JPS6187303A - 生物学的磁性液体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は磁性コロイド液、詳しくは、生化学上および
医学上の用途に適した磁性コロイド液に関する。

（従来の技術） 金属コロイドが１９６０年代に至り、高分子、特にタン
パク質をほぼ完全につまり解離不可能にまで集結させる
性質を有することが発見されるや依然生物学発達の関心
を集め出した。最もよく研究されている金属コロイドで
ある金のコロイドが電子顕微鏡用の特殊担体タンパク質
と連結してマーカーとして使用されている。

−ＩＩＱに第一鉄含有流体として知られ、既に文献で広
く紹介されている磁性液は、マグネタイト（酸化第一鉄
と酸化第二鉄の混合物）を水またはパラフィンもしくは
トルエンその他の水銀を含有した流体からなる分散媒体
中に分布したコロイド分散媒として使っている。界面活
性剤または湿潤剤（例えば、オレイン酸）を混合体に添
加することにより粒子が凝結し最終的に沈澱物を形成す
るのを防いでいる。界面活性剤はマグネタイト粒子の表
面にひっついて同粒子を第一鉄含有液中にコロイド状に
分散した状態に保つ。

デキストランで被膜されたマグネタイト粒子の開発に成
功した。コロイド状マグネタイトは濃縮されたポリサノ
カラリド（デキストラン）中に形成される。このように
マグネタイトは部分的にコロイド状と沈設物状とに分か
れる。加熱するとデキストランの一部がマグネタイト粒
子と結合する。

抗体が過ヨウ素酸塩を用いた酸化方法によってデキスト
ラン被膜性マグネタイト粒子と共有的に連鎖することは
知られている。

細胞分散液から不適当に細胞を物理的にかつ選択的に取
り除く考え方は、多くの研究者によって研究されてきた
。特に、癌治療の分野において悪性の細胞を取り除くこ
とによってトキシン。化学療法剤、補体などの使用に伴
う種々の問題を解消はしたものの、それはインビトロに
限られていた。

濃度勾配分離法が骨髄細胞からリンパ球を取り除くのに
用いられてきたが、あまり効率のよいものではなかった
。

種々の磁性粒子が同相免疫試験やドラッグターゲツティ
ングに、さらに、最近では細胞分離にも用いられるよう
になった。磁性素材の大半にマグネタイトで１種々の担
体粒子または、抗体をもった微粒子に担われている。非
常に規則正しい重合体粒子を作ってその表面をガンマ放
射を使って他のポリマーで被膜することにより抗体をそ
の表面に吸着するようにできる。細胞分離がそうした重
合体粒子を使って試みられたが、肝心の粒子自体を作る
のが難しく１タンパク質との結合中に凝結する傾向があ
る。磁性ポリスチレン粒子が正常の骨髄に種々の割合で
加えられた神経芽細胞線のインビトロでの磁性細胞分離
に用いられてきた。抗体反応細胞の９７％〜９９％程度
は除外できる。この種の磁性粒子の１つの問題点は２粒
子が細胞から引き抜かれてしまうということである。

両親を同じくした兄弟姉妹の如く細胞和合の強い給血者
からの骨髄注入に引続き行われる高供与の化学療法およ
び全身放射を組み合わせるやり方が、悪性の造血異常の
治療用に長年月を経て開発された。この方法は再発性白
血病の治療に効果的で、１０〜２０％が２年間再発なし
の治療率となって表れている。異質な骨髄移植の大きな
障害はグラフト−バーサス−ホスト（ｇｒａｆ　ｔ−ｖ
ｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ）反応である。このグラフト−バ
ーサス−ホスト反応の原因は、注入されたリンパ細胞に
ある。これが骨髄移植部に存在するからである。供血者
と受血者は親を同じくする兄弟または姉妹といった同−
組織因子座にも拘わらず拒絶反応がしばしば起こりその
発生率は７０％である。そのうちの約２５％は死亡につ
ながっている。

モノクローナル抗体の出現によって細胞表面の抗原の性
格づけの道が開かれた。マウスを免疫にてその免疫肺臓
細胞を取り出し、それをマウスの骨髄腫と混ぜることに
よって、あらかしめ特定した腫瘍細胞を作るクローン抗
体を多くの研究グループが作ってきた。各クローンは免
疫原の唯一の因子となる抗体を作るのである。このよう
にして特別の免疫体が作られる。抗体の生成にもその！
；コ殖にも安定しているクローンは培養でき、マウスの
腹水腫瘍のようにこの抗体はほぼ無制限に作られ、その
結果、同一の抗体が世界中で用いることができる。移植
の可能性については各方面の研究グループは既に認識し
ている。ある種のモノクローナル抗体に白血病細胞の表
面物質と反応する旨がいくつかの研究グループにより報
告されている。

また、あるグループに移植前に骨髄のモノクローナル治
療を施している。

モノクローナル抗体をボロン含有化合物と結合させる技
術の開発が本格的に始まっている。悪性の組織は抗体に
より目標とされ、「低速」　（熱）ニュートロンビーム
により照射され、それによって問題の細胞絶滅を図ろう
とするわけである。ボロン”Ｂの同位元素に熱ニュート
ロンビームが照射されるとそれは分解してアルファ粒子
（ヘリウム原子核）と−緒にリチウムに変換され、そこ
で膨大な熱を発生して約１０μの半径以内にある細胞を
殺してしまうのである。しかし、この技術には限界があ
る。というのは、現在行われている方法の下でボロンの
ほんの故分子しか１つの細胞に付着しないからである。

（発明の要旨） 本発明の一態様によれば生物学的磁性液体は分散媒液中
に分布された磁性コロイド分散相を有し。

同分散相は架橋された生物学的に相溶性のあるポリマー
により表面被膜された磁性微細粒子を含むことを特徴と
している。

本発明の別の態様によれば、生物学的磁性液体は分散媒
液中に分布された磁性コロイド分散相を有し、同分散相
はコバルトおよび生物学的に相溶性のあるポリマーを含
むことを特徴としている。

さらにもう一つの態様によれば生物学的磁性コロイドを
作る方法は、生物学的に相溶性のあるコロイドを形成す
る工程を含み、同相溶不可能のコロイドが生物学的に相
溶性のあるポリマーに徐々に添加されることを特徴とし
ている。

さらに本発明の態様によれば、生物学的（〃性液体を作
る方法は、磁性金属塩溶液を還元剖を混ぜることにより
コロイドを形成し、同コロイドの形成工程において生物
学的に相溶性のあるポリマーの低濃度塩が前記混合物に
添加されることを特徴としている。

さらに本発明の態様によれば、凍結乾燥された生物学的
磁性コロイドは、生物学的に相溶性のあるポリマーで被
覆された磁性コロイド粒子を有することを特徴としてい
る。

（発明の構成） 生物学上の磁性液は１分散媒液中に分布された磁性コロ
イド分散相を含み、同分散相はマグネタイトの微細粒子
からなり、同微細粒子はコハルトまたは鉄もしくはその
他の磁性金属であって、各種用途に応じた微細粒子の状
態においても充分に高い磁性を有するものにより表面被
膜されている。

一般に２粒子の大きさはコロイド形式のためには３００
ｎｍ以下、好ましくは２００ｎｍ未満である。概してい
えば９粒子濃度が大きくなれば、液体はそれだけ磁性を
帯びる。適当な生物学的に相溶性のあるポリマーの低？
ＩＩｊ度塩、すなわち、生きた細胞と相溶性のある重合
体とがコロイド液に添加される。

前記「低濃度塩」とは、１０１モル未満の塩濃度を有し
たものを意味している。分散媒体液としては好ましくは
ｐＨ１程度の生理食塩液などの水溶液を用いる。

生物学的に相溶性のあるポリマーの低濃度塩をコロイド
液に添加する方法としては、コロイド形成と同様に１つ
の過程として行うか、または、最初のコロイド液の形成
の後で第２の過程として行うか、２つのやり方がある。

後者の２段階方式では毒性があるような従来からの生物
学的に相溶不可能なコロイドが、おおまかな処理に耐え
られるような生物学的に相溶性のあるポリマーの低濃度
の塩に添加される。適当と思われる重合体としては、ア
ルブミン、イーストマンナン、重合されたシュクローズ
、デキストランのような生物学的薬剤、または、ポリメ
タクリレートのような生物学的に相溶性のある重合体な
どが用いられる。前記おおまかな処理でも充分効果の生
しるものでなければならず、これによってコロイドは生
物学的に相溶不可能となるわけではあるが、具体的には
強度の酸化還元条件と広範囲のｐＨ幅（例えば、３〜１
１といった広範囲な幅）の下における処理のことである
。好ましくは生物学的に相溶不可能なコロイドは相溶可
能なポリマーに徐々に添加すべきであって、その逆であ
ってはならない。また、添加はゆっくりした速度で行う
ようにして肉眼で認識できるような沈澱物が生成しない
ようにしなければならない。１段階方式にあってはコロ
イドは生化学物質の中で直接に成長する。

前記２段階方式は種々の磁性素材を用いて行うことがで
きるが、マグネタイトがその強ノコな磁性ゆえに最も有
利な素材である。マグネタイト粒子または細胞核の生物
学的に相溶不可能なコロイドは従来からの技術、たとえ
ばＲ，Ｍａｓｓｒｔの論文「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　
　ｏｆ　　Ａｇｕｅｏｕｓ　　Ｍａｇｎｅｔｉｓ　　Ｌ
ｉｑｕｉｄｓ　　１ｎＡｌｋａｌｉｎｅ　　ａｎｄ　　
Ａｃ１ｄｉｃ　　Ｍｅｄｉａ　　Ｊ　　　（１９８１年
　　ＩＥＥＩＥＴｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ　ｉｎ　Ｍａ
ｇｎｅｔｉｓｍ、　Ｖ、ＬＬ　Ｎｏ、２＋　Ｐ、１２４
７〜１２４８．　Ｍａｒｃｈ　１９８１）に記載の方法
などが用いられる。

（以下余白） 特に、塩化第二鉄および塩化第一鉄の水性混合液がアン
モニア溶液に加えられる。ゼリー状の沈澱は、遠心分離
または水洗を行うことなく磁気デカンテーションにより
、溶液から分離される。高電荷をもったカチオン源（例
えば、水溶性テトラメチルアンモニウムハイドライド）
を用いて沈澱を消散させ、そのことによりアルカリゾル
が形成されうる。酸性ゾルもできるものの、アルカリゾ
ルは２本発明で予想される応用例に有用であると考えら
れている。もしＦｅ（ＤＩ）　／　Ｆｅ（ＩＩ）重量圧
が（ＦｅＪ４中のように）２より大なら、ゾルだけが得
られる。適当な生物学的に相溶性のあるポリマーの低濃
度塩は、水に対する透析により生成されうる。磁性流体
は、生物学的に相溶性のあるポリマーの低濃度塩１例え
ば、ヒトアルブミンに。

ｐＨ約９．５まで比較的よく付着する。このポリマーの
低濃度塩の濃度は、少なくとも１０ｍｇ／ｍ　７！、好
適には３０ｍｇ／ｍ　１！である。溶液は充分な時間放
置された後、ａ染物を取り除くため、遠心分離され、そ
れから濾過される。

生物学的なコロイドが形成される前に、生物学的に相溶
性のあるポリマーを加えることによって。

コロイドが安定化されうる。そのため、このポリマーを
コロイドに強力に結合させることがなされる。事実、生
物学的に相溶性のあるポリマーは。

しばしば、コロイドの形成過程を促進することが知られ
ている。いくつかの段階を経て最終的にコロイドを形成
することが好ましい。第一の段階方式では、まずコロイ
ド溶液が調製され、これに生物学的に相溶性のあるポリ
マーが加えられる。第二の段階方式では、コロイド粒子
表面にある生物学的に相溶性のあるポリマーとともに、
引続きコロイド粒子が成長する。

磁性コロイドは、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＩＩ
４）を用いた塩化コバルト（ＩＩ）の化学的還元により
形成される。コバルトに対する反応生成物のあるものは
、明らかにホウ化物（ＣｏｚＢ、　ＣｏＢ）であり、こ
れはまた常磁性である。同じ反応が塩化鉄（ｎ）および
塩化鉄（Ｉ）の還元にも適用される。この反応では、ホ
ウ化鉄よりむしろ金属鉄が形成される。コバルトコロイ
ドの形成は、前述の第一の方式または第二の方式のいず
れかを用いてなされうる。

第一の方式で磁性溶液をつくる手順としては。

まず金属塩溶液（例えば、水素化ホウ素ナトリウムのよ
うな適当な還元剤を含む塩化コバルト溶液）を一部還元
し、さらにこの還元を繰り返すことが好ましい。事実、
還元剤と金属塩／８液とを２回使用することは、特に有
効であることが知られている。より優れた方法では９粒
子径を変えることが可能である。さらに２反応系に適当
な錯化剤（例えば、クエン酸ナトリウム、コハク酸ナト
リウム。

酒石酸ナトリウムのような有機酸を含む試薬）を混ぜる
ことにより、還元反応の反応速度を制御または遅延させ
ることが好ましい。

良好なコロイド′！！、’（ｌｉｓ液を得るためには１
粒子径の揃ったコロイドを形成することが重要である。

このような粒子は、第二の方式の反応操作を経て得られ
る。好ましい実施態様においては、　ｆ１ｉ子径の範囲
は、最大粒子の粒子径が最小粒子のそれの約５倍を越え
ない。最初の核形成反応の後に、核の上にコバルトのよ
うなコロイド状金属が成長し。

これが磁性粒子となりうる。まず多数の核が形成され５
　これがコロイドの粒子径を決定する。これは有限の反
応物を与える。しかし、核形成とその成長を制御するこ
とにより１種々の粒子径のコロイドをつくることが可能
である。

系内に残る金属鉄や金属コバルトは、溶液中で数時間以
上熔解しているため１通常、その表面は不動態化される
必要がある。この処理は様々な方法で行われる。特に、
リン酸（好ましくは約１から５０ｍＭ）および／または
重クロム酸カリウム（好ましくは約１から５０ｍＭ）お
よび／または亜鉛塩（好ましくは０．１から１０ｍＭ）
を用いた処理が効果的である。過剰の不動態化試薬は、
透析または限外濾過により除去される。

得られたコロイドは、タンジェンシャルフロー濾過を用
いて限外濾過することが特に有効である。

この濾過では、流体が、加圧された濾過膜を介して接線
方向に吸引される。その結果２粒子は膜から除かれ、膜
の閉塞は′減少する。生成したコロイドの純度は、多く
の応用において重要である。

生成したコロイドの安定性を増すため、生物学的に相溶
性の界面活性剤が添加される。生物学的な応用のための
界面活性剤には１例えば、ポリビニルピロリドンやポリ
エチレングリコールがある。

好ましい実施態様においては、界面活性剤の濃度は、　
　０．１ｍｇ／ｍ　１１から２　ｍｇ／ｍ　ｌである。

第一の方式においては、コロイド（コロイド状の生物学
的マグネタイトおよび鉄またはコバルト）中へ、生物学
的に相）容性のポリマーを結合させる手順が用いられう
る。コロイド状の生物学的マグネタイトは１前述の２つ
の方式に従って調製されうる。その時形成される付加コ
ロイドには２例えば、コバルトが使用される。第一の方
式では、コロイドが９表面のあら（ない化学物質で形成
されるため、多種の生物学的に相溶性のあるポリマーの
低濃度塩がコロイド中へ結合される。第一の方式におい
て、コロイド中へ結合するのに適当なポリマーは、第二
の方式における前述のポリマー（例えば、多糖類、糖タ
ンパク質のような一般のポリマー、レクチンのような他
のタンパク質）を含む。しかし、第二の方式では比較的
安価でかつ反応性の少ないポリマー（例えばアルブミン
）をまず結合させることが、最も経済的である。

金属磁性体の分散相表面にある生物学的な相溶性のポリ
マーを保持するため２次のような改良がなされている。

つまり、コーティングした表面を安定化するため１　こ
の生物学的に相溶性のあるポリマーは架橋される。事実
、架橋されたポリマーは網状構造となり、これが金属粒
子をとり囲む。

その結果、このポリマーは金属粒子から非常に離脱しに
くくなる。コロイドの凝集を妨げることなく、このポリ
マーを金属粒子に結合させるために。

様々な架橋方法が有効に利用されうる。架橋は。

グルタルアルデヒドを用いて多種の異なる生物学的に相
溶性のポリマーに対し行われる。さらに。

塩化シアヌル、水溶性カルボジイミド（例えば。

１−エチル−３−（３−ジブチルアミノプロピル）カル
ボジイミド（ＥＤＣＩ））も架橋剤として用いられうる
。

個々の分散相の粒子に、多種の生物学的に活性な高分子
を確実に供給し、そのことにより生物学的に好ましい組
成物が得られる。この高分子は。

生物学的に相溶性のある架橋ポリマー（これは個ｌの金
属核のまわりに巻きついている）と共有連鎖を介して付
着し得る。共有連鎖を形成するには。

様々な方法が用いられる。これらの方法は、上記機能を
得るためになされ、グルタルアルデヒド（架橋方法のと
ころで既述＞、ｐ−ベンゾキノン。

Ｎ、Ｎ−ジシクロへキシルカルボジイミド、ジＮ−ヒド
ロキシスクシンイミデルスクシナートなどが使用される
。生物学的に相溶性のあるポリマーと生物学的に活性な
高分子とは、異なる物質の使用が好ましい場合がある。

例えば、ある物質が金属粒子と結合可能であって、生物
学的に相溶性のポリマーとして適当であるのに対して、
別の物質は生物学的に望ましい活性を有し、それゆえ生
物学的に活性な高分子として適当である。

共有連鎖には、まず、コロイド粒子に付着する：あるい
はまず生物学的に活性な高分子に付着し。

それからコロイド粒子に付着する。の２つの作用がなさ
れ得る。このうち、上記高分子が共有連鎖をもって活性
化し、そのあとコロイド粒子に付着する方が好ましい結
果が得られる。

生物学的に活性な高分子（例えば、イミノグロブリン、
ポリサツカリド、レクチンまたは他の特殊なタンパク質
）は、ｐ−ベンゾキノンを含む多種の共有連鎖を用いて
活性化されうる。その手順は次の原理に基づいている。

つまり、過剰量のｐ−ベンゾキノンは、はぼ中性条件下
、その２つの活性部位のうち１つだけ高分子と反応する
。反応後、過剰のｐ−”、ンゾキノンは除去される。活
性化された高分子は、わずかにアルカリ条件下で。

続いて適当な添加物との反応に供される。ベンゾキノン
は、まず第１に、アミノ基またはスルフリル基と反応し
、またポリサツカリド混合物はもちろんタンパク質中の
他の活性基とも反応することが知られている。ｐ−ベン
ゾキノンまたは他の共存連鎖剤の使用は、以下の論文に
記述されている。

Ｓ、　八ｖｒａｍｅａｓ　　ｅｔ　　ａｌ　　　”　　
Ｃｏｕｐｌｉｎｇ　　ｏｆ　　Ｅｎｚｙｍｅｓ　　ｔ。

Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　　ａｎｄ　　　Ａｎｔｉｇｅｎ
ｓ　　”　　：　　ｉｎ　　５ｃａｎｄ、　　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　Ｖｏｌ、８．　５ｕｐｐ、７．　
７−２３．　　（１９７８）。

常に必須というものではないが、これら誘導体および試
薬から形成される生物学的に活性な接合体を分離するこ
とがしばしば必要とされる。単＾ＩＩされた接合体は何
の経緯をも与えず、未精製調剤にくらべると、活性物質
の数は小さくなるが、比活性はより大きくなる。これら
接合体の精製はゲル濾過カラム（蛋白と生物学的に活性
な高分子との分子量に依存する）を用いてなされる。

この生物学的磁性流体は貯蔵および輸送のために凍結乾
燥され得１かつ液体を加えることにより再度活性化され
る。好ましい一実施態様によれば。

凍結乾燥は少なくとも１０容■％の胎牛の血清を添加す
ることにより進められる。その粉末は水を添加すること
により復元されうる。

本発明により製造される生物学的磁性流体己こは多くの
用途がある。これらは細胞分７ｆｔ用に、放射処理用の
“ターゲット”としての薬品を的にするために、もしく
は動脈をブロックするために用いられうる。この磁性液
体に放射性マーカーを混ぜることが有利な場合がある。

これは鉄もしくはコバルト５７のようなコバルトの同位
元素を用いて行われうる。

個々のコロイド状磁性粒子に付着した生物学的に活性な
高分子はモノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗
体に結合されうる。これら抗体は癌細胞のような生物学
的に関係のある特異細胞を攻撃しそして付着する。該コ
ロイド力＜（磁性を有するために、細胞分離がなされう
る。例えば、癌に犯された骨髄細胞は正常細胞から磁性
により分離されうる。

金属塩溶液を還元剤で還元することにより調製された。

はう化物を高濃度で含有する生物学的磁性液体は、　（
人の骨髄の癌細胞のような）インビトロでの細胞混合物
から選択された細胞集団を被覆するべく用いられうる。

癌細胞もしくは他の細胞は、上記のように、コロイド粒
子上に付着された適当に特有なモノクローナル抗体によ
り選択されうる。これら細胞を注意深く洗浄して過剰の
（遊離の）コロイドを除去してのち、これら細胞はゼラ
チン（約１％濃度）のような適当な媒体に均等に拡散さ
れこれら細胞の沈降が阻止されうる。

これら細胞は次いで熱ニュートロンビームにさらされ、
それによりボロン原子が高エネルギーアルファ粒子を発
する。それにより、コロイド被覆細胞を殺す。他方、他
の細胞は生育し得そして無傷のままである。このように
して、骨髄は癌細胞もしくは他の細胞から除かれうる。

本発明で得られうる高濃度で拡散したボロン原子のゆえ
に、ボロンとニュートロンとの衝突の確率は大きく増大
するであろう。好ましい一実施態様では、各コロイド粒
子は少なくとも約５％ボロンであろう。これはコロイド
粒子光たり１００．０００１０Ｂモルでかつ細胞溝たり
５　×１０’＋　１０３モル（細胞溝たり５０，０００
コロイド粒子と計算される）の近くにあるであろうこと
を意味する。

赤血球ゴーストを作る技術は確立されている（例えば、
　Ｓｃｈｗｏｃｈ　＆　Ｐａｓｓｏｗ、　Ｍｏ１ｅｃｕ
ｌａｒ　＆　ＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ、　　Ｖｏｌ、２．　　Ｎｏ、２＋　　Ｐ、１９７−
２１８＋　　Ｄｅｃｅｍｂｅｒ１５、１９７３．　　こ
こに明確に記載されている。）。ヒトアルブミン磁性流
体は、該流体の形成直後に。

他の官能分子を共有連鎖することなく、赤血球ゴースト
用の充填剤として用いられうる。この流体と、薬品のよ
うな該流体への添加物もしくは放射性マーカーが赤血球
の懸濁液を濃厚磁性流体と混ぜることにより再封止され
た赤血球ゴースト内に混入されうる。

この混合物は次いで浸透圧の低いマグネシウム／トリス
イオン含有緩衝液で希釈され、これら赤血球を分離する
。これら赤血球は９次いでそのオスモラリティ　（その
溶液と同じ浸透圧を示す非会合物質の理想溶液のモル濃
度）を例えば塩化ナトリウムで生物学的レベルにもどす
ことにより、数分後に再封止される。これら細胞は次い
で磁性流体および）の添加物質をカプセル化し、そして
濃度勾配遠心分離のような種々の方法により分離精製さ
れうる。これら磁性赤血球ゴーストは、磁性法により身
体の医学的もしくは生物学的に望ましい部分に物質を輸
送すべく用いられうる。オートロゴスゴーストは身体に
より少なくとも最初は外来物と認識されないので、オー
トロゴスゴーストを用いると有利である。

（実施例） 以下に本発明を実施例について述べる。

実施例１ マグネタイトコバルート磁１生コロイドのＢ’ｌｄ　”
Ａ（ａ）蛋白質溶液中のコロイド状マグネタイトの形成
：塩化第二鉄（４０ｍｌ！、　ＩＭ）と塩化第一鉄（１
０ｍｌ！、　２Ｍ、　２Ｍ　ｔｌｃｌ中）との水性混合
液からつくられたマグネタイト流体（１２ｎｍ、マグネ
タイト粒子）を室温でアンモニア）容）・夜（５００ｍ
１１　、０．７Ｍ）にカロえる。ゼリー状の沈澱物を遠
心分離もしくは磁気デカンテーションで水洗せずに溶液
から分離する。

沈澱物を水性テトラメチルアンモニウムヒドロキシドに
コロイド状に分散させてアルカリ性第一鉄流体が得られ
る。沈澱物は混合液中の濃度が少なくとも１門もしくは
１８０ｍｇ／ｍ　ｅとなるまで加えられる。Ｆｅ（ＩＩ
）のＦｅ（ＩＩ）に対する重量比が２より大きい場合に
のみゾルが得られる。

磁性流体を生物学的に相溶性のあるポリマーの低濃度塩
（３０ｍｇ／ｍ　Ａ　（３％）ヒトアルブミン５０ｍｊ
２；イリノイ州ディアフィールドのバクスター　トラヘ
ノールから入手）に徐々に加える。アルブミンはｐｌ＋
約９．５となるまで加えられる。このようなｐｆｌにお
いては水素化ホウ素ナトリウムによる還元が好適に行わ
れうる。わずかに凝集のある深褐色の溶液が得られる。

この溶液を４°Ｃで１夜放置する。

溶液を約１０００８’　ｓにて２０分間遠心分離し、低
ン層度で蛋白の結合した０、２２ミクロンのフィルター
で濾過した。水を加えて容量を５０ｍ７！とし１得られ
たものを４°Ｃで保存した。

（ｂ１粒子表面でのコバルト／ホウ化物の成長と不動態
化：（ａ）項で得られた溶液５０　ｍｌにＩＭの水素化
ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ＝＞　３００μｌを室温以
上の温度で混合する。新たに調製した塩化コバルト？容
ン夜１５０μｊｌ！　　（０，５ＭのＣｏＣＩｚおよび
０．５Ｍのクエン酸ナトリウム、容積比３：２）を加え
て速やかに混合する。これを５分間放置し、　　１Ｍ水
素化ホウ素ナトリウム１　　ｍｌを加えて混合する。

塩化コバルト／クエン酸ナトリウム溶液２　ｍｅをさら
に上記と同様に加えて混合する。但し、今回は放置時間
を１５分とする。

酸化を防止するために１重クロム酸カリウムを最終濃度
が１５ｍＭとなるように、そして塩化亜鉛を５ｍＭとな
るように加える。生物学的に安全な界面活性剤としてポ
リビニルピロリドン（Ｐ　Ｖ　Ｐ）（分子量４０，００
０）を１■／ｍｊ！の割合で加える。このような界面活
性剤はコロイドの安定性を増す。

コロイドを３０μｍの薄膜を有するタンジェントフロー
アミコン（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ　ｆｌｏｉｎ　ＡＭＩ
ＣＯＮ）を用いて限外濾過を行い約１５ｍｊ２とする。

コロイドを次に０．２２μのフィルターを用いて濾過し
、１０ｍＡの分別物をゲル濾過カラムにかける。好適な
ゲル濾適用ビーズとしてはセファロースＣＬ　６Ｂ（２
５０ｍ　ｌ！　）があり、そして好適なカラムの大きさ
は３．５ｃｍφ×２０ｃｍである。ゲルはＰＶＰ（１０
ｍＭのＮａＨＣＯ３中に１ｍｇ／ｍＡ）により平衡化す
る。

（Ｃ）表面被覆を安定化させるだめのアルブミンの架橋
：コロイドのｐＨはリン酸緩衝液を用いて６．８に調整
する（２００ｍ＃中に最終濃度５０ｍＭ　）。次に、１
．５％のグルタルアルデヒドを加え、得られたものを室
温に１８時間放置する。その後５０ｎｍの限外濾過膜を
用い限外濾過を行い１０〜１５ｎ＋ｊ２とする。

Ｃｄｌ高分子の共有連鎖の形成：免疫グロブリン（ヤギ
の抗マウス免疫グロブリン；インディアナ州インディア
ナポリスのヘーリンガーマンハイムバイオケミカル社よ
り人手）をｐ−ベンゾキノンで活性化する。１ｍｇの免
疫グロブリンを含む０．４ｍｊ２の０．１４リン酸塑衝
液（ｐＨ６，０）にｐ−ベンゾキノンの９５％エクノー
ル？容ン（１（３０ｍｇ／ｍ　Ｅ　）を０．１ｍ＃加え
る。その溶液を暗所に１時間保つ。その後。

０．１５Ｍ　ＮａＣｌで平衡化された微粒のセファデッ
クスＧ−２５カラム（０，９ＣＩｌφＸ４ｃｍ）で濾過
する。最初に溶出する色のついたフラクションは活性化
蛋白を含み、約１　ｍｌ得られる。　１７１０モル容量
のＩ　Ｍ　ＮａＨＣＯ３をベンゾキノンで活性化された
免疫グロブリンに加える。得られた混合物を０．１ＭＮ
ａ１ｌＣＯ：＋　／ＮａｚＣＯ：＋　（ｐＨ９，０）中
の濃縮コロイドに加える（１■の蛋白１５ｍｊ２のコロ
イド）。得られた液体を４“Ｃで４８時間放置する。こ
れを次にゲル濾過カラム（ｐｆｌ　７．４．食塩を含む
リン酸緩衝液で平衡化したセファロースＣＬ　６Ｂ）に
かけ、　０．２２μの低蛋白結合フィルターを用いて無
菌的に濾過した。

実施例２ コロイド状マグネタイト／コバルト液体の別の形成法：
実施例１（ａ）〜（Ｃ１項に概略が説明された方法によ
り行う。ただし、共有連鎖はｐ−ベンゾキノンでコロイ
ドを活性化して形成しうる。これはコロイド（１０ｍ６
の分別部分）をゲル濾過カラムにかけることによりなさ
れる。ゲル濾過カラムとしては、セファロースＣＬ　６
Ｂを２５０ｍｎ充填し。

１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）中に１　ｍｇ／ｍ
ρのｐｖＰを含む溶液により平衡化したものを用いる。

リン酸緩衝液でｐＨを６に調整し、最終濃度を５０ｍＭ
とする。ｐ−ベンゾキノンの９５％エタノールン容液（
３０ｍ８／ｍ　Ａ’　）を１７４容量加え、得られた混
合物を時々攪拌しながら１時間暗所に保つ。生成物を１
０ｍＭのＮａＨＣＯ，で平衡化したカラムにかけ２次に
限外濾過に付して約１Ｏｎ＋ｊ２に濃縮する。ｐＨを９
に調整し。

コロイドがＮａ１１ＣＯ，／Ｎａ２ＣＯ３緩衝液中にＯ
，１Ｍとなるようにする。濃縮されたコロイド５ｍβあ
たりｌｎｗの濃度で免疫グロブリンを加える。これを４
℃で４８時間放置し、結合させる。その後１食塩を含む
リン酸緩衝液で平衡化されたゲル濾過カラムにかける。

実施例３ ポウ化物高含量磁性流体の形成：低塩濃度ヒトアルブミ
ン５０　ｍｌ　（３０ｍｇ／ｍ　Ｒ）に１ｈ水酸化ナト
リウム３００μβを加える。これに新たに調製したコバ
ルト溶液（０，５Ｍ塩化コバルトおよび０．５Ｍクエン
酸ナトリウム；容量比３：２）１５０μｌを速やかに混
合する。その液体を５分間放置した後。

１門水酸化ナトリウム１ｌＴ１１を混合する。さらに塩
化コバルト／クエン酸ナトリウム混合液２　ｍｊ２を加
えて混合する。

この液体を１５分間放置した後、実施例１で論じたよう
に重クロム酸カリウムおよび塩化亜鉛およびポリエチレ
ングリコール（ＭＷ　２０，０００＞を加えることもで
きる。限外濾過とゲル濾過もまた実施例１で述べたよう
に行うことができる。

災施奥土 種々の骨髄細胞の分離：実施例１，２または３に従って
調製されるコロイドは、骨髄細胞を癌に侵された細胞と
癌に侵されていない細胞とに分離したりグラフト−バー
サス−ホスト病（ｇｒａｆｔｖｅｒｓｕｓ　ｈｏｓｔ　
ｄｉｓｅａｓｅ　）の原因となる細胞を除去するのに用
いられうる。これは、提供者から通常の麻酔下で腸骨の
稜から複式吸引によって骨髄細胞（１，０００ｃｃ）を
集めることにより行われうる。この細胞は１０°Ｃ以下
で保存されなければならない。

細胞はｈｅｍｏｎｅｔｉｃ　ｃｅｌ１分離機または傾斜
遠心分離機にかけられ、顆粒白血球と赤血球とが除かれ
る。グラフト−バーサス−ホスト病の原因となる細胞を
除去するには、細胞はマウスモノクローナル抗体（ＣＴ
−２）と４℃で４５分間インキュベートされる。このＣ
Ｔ−２抗体はＥ−ロゼノトリセプター陽性リンパ細胞（
Ｔ−細胞）と反応する。このＣＴ−２抗体、つまり、パ
ンニー細胞モツクローナル抗体、についてはＪ、　Ｃｅ
１ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　７八（補遺）：５７、１９８
３．でＭ、　Ｔｒｉｇｇ、　Ｒ，ＢＢｌｌｌｉｎ　らに
よる論文！’　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
　ｏｆ　Ｄｏｎｏｒ　Ｂｏｎｅ　Ｍａｒｒｏｗｗｉｔｈ
　　Ａｎｔｉ　　Ｅ−ｒｏｓｅｔｔｅ　　Ａｎｔｉｂｏ
ｄｙ　　ａｎｄ　　ＣｏｍｐｌｅｍｅｎｔＰｒｉｏｒ　
ｔｏ　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｏｎ”　の中で述べられ
ている。この生成物は遠心分離によりＨＨＢ　Ｓ　（ｌ
ｌｅｐｅｓｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｈａｎｋｓ　ｂａｌａｎ
ｃｅｄ　５ａｌｔ　５ｏｌｕｔｉｏｎ）？９液（ｐＨ７
，４）にて３度洗浄される。この溶液には２容量％の胎
牛血清（ＦＢＳ）が含まれている。

細胞を再分散させた後、アフィニティ精製したヤギ抗マ
ウス抗体免疫グロブリン画分と４°Ｃで６０分間インキ
ュベートする。このヤギ抗マウス抗体は、１０容量％の
胎牛アルブミンを用いて実施例１の方法により磁性流体
に結合されている。４°Ｃで６０分間永久磁石を用いて
磁性分離を行い、抗体コロイド被覆細胞を除去する。ま
たは、磁性チャンバーを通過する流れが２容量％のＦＢ
Ｓを含むＨＨＢ　Ｓ　（ｐＨ７，４）と共に用いられう
る。このチャンバーはコバルト−サマリウムのＵ字型永
久磁石を積み重ねてつくられうる。この磁石は８，５０
０ガウスの磁力を生ずる。個々の磁石は凹形極面と内部
溝とを備え１通過中の細胞に磁性勾配を集中させる。磁
性ワイヤーのコイルまたは網は、Ｕ字型磁石により生ず
る間隙中に保持されるケイ素ガラス（ｓｉｌｉｃｏｎｉ
ｚｅｄ　ｇｌａｓｓ）中に含まれる。細胞はケイ素チュ
ーブを通ってチャンバーの中を流れる。

残余の細胞はデカンテーションにより除去される。得ら
れたものは、ＨＨＢＳ溶液で洗浄され。

細孔の大きさが４０〜８０μであるグラスフィルターを
用いて濾過される。そして、　Ｈａｎｋｓ　ｂａｌａｎ
ｃｅｄｓａｌｔ　５ｏｌｕｔｉｏｎ　’ｌ容？夜で洗浄
される。この／夜体はインビトロでのプロゲナイター試
験および分＾１を効果測定のためにサンプリングされる
。細胞が静脈注射のために３０分にわたって集められる
。

分離の手順から漏れたモノクローナル抗体反応性細胞は
種々の方法で検知される。免疫螢光法は。

フレオレセインでラヘルした第２抗体例えばヤギの抗マ
ウス免疫グロブリンに用いられ、またコロイド結合抗体
と反応性を有しフレオレセインでラヘルした第３抗体例
えばウサギの抗ヤギ免疫グロプリン、にも用いられる。

さらに、白血病細胞は。

ラベルされていない正常骨髄細胞との混合物の分離に先
立って、培地中で放射性にラベルされる。

クローン原性の白血病細胞は分離後培地中で生育する。

最後に、動物（ラットまたはマウス）の白血病を用いた
生物学的モデルが用いられ、それにより、ひとつの生存
しうる残余の白血病細胞さえも検知されうる。

抗体反応性細胞は免疫螢光の限界値まで除去された（そ
の残余量は１％より小さい）。抗体陰性細胞の回収は５
０％以上であった。

本発明は限られた数の実施態様について述べられたが、
当業者によれば多くの改良・改変がなされるであろう。

そのような改良と改変はすべて特許請求の範囲内に入る
ことはいうまでもない。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、液体分散媒中に分散された磁性コロイド分散相を有
   し、該分散相が架橋した生物学的に相溶性のあるポリマ
   ーで被覆された磁性微粒子を含有する生物学的磁性液体
   。 ２、前記磁性粒子が実質的成分としてマグネタイトを含
   有する特許請求の範囲第１項に記載の液体。 ３、前記粒子が実質的成分としてコバルトを含有する特
   許請求の範囲第１項に記載の液体。 ４、前記粒子がボロンを含有する特許請求の範囲第１項
   に記載の液体。 ５、前記磁性粒子がコバルトおよびボロンを含有する特
   許請求の範囲第１項に記載の液体。 ６、前記生物学的に相溶性のあるポリマーが生物学的ポ
   リマーである特許請求の範囲第１項に記載の液体。 ７、前記ポリマーがヒトアルブミンである特許請求の範
   囲第６項に記載の液体。 ８、前記液体分散媒が水溶液である特許請求の範囲第１
   項に記載の液体。 ９、前記液体分散媒が生理食塩から実質的に形成される
   特許請求の範囲第８項に記載の液体。 １０、液体分散媒中に分散された磁性コロイド分散相と
   界面活性剤とを有し、該分散相が架橋した生物学的に相
   溶性のあるポリマーで被覆された磁性微粒子を含有する
   生物学的磁性液体。 １１、前記界面活性剤がポリビニルピロリドンである特
   許請求の範囲第１０項に記載の液体。 １２、前記界面活性剤がポリエチレングリコールである
   特許請求の範囲第１０項に記載の液体。 １３、前記架橋した生物学的に相溶性のあるポリマーに
   共有連鎖剤が連結した特許請求の範囲第１項に記載の液
   体。 １４、前記共有連鎖剤を介して抗体が連結された特許請
   求の範囲第１３項に記載の液体。 １５、前記共有連鎖剤がｐ−ベンゾキノンである特許請
   求の範囲第１３項に記載の液体。 １６、磁性粒子を被覆した前記生物学的に相溶性のある
   ポリマーに、前記共有連鎖剤を介して、生物学的に活性
   な高分子が付着された特許請求の範囲第１３項に記載の
   液体。 １７、液体分散媒中に分散された磁性コロイド分散相を
   有し、該分散相が生物学的に相溶性のあるポリマーとコ
   バルトと適宜他の磁性金属とを有する磁性粒子を含有す
   る生物学的磁性液体。 １８、前記生物学的に相溶性のあるポリマーがヒトアル
   ブミンである特許請求の範囲第１７項に記載の液体。 １９、前記液体分散媒が水溶液である特許請求の範囲第
   １７項に記載の液体。 ２０、前記磁性粒子が実質的成分としてマグネタイトか
   らなる特許請求の範囲第１７項に記載の液体。 ２１、前記磁性粒子がボロンを含有する特許請求の範囲
   第１７項に記載の液体。 ２２、前記磁性粒子が少なくとも約５％ボロンを含有す
   る特許請求の範囲第２１項に記載の液体。 ２３、（ａ）生物学的に相溶不可能のコロイドを形成す
   る工程、および （ｂ）該コロイドを実質的な凝集を避けるために生物学
   的ポリマーの低濃度塩液にゆっくり添加し、生物学的に
   相溶性のあるコロイドを形成する工程 を包含する生物学的磁性液体の製造方法。 ２４、前記液体をトランジェントフロー限外濾過に供す
   る工程を包含する特許請求の範囲第２３項に記載の方法
   。 ２５、前記生物学的に相溶性のあるポリマーを架橋する
   工程を包含する特許請求の範囲第２３項に記載の方法。 ２６、前記生物学的に相溶性のあるポリマー上に共有連
   鎖を形成しコロイド粒子を生物学的に活性な高分子に固
   着させる工程を包含する特許請求の範囲第２３項に記載
   の方法。 ２７、抗体を免疫グロブリンにより前記共有連鎖に連結
   させる工程を包含する特許請求の範囲第２６項に記載の
   方法。 ２８、前記免疫グロブリンが適当な連鎖で活性化され、
   付着した該連鎖で活性化された該免疫グロブリンが次い
   で磁性コロイド粒子に連結される特許請求の範囲第２７
   項に記載の方法。 ２９、前記生物学的コロイドに、還元剤および磁性金属
   塩溶液を添加する工程を包含する特許請求の範囲第２３
   項に記載の方法。 ３０、胎牛の血清を加える工程そして前記磁性液体を凍
   結乾燥する工程を包含する特許請求の範囲第２３項に記
   載の方法。 ３１、磁性金属塩溶液を還元剤と混ぜて生物学的に相溶
   性のあるポリマーの低温度塩存在下でコロイドを形成す
   る工程を包含する生物学的磁性液体の製造方法。 ３２、前記磁性金属塩溶液が実質的成分としてコバルト
   を含有する特許請求の範囲第３１項に記載の方法。 ３３、前記還元剤がボロンを含有する特許請求の範囲第
   ３１項に記載の方法。 ３４、前記生物学的に相溶性のあるポリマーが生物学的
   ポリマーである特許請求の範囲第３１項に記載の方法。 ３５、錯化剤を加えてコロイドの生成を遅くする工程を
   包含する特許請求の範囲第３１項に記載の方法。 ３６、前記コロイドの粒子表面を不動態化する工程を包
   含する特許請求の範囲第３１項に記載の方法。 ３７、生物学的界面活性剤を添付する工程を包含する特
   許請求の範囲第３１項に記載の方法。 ３８、前記コロイドを限外濾過する工程を包含する特許
   請求の範囲第３１項に記載の方法。 ３９、前記磁性金属塩と前記還元剤とが一段より多い離
   散段階にて混合される特許請求の範囲第３１項に記載の
   方法。 ４０、前記還元剤および前記磁性金属塩が二段の離散段
   階において加えられる特許請求の範囲第３９項に記載の
   方法。 ４１、前記生物学的に相溶性のあるポリマーを架橋する
   工程を包含する特許請求の範囲第３９項に記載の方法。 ４２、前記生物学的に相溶性のあるポリマー上に共有連
   鎖を形成する工程を包含する特許請求の範囲第３１項に
   記載の方法。 ４３、抗体を免疫グロブリンにより前記共有連鎖に連結
   することを包含する特許請求の範囲第４２項に記載の方
   法。 ４４、前記免疫グロブリンが共有連鎖により活性化され
   、そして付着した該連鎖で活性化された該免疫グロブリ
   ンが次いで磁性コロイド粒子に連結される特許請求の範
   囲第４３項に記載の方法。 ４５、生物学的に活性な高分子に付着した前記共有連鎖
   が前記生物学的に相溶性のあるポリマーに付着される特
   許請求の範囲第４２項に記載の方法。 ４６、前記液体が少なくとも１０容量％の胎牛の血清と
   の混合物中にて凍結乾燥される特許請求の範囲第３１項
   に記載の方法。 ４７、架橋した生物学的に相溶性のあるポリマーで被覆
   された磁性コロイド粒子を有する凍結乾燥された生物学
   的磁性コロイド。 ４８、凍結乾燥された胎牛の血清を含む特許請求の範囲
   第４７項に記載のコロイド。 ４９、コバルトと生物学的に相溶性のあるポリマーとで
   被覆された磁性コロイド粒子を有する凍結乾燥された生
   物学的磁性コロイド。 ５０、凍結乾燥された胎牛の血清を含む特許請求の範囲
   第４９項に記載のコロイド。