JPS6184557A - 血液分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一般に、遠心分離で分離された多相液体試料の
、より重い相をより軽い相から分離する方法及び装置に
関する。より詳細には、本発明は血液試料中の顆粒細胞
および赤血球から、血小板、白血球および単球を分離す
る方法及び装置に関する〇 一般に血液の分析には詳細な分析のための白血球の単離
および分離を必要とする〇一般に、白血球の分離のため
には、二つの異なる方法が使用されている。これらのう
ちの一つは、特にニュートン性の液体中での細胞の浮遊
密度遠心分離法である。最も一般に使用される液体は、
フィコール−パック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ）の名
で知られる、スウェーデン、ウプサラのファルマシア・
ファイン・ケミカルスＡＢから市販されている、比重１
．０７７、！７　／ｃ　ｃの水溶性液状物である。第二
の方法は、非ニユートン性、水不溶性、チキントロピー
性のゲル様物質であって、リンホサイト（白血球）を含
む軽い相と赤血球および顆粒球を含む重い相との間に、
容器内に沿って連成的半固体ゲル様シールを形成する物
質を使用することである。

上記「フィコール−パック」法は次の一般的方法による
： （１）　　所定量のフィコール−パンクを、試験管のよ
うな遠心分離に適する容器の底部へ注加し、（２）全血
又は希釈血のサンプルを注意深くフィコール−パック上
にピペットでのせ、 （３）次に、フィコール−パック／血液を約４００ｇで
約３０分間遠心分離して、血液成分を層分離させ、白血
球を含む単核細胞層よりなる上部の軽い相とフィコール
−パック中に移動もしくはそれｔ通過して移動する赤血
球および顆粒球を含む底部の重い相とを形成させ、 （４）上部血漿層をピペットで取り除き、後にフィコー
ル−パック表面上の白血球層を残し、（５１ａ浄なパス
ツールピペットａ’用いて白血球層乞清浄な遠心分離管
へ移す。

しかし、フィコール−パック法はいくつかの欠点を有す
る。第一に、作業者に非常に細かい技術が要求される。

もし、最初の血液サンプルの導入において、注意が欠け
ると、白血球がフィコール−パック基質の表面より下側
に拡散し、フィコール−パックの局部的比重を減少させ
、白血球および単核球の分離？不十分とする。

第二Ｋ、フィコール−パックの表面から白血球層を洗浄
のために漬浄な遠心管に移す際にも注意深い技術を要す
る。この移し変えの際にはフィコール−・４ツクの移動
乞最少限に抑えながら全ての界面部乞移動させることが
重要なためである。

第三に、遠心分離中に血液中の軽い相がフィコール−パ
ンク基質中に入り込むと、その後この基質中７上昇する
ことはできない。これは、約４００１という低い遠心力
を使用するため生じろ遠心力が低いことによる。

第四に、約４００！Ｉより大ぎな遠心力を使用すること
は出来ない。この理由は、フィコール−パックは水溶性
であり、遠心力を強めると血液サンプル中への溶解性が
大きくなり、フィコール−パックの比重が変化して分離
効率の実質的変化が生じるためである。

第五に、この方法は終了まで１ないし２時間を必要とす
る。より迅速な方法が切望されて（・る。

より迅速な方法は、白血球？含む軽い相と赤血球及び顆
粒球を有する重い相との間にバリヤーを形成させる、非
ニユートン性、水不混和性、チキントロピー性のゲル様
物質（以下、単にゲル様物質と略称する）の使用により
達成される。この方法はルデレール（Ｌｕｄｅｒｅｒ）
の米国特許第４，１９０゜５３５号、ザイネ（Ｚｉｎｓ
）の米国特許第３，８５２゜１９４号、ベネノト（Ｂｅ
ｎｎｅｔｔ　）の米国特許第４゜１４７．６２８号、ケ
スラー（Ｋｅｓｓｌｅｒ）の米国特許第４．３５０，５
９３号およびケスラーの米国特許第４．１５３，７３９
号に記載されている。ゲル様物質を軽い相と重い相との
間にバリヤー層を設けるために使用することは、フィコ
ール−パック法に比べて軽い相および重い相を分離する
だめのより迅速且つ容易な方法χ一般に提供する。しか
しながら、血液分離手段におけるゲル様物質の使用にも
短所がある。最も重大な短所は、遠心分離後にゲル様る
。したがって、血液サンプルを白血球及び単核球７含む
軽い相と、赤血球および顆粒球７含む重い相から分離す
るだめの、迅速で且つ後読の分析のために混在物のない
白血球成分のみを提供しりる方法および装置の出現が望
まれていた。

本発明は、フィコール−パック法より迅速で、チキント
ロピー性ゲル様物質を単独で使用する方法よりも分離性
の優れた、血液サンプル中の白血球および単核球を赤血
球および顆粒球から分離する方法である。

最も広い範囲において、本発明の方法は、次の一般的工
程よりなる： （１）フィコール−パックのような水溶性密度勾配物質
を遠心分離に適する開口容器に添加する。

（２）前記のような非ニユートン性、水不溶性、チキン
トロピー性のゲル様物質のような水不溶性ゲル様物質ｔ
、上記容器の水溶性密度勾配物質の上に添加する。

（３）血液サンプルをこの容器に加え、これをフィワ コールーパンク法におけるよう若干高い遠心力で遠心分
離し、この間にゲル様物質と水溶解性密度勾配物質によ
るバリヤーを重い血球細胞と経い血球細胞の間に形成さ
せ、そして （４）血液の血漿分画？バリヤー層の上部から取り除き
、白血球、単核球および血小板を含有する層乞後に残し
、これを次の分析に用いるため容易に回収する。分離操
作の間、赤血球および顆粒球を含む重い血液分画はバリ
ヤー層を通過して、容器の底に集められろ。

本発明の重要点は、血液の重い細胞が、水溶性密度勾配
物質を通過する際、血液中の血゛漿の少量を伴って移動
することである。このため、水浴性密度勾配物質の一部
が希釈され、この希釈物は遠心分雛中にゲル様物質中を
通過上昇して、ゲル様物質の上部で単核細胞の下部に水
溶性密度勾配物質中間層乞形成する。この水溶性密度勾
配物質中間層は、ゲル様物質の層の下方に横たわる水溶
性密度勾配物質の大部分と協力して、単核細胞層の大 猥雑から効果的に顆粒球細胞乞隔離するために役立つ。

これにより、顆粒球による混在なしに単核球細胞が一層
きれい且つ一層効果的に分離できる。

ゲル様物質の組成または混合は厳密でなくてよい。

本発明の方法においては水不混和性、チキントロピー性
、ゲル様物質について記載された任意の先行技術組成物
を使用できろ。例えば、米国特許第４、１９０．５３５
号はシリコン流状物と非常に微細な疎水性シリカ粉末の
混合物の使用によるゲル様物質の提供につき記載してい
る。この特許明細書には、アモコ　ケミカル　コーポレ
ーション（Ａｍ。

ｃｏ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　）
シカゴ　イリノイから市販され、同社の技術情報（ｂｕ
ｌｌｅｔｉｎ　）１２−１１に主として高分子量モノ−
オレフィン（８５−９８％）よりなり、残部はイソパラ
フィンであるブチノン　ポリマーとして記載されている
ポリブタン１１−１００乞炭化水素系ゲル様物質として
使用することも記載している。このポリブチレンをヒユ
ームドシリカ粉末と混合して、水不混和性、チキントロ
ピー性のゲル様物質暑製造している。他に有用なものは
重合度が約５０のヒドロキシ末端ブタジェンホモポリマ
ーである。これをヒユームドシリカ粉末と混合して適す
る水不混和性−チキントロピー性のゲル様物質を得る。

ゲル様物質として使用するに好ましい物質は、ケスラー
（Ｋｅｓｓｌｅｒ）の米国特許第４，３５０，５９３号
に記載されているような、ポリエステルであろ０特に好
ましいものは、エメリー　インダストリー社から市販さ
れているポリエステルである単一成分ポリエステル＃Ｎ
Ｂ　２０４２−１０８である。このポリエステル組成は
適当な比重を得るためにシリカ粉末と混合する必要がな
いため本発明のゲル様物質としての使用に特に好ましい
。シリカ粉末の使用は、フローサイトメトリー装置のよ
うなある種の装置で、回収した白血球？分析するために
は、有害であることが判明して℃・ろ。従って、適する
比重７有するポリエステルの使用が好ましい。

一般に、ゲル様物質は次の要件に合致する必要がある。

（ａ）　　ゲル様物質は、単核細胞の比重と顆粒球およ
び赤血球の比重の中間の比重を有する必要がある。

一般に、ゲル様物質の比重は約１．０７乃至約１．８５
９／ｃｃ、好ましくは約１．０７５乃至約１．０８ｇ／
ｃｃ。

最も好ましくは１．０７７　ｙ／ｃｃである；（ｂ）　
　ゲル様物質は、血液中に存在する成分に対して化学的
に不活性で有ることを必要とする；（ｃ）　　ゲル様物
質はチキントロピー性であ、る。即ちこの物質は、分離
操作で使用される遠心分離力下で流動性であって遠心分
離後にバリヤーを形成しなければならない。

水溶性密度勾配物質は、好ましくはフィコール−バック
タイプの物質である。フィコール−パックは、フィコー
ル−４００とナトリウム・ジアドリゾエート（ｄｉａｔ
ｒｉｚｏａｔｅ　ｓｏｄｉｕｍ）の水溶液である。フィ
コール−４００は、蔗糖とエビクロロヒドリンとの合成
高分子（平均分子量４０００）ポリマーであり、水に容
易に溶けろ。フィコール−４００の分子は高度に枝分か
れ゛しており、はぼ粒状であり、同一分子量の線状ポリ
サンカライドに比べて低い固有粘度を有する。ナトリウ
ム・ジアドリゾエートは、低粘度および高見・密度の溶
液を形成するからフィコール−４００とともに使用する
ために都合よい化合物である。ナトリウム・ジアドリゾ
エート（分子量６３５．９２）は３．５−ジアセタミド
ー２．４．６−ドリヨード安息香酸のすトリウム塩であ
る。フィコール−パックの比重は、フィコール−４００
の中に含まれるナトリウム・ジアドリゾエートの量乞変
化させて調節することができる。フィコール−パックは
各１ＯＯａ中に５．７ｇのフィコール−４００と９！Ｉ
のナトリウム・シア）　ＩＪシェードを含有する。本発
明に使用するには、フィコール−パックの比重は約１．
０８乃至約１．１ＯＯｙ／ｃｃ　　の範囲に調節するこ
とか好ましく、更に好ましいのは約１．０８５乃至約１
．０９５、最も好ましいのは１．０９０！１／Ｃｃであ
る。

本発明で使用するために、約５．７！！乃至６．０ｙの
フィコール−４００および約１１．０！１乃至約ｉ２．
ｏｙのナトリウム・ジアドリゾエートを含有する水性溶
液が水浴性密度勾配物質の使用に適する。

本発明の方法は、通常の開口採血チューブおよび血液サ
ンプルの挿入のための針で刺通可能な隔壁で口部が閉じ
られた採血チューブのどちらにも有用であるＯ開ロチェ
ープ系においては、ゲル様物質および水浴性密度勾配物
質乞、任意の順序でチーープ中に適当な量で添加する。

例えば、７ｒｎｌ試ｊ験管におけろゲル様物質の過当量
は約１２ｇであり、水溶性密度勾配物質の適当量は約ｔ
、ｏｙである。これにより、約５ｍｌ迄の血液サンプル
を分離可能である。フィコール−パック法で要求された
血液サンプルの注意深い重層の問題を避けろため、ゲル
様物質および水溶性密度勾配物質を含有する採血試験管
は、血液サンプル添加前に予備−遠心分離しておく必要
がある。予備−遠心分離は水溶性密度勾配物質を試雀管
の底に移動させ、ゲル様物質が水溶性密度勾配物質の上
面にバリヤーを形成させろ。次いで、血液サンプルを特
別注意すべき技術を要せずに採血試験管に挿入出来る。

サンプルを採血試験管の水溶性密度勾配物質の上面に添
加した後、採血試験管を適当な加重で適当な時間遠心分
離する。通常、約６００．９から約２０００１の遠心加
重を使用して、約２０ないし約５分間行う。

第１図に示す通り、予備−遠心分離の後、採血試験管１
５中の水溶性密度勾配物質１３の上面にゲル様物質１１
がバリヤー乞形成する。血液サンプル１７を第２図に示
す通り、ゲル様物質１１のバリヤーの上面に重層する。

遠心分離の後、血液サンプルは第３図に示す通り、数層
に分離する。

赤血球１９は最も底に層となる。顆粒球の層２１は赤血
球１９の上に存在する。水溶性密度勾配物質の大部分は
顆粒球２１の上部に存在する。前記のとおり、赤血球は
水溶性密度勾配物質の層を通過して移動するとさ少量の
血漿を一緒に運ぶ。このため、水溶性密度勾配物質の一
部分の比重が若干減少し、これが遠心分離中にゲル様物
質のバリヤー層を通過して移動し、第３図に示す通り、
水溶性ぞ度勾配物質の少量部分の層２３を形成する。

白血球、単核球および血小板の層２５は比重の減少した
水溶性密度勾配物質１３の層２３の上に存在する。血漿
２７が最上部の層である。

次いで、血小板、白血球および単核球の層２５乞水溶性
ぞ度勾配物質の層２３の表面上に乱れのないよう残すよ
うにして、血液の血漿部分ケ取り除く。通常の方法とし
ては、パスツールピペットを使用して、血漿ｊ＝Ａ　２
７　ｗ除去し、白血球、単核残す。

次〜・で、白血球、単核球および血小板の層２５乞、次
の二つの方法のいづれかで取り出すことができる。一つ
の方法では、パスツールピペットヲ使用して、層２５を
清浄な遠心分離チューブに洗浄のために移す。ぺつの方
法では、単核球細胞および血小板の層２５の上に直接緩
衝化塩＄液乞注加することができろ。ゲル様物質の層１
１が、緩衝化塩類液と顆粒球および赤血球との相互作用
を防止する。次いで単核細胞をバリヤー層１１の頂部か
ら取り出すために、単に緩衝化塩類液および単核細胞の
混合物乞採血試験管１５がらηｃし吊すことができる。

枳 以下の実施例及び比Ｎ例により、本発明？：ざらに説明
するが、この実施例は限定的なものと解すべきではない
。

比較例１ 血液サンプルの一定量乞密度１．０７７　ｇ　／ｍｉ！
　Ｙｊ、）持つポリエステル系チキソトロピーゲルの上
面に重層した。９００ＸＧで１０分間遠心分離乞行った
。

血漿乞サイフオンで除いて緩衝化塩類ｉを加え、泡だて
およびピペット操作で細胞に穏やかな乱れを与え、細胞
を収穫した。単核細胞の収量は８４チそしてこの単、核
細胞のなかの顆粒球の混在量は１０．２８係であった。

比較例２ 等量の緩衝化等張塩類液で希釈した血液サンプル（血液
サンプル２′ｆｆＬｌ十緩衝化塩類液２成）の一定ＭＹ
使用して比較例１の方法をくりかえした。

単核球細胞の収量は理論量の６４％であり、顆粒球の混
在率は３．２５％であった。

実施例１ 血液サンプル中の単核細胞を単離するために本発明の方
法を使用した。７ｍｌ試験管中に１．０７７ダ／ｒｎｌ
のチキントロピー性ポリエステルのゲルを１．２．！７
加えた。この試験管中にシーークロースホＩＪ　マー　
５．８　ｙおよび水に溶解したナトリウム・ジアドＩＪ
シェードｌｏ１ｇ含んだ密度勾配物質１．０ｇを添加し
た。試験管を予備遠心分離して密度勾配物質の上部にゲ
ル物質のバリヤー層を形成させた。このゲルバリヤー層
の上面に血液サンプルの一定量を乗せた。９００ＸＧで
１０分間遠心分離を行った。血漿？サイフオンで除去し
て、緩衝化塩類液を加え、泡立ておよびピペット操作に
よって細胞に穏やかな乱れ乞与え、細胞乞収穫した。単
核球細胞の収量は８０％であり、顆粒球の混在量は１．
６５　％であった。

実施例２ 一定量の血液サンプルを緩衝化等張塩類液の等量で希釈
した以外は実施例１と同様の試験を繰り返した。単核細
胞の収量は６０チであり、顆粒球の混在率は１．９４％
であった。

実施例３ ５人の別々の患者からの血液サンプルについて、実施例
１の方法ビアイコール−パック密度勾配法と比較した。

第１表に平均収量と分析の実施に要した時間を示す。

第　　１　　表 結　果　　　　　　実施例１の　　フィコール方法　　
−パック法 単核細胞の収量　　　３６，４チ　　　３６．５係順粒
球　　　　１．８８チ　　１．１０％希釈段階（分）　
　　０分　　　　０分試験管の用意（分）　　０分　　
　　　３分血液の重層（分）　　　３分　　　　　３分
遠心分離　　　　　１５分　　　４０分

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の水不溶性密度勾配物質および水溶性
密度勾配物質の入った血液採取試験管を示す図であり、 第２図は、遠心分離前に血液サンプルを添加した後の第
１図の血液採取試験管７示す図であ弘第３図は、サンプ
ル乞遠心分離した後の第２図の血液採取試験管７示す図
である。 １１・・・・ゲル様物質 １３・・・・水溶性密度勾配物質 １５・・・・試験管 ２１・・・・顆粒球 ２３・・・・水溶性密度勾配物質の少量部分の層２５・
・・・白血球、単核球および血小板の層２７・・・・血
漿 ＝　　　１

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ａ）閉じた末端及び開口した末端を有する容器
   を用意し、 （ｂ）前記容器中にゲル様物質及び該物質より大きい比
   重を有する水溶性の密度勾配物質を入れ、（ｃ）前記容
   器中に液体試料を入れ、 （ｄ）前記容器を遠心力下に置いて、前記液体試料を重
   い相と軽い相に分離し、そして該重い相と軽い相の間に
   前記ゲル様物質と前記水溶性密度勾配物質の別々の層よ
   りなるバリヤー層を確立する、ことよりなる、遠心分離
   により分離した液体試料の重い相を軽い相から分離する
   方法。