JPS6178397A - 酵素及び微生物の反応方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は酵素及び微生物の新規な反応方法に関する。更
に詳しくは本発明は２種類以上の物質が関与する酵素反
応或いは微化物反応において、酵素や微生物を自由に通
過させない多孔性材料の膜２枚で仕切られた内側の空間
（酵素室）に、これら酵素や微生物を存在させ、２枚の
多孔性材料の膜に接する両外側の空間には反応に関与す
る物質を存在させて、これら物質が多孔＝　２− 性材料の膜を界して内側の空間へ透過し、中央の酵素室
で反応し、化成物がまた多孔性材料の膜を界して外側の
空間へ透過して、効率良く、酵素或いは微生物反応とと
もに生成物の分離も行いうる様にしたバイオリアクター
を用いる酵素及び微生物の反応方法に関する。

〔従来の技術及び問題点〕

周知のように、酵素反応や微生物反応では２種類以上の
基質を必要としたり、或いは活性化剤として基質以外の
物質を必要とする場合が多く、単一物質のみが関与する
反応は少い。また反応生成物においても単一の場合だけ
ではなく、２種類以上の化成物を生産することが非常に
多い。このように酵素反応や微生物反応では１反応基質
だけでなく１反応生成物においても２ｆ４１！類以上の
物質が関与する反応は非常に多い。しかし、例えば、反
応生成物が２種類以上となる場合には、反応終了後、目
的の生産物を得るにはこれら反応生成物の分離操作が必
要である。

また２種類以上の基質を要する反応の場合には、時とし
て基質のうちのいずれかが酵素或いは微生物の阻害要因
や失活要因となる場合もある。

また反応生成物自身が阻害要因となる場合もある０ これらのことを考えると、阻害要因物質を酵素反応系、
或いは微生物反応系へ与える量をコントロールしたり、
或いは阻害要因を系内から速やかに除去することができ
れば更に効率良く酵素反応、微生物反応を行うことがで
きると瑚見られる。捷た反応と同時に生成物の分離も可
能となるようなりアクタ−を用いれば、生産物の分離工
程を省略できる可能性がある。一方酵素は一般に非常に
高価なものであり、これを再利用することは生産コスト
を下げる上で欠くべからざる条件である。バイオリアク
ターを考える除には、当然酵素や微生物を反応系内から
簡単に取出して、再利用できることが重要なポイントと
なる。

従来これらの銖題全てを満足するバイオリアクターは未
だ開発されていない。例えば固定化酵素や固定化微生物
では反応系からの酵素、微生物の容易な分離、或いは、
酵素、微生物の再利用といった課題は解決できるかも知
れないが、反応と分離の同時操作や、阻害物質の制御と
いった問題の解決は不可能である。最近、固定化酵素や
固定化微生物の固定化担体に生成物分離機能（吸着能）
をもたせるという試みもあるが、これとて種々の問題点
を持っている。例えば阻害要因或いは失活要因となる物
質が反応に必要な場合、この方法ではこの物質の量をコ
ントロールするととＶｉ難しい。また担体の吸着能を利
用する場合には、生成物質を吸着させるのに非常に多量
の担体を必要とし、工業化の面では大きな障害となる。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らはこのような種々の課題をもつ酵素或い１−
ｉ微生物反応のりアクタ−について鋭意検討の結果、こ
れらの課題を解決することができる画期的なりアクタ−
を開発した。

即ち本発明は２種類以上の物質が関与する酵素反応或い
は微生物反応において、これら酵素あるいは微生物が通
過できない多孔性材料２枚を１組とし、これらの多孔性
材料にはさまれた内側の空間部に酵素または微生物、或
いは、固定化酵素或いは固定化微生物を存在させ、２枚
の多孔性材料の両性側の空間には上記反応に関与する物
質を夫々存在させて、多孔性材料を界してこれらの物質
を透過させ上記内側空間部で反応を行なわせることを特
徴とする酵素及び微生物反応方法に関するものである。

本発明による反応方法は、酵素や微生物を自由に通過さ
せない多孔性材料の膜２枚を１組とし、これらで仕切ら
れた空間に、酵素や微生物を存在させ、反応物質が多孔
性材料を通過して５中夫の空間で、酵素或いは微生物反
応を受け、反応後の生成物をまた、多孔性材料を通過せ
しめて、酵素反応系或いは微生物反応系から除去するこ
とを特徴とするものである。

〔作用〕

本発明を更に詳しく、本発明の好適実施態様＝　６− を示した図面に基いて説明する。−例としてリパーゼに
よる油脂分解反応のように、Ａ＋Ｂ→Ｃ＋Ｄ（Ａ、Ｂは
反応に関与する物質で、以下基質という。Ｃ２Ｄは生成
物。リパーゼ反応では、Ａ−油、Ｂ＝水、Ｃ−脂肪酸、
Ｄ＝グリセリン）で表わされる酵素反応系について、第
１図を用いて説明すると、１及び２の多孔性材料で仕切
られた内側の空間４（酵素室）に酵素を存在させ、一方
の外側の空間５（反応物質室）に基質Ａを、他方の外側
の空間５（反応物質室）に基質Ｂを存在させる。多孔性
材料１．２は酵素を通過させず、また基質Ａが多孔性材
料１を通過し、また基質Ｂが多孔性材料２を通過し得る
様に構成されている。従って第１図のりアクタ−では、
夫々の反応物質室３，５から酵素室４へ通過した基質Ａ
、Ｂは、酵素室４に存在する酵素により酵素反応を受け
て生成物ＣとＤになる。ここで多孔性材料１は基質Ａは
通すが、Ｂは通さず、また反応生成物○、Ｄのうちのい
ずれか一方のみ（仮にＣとする）を通すものを選択する
。多孔性材料２は逆に基質Ｂのみを通すが、Ａは通さず
、また反応生成物のうちのＤのみを通すものを選択する
。これらの性質を多孔性材料に付与するには、多孔性材
料の材質及び孔径を適当に選択すれば良い。例えばリパ
ーゼの反応においては、基質の油と反応生成物の脂肪酸
のみを通す多孔性材料としては、ポリプロピレンやポリ
エチレン等の疎水性材料を選択すれば良く、また水及び
グリセリンのみを通す材料としては酢酸セルロースなど
のセルロース材料、アクリロニ）　ＩＪル重合物等に代
表される親水性材料を選択すれば良い。また一般に多孔
性材料の細孔径は酵素や微生物を通さない大いさである
ことが必要であって、酵素の大きさは数十〜数百オング
ストロームと言われているからこの程度の細孔が必要で
あることになるが、反応系によってはこれ程微細な細孔
ををしない場合もある。例えば、リパーゼの油脂分解反
応では、多孔性材料で仕切られた空間４での反応状態を
みてみると、油／水エマルジョンが形成され、このエマ
ルジョン表面に酵素が存在するような状態となっている
。従ってこのエマルジョンを通さない孔径であれば良く
、０．１〜数μｍの孔径で酵素の通過を阻止できる。ま
た固定化酵素や、固定化微生物を用いれば、当然のこと
ながら微細な細孔は必要ない。

従って本発明に於ては多孔性材料の材質、細孔径につい
ては特に限定するものではなく、上記の様な基準に従っ
て適当に選択される。

多孔性材料で仕切られた空間４に存在させる酵素或いは
微生物は、粉末のまま存在させても良いし、また酵素や
微生物を失活させない溶媒に溶かすか、或いは懸濁させ
て存在させても良い。本発明の実施に当っては酵素が一
部に片寄るのを防ぐため、スペーサを空間４に設け、酵
素或いは微生物をこの上に散布、或いは流延させるのが
一つの好ましいやり方である。また或いは、後述するよ
うに酵素液或いは微生物液をポンプでこの空間、即ち酵
素室４へ循環させても良い。なお、空間４に設けるスペ
ーサの材質、一　９− 形態等については特に限定するものではなく。

例えば、スペーサとして酵素を吸着させるような性質を
有する材１例えば、イオン交換繊維のようなものを用い
れば、その上に酵素を固定化することもでき、又この場
合の様にこのスペーサに伺らかの新たな機能を付加させ
ることもできる。

第１図の反応物質室５及び５に存在する基質は濃度拡散
により酵素室４へ拡散し、また反応生成物も濃度拡散に
より酵素室４から反応物質室３或いは５へ拡散する。し
かし、濃度拡散だけでは拡散速度が遅く、十分な反応速
度が得られない場合は、拡散を促進する力１例えば圧力
や温度をそれぞれの室に与えて拡散を促進することも出
来る。或いはまた。酵素反応、微生物反応を阻害せず、
且つ多孔性材料を通過しない第３物質をそれぞれの室に
添加して、この物質の浸透圧差を拡散の促進力とするこ
とも可能である。

本発明に使用されるバイオリアクターは種々の酵素反応
、微生物反応に適用でき、前述したリパーゼによる油脂
分解反応以外にも、リパーゼによるトリグリセリドの合
成、トリグリセリドのエステル交換反応、ホスホリパー
ゼによるリン脂質の分解反応、ホスホリラーゼによる多
糖類の加リン酸分解反応に代表される転移酵素（トラン
スフェラーゼ）群による一連の反応、フマラーゼによる
リンゴ酸の合成反応、ホスファターゼ、ヌクレオチオダ
ーゼ等の加水分解酵素群の一連の反応、或いは、アルコ
ールデヒドロゲナーゼやアミノ酸酸化還元酵素等に代表
される酸化還元酵素群の反応等、２ａＩ類以上の物質が
関与する酵素反応系に使用できる。また微生物反応系に
おいては、反応基質以外にも、微生物の生育に数多くの
物質を必要とすることから、殆どの微生物反応に本リア
クターは適用できる。例えば、ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｅｕｍ等によるグルタミン酸
発酵では、基質のグルコースからグルタミン酸を発酵生
産するが、重曹の生育にはビオチンを必要とし、ビオチ
ン量によってグルタミン酸生産量の増減がみられる。

このように微生物反応では、反応基質以外にビオチンな
どのビタミン類、無機塩、アミノ酸等を必要とする場合
が多く、本リアクターはこれら微生物反応の殆どに適用
できる。

本発明で用いる酵素或いは微生物は、必ずしも高度に精
製されているものである必要はなく、抽出液や部分精製
品、また或いは発酵液も用いることができる。

本発明によるバイオリアクターで効率的に反応を行うに
は、第２図に示したように酵素室７をはさんで多孔性材
料９，１０を多数組、同種の多孔性材料が相互に相対し
て、一方の多孔性材料９の間には反応物質室５が、又他
方の多孔性材料１０の間には反応物質室６が形成される
様セットし、反応に関与する物質を夫々ポンプ３ａ、３
ｂで夫々の反応物質室５，６へ循環させる様にするのが
良い。第２図に於てはまた、酵素或いは微生物もポンプ
３で酵素室７へ循環可能にしである。第２図に於て１，
２は反応物質貯留容器、４は酵素或いは微生物液貯留容
器、８は外枠である。同、酵素、微生物は前述のように
酵素室７内に設けたスペーサ上に散布するか流延するこ
とによって静置して存在させても良い。

伺本発明の方法に用いるリアクターの形態は、第１図及
び第２図に示したよりな平膜型に限られず、第３図のよ
うな管型、第４図のようなスパイラル型など種々の形態
が可能であり、特にその形態について限定するものでは
ない。第３図の管Ｗ　リアクターでは、１，２が多孔性
材料で、これらの間に酵素室４があシ、多孔性材料の管
状膜１の内側に反応物質室３が、又多孔性材料の管状膜
２の外側に反応物質室５があり、６は外枠である。第４
図のスパイラル型リアクターでは、多孔性材料の膜１，
３にはさまれた空間に酵素が置かれたスペーサ２が挾ま
れて、これが酵素室を形成している。そして多孔性材料
の膜１，３を２枚の外枠４がはさんでおり、これらがス
パイラル状に巻かれておシ、外枠４と多孔性栃料の膜１
，３の夫々との間に反応物質室を形成している。

本発明の一つの特徴は固定化酵素と同様に、反応系から
酵素や微生物を容易に除去できる一方、酵素や微生物を
多孔性材料に固定化してい力いため、酵素や微生物が失
活した場合、多孔性材料を交換すること力＜、酵素や微
生物のみを交換することができることである。従って高
価な多孔性材料のロスを防げる。

また前述したように酵素や微生物に対して阻害物があれ
ば、多孔性材料の膜の材質、細孔径をコントロールする
ことによシ、これら阻害物を酵素反応系あるいは微生物
反応系へ与える量をコントロールしたシ、また生成物が
阻害する場合は、この生成物を反応系から速やかに除く
ことが可能となる。従って酵素、微生物の失活血抑え、
これらを再利用することが可能となる。

例えば、リパーゼによる油脂分解反応では、反応基質の
水がリパーゼの失活要因となり、水の量が多くなシすぎ
ると酵素は著しく失活する。

従って多孔性材料の木造過量をコントロールすることに
より反応に必要な量の水だけを反応系に与えることがで
きる。従ってこれによりリパーゼの失活を抑制すること
ができる。

本発明の方法のもう一つの大きガ特徴としては、反応生
成物の分離が反応と同時に行いうろことがあげられる。

例えばリパーゼによる油脂分解反応では、反応生成物で
ある脂肪酸とグリセリンの分離は反応と同時に行いうる
。

また本発明によるバイオリアクターにおける酵素反応或
いは微生物反応の速度は、基質（反応物質）等の多孔性
材料の膜を透過する透過速度と、多孔性材料の膜の表面
積に大きく依存する。従って反応速度を上げるには、基
質等の透過速度の速い材質の多孔性材料を選ぶことが重
要である。また多孔性材料の膜の表面積が反応速度に大
きく関与することから、表面積を増大させることにより
反応時間を大巾に短縮することも可能である。

以上述べてきたように、本発明によるバイオリアクター
は酵素や微生物をマクロに多孔性材料間に固定化する方
法であシ、酵素や微生物が反応系内から容易に除去でき
る一方、酵素、微生物の再利用、失活防止、また反応と
分離の同時操作が可能となるなど、従来の固定化酵素を
利用する方法にみられなかった利点をも併せ持った全く
新しい反応方法であり、その工業的有用性は非常に大き
いものである。

〔実施例〕

以下本発明の実施例について説明するが、本発明はこれ
ら実施例に限定されるものではない。

実施例−１ 面積０．０２　ｍ２をもつポリアクリロニトリルの多孔
質膜（限外沖過膜、分画分子量２００００　）及びテフ
ロンの多孔質膜（ポアサイズ０．１μ）全１０枚ずつ用
意した。油脂分解酵素（リパーゼ）２ｆを少量の大豆油
に懸濁し、約１／１０ずつ両膜間のスペーサ上に流延し
、両膜でこれをはさむようにしてセットし、第２図に示
したよりな平膜型反応器を作成した。但し、第２図の酵
素液はポンプで循環しているが、ここではスペーサ上に
流延して静置する方法をとった。

大豆油４００　Ｆ　、水４００ｆを大豆油はテフロン膜
と接するように、水はポリアクリロニトリル膜と接する
ように循環送液した。温度は恒温槽で３０℃に保持して
大豆油のリパーゼによる分解反応を行った。

２４時間後、大豆油の分解率は７０％、−志木中のグリ
セリン濃度は７％であった。また油中のグリセリン及び
水中の脂肪酸はそれぞれ０．１％以下でちった。

この結果より、大豆油及び水は多孔質膜を透過して中央
の酵素室で反応し、反応後の脂肪酸は油側へ、グリセリ
ンは水側へ、再び多孔質膜を透過して拡散分離されたこ
とがわかる。このように反応と分離の同時操作も可能で
あった。

実施例−２ 実施例−１で使用した酵素をそのままにして、反応後の
脂肪酸溶液及びグリセリン水溶液を抜き出した後フレッ
シュな大豆油４００　Ｆ、及び水４００ｆを実施例−１
と全く同様に送液した。２４時間後の大豆油分解率は実
施例−１と同じ７０％が得られた。

更に同様に酵素をそのま捷にして、再びフレッシュな大
豆油、水を４００ｔずつ送液した。５回目も全く同様に
２４時間後の大豆油分解率７０％が得られた。

このように本バイオリアクターでは酵素の失活は無かっ
た。

また一方、酵素はそのままにして単に液を抜き出し、フ
レッシュな油、水を送液するだけで、効率よく反応が行
なえた。

このように酵素を系内から分離する工程は必要ないこと
がわかる。

実施例−５ 実施例−１と同様の条件だが、油に接する多孔質膜とし
てポアサイズ２．５μのポリ塩化ビニル系膜（表面積０
．０２ｍ２）１０枚を用いた。水に接する多孔質膜は実
施例−１と同じポリアクリロニトリル膜を用いた。実施
例−１と同様の条件で、大豆油４００Ｆ、水４００？を
循環送液し、油脂分解反応を行った。なお、塩ビ系膜で
は、油側への水の拡散が認められたので、油側に約ｏ、
ｏ　３Ｋｔ／ａｎ２の差圧をかけて、油側への水の侵入
を防いだ。

２４時間後の大豆油分解率は８０％、水中のグリセリン
濃度８．１％が得られた。また４８時間後の大豆油分解
率９０％、水中のグリセリン濃度９％が得られた。

このように実施例−１と比較すると、膜材質、孔径によ
って反応速度に差がみられることがわかった。

実施例−４ 実施例−１と同様の多孔質膜を用い、膜枚数をそれぞれ
５枚とした。大豆油４００　？　、水４００Ｖを同様に
して送液したところ２４時間後の分解率４４％が得られ
た。

このように反応速度は膜面積に大きく依存していること
がわかる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に使用される装置の構成を示す図であう
、１，２は多孔性材料、３，５け反応物質室、４ｔｄ、
酵素室、６は外枠である。第２図は本発明に用いられる
平膜型リアクターの説明図、第３図は管型リアクター、
第４図はスノくイラル型リアクターの略示図である。 出願人代理人　　古　　谷　　　　　馨第３図 第４図 千糸売肴１１ｊ「νＦ　（自発） 昭和５９年１０７］３１＋＋ 特許１ｉ’−Ｅ＃官　志賀　学　殿 １、事件の表示 特願昭５９−１９８７７８号 ２、発明の名称 酵素及び微生物の反応方法 ３、補正をする渚 ・１）件との関係　　４１ｙ訂出願人 （０９１）花　−１石　的株　式　会　着４、　　代　
　理　　人 明細書の特３′１請求の範囲及び発明の（１）明細、１
）２真下から４行「の膜」を「（例えばＩＩ！ＩりＪ　
と訂１１ ２、特許請求の範囲 １　２種類以上の物質か関Ｉｊ−する酵素反応或いは微
生物反応において、これら酵素あるいは微生物が通過で
きない多孔＋１材料２枚を１Ｍ１とし、これらの多孔性
材ネ゛１にはさまれた内側の空間部に酵素または微生物
、或いは、固）１−゛化酵素或いは国定化微生物を存在
させ、２枚の多孔性材ネ；Ｉの両性側の空間には１．記
反応に関与する物質を夫々仏前させて、多孔に１材料を
界してこれらの物質を透過させ１−記内側空間部で反応
を行なわせることを特徴とする酵素及び微生物反応方Ｉ
ノ、。 ２．２枚の多孔性材料が、１枚は反応に関りする物質の
うちの１部のみを及び反応後の生成物のうちの１部のみ
を通過させ易く、他の１枚は反応に関与する物質のうち
の残りの物質及び残りの反応生成物のみを通過させ易い
Ｐ１質をもつものである特許請求の範囲第１ダ１記載の
方Ｖ、。 ３２枚ｉｆの多孔性材料の複数組が同種の多孔性材ネ；
Ｉが向い合う様に順次配列されている特許請求の範囲第
１項または第２項記載の方１人。 ４　反応に関ケーする物質が木及び油であり、酵素反応
が酵素としてリパーゼを用いる油脂の加水分解反応であ
る特許請求の範囲第１項、第２項または第３項記載の方
法。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　２種類以上の物質が関与する酵素反応或いは微生物
   反応において、これら酵素あるいは微生物が通過できな
   い多孔性材料２枚を１組とし、これらの多孔性材料には
   さまれた内側の空間部に酵素または微生物、或いは、固
   定化酵素或いは固定化微生物を存在させ、２枚の多孔性
   材料の両外側の空間には上記反応に関与する物質を夫々
   共存させて、多孔性材料を界してこれらの物質を透過さ
   せ上記内側空間部で反応を行なわせることを特徴とする
   酵素及び微生物反応方法。 ２　２枚の多孔性材料が、１枚は反応に関与する物質の
   うちの１部のみを及び反応後の生成物のうちの１部のみ
   を通過させ、他の１枚は反応に関与する物質のうちの残
   りの物質及び残りの反応生成物のみを通過させ易い性質
   をもつものである特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３　２枚１組の多孔性材料の複数組が同種の多孔性材料
   が向い合う様に順次配列されている特許請求の範囲第１
   項または第２項記載の方法。 ４　反応に関与する物質が水及び油であり、酵素反応が
   酵素としてリパーゼを用いる油脂の加水分解反応である
   特許請求の範囲第１項、第２項または第３項記載の方法
   。