JPS6154451A - Gel for affinity chromatography having group specificity and its production - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To obtain a gel for affinity chromatography having heparin-like affinity useful for refining of various protein and virus by esterifying a solid granular crosslinked polysaccharide to sulfate gel. CONSTITUTION:A sulfate forming esterifying agent is dissolved into an amine or amide and th solid granular material of the crosslinked polysaccharide is brought into reaction therewith while the solid granular state is maintained to sulfate the material and thereafter the material is neutralized by an alkali. The amine or amide to be used as the solvent is enumerated by pyridine, triethyl amine or dimethyl formamide. The commercially marketed granular material having about 15-150mum grain size for column chromatography is dried down to about 1% moisture content and is used for the raw material crosslinked polysaccharide to be added thereto so as to react therewith or the material dehydrated and dried with the solvent and substd. with amine or amide is used for the same. The gel for group specific affinity chromatography is extremely useful for refining of various proteins and virus.

Description

【発明の詳細な説明】 及糺ト１１炭激 本発明は、各種の蛋白質、ウィルスなどの精製に有用な
アフイニテイクロマトグラフィ用ゲル、さらに詳しくは
、固体粒状架橋ポリサッカライドの硫酸エステルゲルか
らなる群特異性を有するアフイニテーイクロマトグラフ
イ用ゲルおよびその製造法に関する。[Detailed Description of the Invention] The present invention consists of a gel for affinity chromatography useful for purifying various proteins, viruses, etc., and more specifically, a sulfate ester gel of solid particulate crosslinked polysaccharide. The present invention relates to an affinity chromatography gel having group specificity and a method for producing the same.

従来技術 特定の蛋白質、ウィルスなどを精製取得するには、従来
、遠心分離法、イオン交換法、ゲル濾過法などが採用さ
れており、これらの方法を適宜組合せたり、また反覆し
て用いられる。ところで、これらの方法な姐合せあるい
は反覆して実施する場合、各工程ごとに複雑な操作を必
要とし、また長時間を要するうえ、それらの工程を経る
にしたがって目的物の損失減量が生じる不利益がある。Prior Art Conventionally, centrifugation, ion exchange, gel filtration, and the like have been used to purify and obtain specific proteins, viruses, etc., and these methods are appropriately combined or used repeatedly. By the way, when these methods are combined or repeated, each step requires complicated operations, takes a long time, and has the disadvantage that the target material is lost and reduced as the steps go through. There is.

別の精製法として、生物学的親和性を有する物質を用い
てクロマトグラフィにより生体物質を分離精製する、い
わゆるアフィニティクロマトグラフィ法も知られている
。そのような生物学的親和性を有する物質として強酸性
のムコ多糖類であるヘパリンがあり、これは生体内で種
々の重要な生理活性を有する蛋白質と結合する特性を有
し、例えばアンチトロンビンＩＩＩ　と結合して血液凝
固阻止作用を促進したり、リボ蛋白リパーゼと結合して
脂血清澄作用を示すなど重要な生理作用、薬理作用を示
す。As another purification method, a so-called affinity chromatography method is also known, in which a biological substance is separated and purified by chromatography using a substance having biological affinity. Heparin, a strongly acidic mucopolysaccharide, is a substance with such biological affinity, and it has the property of binding to proteins that have various important physiological activities in vivo, such as antithrombin III. It exhibits important physiological and pharmacological effects, such as promoting blood coagulation prevention by binding to riboprotein lipase, and exhibiting lipid-serum clarifying effects by binding to riboprotein lipase.

かかるヘパリンの生理活性を利用して、これを七７７０
−スＣＬ−４Ｂ（ファルマシア社製）などのクロマトグ
ラフィ用ゲル担体にＣＮＢｒなどを用いて結合させてア
フイニテイクロマトグラフィ用ゲルを調製し、それを用
いてアンチトロンビンＩ１１、凝固因子、リボ蛋白リパ
ーゼなどの重要な生理活性を有する蛋白質を精製するこ
とが提案されている。しかしながら、ヘパリンは動物の
肺臓、腎臓、肝臓などから抽出精製されるものであるた
め、その操作が煩雑であり、しがも原料が違えぼヘパリ
ンの性状も異なるため、同一性状のヘパリンを大量に入
手することが困難でかつきわめて高価である。したがっ
て、ヘパリンを、結合させたアフイニテイクロマトグラ
フィ用ゲルを用いる方法は現段階では工業的規模で採用
することはきわめて難かしい。Utilizing the physiological activity of heparin, this
A gel for Affinity chromatography is prepared by binding CNBr to a chromatography gel carrier such as CL-4B (manufactured by Pharmacia), and using it, antithrombin I11, coagulation factors, riboprotein lipase, etc. It has been proposed to purify proteins with important physiological activities. However, since heparin is extracted and purified from animal lungs, kidneys, livers, etc., the process is complicated, and because different raw materials have different heparin properties, it is necessary to produce large quantities of heparin with the same properties. It is difficult to obtain and extremely expensive. Therefore, at present, it is extremely difficult to employ a method using an affinity chromatography gel bound with heparin on an industrial scale.

１９３５年ジョルベスら（Ｊｏｒｐｅｓ　ｅｔ　ａｌ）
によリヘパリンの血液ｉ！固阻止作用は分子中の硫酸基
の存在に基づくことが明らかにされて以来、ヘパリンに
代る高分子硫酸エステルを合成してアフィニティクロマ
トグラフィ用ゲルを調製する試みか。1935 Jorpes et al.
Yori Heparin Blood i! Since it was revealed that the blocking effect is based on the presence of sulfate groups in the molecule, attempts have been made to synthesize polymeric sulfate esters to replace heparin and prepare gels for affinity chromatography.

されている。そのような物質として、例えば、セルロー
ス硫酸、デキストラン硫酸、コンドロイチンポリ硫酸な
どがあり、これらはヘパリンと同様に血液凝固阻止作用
、脂血清澄作用などを有し、また塩基性有機物と結合し
て複合体を形成する性質を示す。これら高分子硫酸エス
テル類はヘパリンの有する主要な性質をすべて具備して
いるのでそれらを総称して「ヘパリノイド」と呼んでい
る。has been done. Examples of such substances include cellulose sulfate, dextran sulfate, and chondroitin polysulfate. Like heparin, these substances have anticoagulant effects and lipid serum clarifying effects, and also combine with basic organic substances to form complexes. Indicates the property of forming a body. Since these polymeric sulfate esters have all the major properties of heparin, they are collectively called "heparinoids."

このヘパリノイドをＣＮＢｒ等でクロマトグラフィ用ゲ
ルに結合させてアフィニティクロマトグラフィ用ゲルを
調製し、これを用いて凝固因子などを精製する方法が報
告されている（例えば、米国特許＠４．１３９，２８７
号、特開昭５２−１１４０１８号）。A method has been reported in which this heparinoid is bound to a chromatography gel using CNBr or the like to prepare an affinity chromatography gel, and this is used to purify coagulation factors (for example, U.S. Pat. No. 4,139,287
No., JP-A-52-114018).

しかしなが呟このような方法でも、ヘパリノイド自体が
高価であり、しかもヘパリノイドをゲル担体に結合させ
る方法が煩雑で、かつその結合が比較的弱く、しばしば
結合されたヘパリノイドか脱離するという難点がある。However, even with this method, the heparinoid itself is expensive, the method of binding heparinoid to the gel carrier is complicated, and the binding is relatively weak, so the problem is that the bound heparinoid often detaches. be.

発明の目的 本発明者らは、アフィニティクロマトグラフィ用として
すぐれた特性を有する改良されたデルを見出すべく種々
研究を重ねた結果、架橋ポリサッカライドの固体粒状粒
子をその固体粒状状態を保持しながら硫酸エステル化し
たのちアルカリで中和して得られるゲルがヘパリン様の
親和性を有しアフイニテイクロマトグラフィ用ゲルとし
てきわめてすぐれた特性を示すことを知り、本発明を完
成するに至った。すなわち、本発明は群特異性を有し、
各種蛋白質、ウィルスなどの精製に有用な新規なアフイ
ニティクロマトグラフィ用ゲルおよびその製造法を提供
するものである。Purpose of the Invention The present inventors have conducted various studies in order to find an improved model with excellent properties for use in affinity chromatography. As a result, the present inventors have discovered that solid granular particles of cross-linked polysaccharide can be converted into sulfuric acid ester while maintaining their solid granular state. The present invention was completed based on the knowledge that the gel obtained by neutralizing the gel with alkali has a heparin-like affinity and exhibits excellent properties as a gel for Affinity chromatography. That is, the present invention has group specificity,
The present invention provides a novel affinity chromatography gel useful for purifying various proteins, viruses, etc., and a method for producing the gel.

発明の構成および効果 本発明のアフィニティクロマトグラフィ用ゲルは、架橋
ポリサッカライド硫酸エステルゲルであって、セルロー
ス類、アガロースなどのポリサッカライドを、例えばエ
ピクロルヒドリン、ジクロルヒドリン、ジブロムヒドリ
ン、エチレングリフールビスエポキシプロビルエーテル
等の架橋剤で架橋して得られる架橋ポリサンカライドを
硫酸エステル化して得られるものである。架橋ポリサッ
カライドはすでに市販されており、例えば架橋アガロ−
又としてセファ０−ズＣＬ−２８，ＣＬ−４８、ＣＬ−
６Ｂ（７フルマシア社製）などがあ１）、架橋セルロー
スとしてセルロファインＧＣＬ−２５、ＧＣＬ−９０（
チッソ社製）などがある。Structure and Effects of the Invention The gel for affinity chromatography of the present invention is a cross-linked polysaccharide sulfate ester gel, in which a polysaccharide such as cellulose or agarose is combined with epichlorohydrin, dichlorohydrin, dibromhydrin, ethylene glycol bisepoxy probyl ether, etc. It is obtained by sulfuric acid esterification of a crosslinked polysancalide obtained by crosslinking with a crosslinking agent. Cross-linked polysaccharides are already commercially available, such as cross-linked agarose.
Also, Sefa 0-'s CL-28, CL-48, CL-
6B (manufactured by 7Furmacia) 1), crosslinked cellulose such as Cellulofine GCL-25, GCL-90 (
(manufactured by Chisso Corporation).

得られる架橋ポリサッカライド硫酸エステルは原料の形
状を保持し、水性溶媒に不溶性であり、物理的安定性に
すぐれ、クロマトグラフィ用ゲルとして好適である。The resulting crosslinked polysaccharide sulfate ester retains the shape of the raw material, is insoluble in aqueous solvents, has excellent physical stability, and is suitable as a gel for chromatography.

本発明の７フイニテイクロマトグラフイ用デルを製造す
るには、硫酸エステル化剤をアミンまたはアミドに溶解
し、これに架橋ポリサッカライドの粒状物を反応させ、
ついでアルカリで中和することにより行なわれる。To produce the 7 Finitei chromatography delta of the present invention, a sulfuric acid esterifying agent is dissolved in an amine or an amide, and crosslinked polysaccharide granules are reacted therewith.
This is then carried out by neutralizing with an alkali.

硫酸エステル化剤としては無水硫酸またはクロルスルホ
ン酸が好ましいが、その池、硫酸、濃硫酸、発煙硫酸、
ピロ硫酸、スル７７ミン酸などら用いられる。しかし、
条件によっては、セルロースの加水分解、を進行させる
ため、少なくとも原料セルロースの粒状状態を保持する
限度内で硫酸エステル化を行なう必要がある。そのため
、硫酸エステル化剤は過剰に加えず、通常原料架橋ポリ
サッカライド１００ｇ１Ｓ（重量部、以下同じ）に対し
て１〜１５０部程度で用い、反応温度は一１０〜１００
°Ｃ程度で、反応時間は３０分〜６時間程度とする。As the sulfuric acid esterification agent, sulfuric anhydride or chlorosulfonic acid is preferred, but sulfuric acid, concentrated sulfuric acid, fuming sulfuric acid,
Pyrosulfuric acid, sul-77mic acid, etc. are used. but,
Depending on the conditions, in order to advance the hydrolysis of cellulose, it is necessary to carry out the sulfuric acid esterification within a limit that at least maintains the granular state of the raw material cellulose. Therefore, the sulfuric acid esterifying agent is not added in excess, but is usually used in an amount of about 1 to 150 parts per 100 g 1S (parts by weight, the same applies hereinafter) of raw material crosslinked polysaccharide, and the reaction temperature is -10 to 100 g.
The reaction time is approximately 30 minutes to 6 hours.

ン容媒として用いるアミンまたはアミドとして（土ビリ
ジ゛ン、トリエチルアミン、ジメチルホルム７ミドなど
が挙げられる。これに添加反応させる原料架橋ポリサッ
カライドはカラムクロマトグラフィ用として市販の粒径
約１５〜１５０μｍの粒状物を含水率１％程度まで乾燥
するかまたは溶ｂａｔを脱水乾燥しｒこアミンまたはア
ミドで置換して用ｌ・る。Examples of the amine or amide used as a solvent for the reaction include pyridine, triethylamine, and dimethylformamide. The product is dried to a moisture content of about 1%, or the molten bat is dehydrated and dried and replaced with an amine or amide.

アルカリによる中和は、水酸化ナトリウム、水酸化カリ
ウム、水酸化マグネシウムなどの適当な濃度の水溶液ま
たはメタノール性水溶液を用り１て行なわれる。この中
和反応は通常発熱を伴なうため、氷水やドライアイスエ
タノール冷媒などで充分に冷却し、反応温度を５０°Ｃ
以上に上昇させないように留意する。Neutralization with an alkali is carried out using an aqueous solution or a methanolic aqueous solution of sodium hydroxide, potassium hydroxide, magnesium hydroxide or the like at an appropriate concentration. This neutralization reaction is usually accompanied by heat generation, so the reaction temperature should be sufficiently cooled with ice water or dry ice ethanol refrigerant, and the reaction temperature should be 50°C.
Be careful not to let it rise above this level.

上記の方法で得られる本発明の７フイニテイクロマトグ
ラフイ用ゲルは、粒径約１５〜１５０μｍｏの架橋ポリ
サッカライド硫酸エステルの水不溶性固体粒状粒子から
なる。The gel for 7 Finitei chromatography of the present invention obtained by the above method consists of water-insoluble solid particulate particles of crosslinked polysaccharide sulfate ester having a particle size of about 15 to 150 μm.

本発明の群特異性アフィニティクロマトグラフィ用ゲル
は、各種蛋白質、ウィルス類の精製にきわめて有用であ
る。効果的に適用される蛋白質、ウィルス類としては、
例えば、下記のような特異性をする群がある。The group-specific affinity chromatography gel of the present invention is extremely useful for purifying various proteins and viruses. Proteins and viruses that can be effectively applied include:
For example, there are groups that have the following specificities.

百日せき菌などの産生する蛋白質Ｆ−ＨＡ（Ｆｉｌａｍ
ｅｎｔｏｕｓ　Ｈｅ＋ｎａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）および
／またはＬ　Ｐ　Ｆ　−ＨＡ　（Ｌｅｕｃｏｃｙｔｏｓ
ｉｓ　ｐｒｏｍｏｔｉｎｇｆａｃｔｏｒｈｅ＋ｎａ２．
；１ｕｔｉｎｉｎ） Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）およびその抗原　（ＨＢｃ
Ａｇ、ＨＢｓＡｇ）、またはこれらの形質転換動物細胞
由来または形質転換微生物由来の発現抗原または蛋白質 単純ヘルペスウィルス蛋白質（Ｈ８ＶｇＢ）、　または
その形質転換動物細胞由来または形質転換微生物由来の
発現抗原または蛋白質 インフルエンザウィルス（ヒト、ウマ、ブタ、トリ）、
　日本脳炎ウィルス、狂犬病ウィルス、イバラキウイル
ス、ウシ流行熱ウィルス、ブタパルボウイルス、イヌパ
ルボウイルス、オーエ又キーウィルス、ニューカッスル
ウィルス、がンボロ病ウィルスなど、および／またはこ
れらの形質転換動物細胞または形質転換微生物に由来す
る産生物質 アンチトロンビンＩＩＩ、血液凝固因子、血小板第４因
子、リボ蛋白リパーゼ、または補体成分などの生理活性
を有する蛋白質 ウロキナーゼ、インベルターゼなどの動物、植物、微生
物などの生物体由来の酵素 本発明の７フイニテイクロマトグラフイ用デルを用いて
上記各種蛋白質、ウィルスなどの吸着、溶出を行なうに
は通常のカラムクロマトグラフィで採用される操作が適
用されるが、その条件は吸着上たは溶出ずべぎ蛋白質ま
たはウィルスの種類によって異なる。しかし、一般的な
繰作条件としでは、該ゲルをカラムに充」眞し、ｐＨ５
，（１〜９゜０、比電導度０　、５−２５　、Ｏ口ｅｓ
／ｃａｎの緩衝液であらｈ化め平衡化し、これに１）８
５．０〜９．０、温度０〜６０°Ｃ１比電導度０，５〜
２５．Ｏｍｓ／ｃｍの条件下で処理すべき蛋白質または
ウィルスを吸着せしめ、ついで前記平衡化に用いたもの
と同じ緩衝、（支）またはそれより比電導度の大きい緩
衝液で洗浄し、最後に、イオン強度が上記平衡化および
洗浄に用いた緩衝液よりも大すい、ｐＨｓ、ｏ〜１０゜
０、比電導度５　、０−１３０ｍｓ／ｅｔａの緩Ｓ液を
用いて溶出することにより、高度に精製された蛋白質ま
たはウィルスを得ることができる。なお、該精製操作は
バッチ法、カラム法のいずれでも行なうことができる。Protein F-HA (Filam) produced by Bordetella pertussis etc.
entous He+nagglutinin) and/or L P F -HA (Leucocytos
is promoting factor+na2.
;1utinin) hepatitis B virus (HBV) and its antigen (HBc
Herpes simplex virus protein (H8VgB), or expressed antigen or protein derived from these transformed animal cells or transformed microorganisms; Influenza virus (human, horse, pig, bird),
Japanese encephalitis virus, rabies virus, Ibaraki virus, bovine epidemic virus, porcine parvovirus, canine parvovirus, Ohemata key virus, Newcastle virus, Gambolo disease virus, etc., and/or transformed animal cells or transformed microorganisms thereof Enzymes derived from organisms such as animals, plants, and microorganisms, such as antithrombin III, blood coagulation factors, platelet factor 4, riboprotein lipase, or proteins with physiological activities such as complement components, urokinase, and invertase. In order to adsorb and elute the above-mentioned various proteins, viruses, etc. using the 7 Finitei chromatography device of the present invention, operations adopted in ordinary column chromatography are applied, but the conditions are Varies depending on the type of eluted Zubegi protein or virus. However, under general operating conditions, the gel is filled into a column and the pH is adjusted to 5.
, (1~9゜0, specific conductivity 0, 5-25, O mouth es
/can buffer and equilibrate, and add 1)8 to this.
5.0~9.0, temperature 0~60°C1 specific conductivity 0.5~
25. The protein or virus to be treated is adsorbed under conditions of Oms/cm, then washed with the same buffer as that used for the equilibration, or a buffer with a higher specific conductivity, and finally, the ion Highly purified by elution using a mild S solution with a pH of 0-10°0, specific conductivity 5, and 0-130ms/eta, which has a strength higher than that of the buffer used for the above-mentioned equilibration and washing. protein or virus can be obtained. Note that the purification operation can be performed by either a batch method or a column method.

Ｌ記精製操作について、百日せき菌の産生する蛋白質で
あるＦ−ＨＡおよびＬＰＦ−ＨＡの単離精製の場合を例
にとってさらに具体的に説明すれば下記のとお１）であ
る。The purification procedure described in L will be described in more detail in 1) below, taking as an example the isolation and purification of F-HA and LPF-HA, which are proteins produced by Bordetella pertussis.

（１）　　Ｆ−ＨＡの単離精製 後記実施例１で得られる架橋アガロース硫酸エステルデ
ルは、あらかじめ例えば０．２Ｍ塩化ナトリウム添加（
１，０１人１リン酸緩衝液等の、中性付近のｐＨ値（１
）Ｈ６〜９）であり、比電導度５〜２５　ｎ＋ｓ／ｃ＋
＋＋程度の適当な緩Ｎｌｊ液を用いて平衡化を行なった
後に、Ｆ　−ＨＡの吸着操作に洪する。(1) Isolation and purification of F-HA The cross-linked agarose sulfate ester obtained in Example 1 described below is prepared by adding 0.2M sodium chloride (
1,01 people 1 pH value near neutrality (1
) H6-9), specific conductivity 5-25 n+s/c+
After equilibration using a suitable mild Nlj solution of about ++, the F-HA adsorption operation is carried out.

架橋アガロース硫酸エステルゲルへのＦ−ＨＡの吸着、
ゲルの洗浄、Ｆ−ＨＡの溶出等一連の精製操作は、バッ
チ法およびカラム法等の工業的に通常よく用いられる挽
作方法で行なう。バッチ法で行なう場合は、百日せき菌
培養物中に架橋アガロース硫酸エステルデルを投入し、
ｐＨ６，０〜９．０程度の範囲においてＯ〜３　（１’
Ｃ程度の温度にて１０〜６０分程度緩く撹拌してＦ−Ｈ
Ａを吸着させる。この際、百日せき菌培養物の比電導度
が５．０−２５．０ｍｓ／ｃｍ程度となるように、適宜
）層線または希釈して吸着操作に付す。Adsorption of F-HA onto cross-linked agarose sulfate gel,
A series of purification operations such as gel washing and F-HA elution are carried out by a grinding method commonly used in industry, such as a batch method or a column method. When performing the batch method, add cross-linked agarose sulfate del to the B. pertussis culture;
O~3 (1'
Stir gently for about 10 to 60 minutes at a temperature of about C to F-H.
Adsorb A. At this time, the B. pertussis culture is subjected to the adsorption operation after being layered or diluted as appropriate so that the specific conductivity is about 5.0-25.0 ms/cm.

吸着終了後、培養物−デル混合液を濾過器上に充填し、
吸引濾過してゲルと炉液を分離する。分離したゲルを、
比電導度５〜２５ｍ５／ｃｍ程度で、ｐＨが５．０〜１
０．０程度である適当な緩衝液例えば、０．２Ｍ塩化ナ
トリウム添加０．０２Ｍマツキルベン（Ｍｅ　Ｉ　１ｖ
ａｉｎｅ’ｓ）緩衝液、０　、３　Ｍ塩化ナトリウム添
加０．０１Ｍリン酸緩衝液あるいは０．３Ｍ塩化ナトリ
ウム添加０．ＯＩＭ）リス塩酸緩衝液等を注ぎ吸引して
洗浄する。After the adsorption is completed, fill the culture-del mixture onto the filter,
Separate the gel and solution by suction filtration. The separated gel is
Specific conductivity is about 5-25 m5/cm, pH is 5.0-1
For example, 0.02M pine kilbene (Me I 1v
aine's) buffer, 0.01M phosphate buffer with 3M sodium chloride or 0.01M phosphate buffer with 0.3M sodium chloride. OIM) Pour lithium-hydrochloric acid buffer, etc. and aspirate to wash.

この後、ｐＨが５．０〜１０．０程度で、比電導度が２
５−１３０　＋ｎｓ／ｃｍ程度である（上記洗浄用緩衝
液の比電導度より大）適当な緩衝液、例えば１．５Ｍ塩
化ナトリウム添加マツキルベン緩衝液、１．５Ｍ塩化す
）　１７ウム添加リン酸緩衝液等を注ぎ、吸着している
Ｆ−ＨＡを溶出する。After this, the pH is about 5.0 to 10.0 and the specific conductivity is 2.
Approximately 5-130+ns/cm (greater than the specific conductivity of the washing buffer mentioned above).Appropriate buffer, such as 1.5M sodium chloride-added pine kirbene buffer, 1.5M chloride-added phosphate buffer) The adsorbed F-HA is eluted by pouring a liquid, etc.

カラム法にて実施する場合は、原材料液、洗浄用緩衝液
、溶出用緩衝液の条件はバッチ法の場合と同様でよく、
これらの通液速度は１０ｍｌ／ｃｎ＋”／Ｈｒ−５０（
ｈｌ／ｃ＋ｏ２／Ｈｒ程度に調整して行なうとよい。When using the column method, the conditions for the raw material solution, washing buffer, and elution buffer may be the same as for the batch method.
The flow rate of these liquids is 10ml/cn+”/Hr-50 (
It is preferable to adjust it to about hl/c+o2/Hr.

上記方法によれば、架橋アガロース硫酸エステルゲルの
百日せき菌培養物中のＦ−ＨＡの特異的吸着能にすぐれ
、Ｆ−ＨＡの精製度は従来法に比し数十倍に達し、しか
もＦ−ＨＡの回収率は９０％以上１００％近くに達する
。得られる精製Ｆ−ＨＡの比活性は４−８Ｘ１０’　Ｈ
Ａ−Ｌ−ット／　１１ｇ蛋白質ときわめて高く、ポリア
クリルアミドディスク電気泳動（ｐＨ４，５）分析にお
いて単一のバンドを形成し、百日せき菌内毒素がほぼ完
全に除去される。According to the above method, the cross-linked agarose sulfate ester gel has excellent specific adsorption ability for F-HA in B. pertussis culture, and the degree of purification of F-HA is several tens of times higher than that of the conventional method. The recovery rate of F-HA reaches 90% or more and nearly 100%. The specific activity of the purified F-HA obtained is 4-8X10'H
A-L-t/11g protein is extremely high, forms a single band in polyacrylamide disk electrophoresis (pH 4, 5) analysis, and Bordetella pertussis endotoxin is almost completely removed.

（２）　　ＬＰＦ−ＨＡの単離精製 原材料液であるＬＰＦ−ＨＡ含有液は、百日せき菌培養
物の遠心上清を、蒸留水または緩衝液で比電導度が０　
、５−５　、　Ｏｍｓ／ｃａｎとなるように希釈した後
、吸着操作に付すこともできるが、この上清中には架橋
アガロース硫酸エステルデルに対して同じく親和性を有
するＦ−ＨＡが含まれているため、あらかじめ、ＬＰＦ
−ＨＡは吸着せずＦ−ＨＡを吸着する条件にて、架橋ア
ガロース硫酸エステルゲルによるクロマトグラフィを行
ない、その素通り画分であるところのＦ　−ＨＡを含ま
ずＬＰＦ−ＨＡを大量に含んだ両分を吸着操作に（」す
。(2) Isolation and purification of LPF-HA The LPF-HA-containing solution, which is a raw material solution, is obtained by diluting the centrifuged supernatant of a B. pertussis culture with distilled water or a buffer solution until the specific conductivity is 0.
, 5-5, it is also possible to subject it to an adsorption operation after diluting it to Oms/can, but this supernatant contains F-HA, which also has an affinity for cross-linked agarose sulfate ester. Therefore, the LPF
Chromatography was performed using a cross-linked agarose sulfate ester gel under conditions that adsorbed F-HA but not -HA. into the adsorption operation.

架橋アガロース硫酸エステルゲルへのＬＰＦ−ＨＡの吸
着、ゲルの洗浄、ＬＰＦ−ＨＡの溶出等一連の精製程作
は、バッチ法お上びカラム法箸の工業的に通常よく用い
られる繰作方法で行なうことかできるが、カラム法の方
が繰作が簡単であり好都合である。カラム法の場合、架
橋アカ゛ロー又硫酸エステルデルをカラムに充填し、あ
らかしめ例えば０　、０２　Ｍマツキルベン緩衝液（ｐ
ｉ−１５，２）等の比電導度０．５−５．０ｍｓ／ｃｍ
でｐＨが５．０〜９．０程度である適当な緩衝液を通液
して平衡化を行った後に、ＬＰＦ−）ＩＡの吸着操作に
移る。A series of purification processes, such as adsorption of LPF-HA onto cross-linked agarose sulfate gel, washing of the gel, and elution of LPF-HA, are carried out by the batch method and column method, which are commonly used industrially. However, the column method is easier to repeat and more convenient. In the case of the column method, the column is filled with cross-linked akaryo or sulfate ester, and pre-warmed with, for example, 0,02 M pine kilbene buffer (p
Specific conductivity of i-15,2) etc. 0.5-5.0ms/cm
After equilibration is carried out by passing a suitable buffer solution having a pH of about 5.0 to 9.0, the operation for adsorption of LPF-)IA is started.

吸着に際しては、ＬＰＦ−ＨＡの含有液をｐＨか５．０
〜９．０、比電導度か０．５〜５．０になるように適宜
調整して、架橋アがロース硫酸エステルゲル充填カラム
に通液し、ＬＰＦ−）（Ａを吸着させる。この後、前述
の平衡化に用いたのと同様の緩衝液を通液し、ゲルを洗
浄し、夾雑物質を洗い出す。During adsorption, adjust the LPF-HA containing solution to pH 5.0.
~9.0, the specific conductivity is adjusted appropriately to 0.5 to 5.0, and the cross-linked A is passed through a gel-packed column of loose sulfate ester to adsorb LPF-) (A. After this, , the gel is washed with a buffer solution similar to that used for the above-mentioned equilibration, and contaminants are washed out.

ＬＰＦ−ＨＡの溶出に際しては、ｐＨか５．０〜９．０
、比電導度が５．０ｍｓ／ａｍ以上である適当な緩衝液
を通液し溶出を行なうが、好ましくは段階溶出または塩
濃度勾配溶出を行なう。すなわち、原材料液として百日
せき菌培養液の遠心上清の希釈したちのをそのまま用い
る場合は、１ｉｉｊ述の吸着条件下において、Ｌ　Ｐ　
Ｆ　−ＨＡと同時にＦ　−１−Ｉ　Ａも吸着されてくる
ので、Ｌ　Ｐ　Ｆ　−）Ｉ　Ａか溶出され、かっＦ　−
ＨＡが溶出されない条件下で溶出する必要がある。この
条件としては１）Ｈ５〜！Ｊにおいて比電導度５−１０
　ｔ）　ｉｎｓ／ｃｏ＋、好ましくは５０〜６ｔ）ｍｓ
／ｃｍである適当な緩衝液（例えば０．７　Ｍ塩化すＹ
リウム添加０．０２ト４マツキルベン緩衝液）を最初に
通液し、ＬＰＦ−ＨＡを含む両分を回収する。この後に
上述の溶出用緩衝液より比電導度の大なる（１００−３
００ｍｓ／ｃｍ）緩衝液を通液し、Ｆ−ＨＡその池の不
純成分を溶出させ、架橋アガロ−又硫酸エステルゲルを
平衡化再使用に供する。When eluating LPF-HA, the pH should be 5.0 to 9.0.
Elution is carried out by passing a suitable buffer solution having a specific conductivity of 5.0 ms/am or more, preferably stepwise elution or salt concentration gradient elution. That is, when using the diluted centrifuged supernatant of B. pertussis culture as a raw material solution, L P
Since F-1-IA is also adsorbed at the same time as F-HA, LPF-)IA is eluted, and F-HA is eluted.
It is necessary to elute under conditions in which HA is not eluted. The conditions are 1) H5~! Specific conductivity 5-10 in J
t) ins/co+, preferably 50-6t) ms
/cm of a suitable buffer (e.g. 0.7 M YCl
0.02 to 4 pine kilbene buffer) was first passed through the tube, and both portions containing LPF-HA were collected. After this, a solution with a higher specific conductivity than the elution buffer mentioned above (100-3
00 ms/cm) buffer solution is passed through the gel to elute impure components in the F-HA pool, and the crosslinked agaro-sulfate gel is equilibrated and reused.

最ら好ましくは、塩濃度勾配溶出を実施する。Most preferably, a salt gradient elution is performed.

原材料液として、あらかじめＦ−ＨＡを分離したＬＰＦ
−）（Ａ含有液を用いる場合においてら、比電導度が０
．５→３００＋ｏｓ／ｃｍとなるような塩濃度勾配緩衝
液（例えば塩化ナトリウム０→４　、ＯＭ塩濃度勾配・
０．０２Ｍマツキルベン緩衝液（１）Ｈ５，２）を用い
て溶出を行ない、ＬＰＦ−ＨＡ含有両分を分取すれば、
きわめて高純度のＬＰＦ−ＨＡを得ることができる。LPF from which F-HA has been separated in advance as a raw material liquid
-) (When using A-containing liquid, the specific conductivity is 0.
．． 5→300+os/cm (e.g., sodium chloride 0→4, OM salt gradient buffer)
If elution is performed using 0.02M pine kilbene buffer (1) H5, 2) and both fractions containing LPF-HA are separated,
LPF-HA of extremely high purity can be obtained.

上記の精製法によれば、ＬＰＦ−ＨＡの精製度は従来法
に比し数十倍に達し、しかもＬＰＦ−ＨＡの回収率は９
０％以上１００％近くに達する。According to the above purification method, the degree of purification of LPF-HA is several tens of times higher than that of the conventional method, and the recovery rate of LPF-HA is 9.
It reaches from 0% to nearly 100%.

得られる精製ＬＰＦ−ＨＡの比活性は９Ｘ１０４ＬＰＥ
Ｕ／＋ａＨ蛋白質ときわめて高く、ポリアクリルアミド
ディスク電気泳動（ｐＨ４，５）分析において単一のバ
ンドを形成し、百日せき菌内毒素がほぼ完全に除去され
る。The specific activity of the purified LPF-HA obtained is 9X104LPE.
It is extremely high in U/+aH protein, forms a single band in polyacrylamide disk electrophoresis (pH 4, 5) analysis, and Bordetella pertussis endotoxin is almost completely removed.

つぎに、本発明の７フイニテイクロマトグラフイ用ゲル
の製造に関する実施例およびそのゲルを用いた各種蛋白
買主たけウィルスの精製に関する実験例を挙げて本発明
をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定さ
れない。Next, the present invention will be explained in more detail with reference to Examples relating to the production of a gel for 7 Finitei chromatography of the present invention and experimental examples relating to the purification of various protein-purifying viruses using the gel. The invention is not limited to these.

実施例１ ０°Ｃ以下の温度にてピリジン２００＋ａｌｌこりロル
スルホン１１１１＋ＩＩｌを滴下し、混合する。滴下終
了後、混液を加熱し、６５〜７０’Ｃに昇温する。この
中にエピクロルヒドリン架橋ア〃ロースであるセフ７０
−ズＣＬ−６Ｂ（７フルマシア社製）７゜５ｇを加え、
撹拌下６５〜７０°Ｃにて４時間保持する。反応終了後
、冷却し、水酸化ナトリウム水溶液を加えて中和する。Example 1 Pyridine 200+all lorsulfone 1111+IIl are added dropwise at a temperature below 0°C and mixed. After the addition is complete, the mixed solution is heated to 65-70'C. This includes Cef70, which is epichlorohydrin cross-linked allose.
Add 7゜5g of -'s CL-6B (manufactured by 7Furmacia),
Hold at 65-70°C for 4 hours under stirring. After the reaction is completed, it is cooled and neutralized by adding an aqueous sodium hydroxide solution.

ゲルをシ濾過分＃ｉＩ　シ、０゜０１Ｍリン酸緩衝食塩
液で充分に洗浄して架橋アガロース硫酸エステルゲルを
得る。The gel was thoroughly washed with 0.01M phosphate buffered saline to obtain a cross-linked agarose sulfate gel.

実施例２ 上記実施例１と同様にして調製したピリジン−クロルス
ルホン酸混ｔ２１０ｍｌに、架橋セルロースゲルである
セルロファインＧＣＬ−２５（チッソ社製）の乾燥物７
．５ｇを加え、６５〜７０°Ｃにて４時間反応させる。Example 2 To 210 ml of a pyridine-chlorosulfonic acid mixture prepared in the same manner as in Example 1 above, 7 ml of dried cellulofine GCL-25 (manufactured by Chisso Corporation), which is a crosslinked cellulose gel, was added.
．． Add 5g and react at 65-70°C for 4 hours.

反応終了後、冷却し、水酸化ナトリウム水溶液を加えて
中和する。ゲルを濾過分離し、０．ＯＩＭＩＪン酸緩衝
食塩液で充分に洗浄して架橋セルロース硫酸エステルデ
ル７８２Ｂを得る。After the reaction is completed, it is cooled and neutralized by adding an aqueous sodium hydroxide solution. The gel was separated by filtration and 0. Cross-linked cellulose sulfate ester Del 782B is obtained by thorough washing with OIMIJ acid buffered saline solution.

実施例３ 前記実施例１と同様にして調製したビリノン−クロルス
ルホン酸混液２１０＋ｏｌに、架橋アガロースゲルであ
るセファロースＣＬ−６Ｂ（７フルマシア社製）のピリ
ジン包含体３０＋１１１を加え、６５〜７０°Ｃに′Ｃ
４時間反応させる。反応終了後、冷却し、水酸化ナトリ
ウム水溶液を加えて中和する。Example 3 Pyridine inclusions 30+111 of Sepharose CL-6B (manufactured by 7 Flumacia), which is a cross-linked agarose gel, were added to 210+ol of the birinone-chlorosulfonic acid mixture prepared in the same manner as in Example 1, and the mixture was heated at 65 to 70°C. ni'C
Allow to react for 4 hours. After the reaction is completed, it is cooled and neutralized by adding an aqueous sodium hydroxide solution.

デルを濾過分離し、０．ＯＩＭ’Ｊン酸緩衝食塩液で充
分に洗浄して架橋アガロース硫酸エステルゲル２３ｍ１
を得る。The del is separated by filtration and 0. Wash thoroughly with OIM'J acid-buffered saline solution and remove 23 ml of cross-linked agarose sulfate gel.
get.

実験例１（ＨＢｓ抗原の精製） 前記実施例２で得られた架橋セルロース硫酸エステルゲ
ルを充ｊ眞したカラム（２６，４＋ｎ＋ｏφ×１０５ｎ
ｕΩ）に、０．０５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２７
Ｎ１マツキルベン緩衝液（ｐＨ７，３９）を通し平衡化
する。このカラムにＨＢｓ抗原陽性人血清２０　ｍ　ｌ
を上記緩衝液で倍量に希釈したものを通液する。その後
、上記緩衝液で充分に洗浄する。ついで、０．６Ｍ塩化
ナトリウムを含む０．０２７ＭマツキルベンＭ？Ｘｊ’
を液（ｐＨ７，３９）で溶出する。この結果を第１表に
示す。第１表に示すように、ＨＢｓ抗原は溶出画分にほ
ぼ回収され、精製度は約１７倍に達した６ 第１表 ＊１）　　ラノオイム７アッセイ（グイナボット社製、
オーセリア［１−１２５＞で測定。Experimental Example 1 (Purification of HBs antigen) A column filled with the crosslinked cellulose sulfate gel obtained in Example 2 (26,4+n+oφ×105n
0.027 μΩ) containing 0.05M sodium chloride
Equilibrate through N1 pine kilbene buffer (pH 7,39). Add 20 ml of HBs antigen positive human serum to this column.
diluted with the above buffer solution and passed through the tube. Then, wash thoroughly with the above buffer solution. Next, 0.027M Pine Kirbene M containing 0.6M Sodium Chloride? Xj'
is eluted with a solution (pH 7,39). The results are shown in Table 1. As shown in Table 1, HBs antigen was almost recovered in the elution fraction, and the degree of purification reached approximately 17 times.
Measured with Auxeria [1-125>.

（黒用正身、斉藤晴−：　Ｊａｐａｎ−Ｊ、ｔＭｅｄ。(Kuroyo Seishin, Saito Haru: Japan-J, tMed.

Ｓｃｉ、Ｂｉｏｌ、、３２　・４７−５２（１９７９）
を参照） なお、上記私製したＨＢｓ抗原の一部を超遠心分析した
。すなわち、日立７０Ｐ−７２超遠心磯およびＲＰＳ４
０ＴＣ７−ターを用い、塩化セシウム密度勾配を作り、
これにサンプルをのせ、４０゜０００叩【０で１５時間
遠心したところ、このＨＢｓ抗原はρ＝　１　、２　（
＝１近に鋭いピークを示した。こｈは）＾製されたＨＢ
ｓ抗原が単一のものであることを示すものである。Sci, Biol, 32, 47-52 (1979)
) A portion of the above-mentioned privately produced HBs antigen was analyzed by ultracentrifugation. Namely, Hitachi 70P-72 Ultracentrifugal Iso and RPS4
Using 0TC7-tar, create a cesium chloride density gradient,
When a sample was placed on this and centrifuged at 40°000 for 15 hours, the HBs antigen was found to be ρ = 1, 2 (
A sharp peak was observed near =1. hha) ＾Made HB
This shows that the s antigen is a single one.

比較実験例１ 前記実施例２の硫酸エステル化前の原料架橋セルロース
デルであるセルロファインＧＣＬ−２５をカラム（２６
，４ｍｍφＸ　１２０ｍｍ）に充填し、これを０．０５
Ｍ塩化ナトリウムを含む０．０２７Ｍクエン酸緩衝液（
ｐＨ７，４０）で平衡化する。このカラムに実験例１で
用いたＨＢｓ抗原陽性人血漿と同一ロットの血９２０．
０ｍｌを上記緩衝液で２倍に希釈して通液し、同緩衝戒
でカラムを充分に洗浄する。ついで０　、６　Ｍ塩化ナ
トリウムを含む（、’１．０２７八４クエン酸緩衝液（
ｐＨ７，４０）で溶出した。ＨＢｓ抗原の９８．２％は
素通り画分に回収され、また蛋白質もほぼ完全に（９６
，７％）素通り液に回収された。溶出画分に吸光度のピ
ークは観察されず、またＨＢｓ抗原価は１：２以下（Ｒ
ＰＨＡ）であり、ＨＢｓ抗原は全く精製できなかった６
実験例２（インフルエンザウィルスの精製）前記実施例
１で摺られた架橋アガロース硫酸エステルゲルをカラム
（２５τｏ１０φＸ　１００　ＩＩＩτ１１）に充ｊ眞
し、これに０．１４Ｍ塩化ナトリウムを含む０　、１：
＋１０Ｍリン酸緩衝１（ｐＨ７、４）を通液し平衡化す
る。このカラムにＡ／石川（Ｈ，Ｎ２）タイプインフル
エンザウィルス感染尿膜膣液１ｓ（１＋ｎｌを通液する
。その後に０．１４Ｍ塩化ナトリウムを含む０゜０１Ｍ
リン酸緩衝液、１００ｍ１を通して洗浄する。Comparative Experiment Example 1 Cellulofine GCL-25, which is the raw material crosslinked cellulose del before sulfuric acid esterification of Example 2, was placed in a column (26
, 4mmφX 120mm) and fill it with 0.05
0.027M citrate buffer containing M sodium chloride (
Equilibrate at pH 7.40). This column was filled with 920 ml of blood from the same lot as the HBs antigen positive human plasma used in Experimental Example 1.
0 ml is diluted twice with the above buffer and passed through the column, and the column is thoroughly washed with the same buffer. Then 1.02784 citrate buffer containing 0,6 M sodium chloride (
It was eluted at pH 7.40). 98.2% of the HBs antigen was recovered in the flow-through fraction, and the protein was almost completely recovered (96.2%).
, 7%) was recovered in the flow-through liquid. No absorbance peak was observed in the elution fraction, and the HBs antigen titer was less than 1:2 (R
PHA), and HBs antigen could not be purified at all 6
Experimental Example 2 (Purification of Influenza Virus) The cross-linked agarose sulfate gel prepared in Example 1 was filled into a column (25τo10φX 100IIIτ11), and the column was coated with 0.14M sodium chloride.
+10M phosphate buffer 1 (pH 7, 4) is passed through to equilibrate. 1 s (1+nl) of A/Ishikawa (H, N2) type influenza virus infected allantoic vaginal fluid is passed through this column. After that, 0°01M containing 0.14M sodium chloride is passed through the column.
Wash through 100 ml of phosphate buffer.

ついで、１．４９Ｍ塩化ナトリウムを含む（１，０１ｏ
　Ｍ１７ン酸緩衝液で溶出し、溶出画分５０１１１ｆ２
．を得る。その後、４．９９Ｍ塩化ナトリウムを含む０
．０１Ｍリン酸緩衝液でゲルを溶出洗浄する。Then, containing 1.49M sodium chloride (1,01o
Elute with M17 acid buffer, eluate fraction 50111f2
．． get. Then, 0 containing 4.99M sodium chloride
．． Elute and wash the gel with 01M phosphate buffer.

この結果を第２表に示す。The results are shown in Table 2.

第２表 ＊）　　ＣＣＡ（ｃｈｉｃｋ　ｃｅｌｌ　ａｇｇｌｕｔ
ｉｎａｔｉｏｎ）　＝鶏赤血球凝集反応により測定した
ウィルス量の単位、比活性とは、トリクロル酢酸を用い
て沈殿させた蛋白質窒素量を比色定量し、その値（ＴＣ
Ａ−Ｎ）とウィルスｆｆ１（ＯＣＡ）との比で蛋白質窒
素量当りのウィルス（抗原）量を示す。Table 2*) CCA (chick cell agglut
Specific activity is a unit of the amount of virus measured by chicken hemagglutination reaction, and the specific activity is determined by colorimetrically quantifying the amount of protein nitrogen precipitated using trichloroacetic acid.
The ratio of A-N) to virus ff1 (OCA) indicates the amount of virus (antigen) per amount of protein nitrogen.

第２表に示すように、インフルエンザウィルスは溶出画
分にはパ回収され、精製度は約１２倍に達した。As shown in Table 2, the influenza virus was recovered in the eluted fraction, and the degree of purification reached approximately 12 times.

実験例３（日本脳炎ウィルスの精！り 前記実施例１と同様にして調製しｒこ架橋アガロ−久硫
酸エステルゲル３’７．５Ｊをカラム（２５Ｔｌｌ　Ｉ
ＩＩφＸ　４００　ｎｕｎ）に充填する。次に、０．１
４ＭＮａＣ４添加０．ＯＩＭリンｅｔ緩’ｆＨｆＬ３７
５　＋ｎ　、Ｑにてゲルを平衡化したのちこのカラムに
プロタミン−歳末処理して得られる不活化日本脳炎ウィ
ルス浮遊液４０　ｍｌを通液する。０．１４ＭＮａＣｐ
添加０．ＯＩＭリン酸緩衝液にて、ゲルを十分洗浄した
後、１．５ＭＮａＣ，ｇ添加１０　（、Ｉ　Ｎｉリン酸
緩衝液（比電導度的１２０ｍｓ／ｅｒｏ、ｐＨ７，２）
１００Ｊを用いて溶出を行ない、約５　Ｉｌｌ　Ｊ？　
　ずつ分画して分取した後、日本脳炎ウィルスを含有す
る両分的１０Ｊ　をプールする。Experimental Example 3 (Preparation of Japanese Encephalitis Virus) A column (25 Tll I
IIφX 400 nun). Next, 0.1
4M NaC4 addition 0. OIM Lin et Yuru'fHfL37
After equilibrating the gel at 5+n and Q, 40 ml of an inactivated Japanese encephalitis virus suspension obtained by protamine treatment was passed through the column. 0.14M NaCp
Addition 0. After thoroughly washing the gel with OIM phosphate buffer, add 1.5M NaC, 10g (I Ni phosphate buffer (specific conductivity 120ms/ero, pH 7.2)
Elution was performed using 100 J, approximately 5 Ill J?
After fractionating and separating each fraction, 10 J of both fractions containing Japanese encephalitis virus are pooled.

原材料液およＩ／’ｉｆ製日本脳炎ウィルス画分の分析
結果および実験成績を第３表に示す。Table 3 shows the analysis results and experimental results of the raw material liquid and the I/'if Japanese encephalitis virus fraction.

第３表 実験例４ 前記実施例２と同様にして調製した架橋セルロース硫酸
エステルケ′ル５＋ｌＩｌをカラム（４０＋ｎｍφＸ２
ｔ）Ｏｍｍ）に充」眞し、これに蒸留水２００ｍ１を通
液する。このカラムに百日せきＩ相菌束浜株静置培養液
の遠心上清１００ｍ１を蒸留水で７倍希釈した液（比電
導度的３　、０　＋ｎｓ／ｅｒ１１）、を通液する。Table 3 Experimental Example 4 A column (40+nmφX2
t) Fill to 0mm) and pour 200ml of distilled water through it. A solution obtained by diluting 100 ml of a centrifuged supernatant of a static culture of Pertussis I phase bacteria Tsukahama strain 7 times with distilled water (specific conductivity: 3, 0 + ns/er, 11) is passed through this column.

約２００＋１１１の０．０２Ｍマツキルベン緩衝液（ｐ
Ｈ５，２）をカラムに通渡し、ゲルを洗浄した後、０゜
０２Ｍ塩化ナトリウム添加マツキルベン緩衝液（比電導
度的２．Ｏｍｓ／ｃｍ、ｐＨ５，２）５０ｍｌを用い、
塩化ナトリウム０→４．ＯＭの塩濃度勾配置５で溶出を
行ない、約Ｌｄずつ分画して分取した後、ＬＰ　Ｆ　−
ＨＡを含有する両分的６ｔＩＩｌをプールする。Approximately 200 + 111 0.02M pine kirbene buffer (p
After passing H5,2) through the column and washing the gel, using 50 ml of pine kilbene buffer (specific conductivity 2.Oms/cm, pH 5,2) containing 0.02M sodium chloride,
Sodium chloride 0→4. Elution is carried out using the salt concentration gradient device 5 of OM, and after fractionation and collection in approximately Ld portions, LPF −
Pool the bipartite 6tIII containing HA.

原材料液および精！！！ＬＰＦ−ＦＩＡ画分の分析結果
および実験成績を第４表に示す。Raw material liquid and essence! ! ! Table 4 shows the analysis results and experimental results of the LPF-FIA fraction.

第　　４　表 １）ＬＰＦ−ＨＡのｉｎ　ｖｉｔｒｏテスト：ハプト−
ＥＬＩＳＡ法［佐藤ら、第２８回母素シンポジウム予稿
集１４１−１４４（ｉｌｌ）を参照１によるＬＰＦＨＡ
の単位 ２）キルブール法蛋白窒素測定値Ｘ６．２５により蛋白
質含量として表示 ３）　　６．２５μｇ蛋白質／　＋ｎ　Ｉの含量に希釈
後、生物学的製剤基準（薬発２８７号、１９８１）に樵
じて不活化して実施した。Table 4 1) In vitro test of LPF-HA: Hapto-
LPFHA by ELISA method [Sato et al., see 28th Mother Element Symposium Proceedings 141-144 (ill) 1
2) Displayed as protein content using the Kirbourg method protein nitrogen measurement value It was carried out after being inactivated.

Claims (4)

【特許請求の範囲】[Claims] （１）架橋ポリサッカライドの固体粒状物を固体粒状状
態を保持しながら硫酸エステル化したのちアルカリで中
和して得られる群特異性を有するアフィニティクロマト
グラフィ用ゲル。(1) A gel for affinity chromatography having group specificity obtained by converting a solid particulate crosslinked polysaccharide into a sulfuric acid ester while maintaining its solid particulate state and then neutralizing it with an alkali. （２）該架橋ポリサッカライドが架橋アガロースまたは
架橋セルロースである前記第（１）項記載のゲル。(2) The gel according to item (1) above, wherein the crosslinked polysaccharide is crosslinked agarose or crosslinked cellulose. （３）硫酸エステル化剤をアミンまたはアミドに溶解さ
せ、これに架橋ポリサッカライドの固体粒状物を反応さ
せ、ついでアルカリで中和することを特徴とする群特異
性を有するアフィニティクロマトグラフィ用ゲルの製法
。(3) A method for producing a gel for affinity chromatography with group specificity, which comprises dissolving a sulfuric acid esterifying agent in an amine or amide, reacting solid particles of crosslinked polysaccharide therewith, and then neutralizing with an alkali. . （４）硫酸エステル化剤が無水硫酸またはクロルスルホ
ン酸である前記第（３）項記載の方法。(4) The method according to item (3) above, wherein the sulfuric acid esterifying agent is sulfuric anhydride or chlorosulfonic acid.