞
ハイブリドーマ6ζ関するものであり1本発明の参考の
ために列挙する。
9 ) Kobayashi 、 Y、 、 Aaad
a 、 M、、、Higuchi、 M、 andOs
awa、 T、、 J、Immunol、 1982.
128: 2714゜IQ) Asada、 M、 、
Higuchi、 M、 、 Kobayashi、
Y。
a 、 M、、、Higuchi、 M、 andOs
awa、 T、、 J、Immunol、 1982.
128: 2714゜IQ) Asada、 M、 、
Higuchi、 M、 、 Kobayashi、
Y。
and Osawa、 T、、 Ce11. Immu
nol、 1983.77:150゜ 11) Higuchi、 M、、 Asada、 M
、、 Kobayashi、 Y。
nol、 1983.77:150゜ 11) Higuchi、 M、、 Asada、 M
、、 Kobayashi、 Y。
and Osawa、 T、、 Ce11.Immun
ol、 1983.78:257゜ 発明の構成 以下に本発明の詳細な説明する。
ol、 1983.78:257゜ 発明の構成 以下に本発明の詳細な説明する。
本発明のヒトT細胞はヒト末梢血リンパ球あるいは肺臓
または胸腺より分離したリンパ球であり。
または胸腺より分離したリンパ球であり。
通常は末梢血リンパ球が使用される。ただし単核細胞の
リンパ球のみが使用され、さらに使用にあたっては、ロ
ゼツトを形成するもの(ロゼツト形成細胞)およびプラ
スチックへの耐着性をもつたもの(耐着性細胞)が選択
され、用意される。
リンパ球のみが使用され、さらに使用にあたっては、ロ
ゼツトを形成するもの(ロゼツト形成細胞)およびプラ
スチックへの耐着性をもつたもの(耐着性細胞)が選択
され、用意される。
本発明の特徴はヒトT細胞がスカシ貝ヘモシアニンによ
って処理される点にある。スカシ貝ヘモシアニンはマイ
ト−ジエンの一種であり、 Keyho−1e lim
pet hemocyanin(KLHと略記)の名称
をもってCalbiochem−Behring Co
、、CAより入手することができる。スカシ貝ヘモシア
ニンでヒトT細胞を処理するとは9例えば適当な培地中
で前記ロゼツト形成細胞と耐着細胞の混合物をスカシ貝
ヘモシアニンに接触感作せしめることであり、感作後さ
らに増殖せしめるためにインターロイキンー2を加えて
継代培養すればよい。
って処理される点にある。スカシ貝ヘモシアニンはマイ
ト−ジエンの一種であり、 Keyho−1e lim
pet hemocyanin(KLHと略記)の名称
をもってCalbiochem−Behring Co
、、CAより入手することができる。スカシ貝ヘモシア
ニンでヒトT細胞を処理するとは9例えば適当な培地中
で前記ロゼツト形成細胞と耐着細胞の混合物をスカシ貝
ヘモシアニンに接触感作せしめることであり、感作後さ
らに増殖せしめるためにインターロイキンー2を加えて
継代培養すればよい。
本発明に係るヒトT細胞ハイブリドーマはスカシ貝へそ
シアニンで処理したヒトT細胞を出発細胞として適当な
融合方法9例えばHATセレクション法あるいはエメチ
ンーアクチノマイシンD法により融合細胞とし、ナチュ
ラルキラー細胞活性化能をもってスクリーニングするこ
とにより得ることができる。本発明者等が開発したエメ
チンー7クチノマイシンD法に従っておこなう場合には
。
シアニンで処理したヒトT細胞を出発細胞として適当な
融合方法9例えばHATセレクション法あるいはエメチ
ンーアクチノマイシンD法により融合細胞とし、ナチュ
ラルキラー細胞活性化能をもってスクリーニングするこ
とにより得ることができる。本発明者等が開発したエメ
チンー7クチノマイシンD法に従っておこなう場合には
。
スカシ貝ヘモシアニンで処理したヒトT細胞およびエメ
チンーアクチノマイシンDで処理したヒト急性白血病細
胞株2例えばOEMを1=1乃至10:1の割合で混合
し、ポリエチレングリコール4000を加えて融合し、
スクリーニングすればよい。また、クローニングはりミ
ティングダイリューション法を用いておこなえばよい。
チンーアクチノマイシンDで処理したヒト急性白血病細
胞株2例えばOEMを1=1乃至10:1の割合で混合
し、ポリエチレングリコール4000を加えて融合し、
スクリーニングすればよい。また、クローニングはりミ
ティングダイリューション法を用いておこなえばよい。
後記実施例によって示されるごとく本発明者は本発明に
係るヒトT細胞ハイブリドーマとしてKC8−1と命名
する株を得た。KC8−1をさらにナチュラルキラー細
胞活性化活性にもとづいてクローニングしてKC8−1
−9およびKC8−1−10と命名する株を得た。KC
8−1,KC8−1−9およびKC8−1−10は微工
研にそれぞれ寄託申請された。
係るヒトT細胞ハイブリドーマとしてKC8−1と命名
する株を得た。KC8−1をさらにナチュラルキラー細
胞活性化活性にもとづいてクローニングしてKC8−1
−9およびKC8−1−10と命名する株を得た。KC
8−1,KC8−1−9およびKC8−1−10は微工
研にそれぞれ寄託申請された。
本発明リンホカインは本発明に係るヒトT細胞ハイブリ
ドーマの培養上清に存するが、培養上清を9096硫安
飽和とすることによって濃縮し、ブルーセファローズカ
ラム(ファルマシア)にかけてPBSで溶出させナチュ
ラルキラー細胞活性化活性をもって所定のフラクション
を集めれば精製リンホカインとして得ることができる。
ドーマの培養上清に存するが、培養上清を9096硫安
飽和とすることによって濃縮し、ブルーセファローズカ
ラム(ファルマシア)にかけてPBSで溶出させナチュ
ラルキラー細胞活性化活性をもって所定のフラクション
を集めれば精製リンホカインとして得ることができる。
この精製リンホカインをTSK G3000−8Wカラ
ムにかけPBSで溶出してゲル濾過をおこなうと。
ムにかけPBSで溶出してゲル濾過をおこなうと。
おおよその分子量が15.000および30,000で
あることが判明する。また下記に示すナチュラルキラー
細胞活性化活性測定法によって、その活性を測定してみ
ると当該活性を有しており、従って本発明リンホカイン
はナチュラルキラー細胞活性化因子(NKAF)と本発
明者によって命名される。またこの活性は本発明リンホ
カインをpH2において24時間放置したときに大きく
失なわれ。
あることが判明する。また下記に示すナチュラルキラー
細胞活性化活性測定法によって、その活性を測定してみ
ると当該活性を有しており、従って本発明リンホカイン
はナチュラルキラー細胞活性化因子(NKAF)と本発
明者によって命名される。またこの活性は本発明リンホ
カインをpH2において24時間放置したときに大きく
失なわれ。
従って本発明リンホカインは酸性領域1ζおいて化学的
に不安定であることが知られる。
に不安定であることが知られる。
また下記に示すインターロイキン−2活性測定法および
インターフェロン活性測定法によって。
インターフェロン活性測定法によって。
それらの活性を求めてみると、いづれの活性も有しない
ことが判明する。
ことが判明する。
なお、また本発明リンホカインの標的細胞はナチュラル
キラー細胞であると考えられる。すなわち下記に示すナ
チュラルキラー細胞活性化活性の測定法におけるプラス
チック非耐着性PBSを抗Leu−11モノクロナール
抗体およびウサギ補体によって処理し、あらか、じめL
eu−11表面抗原を有するナチュラルキラー細胞を除
去してから本発明リンホカインを加えて本発明リンホカ
インのナチュラルキラー細胞活性化活性を求めても、当
該活性は発現しない。従って本発明リンホカインは標的
細胞としてのナチュラルキラー細胞の存在を必要とする
ことが判明する。なおナチュラルキラー細胞の表面抗原
Leu−11については下記文献が参照される。
キラー細胞であると考えられる。すなわち下記に示すナ
チュラルキラー細胞活性化活性の測定法におけるプラス
チック非耐着性PBSを抗Leu−11モノクロナール
抗体およびウサギ補体によって処理し、あらか、じめL
eu−11表面抗原を有するナチュラルキラー細胞を除
去してから本発明リンホカインを加えて本発明リンホカ
インのナチュラルキラー細胞活性化活性を求めても、当
該活性は発現しない。従って本発明リンホカインは標的
細胞としてのナチュラルキラー細胞の存在を必要とする
ことが判明する。なおナチュラルキラー細胞の表面抗原
Leu−11については下記文献が参照される。
12) Ph1llips、 J、 H,and Ba
bcock、 G、 F、。
bcock、 G、 F、。
Immunol、 Letters 1983.5:
143゜13) Lan1er、 L、 L、、 Le
、 A、 M、、 Ph1llips、 J、 H,。
143゜13) Lan1er、 L、 L、、 Le
、 A、 M、、 Ph1llips、 J、 H,。
Warner、 N、 L、 and Babcock
、 G、 F、 、 J、 Immunol。
、 G、 F、 、 J、 Immunol。
1983.131: 1789゜
14) Ph1llips、 J 、 H,、Le、
A−M、 and Lan1er、 L。
A−M、 and Lan1er、 L。
L、、 J、 Exp、 Med、 1984.159
: 993゜ナチュラルキラー細胞活性化活性の測定法
牛胎児血清1096を含有するRPMI−1640培地
にプラスチック非耐着性のヒト末梢血リンパ球(プラス
チック非耐着性PBLと略称される)を入れ。
: 993゜ナチュラルキラー細胞活性化活性の測定法
牛胎児血清1096を含有するRPMI−1640培地
にプラスチック非耐着性のヒト末梢血リンパ球(プラス
チック非耐着性PBLと略称される)を入れ。
ヒトT細胞ハイブリドーマの培養上清を加え、さらに全
量を100μtとし試料とする。ただ゛しプラスチック
非耐着性PBLの細胞密度は5X105/−となるよう
にする。20時間培養し、この培養液に51Crでラベ
ルしたに562細胞液(105k)100μtを加え、
さらに4時間培養する。次にここから100μtをとり
、遊離51Crを測定する。別に対照として牛胎児血清
1096を含有するRPMI−1640培地100μt
を用意し、20時間培養し、この培養液に51Crでラ
ベルしたに562細胞液(・105/rt’) 100
ptを加え、さらに4時間培養する。次にここから1
00μtをとり、遊離51Crを測定する。
量を100μtとし試料とする。ただ゛しプラスチック
非耐着性PBLの細胞密度は5X105/−となるよう
にする。20時間培養し、この培養液に51Crでラベ
ルしたに562細胞液(105k)100μtを加え、
さらに4時間培養する。次にここから100μtをとり
、遊離51Crを測定する。別に対照として牛胎児血清
1096を含有するRPMI−1640培地100μt
を用意し、20時間培養し、この培養液に51Crでラ
ベルしたに562細胞液(・105/rt’) 100
ptを加え、さらに4時間培養する。次にここから1
00μtをとり、遊離51Crを測定する。
各測定値より2次式に基づきナチュラルキラー細胞活性
(NK活性と略記される)を求める。
(NK活性と略記される)を求める。
−a
NK活性= −X 1005%
−a
ただし9式中−は試料に係る遊離”Cr(cpm )を
示し、aは対照に係る遊離”Cr(cpm )を示し。
示し、aは対照に係る遊離”Cr(cpm )を示し。
また今は61(rでラベルしたに562細胞液(105
/d)100μtにおける総5℃r(cpm)を示す。
/d)100μtにおける総5℃r(cpm)を示す。
なお。
三回の測定の平均値を求める。
他方、上記記載においてヒトT細胞ハイブリドーマを加
えない点を除いて上記記載とまったく同一に測定操作を
おこない、ナチュラルキラー細胞活性を求める。三回の
測定の平均値を求める。ヒトT細胞ハイブリドーマの培
養上清を加えた場合におけるナチュラルキラー細胞活性
をSとし、またヒトT細胞ハイブリドーマの培養上清を
加えない場合におけるナチュラルキラー細胞活性をRと
すると9本発明に係るナチュラルキラー細胞活性化活性
(NKAF活性と略記される)は次式によって求められ
る。
えない点を除いて上記記載とまったく同一に測定操作を
おこない、ナチュラルキラー細胞活性を求める。三回の
測定の平均値を求める。ヒトT細胞ハイブリドーマの培
養上清を加えた場合におけるナチュラルキラー細胞活性
をSとし、またヒトT細胞ハイブリドーマの培養上清を
加えない場合におけるナチュラルキラー細胞活性をRと
すると9本発明に係るナチュラルキラー細胞活性化活性
(NKAF活性と略記される)は次式によって求められ
る。
ただし9本発明において特にことわらない限り。
NKAF活性は上式によって算出される値としてではな
く、単にRおよびSのNK活性値を対比のために提示す
ることによって表現されるものとする。
く、単にRおよびSのNK活性値を対比のために提示す
ることによって表現されるものとする。
インターロイキン−2活性の測定法
この活性は、ヒトT細胞ハイブリドーマの培養上清がマ
ウスのインターロイキン−2依存性細胞(例えばLe7
)の成長を維持する能力として測定される。すなわち
5X10個のLc7細胞を牛胎児血清1096を含有す
るRPMI−1640培地50μLにとり。
ウスのインターロイキン−2依存性細胞(例えばLe7
)の成長を維持する能力として測定される。すなわち
5X10個のLc7細胞を牛胎児血清1096を含有す
るRPMI−1640培地50μLにとり。
これにヒトT細胞ハイブリドーマの培養上清を系列希釈
したもの5Qptを加え、混合する。20時間; 培養後 3H−チミジン(比活性5.OC+/mM。
したもの5Qptを加え、混合する。20時間; 培養後 3H−チミジン(比活性5.OC+/mM。
Amersham、 England ) Q、5 p
(:iで4時間パスルし。
(:iで4時間パスルし。
とりこまれた放射活性を液体シンチレーションカウンタ
ーで測定する。
ーで測定する。
他方上記記載においてヒトT細胞ハイブリドーマの培養
上清を加えない点を除いて上記とまったく同一に測定操
作をおこない放射活性を測定する。
上清を加えない点を除いて上記とまったく同一に測定操
作をおこない放射活性を測定する。
本発明においてインターロイキン−2活性(IL−2活
性)は上記の二側定値が対比のために提示されることに
よって表現されるものとする。
性)は上記の二側定値が対比のために提示されることに
よって表現されるものとする。
インターフェロン活性の測定法
この活性は具体的には口内炎ウィルスに対する抗ウィル
ス活性として測定され、当該ウィルスにj・
よってヒト羊膜細胞上に形成されるプラークの減少に
よって測定される。測定方法の詳細については下記文献
15)および16)が参照される。
ス活性として測定され、当該ウィルスにj・
よってヒト羊膜細胞上に形成されるプラークの減少に
よって測定される。測定方法の詳細については下記文献
15)および16)が参照される。
15) Hooks 、 J、 J、 、 Haye
s、 B、 F、、 Petrich −Ho−oks
、 B、、 Dieh、 L、 F、、 Gerrar
d、 T、 L、 and Fcuu−ci、 A、
S、、 Blood 1982.59: 198゜
16) Hooks J、J、 Moutsopou
los M、 Ge1s S、5ta−hl NI 、
Decker JL、 Notkins AL :
Immune 1nterfe−ron in the
circulation of patients
with autoim−mune disease、
N Engl、J、 Med、 3Ql :5(19
79)以下に記載する実施例をもつて本発明をさらに具
体的に説明する。
s、 B、 F、、 Petrich −Ho−oks
、 B、、 Dieh、 L、 F、、 Gerrar
d、 T、 L、 and Fcuu−ci、 A、
S、、 Blood 1982.59: 198゜
16) Hooks J、J、 Moutsopou
los M、 Ge1s S、5ta−hl NI 、
Decker JL、 Notkins AL :
Immune 1nterfe−ron in the
circulation of patients
with autoim−mune disease、
N Engl、J、 Med、 3Ql :5(19
79)以下に記載する実施例をもつて本発明をさらに具
体的に説明する。
実施例1
(a) ヒトT細胞の調製
ヒト末梢血(供与者YK)をFicoll −Urog
rafin溶液に重層し、濃度勾配遠心法により単核細
胞を採取した。なお、下記文献が参照される。
rafin溶液に重層し、濃度勾配遠心法により単核細
胞を採取した。なお、下記文献が参照される。
17) Kawaguchi 、T、 、 Matss
bmoto、I 、 and Osawa。
bmoto、I 、 and Osawa。
T、、 J、 Biol、Chem、 1974.24
9: 2786゜次に単核細胞に2−アミノエチルイソ
チオウロニウムブロマイド臭化水素塩(AETと略記さ
れる)で処理したヒツジ赤血球を加えてロゼツトを形成
せしめ、ロゼツトを形成する細胞のみを分離した。なお
、下記文献が参照される。
9: 2786゜次に単核細胞に2−アミノエチルイソ
チオウロニウムブロマイド臭化水素塩(AETと略記さ
れる)で処理したヒツジ赤血球を加えてロゼツトを形成
せしめ、ロゼツトを形成する細胞のみを分離した。なお
、下記文献が参照される。
18) Pellegrino 、 M、 A、 、
Ferrone、 S、、 Dierich。
Ferrone、 S、、 Dierich。
M、 P、 and Re1sfeld、 R,A、
、 Cl1n、 Immunol。
、 Cl1n、 Immunol。
Immunopbato!、 1975.3: 324
゜また、前記単核細胞をプラスチック製ペトリ皿(3Q
Q3 、 Falcon Plastics、 Bec
ton DickinsonIε & Co、 、 Cockneysvilb、 M D
)に入れて1時間培養し、プラスチック面に耐着した
細胞を採取し、マイトマイシンC(50μy/rnt)
を加えて30分間処理し、プラスチック耐着細胞を用意
した。
゜また、前記単核細胞をプラスチック製ペトリ皿(3Q
Q3 、 Falcon Plastics、 Bec
ton DickinsonIε & Co、 、 Cockneysvilb、 M D
)に入れて1時間培養し、プラスチック面に耐着した
細胞を採取し、マイトマイシンC(50μy/rnt)
を加えて30分間処理し、プラスチック耐着細胞を用意
した。
(bl スカシ貝ヘモシアニン処理
牛脂児血清10%、グルタミン2mMおよび2−メルカ
プトエタノール5刈0−5Mを含有するRPMI−16
40培地に、前記Ta)におけるロゼツト形成細胞(1
0’/d )およびプラスチック耐着細胞(107d)
を入れ、スカシ貝ヘモシアニン100μf/dノ存在下
で10日間培養した。再びFicoll−Urogra
fin溶液による濃度勾配遠心により生細胞を集め、プ
ラスチック耐着細胞とともに牛胎児血清1096を含有
するRPMI−1640培地に入れ、100μt/va
tのスカシ貝ヘモシアニンおよび596のインターロイ
キン−2の存在下で培養し、5日毎に牛胎児血清を10
96およびインターロイキン−2を596それぞれ含有
する新鮮なRPMI−1640培地にとりかえて継代培
養した。
プトエタノール5刈0−5Mを含有するRPMI−16
40培地に、前記Ta)におけるロゼツト形成細胞(1
0’/d )およびプラスチック耐着細胞(107d)
を入れ、スカシ貝ヘモシアニン100μf/dノ存在下
で10日間培養した。再びFicoll−Urogra
fin溶液による濃度勾配遠心により生細胞を集め、プ
ラスチック耐着細胞とともに牛胎児血清1096を含有
するRPMI−1640培地に入れ、100μt/va
tのスカシ貝ヘモシアニンおよび596のインターロイ
キン−2の存在下で培養し、5日毎に牛胎児血清を10
96およびインターロイキン−2を596それぞれ含有
する新鮮なRPMI−1640培地にとりかえて継代培
養した。
(C) エメチンーアクチノマイシンD処理OEMの
調製 OEMをRPMI−1640培地に細胞密度2 XIO
’/wtとなるように懸濁し、 5X10−M塩酸エ
メチンおよび0.25μf/−アクチイマイシンDを加
えて37℃、596CO2中で2時間処理した。処理後
、細胞をPBSで4回洗浄し、MEM培地を加えた。
調製 OEMをRPMI−1640培地に細胞密度2 XIO
’/wtとなるように懸濁し、 5X10−M塩酸エ
メチンおよび0.25μf/−アクチイマイシンDを加
えて37℃、596CO2中で2時間処理した。処理後
、細胞をPBSで4回洗浄し、MEM培地を加えた。
(d)融合
前記(b)の継代培養を30日おこなった後、エメチン
ーアクチノマイシンD処理OEMと融合した。
ーアクチノマイシンD処理OEMと融合した。
すなわち、まず前記(b)の継代培養後の細胞をよ(洗
浄してスカシ貝ヘモシアニン除去し、遠心後。
浄してスカシ貝ヘモシアニン除去し、遠心後。
25mM−HEPESを含有するMEM培地(pH7,
2)に懸濁し、(C)で調製したエメチンーアクチノマ
イシンD処理CEMを10:1の比で混合した。混合液
を遠心してペレットを形成せしめ、このペレットに、ポ
リエチレングリコール4000を46%、ジメチルスル
ホキサイドを15%、ポリL−アルギニン(分子量60
,000)を5 pf/−含有し、あらかじめ37℃に
温めたMEM培地0.5−を加えた。37℃で45秒間
ゆっ(り撹拌し9次に25mMHEPESを含有するM
EM培地で徐々に10w1tに希釈した。
2)に懸濁し、(C)で調製したエメチンーアクチノマ
イシンD処理CEMを10:1の比で混合した。混合液
を遠心してペレットを形成せしめ、このペレットに、ポ
リエチレングリコール4000を46%、ジメチルスル
ホキサイドを15%、ポリL−アルギニン(分子量60
,000)を5 pf/−含有し、あらかじめ37℃に
温めたMEM培地0.5−を加えた。37℃で45秒間
ゆっ(り撹拌し9次に25mMHEPESを含有するM
EM培地で徐々に10w1tに希釈した。
遠心してペレットとし9通常培地にゆっくり懸濁して細
胞密度5 XIO’/−とした。当該細胞6.0×10
6個にフィーダー細胞としてマイトマイシンC25μt
/wtで37℃、30分間処理したCEM細胞1.2X
10’個を加え、96穴プレ一ト番ζ0.2dづつ分注
した。
胞密度5 XIO’/−とした。当該細胞6.0×10
6個にフィーダー細胞としてマイトマイシンC25μt
/wtで37℃、30分間処理したCEM細胞1.2X
10’個を加え、96穴プレ一ト番ζ0.2dづつ分注
した。
融合後−週間は毎日各穴の培地の100μtを新鮮な培
地で交換した。数日後にはエメチンーアクチノマイシン
D処理OEMおよびマイトマイシンC処理OEMは死滅
したのに反し、融合細胞は20穴中3穴において融合後
2週に良好に増殖した。
地で交換した。数日後にはエメチンーアクチノマイシン
D処理OEMおよびマイトマイシンC処理OEMは死滅
したのに反し、融合細胞は20穴中3穴において融合後
2週に良好に増殖した。
(e) クローニング
ラミティングダイリューション法によりクローニングし
た。すなわち選択したKO8株を0.5細胞個/穴とな
るように96穴プレートにまき、同時にフィーダー細胞
としてマイトマイシン050μt/−で30分間処理し
たOEM細胞を2 XIO’/−となるよう番ζ加えた
。10〜14日後番こクローンの増殖が認められ、KC
8−1株として微工研に寄託申請された。
た。すなわち選択したKO8株を0.5細胞個/穴とな
るように96穴プレートにまき、同時にフィーダー細胞
としてマイトマイシン050μt/−で30分間処理し
たOEM細胞を2 XIO’/−となるよう番ζ加えた
。10〜14日後番こクローンの増殖が認められ、KC
8−1株として微工研に寄託申請された。
げ)ハイブリドーマの表面形質の決定
OKT 3 + 4 、8 e 11 (0rtho
pharmaceuticalCo、 、 Rarit
an、 NJ )を使用するtwo−step bin
dingassay IこよりKC8−1の表面形質を
求めたところ0KT8および11がCEMIIよりも多
く表現されていることが判明した(スチューデントの1
−検定においてp<0.01)。なお、 two−st
ep bindi−ng amyについては前記文献9
)が参照される。
pharmaceuticalCo、 、 Rarit
an、 NJ )を使用するtwo−step bin
dingassay IこよりKC8−1の表面形質を
求めたところ0KT8および11がCEMIIよりも多
く表現されていることが判明した(スチューデントの1
−検定においてp<0.01)。なお、 two−st
ep bindi−ng amyについては前記文献9
)が参照される。
(g) 精製リンホカインの取得
KC8−1を細胞密度106/−で20時間培養した。
培養上清をとり、硫安を加えて9096飽和とし、沈澱
をとった。これをブルーセファローズカラム(5,Os
d、 Pharmacia、 Sweden )にかけ
、PBSで溶出し、PBSに対して透析し、精製リンホ
カインを得た。
をとった。これをブルーセファローズカラム(5,Os
d、 Pharmacia、 Sweden )にかけ
、PBSで溶出し、PBSに対して透析し、精製リンホ
カインを得た。
(h) 理化学的測定
前記(glの精製リンホカインをTSKG3000−S
WカラムにかけPBSを用い0.25 d/min (
7)流出速度で流出せしめた。各フラクションにつきナ
チュラルキラー細胞活性を測定した。
WカラムにかけPBSを用い0.25 d/min (
7)流出速度で流出せしめた。各フラクションにつきナ
チュラルキラー細胞活性を測定した。
結果を図1に示す。本図に限りタテ軸は前記ナチュラル
キラー細胞活性化活性の測定法において示される弐薯ζ
よって算出されたNKAF活性を表わす。図中、矢印は
分子量既知の標準蛋白質の溶IVグ 重位置を示しており、左から右へオポアーミン(44K
)およびリボヌクレアーゼ(14K)の流出位置を示す
。図1より本発明リンホカインの分子量は15におよび
30にであることが判明する。
キラー細胞活性化活性の測定法において示される弐薯ζ
よって算出されたNKAF活性を表わす。図中、矢印は
分子量既知の標準蛋白質の溶IVグ 重位置を示しており、左から右へオポアーミン(44K
)およびリボヌクレアーゼ(14K)の流出位置を示す
。図1より本発明リンホカインの分子量は15におよび
30にであることが判明する。
前記(g)の精製リンホカインについて精製直後および
pH2でU時間放置後におけるナチュラルキラー細胞活
性を測定した。その結果精製リンホカインを加えないと
きのNK活性が13.1±4.2%であるのに対し、そ
れぞれ33.2±7.2%招よび6.1±5.7 %で
あり9本発明リンホカインは酸性領域において不安定で
あることが判明する。
pH2でU時間放置後におけるナチュラルキラー細胞活
性を測定した。その結果精製リンホカインを加えないと
きのNK活性が13.1±4.2%であるのに対し、そ
れぞれ33.2±7.2%招よび6.1±5.7 %で
あり9本発明リンホカインは酸性領域において不安定で
あることが判明する。
前記(g)記載と同様にKC8−1の培養上清に硫安を
加えて9096飽和とし、沈澱をとり、ブルーセファロ
ーズカラム暑とかけ7.5−のPBS(溶出液A)、1
0−のPBS (溶出液B)、塩化ナトリウム1.0M
を含有するpH7,0のlQmMリン酸緩衝液10−(
溶出液C)、エチレングリコール50%を含有するpH
7,0の10mM9ン酸緩衝液(溶出液D)によって段
階的に溶出せしめ、各溶出液で溶出したフラクションを
とった。前記ナチュラルキラー細胞活性化活性の測定法
およびインターロイキン−2活性の測定法の各記載にお
いてヒトT細胞ハイブリドーマの培養上清とあるのを各
溶出液で溶出したフラクションに読みかえて各フラクシ
ョンにおけるナチュラルキラー細胞活性および放射活性
を測定した。結果を図26と示す。図のタテ軸のうち上
段は放射活性を示し、下段はナチュラルキラー細胞活性
を示す。また横軸のA、 B、 C,Dは相当する各溶
出液で溶出したフラクションを示し、Eはフラクション
を加えないコントロールを示す。図2より本発明リンホ
カインはナチュラルキラー細胞活性化活性を有し、イン
ターロイキン−2活性を示さないことが判明する。
加えて9096飽和とし、沈澱をとり、ブルーセファロ
ーズカラム暑とかけ7.5−のPBS(溶出液A)、1
0−のPBS (溶出液B)、塩化ナトリウム1.0M
を含有するpH7,0のlQmMリン酸緩衝液10−(
溶出液C)、エチレングリコール50%を含有するpH
7,0の10mM9ン酸緩衝液(溶出液D)によって段
階的に溶出せしめ、各溶出液で溶出したフラクションを
とった。前記ナチュラルキラー細胞活性化活性の測定法
およびインターロイキン−2活性の測定法の各記載にお
いてヒトT細胞ハイブリドーマの培養上清とあるのを各
溶出液で溶出したフラクションに読みかえて各フラクシ
ョンにおけるナチュラルキラー細胞活性および放射活性
を測定した。結果を図26と示す。図のタテ軸のうち上
段は放射活性を示し、下段はナチュラルキラー細胞活性
を示す。また横軸のA、 B、 C,Dは相当する各溶
出液で溶出したフラクションを示し、Eはフラクション
を加えないコントロールを示す。図2より本発明リンホ
カインはナチュラルキラー細胞活性化活性を有し、イン
ターロイキン−2活性を示さないことが判明する。
前記(g)の精製リンホカインにつきインターフェロン
活性測定したところ、IIU/sg以下であり。
活性測定したところ、IIU/sg以下であり。
無視できる活性であるので1本発明リンホカインはイン
ターフェロン活性を示さないことが判明する。
ターフェロン活性を示さないことが判明する。
実施例2
実施例1で得られたヒトT細胞ハイブリドーマKC8−
1を実施例1 (e)り四−ニングの項番ζ記載と同じ
グミティングダイリューション法によりクローン化し、
7株を得た。これらのうちKC8−1−9およびKC8
−1−10は微工研に寄託申請した。この両者の培養上
清のNKAF活性を調べたところ、上清を加えないとき
のNK活性が6.8±0.396であるのに対し前者に
おけるNK活性は!9.5±1.796であり、また後
者におけるNK活性は9.0±1.3 %であって、共
番CNKAF活性を示した。
1を実施例1 (e)り四−ニングの項番ζ記載と同じ
グミティングダイリューション法によりクローン化し、
7株を得た。これらのうちKC8−1−9およびKC8
−1−10は微工研に寄託申請した。この両者の培養上
清のNKAF活性を調べたところ、上清を加えないとき
のNK活性が6.8±0.396であるのに対し前者に
おけるNK活性は!9.5±1.796であり、また後
者におけるNK活性は9.0±1.3 %であって、共
番CNKAF活性を示した。
本発明りンホカインの標的細胞がナチュラルキラー細胞
であることを確認する目的で以下の実験をおこなった。
であることを確認する目的で以下の実験をおこなった。
実験例
試料
下記三種類のプラスチック非耐着性PBLを試料(イ)
、(ロ)、(ハ)として用意した。
、(ロ)、(ハ)として用意した。
(イ)プラスチック非耐着性PBL
(ロ)抗Leu−11bモ)クロナール抗体(1at/
106細胞個)詔細胞中サギ補体(Cedarlane
、 0ntario。
106細胞個)詔細胞中サギ補体(Cedarlane
、 0ntario。
Canada )で処理し、(イ)と同じ細胞密度に調
整したプラスチック非耐着性PBL (ハ)ウサギ補体(同上)で処理し、(イ)と同じ細胞
密度に調整したプラスチック非耐着性PBL方法 前記ナチュラルキラー細胞活性化活性の測定法の記載に
おいてプラスチック非耐着性PBLとあるのを試料(イ
)、(ロ)、(ハ)に読みかえ、またと)T細胞ハイブ
リドーマの培養上清とあるのを実施例1(h)理化学的
測定の項に記載されている溶出液Aで溶出したフラクシ
ョンに読みかえて、ナチュラルキラー細胞活性化活性の
測定法の要領薔こ従ってナチュラルキラー細胞活性Sお
よびRを求めた。ただし本発明りンホカインの最終濃度
を20%となるようにした。
整したプラスチック非耐着性PBL (ハ)ウサギ補体(同上)で処理し、(イ)と同じ細胞
密度に調整したプラスチック非耐着性PBL方法 前記ナチュラルキラー細胞活性化活性の測定法の記載に
おいてプラスチック非耐着性PBLとあるのを試料(イ
)、(ロ)、(ハ)に読みかえ、またと)T細胞ハイブ
リドーマの培養上清とあるのを実施例1(h)理化学的
測定の項に記載されている溶出液Aで溶出したフラクシ
ョンに読みかえて、ナチュラルキラー細胞活性化活性の
測定法の要領薔こ従ってナチュラルキラー細胞活性Sお
よびRを求めた。ただし本発明りンホカインの最終濃度
を20%となるようにした。
結果
結果を表1に示す。
表1
表1より試料(ロ)にみられるとと(Leu−11表面
抗原を有するナチュラルキラー細胞を除去するとナチュ
ラルキラー細胞活性が失なわれるのが知られる。従って
本発明リンホカインは標的細胞としてナチュラルキラー
細胞の存在を必要とすることが判明する。
抗原を有するナチュラルキラー細胞を除去するとナチュ
ラルキラー細胞活性が失なわれるのが知られる。従って
本発明リンホカインは標的細胞としてナチュラルキラー
細胞の存在を必要とすることが判明する。
図1は実施例1(h)理化学的測定の項に記載の図1に
相当し、ゲル濾過におけるフラクション魔とナチュラル
キラー細胞活性化活性(y)increase )との
関係を示すグラフである。 図2は実施例1(h)理化学的測定の項に記載の図2に
相当し、各種溶出液で溶出したフラクションの放射活性
およびナチュラルキラー細胞活性を示すグラフである。
相当し、ゲル濾過におけるフラクション魔とナチュラル
キラー細胞活性化活性(y)increase )との
関係を示すグラフである。 図2は実施例1(h)理化学的測定の項に記載の図2に
相当し、各種溶出液で溶出したフラクションの放射活性
およびナチュラルキラー細胞活性を示すグラフである。
Claims (4)
- (1)スカシ貝ヘモシアニンで処理したヒトT細胞を出
発細胞とするヒトT細胞ハイブリドーマによって産生さ
れ、下記の理化学性質を有する新規リンホカイン (i)分子量約15,000および30,000 (ii)酸性領域で化学的に不安定である (iii)ナチュラルキラー細胞活性化活性を有する (iv)インターロイキン−2活性を示さない (V)インターフェロン活性を示さない - (2)ヒトT細胞がヒト末梢血由来である特許請求の範
囲第1項記載の新規リンホカイン - (3)ヒトT細胞ハイブリドーマがKC8−1である特
許請求の範囲第2項記載の新規リンホカイン - (4)ヒトT細胞ハイブリドーマがKC8−1−9およ
びKC8−1−10である特許請求の範囲第2項記載の
新規リンホカイン
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP59218643A JPS6197224A (ja) | 1984-10-19 | 1984-10-19 | 新規なリンホカイン |
NO854122A NO854122L (no) | 1984-10-19 | 1985-10-17 | Fremgangsm¨te for fremstilling av et nytt lymfokin. |
EP85113254A EP0181524A3 (en) | 1984-10-19 | 1985-10-18 | Novel lymphokine |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP59218643A JPS6197224A (ja) | 1984-10-19 | 1984-10-19 | 新規なリンホカイン |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6197224A true JPS6197224A (ja) | 1986-05-15 |
Family
ID=16723161
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP59218643A Pending JPS6197224A (ja) | 1984-10-19 | 1984-10-19 | 新規なリンホカイン |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0181524A3 (ja) |
JP (1) | JPS6197224A (ja) |
NO (1) | NO854122L (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5185431A (en) * | 1988-08-31 | 1993-02-09 | Eisai Co., Ltd. | Recombinant natural killer cell activator |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0631318B2 (ja) * | 1985-09-18 | 1994-04-27 | 株式会社林原生物化学研究所 | 新リンホカインiiiとその製法 |
-
1984
- 1984-10-19 JP JP59218643A patent/JPS6197224A/ja active Pending
-
1985
- 1985-10-17 NO NO854122A patent/NO854122L/no unknown
- 1985-10-18 EP EP85113254A patent/EP0181524A3/en not_active Withdrawn
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5185431A (en) * | 1988-08-31 | 1993-02-09 | Eisai Co., Ltd. | Recombinant natural killer cell activator |
US5316933A (en) * | 1988-08-31 | 1994-05-31 | Eisai Co., Ltd. | Recombinant natural killer cell activator |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0181524A2 (en) | 1986-05-21 |
NO854122L (no) | 1986-04-21 |
EP0181524A3 (en) | 1988-12-14 |
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