JPS6176419A - Production of purified tissue plasminogen activator - Google Patents

Abstract

PURPOSE:A solution containing plasminogen activator from tissues is brought into contact with hydroxyapatite to effect the purification of the titled substance. CONSTITUTION:A solution containing plasminogen activator from tissues such as extracts from human uterus, human melanoma, or human lung cancer cell cultivation mixture is brought into contact with hydroxy apatite to allow the activator to be adsorbed on the apatite. Then, the plasminogen activator is eluted from the hydroxyapatite with ammonia-containing water to effect purification. The solution is preferably made weak alkaline, neutral or wear acidic for the adsorption. EFFECT:The use of hydroxyapatite as an adsorbent enables high-efficiency purifi cation of the product with ammonia-containing water as an eluant.

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、精製された組織性プラスミノーゲンアクチベ
ータの製造法に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Field of the Invention The present invention relates to a method for producing purified tissue plasminogen activator.

（従来の技術） 組織性プラスミノーゲンアクチベータハ、ライケンらの
報告〔ディー・シー・ライケンとディー・コレン、ザ・
ジャーナル・オプ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｄ
、Ｃ，Ｒｉｊｋｅｎ　　ａｎｄ　　Ｄ、　Ｃｏ１１ｅｎ
。(Prior art) Tissue plasminogen activator reported by Liken et al.
Journal of Biological Chemistry (D
, C, Rijken and D, Co11en.
.

Ｔｈｅ　　Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ　　Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ　　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　）　。The Journal of Biology
cal Chemistry).

２５６巻、７０３５〜７０４１頁（１９８１年）〕にあ
るように１組織性プラスミノーゲンアクチベータ産生の
組織又は細胞の培養液又は抽出液を亜鉛キレートアガロ
ース、ついでコンカナハＩＪンＡアガロースのアフイニ
テイクロマトグラフイーにかけ、最後に架橋デキストラ
ンゲル（セファデックＧ−１５０，ファルマシア・ファ
イン・ケミカルズ社商品名）を使用したゲルろ過で精製
するのが１代表的な方法である。256, pp. 7035-7041 (1981)], culture fluids or extracts of tissues or cells producing tissue plasminogen activator were subjected to zinc chelate agarose and then subjected to affinity chromatography on Concanach IJ-A agarose. One typical method is to purify the product by gel filtration using a cross-linked dextran gel (Sephadec G-150, trade name of Pharmacia Fine Chemicals).

一方、非組織性のプラスミノーゲンアクチベータである
ウロキナーゼは、尿をセライト、おが屑等の吸着剤に吸
着させ、溶出して最初の精製を行なうのが普通である。On the other hand, urokinase, which is a non-organized plasminogen activator, is usually purified for the first time by adsorbing urine to an adsorbent such as celite or sawdust and eluting it.

（発明が解決しようとする問題点） しかし１組織性グラスミノーゲンアクチベータは、ウロ
キナーゼと異なり９種々の吸着剤に対する吸着力が強く
９例えば、セライトを用いた場合には、溶出を助ける界
面活性剤〔トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００（ロー
ム・アンド・ハース社商品名）。(Problems to be Solved by the Invention) However, unlike urokinase, organized glasminogen activator has strong adsorption power to various adsorbents. [Triton X-100 (Rohm & Haas Company product name).

トウイーン（Ｔｗｅｅｎ　）８０　（ベーカー社商品名
）〕を用いても回収率が５０〜６０チであるように。Even if Tween 80 (trade name of Baker Company) is used, the recovery rate is 50 to 60.

その精製効率（収率）が低い。Its purification efficiency (yield) is low.

すなワチ１組織性プラスミノーゲンアクチベータの精製
において、吸着剤を用いた簡便で安価な精製法を、工業
的規模で採用することができない。In other words, in purifying Wachi-1 tissue plasminogen activator, a simple and inexpensive purification method using an adsorbent cannot be adopted on an industrial scale.

これが第１の問題点である。This is the first problem.

第２の問題点は、上記したように１組織性プラスミノー
ゲンアクチベータの精製では、培ｔｊ液。The second problem is that, as mentioned above, in the purification of tissue plasminogen activator, the culture medium TJ fluid is used.

抽出液等の不純物の多い液を直ちにアフィニティクロマ
トグラフィーにかけているのが現状であシ。Currently, liquids containing many impurities, such as extracts, are immediately subjected to affinity chromatography.

従って、高価なアフィニティクロマトグラフイーの担体
（亜鉛キレートアガロース、コンカナバリンＡアガロー
ス等）を汚染し、該担体の再使用を困難にすることであ
る。この解決のためには、アフイニテイクロマトグラフ
イーによる精製の前に適用される適尚な精製法が望まれ
る。Therefore, it contaminates expensive affinity chromatography carriers (zinc chelate agarose, concanavalin A agarose, etc.) and makes it difficult to reuse the carriers. For this solution, a suitable purification method applied before purification by affinity chromatography is desired.

（問題点を解決するための手段） 本発明は１組織性プラスミノーゲンアクチベータを含む
液から組織性プラスミノーゲンアクチベータを得るに際
し、上記液をヒドロキシアパタイトト接触させて組織性
プラスミノーゲンアクチベータをヒドロキシアパタイト
に吸着させ、ついで。(Means for Solving the Problems) In the present invention, when obtaining tissue plasminogen activator from a solution containing tissue plasminogen activator, the tissue plasminogen activator is obtained by bringing the solution into contact with hydroxyapatite. Adsorb to hydroxyapatite and then.

組織性プラスミノーゲンアクチベータを吸着したヒドロ
キシアパタイトからアンモニアを含有スる水によって組
織性プラスミノーゲンアクチベータを溶出することを特
徴とする精製された組織性プラスミノーゲンアクチベー
タの製造法に関する。The present invention relates to a method for producing purified tissue plasminogen activator, which comprises eluting tissue plasminogen activator from hydroxyapatite adsorbed with tissue plasminogen activator using water containing ammonia.

本発明において９組織性プラスミノーゲンアクチベータ
とは、ヒトの子宮、ヒトメラノーマ、ヒト肺ガン細胞等
の組織又は細胞によって産生されるプラスミノーゲンア
クチベータであって、これを含む液とは、ヒトの子宮か
らの抽出液、ヒトメラノーマ、ヒト肺ガン細胞等の培養
液等の組織又は細胞の培養液又は抽出液であり、これら
は、よく知られた方法で製造できる。また１組織性プラ
スミノーゲンアクチベータを含む液とは、上記培養液又
は抽出液が限外ろ過、硫安による沈殿９分子篩等により
９部分精製された液又は部分精製された物の液をも意味
する。これらの液は９次のヒドロキシアパタイトによる
吸着のために９弱アルカリ性、中性又は弱酸性になるよ
うに調整されるのが好ましい。このような調整のために
、リン酸塩緩衝液を使用するのが好ましく９例えば、上
記培養液、抽出液又は部分精製された液には、該緩衝液
が添加され９部分精製された物は該緩衝液に溶解される
のが好ましい。ｐＨの調整はリン酸塩４番 濃度が０．Ｏ１〜０．１Ｍで弱酸性から中′ｆｓｉ（ｐ
Ｈ６〜７）にされるのが好ましい。ｐＨ調整のために。In the present invention, tissue plasminogen activator is a plasminogen activator produced by tissues or cells such as human uterus, human melanoma, human lung cancer cells, etc. Culture fluids or extracts of tissues or cells, such as extracts from the uterus, culture fluids of human melanoma, human lung cancer cells, etc., and these can be produced by well-known methods. Furthermore, the term "liquid containing a tissue plasminogen activator" also refers to a liquid obtained by partially purifying the above-mentioned culture liquid or extract by ultrafiltration, precipitation with ammonium sulfate, 9-molecular sieve, or the like, or a partially purified liquid. . These liquids are preferably adjusted to be slightly alkaline, neutral or slightly acidic for adsorption by 9th-order hydroxyapatite. For such adjustment, it is preferable to use a phosphate buffer. Preferably, it is dissolved in the buffer. Adjust the pH by adjusting the phosphate No. 4 concentration to 0. O1 to 0.1M is weakly acidic to moderately acidic (p
H6-7) is preferred. For pH adjustment.

他の緩衝液を使用してもよい。Other buffers may also be used.

このように準備された組織性プラスミノーゲンアクチベ
ータを含む液は、ヒドロキシアパタイトと接触させられ
９組賎性プ２スミノーゲンがヒドロキシアパタイトに吸
着させられる。The solution containing the tissue plasminogen activator thus prepared is brought into contact with hydroxyapatite, and the 9-type plasminogen is adsorbed onto the hydroxyapatite.

この場合、ヒドロキシアパタイトは、任意の形状のもの
が使用できるが９粒子状のものが好ましい。In this case, hydroxyapatite in any shape can be used, but it is preferably in the form of 9 particles.

また、ヒドロキシアパタイトは、使用にあたってリン酸
塩緩衝液等の緩衝液に分散させて使用するのが、上記ｐ
Ｈ調整のために好ましい。In addition, hydroxyapatite is used by dispersing it in a buffer such as a phosphate buffer.
Preferable for H adjustment.

また、吸着させる方法としては、上記液にヒドロキシア
パタイトを添加混合する方法（バッチ法）。Further, as a method for adsorption, hydroxyapatite is added to and mixed with the above liquid (batch method).

ヒドロキシアパタイトを充てんしたカラムに上記液を流
す方法（カラム法）等により行なうことができる。This can be carried out by a method such as flowing the above liquid through a column filled with hydroxyapatite (column method).

次に５組織性フリスミノーゲンアクチベータが一吸着さ
れているヒドロキシアパタイト・・（以下、吸着ヒドロ
キシアパタイトという）から９組織性プラスミノーゲン
アクチベータが溶出される。Next, 9 tissue plasminogen activators are eluted from the hydroxyapatite (hereinafter referred to as adsorbed hydroxyapatite) in which 5 tissue frisminogen activators are adsorbed.

溶出方法としては、溶出液としてアンモニアを含有する
水を使用し、上記したバッチ法、カラム法等に準じて、
溶出が行なわれる。溶出液中のアンモニアは、ｐＨが１
０以上になるように該液中に含有させられるのが好まし
い。これ以下になると溶出能が低下する傾向又は溶出液
を多量に要する傾向がある。アンモニアを含む水には、
硫安等の他の物質が溶解させられていてもよい。The elution method uses water containing ammonia as the eluent and follows the above-mentioned batch method, column method, etc.
Elution takes place. Ammonia in the eluate has a pH of 1
It is preferable that the amount is contained in the liquid in an amount of 0 or more. Below this range, there is a tendency for the elution ability to decrease or for a large amount of eluate to be required. Water containing ammonia has
Other substances such as ammonium sulfate may also be dissolved.

本発明において、より好ましくは、上記溶出のな 前に吸着ヒドロキシアバタイ）ｔ−食塩、塩化カリウム
、硫酸ナトリウム等の電解質水溶液で洗浄される。洗浄
方法は、上記したバッチ法、カラム法等に準じて行なわ
れる。電解質水溶液による洗浄は、ヒドロキシアパタイ
トに吸着されない不純物を完全に除去するために効果が
あり、このために該水溶液中の電解質濃度を０．０１〜
０．２Ｍにするのが好ましい。この濃度が小さすぎると
洗浄効果が低下しやすく、大きすぎると組織性プラスミ
ノーゲンアクチベータが一部溶出される。In the present invention, more preferably, before the elution described above, the adsorbed hydroxyabatite is washed with an aqueous electrolyte solution such as t-salt, potassium chloride, sodium sulfate, or the like. The washing method is carried out according to the above-mentioned batch method, column method, etc. Washing with an electrolyte aqueous solution is effective in completely removing impurities that are not adsorbed by hydroxyapatite, and for this purpose, the electrolyte concentration in the aqueous solution is adjusted to 0.01~
It is preferable to set it to 0.2M. If this concentration is too low, the cleaning effect tends to decrease, and if it is too high, some tissue plasminogen activator will be eluted.

本発明の工程の後、亜鉛キレートアガロース。After the process of the invention, zinc chelate agarose.

コンカナバリンアガロース等を用いたアフイニティクロ
マトグラフィー、架橋デキストランゲル等を用いた分子
篩などによって、更に高度に精製することができる。It can be purified to a higher degree by affinity chromatography using concanavalin agarose or the like, molecular sieves using crosslinked dextran gel, or the like.

以上の工程で９組織性プラスミノーゲンアクチベータ及
びそれを含む液は、腐敗しやすいので。In the above steps, the tissue plasminogen activator and the solution containing it are easily putrefied.

１０℃以下の雰囲気で取扱うのが好ましい。It is preferable to handle it in an atmosphere of 10°C or lower.

（作用） 本発明において、吸着剤としてヒドロキシアパタイト及
び溶出液としてアンモニアを含有する水を使用すること
により９組織性プラスミノーゲンアクチベータを吸着剤
を使用して効率よく鞘製す圀 ることかできる。固状率は９０〜１００％とすることが
でき２例えば、比活性が４０Ｉ［Ｊ／ｍｇ程度の原料を
比活性１５０〜２５０ＩＵ／ｍｇ、さらに洗浄工程を挿
入することによって３００〜５００ＩＵ／■までも精製
することが可能である。(Function) In the present invention, by using hydroxyapatite as an adsorbent and water containing ammonia as an eluent, it is possible to efficiently produce a sheath of 9-tissue plasminogen activator using an adsorbent. . The solidity rate can be 90 to 100%2.For example, a raw material with a specific activity of about 40 I[J/mg can be converted to a specific activity of 150 to 250 IU/mg, and by further inserting a washing step, the specific activity can be increased to 300 to 500 IU/■. can also be purified.

ヒドロキシアパタイトは蛋白質の精製に用いられておシ
、普通０．４　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液を用いればほとんど
すべての蛋白質を溶出できると言われている（生化学実
験講座１．タンパク質の化学！。Hydroxyapatite is used to purify proteins, and it is said that almost all proteins can be eluted using 0.4M IJ acid buffer (Biochemistry Experiment Course 1. Protein Chemistry!).

１３６頁）。この方法に準じて吸着ヒドロキシアラスミ
ノーゲンアクチペータの溶出を試みたところ、いずれの
場合も回収率は５０〜６０％であった。136 pages). When attempts were made to elute adsorbed hydroxyalasminogen activator according to this method, the recovery rate was 50 to 60% in all cases.

このように９本発明において、吸着剤としてヒドロキシ
アパタイトを使用した時に溶出液としてアンモニアを含
有する水を用いるととＫよる作用は顕著である。As described above, in the present invention, when hydroxyapatite is used as an adsorbent and water containing ammonia is used as an eluent, the effect of K is significant.

（実施例） 次に９本発明の実施例を示す。(Example) Next, nine examples of the present invention will be shown.

実施例１ 外科手術で摘出された子宮が用いられた。Example 1 A surgically removed uterus was used.

２〜１０℃に保たれた冷蔵室内で、該子宮をアセトンで
脱脂したのち、固形分をホモジナイザーで細かくシ、こ
れを酢酸カリウム水溶液（０，３Ｍ。After degreasing the uterus with acetone in a refrigerator kept at 2 to 10°C, the solid content was finely chopped with a homogenizer and mixed with an aqueous potassium acetate solution (0.3M).

ｐＨ４，２）中に攪拌しながら浸漬した。こののち。pH 4.2) while stirring. After this.

固形分を遠心分離機により除いて、抽出液を得た。The solid content was removed using a centrifuge to obtain an extract.

この抽出液は９組織性プラスミノーゲンアクチベ−タを
１７．５　　ｘＵ／ｍｌ　　（組織性プラスミノーゲン
アクチベータの力価はウロキナーゼを標準にしてウロキ
ナーゼの国際単位ＩＵで表示する）を含み、たん白質を
４２０μｇ　／ｒｒｓｌ含んでいた。したがってこの液
中の組織性プラスミノーゲンアクチベータの比活性は４
２　ＩＵ／ｍｇたん白質であった。This extract contains 17.5 x U/ml of 9 tissue plasminogen activators (the titer of tissue plasminogen activator is expressed in the international unit of urokinase, IU, with urokinase as the standard). It contained 420 μg/rrsl of white matter. Therefore, the specific activity of tissue plasminogen activator in this fluid is 4
It was 2 IU/mg protein.

次いで、この液４００ゴに０．２　Ｍ、　ｐＨ６，８１
Ｊｙ酸塩緩衝液を４０ｍ／加え、さらに０．０２Ｍ、ｐ
Ｈ６，８リン酸塩緩衝液４０ｍ＃にヒドロキシアパタイ
ト４ｇを分散させたものを添加してゆるやかに２時間攪
拌後、ガラスウールを敷いたガラスカラム中に吸着ヒド
ロキシアパタイトを集め、０．１Ｍ食塩水２０ｍｅで洗
浄後ｐＩ−Ｉ　１１．４のアンモニアを含有する水で溶
出した。流出液は約１０ｍｅずつのフラクションに分け
てとシ、各フラクションの組織性プラスミノーゲンアク
チベータの活性を測定し。Next, add 400 grams of this solution to 0.2 M, pH 6.81.
Add Jy salt buffer at 40 m/p and further add 0.02 M, p
After adding 4 g of hydroxyapatite dispersed in 40 m# of H6,8 phosphate buffer and stirring gently for 2 hours, the adsorbed hydroxyapatite was collected in a glass column lined with glass wool, and mixed with 0.1 M saline. After washing with 20 me, it was eluted with water containing ammonia with a pI-I of 11.4. The effluent was divided into fractions of approximately 10 me each, and the tissue plasminogen activator activity of each fraction was measured.

活性のあるフラクションを集めて精製液とした。The active fractions were collected and used as a purified solution.

精製液は液量６２ｍ１！で２組織性プラスミノーゲンア
クチベータは１１２１Ｕ／ｍ１．たん白質は０．３２ｍ
ｇ／ｍｌであった。したがって比活性はａ　５９　　Ｉ
Ｕ／ｍａ　たん白質であった。The volume of purified liquid is 62ml! 2 tissue plasminogen activator was 1121 U/ml. Protein is 0.32m
g/ml. Therefore, the specific activity is a 59 I
U/ma protein.

精製収率は原液中の組織性プラスミノーゲンアクチベー
タの全量が７０００　ＩＵであったのに対し、精製液中
の全量は６９４４ＩＵであるから。Regarding the purification yield, the total amount of tissue plasminogen activator in the stock solution was 7000 IU, whereas the total amount in the purified solution was 6944 IU.

９９．２チであった。It was 99.2chi.

（発明の効果） 本発明によシ９組織性プラスミノーゲンアクチベータヲ
吸着剤（ヒドロキシアパタイト）を用いて優れた精製効
率で工業的規模で精製することができる。(Effects of the Invention) According to the present invention, tissue plasminogen activator can be purified on an industrial scale with excellent purification efficiency using an adsorbent (hydroxyapatite).

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １、組織性プラスミノーゲンアクチベータを含む液から
組織性プラスミノーゲンアクチベータを得るに際し、上
記液をヒドロキシアパタイトと接触させて組織性プラス
ミノーゲンアクチベータをヒドロキシアパタイトに吸着
させ、ついで、組織性プラスミノーゲンアクチベータを
吸着したヒドロキシアパタイトからアンモニアを含有す
る水によって組織性プラスミノーゲンアクチベータを溶
出することを特徴とする精製された組織性プラスミノー
ゲンアクチベータの製造法。 ２、組織性プラスミノーゲンアクチベータを吸着したヒ
ドロキシアパタイトから組織性プラスミノーゲンアクチ
ベータを溶出する前に、該ヒドロキシアパタイトを電解
質水溶液で洗浄する特許請求の範囲第１項記載の精製さ
れた組織性プラスミノーゲンアクチベータの製造法。[Claims] 1. When obtaining tissue plasminogen activator from a solution containing tissue plasminogen activator, the solution is brought into contact with hydroxyapatite to adsorb tissue plasminogen activator to hydroxyapatite, A method for producing purified tissue plasminogen activator, the method comprising: then eluting tissue plasminogen activator from hydroxyapatite adsorbed with tissue plasminogen activator using water containing ammonia. 2. The purified tissue plasminogen activator according to claim 1, wherein the hydroxyapatite is washed with an electrolyte aqueous solution before eluting the tissue plasminogen activator from the hydroxyapatite that has adsorbed the tissue plasminogen activator. Method for producing minogen activator.