JPS6150597B2 - - Google Patents

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【発明の詳細な説明】 発明の概要 技術分野 本発明は、ブレビバクテリウム・アセチリカム
の新菌株に関する。さらに具体的には、本発明
は、１，２，４―トリアゾール―３―カルボキサ
ミドとリボース供与体とからリバビリンを生成す
る反応を触媒する酵素系の活性の強いブレビバク
テリウム・アセチリカムの新菌株に関する。 リバビリンの化学名は１―β―Ｄ―リボフラノ
シル―１，２，４―トリアゾール―３―カルボキ
サミドであり、バイラゾール（Virazole）とも称
され、DNAおよびRNAウイルスに対して広範囲
で強力な抗ウイルス作用を示す化合物として知ら
れている（アナルズ・オブ・ザ・ニユーヨーク・
アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ann.New
York Acad.Sci.）284、272〜292（1977））。 従来技術 従来知られているリバビリンの製造法としては
合成法、発酵法および酵素法がある。 合成法の代表的な方法としては、３―メトキシ
カルボニル―１，２，４―トリアゾールと１―Ｏ
―アセチル―２，３，５―トリ―Ｏ―アシル―β
―Ｄ―リボフラノースを反応させ（溶融法）、得
られた１―（2′，3′，5′―トリ―Ｏ―アシル―β
―Ｄ―リボフラノシル）―３―メトキシカルボニ
ルをアンモニアで処理し、アミド化と脱保護を行
う方法（特開昭48−4469号、特開昭49−80070
号、特開昭49−80071号各公報参照）、前記と同様
の方法においてトリアゾールの３位の置換基とし
てアラルキルオキシ基を用いる方法（特開昭55−
160793号公報参照）、３―メトキシカルボニル―
１，２，４―トリアゾールをトリメチルシリル化
し、２，３，５―トリ―Ｏ―ベンゾイル―β―Ｄ
―リボフラノシドのハロゲン化物と反応させた
（シリル化法）後、アンモニアで処理する方法
（特開昭48−4469号、特開昭49−86372号各公報参
照）などが知られている。このような合成法は、
いずれも反応前に原料化合物の活性基を保護する
必要があり、また反応に際してはリボースの活性
化が必要であつたり、高温に加熱する必要がある
場合もあり、さらに、反応後に脱保護およびアミ
ド化が必要であるなど反応操作が煩雑であるなど
の問題があると思われる。また、縮合反応の位置
選択性はいずれも高くないようである。 発酵法としては、ブレビバクテリウム属、コリ
ネバクテリウム属、アースロバクター属、ミクロ
コツカス属またはバチルス属に属する微生物を培
養して増殖させる際に、使用微生物の培養のため
に必要な炭素源、窒素源、無機物、その他の栄養
物を含有する培地に、培養開始前または培養中、
一時にまたは間歇的に１，２，４―トリアゾール
―３―カルボキサミドを添加し、培養開始後２〜
８日間という長期間にわたつて培養し、培地中に
リバビリンを生成蓄積させる方法が知られている
（特公昭54−17830号公報、日本農芸化学誌、50
(9)、423〜430（1976）参照）。 この方法は、しかしながら、次のような欠点を
有するものと思われる。すなわち、リバビリン
の製造は微生物の増殖中に栄養培地中で行われる
ので、まず微生物を増殖させるために各種の栄養
源を含有する培地を調製しなければならず、種菌
を植菌する前にこれらの培地を殺菌しなければな
らないなど前処理が煩雑である。リバビリンの
蓄積を目的とする、微生物の増殖を伴う培養は通
常20〜40℃の常温で行われるので、常に雑菌汚染
への配慮が必要であるばかりでなく、このような
条件下ではリバビリン分解活性も存在しているの
で、生成したリバビリンも分解され、目的物の収
量が低下する。培養を２〜８日間という長期間
にわたつて行わなければならない。各種のヌク
レオシド、リバビリンのりん酸化物、その他の代
謝産物が副生し、培養液からリバビリンを回収す
るためには、原料化合物だけでなく、各種の副生
物とも分離しなければならず単離精製が煩雑であ
る。微生物をリバビリンの製造の度に培養しな
ければならない。 また、酵素的な製造法としては１，２，４―ト
リアゾール―３―カルボキサミドとリボース―１
―ん酸とをPH５〜９、温度０〜50℃の条件下でヌ
クレオシドホスホリラーゼの存在下において反応
させる方法が知られている（特開昭50−29720号
公報参照）。この方法も、リボース供与体とし
て用いられるリボース―１―りん酸が不安定であ
る上に、入手が容易でない、酵素として精製酵
素が用いられており、酵素の調製が容易でないな
どの欠点を有するものと思われる。 発明の概要 要旨 本発明者らは、微生物の培養物、菌体または菌
体処理物を酵素源とし、微生物の非増殖条件下に
酵素反応によつてリバビリンを生成させることが
できることを初めて知見し、ブレビバクテリウ
ム・アセチリカムの新規な特定の菌株が極めて高
いリバビリン生成能を有することを知見して、こ
の知見に基づいて本発明を完成した。 すなわち、本発明は、新菌株ブレビバクテリウ
ム・アセチリカムAT―６―７（微工研寄第6305
号）を提供するものである。 この新菌株によるリバビリンの製造は、１，
２，４―トリアゾール―３―カルボキサミドまた
はその塩とリボース供与体とを該微生物の酵素作
用下に該微生物の非増殖条件下において水性媒体
中で反応させてリバビリンを生成させること、に
よつて行うことができる。 ここで「酵素作用下に」ということは、使用微
生物の培養物、菌体または菌体処理物の存在下に
ということを意味する。 本発明新菌株を用いる上記のようなリバビリン
の製造法と、従来の発酵法とが最も相違する点
は、前者においては微生物の培養物、菌体または
菌体処理物を酵素剤とし、しかも微生物が増殖し
ない、酵素反応に最適な条件下で反応基質である
１，２，４―トリアゾール―３―カルボキサミド
またはその塩とリボース供与体とを反応させる点
である。 効果 本発明新菌株を使用する上記のようなリバビリ
ンの製造法は、発酵法に比べて、微生物の非増
殖条件、たとえば高温条件下で反応を行う場合に
は雑菌汚染がほとんどなく、リバビリンの分解反
応が抑制されるのでリバビリンの収率低下がな
い。酵素反応なので反応時間が短かく、副性物
の生成も少なく、リバビリンの単離精製が容易で
ある、酵素源の反復使用も、連続使用も可能で
ある、酵素源の保存が可能であり、酵素源の調
製および使用を任意な時期に行うことができるな
どの利点がある。また、酵素法に比べて酵素源
の調製が容易である、リボース供与体をヌクレ
オシド、ヌクレオチドなどから広く選択でき、リ
ボース供与体の入手が容易であるなどの利点があ
る。また、本発明新菌株を使用すれば、従来のこ
れらの方法に比べてはるかに高収率にリバビリン
を製造することができる。 発明の具体的説明 本発明は新菌株に関するが、この菌株は前記の
ようなリバビリンの製造に利用したときに特に有
用なものである。従つて、以下において本発明の
説明はこの菌株を前記のようなリバビリンの製造
に利用した場合についてこれを行うものとする。 酵素源／使用微生物 前記のようなリバビリンの製造法において使用
される微生物は、その培養物、菌体または菌体処
理物が、１，２，４―トリアゾール―３―カルボ
キサミドとリボース供与体との反応を触媒して、
リバビリンを生成する酵素系を含有するものであ
り、本発明によればこれは兵庫県西宮市の甲子園
球場の砂より分離されたAT―６―７株である。 この菌株の菌学的性質を以下に記載する。 A.形態 (1)細胞の形態および大きさ：短桿状、0.8〜1.0
×1.0〜1.2μｍ (2)胞子の形成：なし (3)グラム染色性：陽性 B.各種培地における生育状態 (1)肉汁寒天平板培養（28℃、48時間） 集落の形状：円形（Circular） 集落表面の***： 扁平状（Flat）、平滑（Smooth） 大きさ：２〜４mm 色調：黄色ないし桃黄色 (2)肉汁寒天斜面培養（28℃、48時間） 生育：良好 生育の形：疣状（Echinulate） (3)肉汁液体培養（28℃、48時間） 生育：表面に菌環（Ring）を形成し、やや
沈渣（Sediment）を生じる。 (4)肉汁ゼラチン穿刺培養（20℃、６日間）：層
状（Straitiform）に液化する (5)リトマスミルク培地（28℃、４日間）：わず
かに凝固し、ペプトン化も見られる。 C.生理的性質 (1)硝酸塩の還元（28℃、５日間）：還元性な
し。 (2)硫化水素の生成（28℃、５日間）：生成しな
い。 (3)澱粉の加水分解：分解性あり。 (4)カタラーゼ：陽性 (5)インドールの生成：生成しない。 (6)ペプトンおよびアルギニンからのアンモニア
の生成：陰性 (7)メチルレツドテスト：陰性 (8)Ｖ―Ｐテスト：陽性 (9)酸素に対する態度：好気的 (10)Ｏ―Ｆテスト（Hugh、Leifson法による）：
Ｆ型（Fermentation） 〓糖類からの酸の生成 陽性：グリコース、マンノース、フラクトー
ス、マルトース、サツカロース、トレ
ハロース 陰性：アラビノース、キシロース、ガラクト
ース、ラクトース、ソルビツト、イノ
シツト、グリセリン 〓生育PH範囲：PH6.0〜9.0 〓生育最適温度：25〜37℃ 以上の菌学的性質を、バージエーズ・マニユア
ル・オブ・デイタミネーテイブ・バクテリオロジ
ー（Bergey′s Manual of Determinative
Bacteriology）第７版（1957年）の分類基準によ
り検索した。その結果、AT―６―７株はほとん
ど球菌に近い短桿菌で、グラム陽性であり、フイ
ラメントを形成せず、炭水化物より酸を生成する
ことによりブレビバクテリウム
（Brevibacterium）属に属する菌株と同定し、ブ
レビバクテリウム・アセチリカム
（Brevibacterium acetylicum）AT―６―７と命
名した。 なお、AT―６―７株の同定帰属はバージエー
ズ・マニユアル・オブ・デイタミネーテイブ・バ
クテリオロジー第７版によるものであり、分類基
準の変更などにより、異なる分類基準によつてこ
の菌株の同定帰属が行われた場合には、他種ある
いは他属に属することもあり得るが、本発明にお
いて上記のごとく命名された微生物は、寄託機関
への寄託および前記の菌学的性質に基づいて、一
義的に特定され得るものである。 この菌株について、昭和56年通商産業省告示第
178号に従つて工業技術院微生物工業技術研究所
に対して寄託申請を行い、昭和57年１月13日付け
で受託され、受託番号として微工研菌寄第6305号
（FERM Ｐ―6305）が付与されている。 また、前記の菌株から、紫外線、Ｘ線、γ線の
照射などの物理的処理もしくはニトロソグアニジ
ンなどによる薬剤処理など、一般的変異誘導法に
よる誘発突然変異または自然の原因に起因する自
然突然変異によつて誘導された変異株も、本発明
の範囲内である。 酵素源の調製／培養 前記リバビリンの製造法に使用する酵素源を調
製するために、AT―６―７株を培養するに際し
ては、使用される培地および培養法は、この微生
物が生育する限り、特に限定されない。 培地としてはこの微生物が資化可能な炭素源お
よび窒素源を適当量含有し、必要に応じて無機
塩、微量発育促進物質、消泡剤などを添加したも
のが使用される。具体的には、炭素源としては、
グルコース、フラクトース、マルトース、ガラク
トース、リボース、サツカロース、澱粉、澱粉加
水分解物、糖蜜、廃糖蜜などの糖類もしくはその
脂肪酸エステルなどの誘導体、麦、〓、米などの
天然炭水化物、グリセロール、マンニトール、メ
タノール、エタノールなどのアルコール類、グル
コン酸、ピルビン酸、酢酸、クエン酸などの脂肪
酸類、ノルマルパラフイン、ケロシンなどの炭化
水素類、グリシン、グルタミン酸、グルタミン、
アラニン、アスパラギンなどのアミノ酸類など、
一般的な炭素源より使用する微生物の資化性を考
慮して一種または二種以上を適宜選択して使用す
ればよい。窒素源としては、肉エキス、ペプト
ン、酵母エキス、乾燥酵母、大豆加水分解物、大
豆粉、ミルクカゼイン、カザミノ酸、各種アミノ
酸、コーンステイープリカー、コツトンシードミ
ールないしその加水分解物、フイツシユミールな
いしその加水分解物、その他の動物、植物、微生
物の加水分解物などの有機窒素化合物、アンモニ
ア、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウム、りん酸アンモニウム、炭酸アンモ
ニウム、酢酸アンモニウムなどのアンモニウム
塩、硝酸ナトリウムなどの硝酸塩、尿素など無機
窒素化合物より使用微生物の資化性を考慮し、一
種または二種以上を適宜に選択して使用する。さ
らに、無機塩として微量のマグネシウム、マンガ
ン、鉄、亜鉛、銅、ナトリウム、カルシウム、カ
リウムなどのりん酸塩、塩酸塩、硫酸塩、炭酸
塩、酢酸塩などの一種または二種以上を適宜添加
し、必要に応じて植物油、界面活性剤などの消泡
剤、ビタミンB₁、B₂、ニコチン酸、パントテン
酸、ビオチン、ｐ―アミノ安息香酸などの微量発
育促進物質を添加してもよい。また、栄養要求を
同時に示す変異株を使用する場合、当然その生育
を満足させる物質を培地に添加しなければならな
い。 培養は、前記培地成分を含有する液体培地中で
振盪培養、通気撹拌培養、連続培養などの通常の
培養法より使用微生物に適した培養法を選択して
行う。 培養条件は、培地の種類により適宜選択すれば
よいが、通常は培養開始のPHを約６〜８に調整
し、約25〜35℃の温度条件下で培養を行う。培養
期間は使用微生物の生育に十分な時間であればよ
く、通常１〜３日間である。 酵素源の態様 以上のようにAT―６―７株を培養した後、得
られた培養物、培養物から遠心分離、沈降分離、
凝集分離などの通常の方法によつて集菌した生菌
体、または生菌体に適宜な処理を施して得られる
菌体処理物質を前記のようなリバビリンの製造法
における酵素源として使用できる。ここで、培養
物とは培養後の培地と培養菌体が未分離の状態の
ものをいう。また、菌体処理物とは、乾燥菌体、
細胞膜および／または壁変性菌体、破砕菌体、固
定化菌体、菌体抽出物、リバビリンの製造に関与
する酵素活性を有する菌体抽出物の蛋白質画分も
しくはその精製物、蛋白質画分もしくはその精製
物の固定化物などを指称する。 菌体処理物を得るための方法を以下に例示す
る。すなわち、生菌体に対し、たとえば凍結融
解処理、凍結乾燥処理、通風乾燥処理、アセトン
乾燥処理、酸性ないしアルカリ性下における加温
処理、磨砕処理、超音波処理、浸透圧差処理など
の物理的処理手段、もしくはたとえば、リゾチー
ム、細胞壁溶解酵素などの酵素処理、トルエン、
キシレン、ブチルアルコール（ブタノール）など
の溶媒もしくは界面活性剤との接触処理などの化
学的ないし生物化学処理を単独もしくは組み合せ
て施すことにより、また、菌体抽出物に対し、
たとえば塩析処理、等電点沈澱処理、有機溶媒沈
澱処理、各種クロマトグラフ処理、透析処理など
の酵素分離精製手段を単独もしくは組み合せて施
すことにより、さらに、生菌体、または前記
もしくはの方法による菌体処理物に包括処理、
架橋処理、担体への吸着処理などの酵素固定化手
段を施すことにより菌体処理物を得ることができ
る。 反応基質 前記のようなリバビリンの製造法の酵素反応に
おける反応基質は１，２，４―トリアゾール―３
―カルボキサミドおよびリボース供与体である。 １，２，４―トリアゾール―３―カルボキサミ
ドは遊離型またはナトリウム塩などの塩のいずれ
も使用できる。 リボース供与体としてはリボヌクレオシドもし
くはＤ―リボースまたはこれらの各種りん酸エス
テルのいずれでもよい。すなわち、リボヌクレオ
シドはその塩基部分がプリン系またはピリミジン
系のいかなる塩基であつてもよく、天然物由来で
あれ化学合成によるものであれば使用することが
できる。また、リボヌクレオシドもしくはＤ―リ
ボースの糖部水酸基は非置換のものであつてもあ
るいは２位、３位もしくは５位水酸基のいずれか
一個所、二個所もしくは全てにモノりん酸エステ
ル残基、ジりん酸エステル残基、トリりん酸エス
テル残基を有するものであつてもよい。また、こ
れらのりん酸エステルは遊離型であつてもよく、
またナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネ
シウム、アンモニウム、トリエチルアンモニウム
などの一般的なアルカリ塩であつてもよい。リボ
ース供与体の具体例としてはイノシシ、アデノシ
ン、グアノシン、キサントシン、ウリジン、シチ
ジンなどのリボヌクレオシド、5′―イノシン酸、
5′―アデニル酸、5′―グアニル酸、5′―キサンチ
ル酸、5′―ウリジル酸、5′―シチジル酸、
2′（3′）―イノシン酸、2′（3′）―アデニル酸、
2′（3′）―グアニル酸、2′（3′）―キサンチル
酸、2′（3′）―ウリジル酸、2′（3′）―シチジル
酸などのリボヌクレオチド、Ｄ―リボース、Ｄ―
リボース―１―りん酸などが例示される。 反応基質溶液 前記のようなリバビリンの製造法の酵素反応に
使用される基質溶液は、基本的には前記の反応基
質が水性媒体に溶解もしくは懸濁した水性液であ
る。 水性液中には前記の反応基質のほかに、必要に
応じてりん酸イオン供与体、有機溶媒、界面活性
剤、金属塩類、補酵素類、酸、塩基、糖類など酵
素反応を促進する物質、反応基質の溶解性を向上
させる物質、酵素と反応基質の接触を向上させる
物質等を含有していてもよい。 水性媒体としては、水または酵素反応に好適な
各種緩衝液、（りん酸緩衝液、イミダゾール―塩
酸緩衝液など）を用いることができる。この酵素
反応は主にヌクレオシドホスホリラーゼの作用に
基づくものであり、それ故反応系にりん酸イオン
の存在が必要である。酵素反応系にりん酸イオン
が存在しない場合は、りん酸イオン供与体の添加
が必要である。 りん酸イオン供与体としては、水性媒体中でり
ん酸イオンに解離しうるもののいずれを用いても
よく、たとえば遊離型りん酸そのもの、無機りん
酸塩、たとえばナトリウム、カリウムなどのアル
カリ金属、カルシウム、マグネシウムなどのアル
カリ土類金属、アンモニウムとの塩が好適に使用
される。また、りん酸イオン供与体としては、酵
素反応液中でりん酸イオンを遊離しうる系、たと
えばリボース供与体のリボヌクレオチドとホスフ
アターゼの組み合せ、同じくヌクレオチドとヌク
レチオターゼの組み合せなどを利用することがで
きる。 有機溶媒としては、たとえばメタノール、エタ
ノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノー
ル、アセトン、メチルエチルケトン、酢酸エチ
ル、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサ
ン、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミ
ド、ジメチルホルムアミド、２―メトキシエタノ
ール、２―エトキシエタノール、１，２―ジメト
キシエタンなどが例示される。 接触方法 前記のようなリバビリンの製造法の反応は、
AT―６―７株由来の酵素源と反応基質とを水性
媒体中で該微生物の非増殖条件下において接触さ
せることにより達成される。 接触方法は、酵素源の形態に応じて適宜に選択
すればよいが、通常、酵素源を反応基質溶液に懸
濁もしくは溶解し、好ましくは加温しながら撹拌
もしくは振盪するバツチ方式、または酵素源を必
要に応じて適当な担体、助剤、吸着剤と混和し、
もしくはこれらに担体させてカラムに充填し、反
応基質溶液を通液するカラム方式などが適用され
る。 反応基質および酵素源の濃度もしくは添加量 反応に際し、反応液の基質濃度は特に制限され
るものではなく、反応温度における使用水性媒体
に対する基質の飽和濃度以下の基質濃度が通常採
用されるが、反応基質溶液に添加された前記の有
機溶媒、界面活性剤などにより基質濃度を増大さ
せることもできる。また、反応液中に飽和濃度以
上の基質を懸濁状態で存在させ、反応の進行に従
つて各基質を溶解させることもできる。また、基
質を反応中に逐次添加して、その濃度を適当レベ
ルに保つこともできる。基質を溶解させる場合、
基質濃度は１，２，４―トリアゾール―３―カル
ボキサミドまたはその塩については通常５〜200
ｍＭ程度、好ましくは10〜100ｍＭ程度である。
リボース供与体については、これを別途添加する
場合は通常１〜300ｍＭ程度、好ましくは10〜150
ｍＭ程度である。 酵素源の使用量は微生物の種類、その使用形
態、反応効率、経済性などを考慮し、当業者が予
備実験等によつて容易に決定できるものである
が、通常バツチ方式の場合、たとえば生湿菌体で
あれば10〜150mg/ml基質溶液程度、乾燥菌体であ
れば２〜30mg/ml基質溶液程度であればよく、カ
ラム方式においてはバツチ方式に準じて適当な量
を設定することができる。 反応条件 前記のようなリバビリンの製造法の反応条件
は、酵素源である使用微生物の菌体等を非増殖条
件下、すなわち休止もしくは死滅菌体の状態で反
応に供すること以外は特に限定されない。 微生物の非増殖条件下で反応に供する方法とし
ては、酵素反応温度を使用微生物が増殖できない
温度範囲（ただし、リバビリン生成反応に関与す
る酵素が失活しない温度範囲である。）に設定す
る方法、使用微生物菌体をあらかじめ前記のとお
り物理的、化学的ないし生物化学的に処理するこ
とによつて微生物を増殖できない状態にした後、
反応に供する方法、反応に際して、たとえばトル
エンなどの使用微生物の増殖を阻害する物質を反
応基質溶液に添加する方法などを単独にあるいは
組み合せて採用すればよいが、特に反応温度を操
作する方法が最も効果的で簡便である。 反応温度は上記のとおり重要な条件であり、前
記のようなリバビリンの製造法を特徴づけるもの
である。反応は37〜80℃の範囲において進行する
が、実用性を考慮すれば40〜70℃の範囲が好まし
い。なお、最適の温度条件は反応基質の種類によ
つて異るが、当業者であれば予備実験などによ
り、容易に決定することができる。 40℃以上の温度範囲で酵素反応を行うことによ
り使用微生物の生育は大部分抑制される。たとえ
ば、AT―６―７の生菌体を使用し、28〜60℃の
各所定温度でそれぞれ実施例１と同様に反応させ
たときの１，２，４―トリアゾール―３―カルボ
キサミドからのリバビリンの生成率（％）と反応
後の使用微生物の生存率（％）との関係を示すと
下記第１表のとおりである。なお、微生物の生存
率は反応開始前の微生物の生菌数／mlに対する反
応後の生菌数／mlの百分率である。 【表】 以上のとおり、本反応は使用微生物の非増殖条
件下、すなわち、大部分の微生物が休止もしくは
死滅する条件下で行われなければならない。 さらに、反応温度を前記の範囲に設定すること
により、酵素反応速度を増大させるだけでなく、
生成したリバビリンの分解反応を抑制することが
実験により確認された。一例として、AT―６―
７株の生菌体の懸濁液１mlを20ｍＭリバビリン溶
液１mlに加えて28〜60℃の各所定温度で20時間イ
ンキユベートしたときのリバビリンの残存率
（％）を第２表に示す。 【表】 以上の結果からも37℃以上の反応温度が好適で
あることが確認できる。 反応基質液の液性は、通常PH４〜10、好ましく
はPH６〜８の範囲に保たれればよく、反応中にPH
が変動するときは、塩酸、硫酸、りん酸などの酸
または水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アン
モニア水、アンモニアガスなどのアルカリを用い
て好ましいPH範囲に補正すればよい。 反応時間は、反応基質の目的物への変換率を確
認しながら決定すればよいが、通常バツチ方式で
は２〜45時間程度、好ましくは24〜36時間程度反
応させればよく、カラム方式ではバツチ方式に準
じて適当な条件を設定して反応させればよい。 分離精製 反応後、必要に応じて菌体等を濾過、遠心分離
または凝集分離などの常法によつて分離除去し、
リバビリンの分離精製工程に供する。 リバビリンの分離精製は、公知の方法またはこ
れを応用して行えばよく、たとえばイオン交換ク
ロマトグラフイー、吸着クロマトグラフイー、分
配クロマトグラフイー、ゲル濾過法など各種のク
ロマトグラフイー、向流分配、向流抽出など二液
相間の分配を利用する方法、濃縮、冷却、有機溶
媒添加など溶解度の差を利用する方法などの一般
的な分離精製法を単独で、あるいは適宜に組み合
せて行えばよい。 分 析 本発明の実施例などにおいてリバビリンおよび
１，２，４―トリアゾール―３―カルボキサミド
の分析は高速液体クロマトグラフイーによつて行
つた。以下に示す装置および条件で分析すると、
リバビリンは保持時間3.50分付近に、１，２，４
―トリアゾール―３―カルボキサミドは保持時間
2.65分付近に溶出され、検量線よりそれぞれの量
を算出できる。 装 置：島津高速液体クロマトグラフLC―3A
型（(株)島津製作所） カラム：マイクロ・ボンダバツク（μ
BONDAPAK）C₁₈，4.6mm×250mm
（日本ウオーターズリミテツド社製） 溶出剤：２％アセトニトリルを含む20ｍＭにト
リース塩酸緩衝液（PH7.5） 流 速：１ml/分 測定波長：225nm カラム操作温度：室温 実験例 以下、実験例をもつて本発明をより具体的に説
明するが、これらはいずれも実施の一態様を示す
ものであつて、本発明の範囲を制限するものでは
ない。 実施例 １ ブレビバクテリウム・アセチリカムAT―６―
７を粉末ブイヨン（極東製薬工業(株)製）２％水溶
液５リツトルに植菌し、28℃、24時間振盪培養し
た。 培養終了後、遠心分離によつて集菌し、洗滌
後、殺菌水を加えて250mlの菌体懸濁液を得た。
66.7ｍM1，２，４―トリアゾール―３―カルボ
キサミド、66.7ｍＭイノシンおよび100ｍＭりん
酸―カリウムを含む水溶液（PH7.0）750mlに前記
菌体懸濁液250mlを加え、60℃、24時間反応した
（リバビリン生成率74.88％）。 反応液を遠心分離して菌体を除去した後、カチ
オン交換樹脂（H⁺型）を通過させ、この通過水
洗液を活性炭に吸着させた、活性炭カラムよりエ
タノール―アンモニア溶液でリバビリンを溶出
し、溶出液のエタノールを除去した後、アニオン
交換樹脂を通過させ、通過水洗液を減圧濃縮して
50mlとし、冷却した。冷却後、析出した結晶を分
離し、乾燥してリバビリンの結晶6.5ｇを得た。 実施例 ２ 実施例１と同一の菌株を実施例１と同様に培養
し（ただし、培養液は各10mlとした。）、培養後、
遠心分離によつて集菌し、各１mlの殺菌水を加え
て菌体懸濁液を得た。 この菌体懸濁液に20ｍM1，２，４―トリアゾ
ール―３―カルボキサミド、20ｍＭの第３表に示
す各種リボース供与体および25ｍＭりん酸一カリ
ウムを含む水溶液（PH7.0）各１mlを添加し、60
℃、24時間反応した。反応終了後、遠心分離によ
つて除菌し、上澄液を分析したところリバビリン
の生成率は第３表に示すとおりであつた。 なお、リバビリン生成率とは、１，２，４―ト
リアゾール―３―カルボキサミドからリバビリン
への転換率（％）をいう。 【表】 実施例 ３ ２％粉末ブイヨン培地各100mlに実施例１と同
一の菌株を植菌し、28℃、22時間振盪培養し、培
養菌体を得、次いで以下の処理を行い菌体処理物
懸濁液を得た。 １ アセトン乾燥菌体：生菌体に50mlのアセトン
を加え、15分間放置し、遠心分離して得た菌体
にさらに50mlのアセトンを加え、同様の処理を
行つた後、真空乾燥して乾燥菌体を得た。これ
に水を加えて菌体処理物懸濁液10mlを得た。 ２ 凍結融解菌体：生菌体を−80℃で一晩凍結
後、解凍し、水を加えて菌体処理物懸濁液10ml
を得た。 ３ 浸透圧差処理菌体：生菌体に100mlの飽和食
塩水を加え、一晩氷冷後、遠心分離によつて上
澄液を捨て、分離菌体に水を加えて菌体処理物
懸濁液10mlを得た。 ４ 超音波処理菌体：生菌体に水を加えて10mlと
し、出力電圧1.6KVで20分間超音波処理を行つ
た。 以上の菌体処理物懸濁液各10mlおよび実施例１
と同様にして得た無処理菌体懸濁液10mlに20ｍ
M1，２，４―トリアゾール―３―カルボキサミ
ド、20ｍＭイノシンおよび25ｍＭりん酸一カリウ
ムを含む反応基質溶液（PH7.0）各10mlを加え、
60℃、24時間反応後、リバビリンの生成率を分析
したところ第４表に示すとおりであつた。 【表】 実施例 ４ ２％ブイヨン培地25mlに実施例１と同一の菌株
を植菌し、28℃、24時間振盪培養し、培養後、集
菌し、水を加えて各2.5mlの菌体懸濁液を調製し
た。これに実施例３と同じ反応基質溶液各2.5ml
を加え、28〜70℃の各温度（第５表）で20時間反
応後、リバビリンの生成率を分析したところ第５
表に示すとおりであつた。 【表】 実施例 ５ 実施例１と同一の菌株を使用し、実施例４と同
様に調製した菌体懸濁液各2.5mlに以下の反応基
質溶液(A)または(B)各2.5mlを加え、60℃、20時間
反応後、リバビリンの生成率を分析したところ第
６表に示すとおりであつた。 反応基質溶液(A)：20ｍM1，２，４―トリアゾ
ール―３―カルボキサミドおよび20ｍＭイノシン 反応基質溶液(B)：記反応基質溶液(A)と同量の各
基質に25ｍＭりん酸一カリウムを加える。 【表】 実施例 ６ 実施例５と同じ菌体懸濁液2.5mlに実施例５の
反応基質溶液(B)2.5mlを加え、60℃、20時間反応
後、菌体を分離した。この分離菌体に水10mlを加
えて次回の反応に使用し、上記と同様の反応を10
回繰り返した。第１回のリバビリン生成率を100
としたときの各回の反応の相対生成率を第７表に
示す。 【表】 実施例 ７ ２％ブイヨン培地１リツトルに実施例１と同一
の菌株を植菌し、30℃、22時間振盪培養した後、
遠心分離によつて生菌体を得た。 この生菌体にＡ液〔1N―塩酸24ml、トリス
3.425ｇ、TEMED（Ｎ，Ｎ，N′，N′―テトラメ
チルエチレンジアミン）0.23mlを溶解して水で
100mlに稀釈した水溶液〕20ml、Ｂ液〔アクリル
アミド30ｇ、BIS（Ｎ，Ｎ―メチレンビス（アク
リルアミド））0.8ｇを水に溶解して100mlとした
水溶液〕20mlおよびＣ液〔過硫酸アンモニウム
0.3ｇを水に溶解して200mlとした水溶液〕40mlを
加えて放置し、菌体を固定化した。固定化後ホモ
ジナイザーで細片化し、180mlの固定化菌体を得
た。 この固定化菌体10mlに20ｍM1，２，４―トリ
アゾール―３―カルボキサミド、20ｍＭイノシン
および25ｍＭりん酸一カリウムを含む基質溶液20
ml（PH7.0）を加え、60℃、24時間反応し、反応
液を分析したところ62.89％のリバビリンが生成
していた。なお、生菌体を使用して同一条件で反
応を行なつたところリバビリンの生成率は65.44
％であつた。 実施例 ８ ブレビバクテリウム・アセチリカムAT―６―
７と公知の菌株であるブレビバクテリウム・アン
モニアゲネス（B.ammoniagenes）ATCC 6871
とを同一条件で培養し、同一条件で酵素反応に供
してリバビリンの生成量（生成率）を比較した。 すなわち、1.5％酵母エキス培地（PH7.0）各９
mlに両菌株を植菌し、28℃で１日振盪培養した。 40ｍM1，２，４―トリアゾール―３―カルボ
キサミド、60ｍM5′―ウリジル酸二ナトリウムお
よび８ｍＭりん酸一カリウムを含有する溶液10ml
に前記培養液より遠心分離によつて集菌した菌体
を加え、45℃で20時間反応させた。 反応後、遠心分離によつて菌体を除去し、反応
液を高速液体クロマトグラフイーによつて分析し
たところ、第８表に示す通りであつた。 【表】 実施例 ９ AT―６―７株とATCC6871株とを実施例８と
同様に各100ml培養し、遠心分離によつて集菌
し、菌体を得た。 この菌体を、40ｍM1，２，４―トリアゾール
―３―カルボキサミド、60ｍＭウリジンおよび50
ｍＭりん酸一カリウムを含有する溶液100mlに加
え、45℃で20時間反応させた。 反応後、リバビリンの生成率を測定したところ
AT―６―７株の場合は86.04％であり、
ATCC6871株の場合は2.30％であつた。 実施例 10 実施例８と同様の方法で得たAT―６―７株お
よびATCC6871株のそれぞれの菌体（培養液20ml
分）を、４ｍM1，２，４―トリアゾール―３―
カルボキサミド、４ｍＭウリジンおよび５ｍＭり
ん酸一カリウムを含有する溶液（基質溶液Ａ）な
らびに４ｍM1，２，４―トリアゾール―３―カ
ルボキサミド、４ｍM5′―ウリジル酸二ナトリウ
ムおよび１ｍＭりん酸一カリウムを含有する溶液
（基質溶液Ｂ）のそれぞれに加え、24時間反応さ
せた。なお、反応はAT―６―７株の場合は45℃
で、ATCC6871株の場合は60℃で、行つた。 反応後、リバビリンの生成率を測定したところ
第９表に示すとおりであつた。 【表】 実施例 11 実施例８と同様の方法でAT―６―７株と
ATCC6871株を培養して得た菌体（培養液５ml
分）に水を加えて菌体懸濁液0.5mlを得た。 17.8ｍM1，２，４―トリアゾール―３―カル
ボキサミド、81.9ｍＭウリジンおよび58.8ｍＭり
ん酸一カリウムを含む溶液（PH7.0）0.5mlに上記
菌体懸濁液0.5mlを加え、60℃で10時間反応させ
た。 反応後、反応液中のリバビリンの生成量を測定
し、リバビリンの生成率を算出したところ第10表
に示すとおりであつた。 【表】 参考例 AT―６―７株およびATCC6871株のホスフア
ターゼ活性を比較するために、各菌株の菌体懸濁
液を5′―ウリジル酸二ナトリウム溶液に加えて反
応させウリジンへの転換率を測定した。なお、菌
体懸濁液は実施例８と同様に培養して得た菌体
（培養液９ml分）を水１mlに懸濁させて調製し、
基質溶液としては60ｍM5′―ウリジル酸二ナトリ
ウムを含有する水溶液９mlを使用した。反応は45
℃で行い、0.5〜24時間の各時間において転換率
を測定した。転換率の測定は高速液体クロマトグ
ラフイーによつて行つた。結果を第11表に示す。 【表】 実施例 12 第12表に示すブレビバクテリウム・アセチリカ
ムの各種菌株を実施例８と同様の方法で培養し、
培養液を遠心分離して、菌体（各培養液４ml分）
を得た。 40ｍM1，２，４―トリアゾール―３―カルボ
キサミド、60ｍM5′ウリジル酸二ナトリウムおよ
び10ｍＭりん酸一カリウムを含有する溶液４mlに
上記各菌体を加え、45℃で22時間反応させ、反応
後、リバビリンの生成率を測定したところ、第12
表に示す通りであつた。 【表】 実施例 13 リボース供与体として60ｍＭのイノシンを使用
し、反応温度を60℃とするほかは実施例12と同一
の操作を行つて、第13表の結果を得た。 【表】 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Technical Field The present invention relates to a new strain of Brevibacterium acetylicum. More specifically, the present invention relates to a new strain of Brevibacterium acetylicum that has a highly active enzyme system that catalyzes the reaction that produces ribavirin from 1,2,4-triazole-3-carboxamide and a ribose donor. . The chemical name of ribavirin is 1-β-D-ribofuranosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamide, also known as Virazole, which has a broad range of powerful antiviral effects against DNA and RNA viruses. (Annals of the New York)
Academy of Sciences (Ann.New
York Acad. Sci.) 284, 272-292 (1977)). Prior Art Conventionally known methods for producing ribavirin include synthetic methods, fermentation methods, and enzymatic methods. A typical synthesis method is to use 3-methoxycarbonyl-1,2,4-triazole and 1-O
-Acetyl-2,3,5-tri-O-acyl-β
-D-ribofuranose (melting method), the obtained 1-(2',3',5'-tri-O-acyl-β
-D-ribofuranosyl)-3-methoxycarbonyl is treated with ammonia to perform amidation and deprotection (JP-A-48-4469, JP-A-49-80070)
JP-A No. 49-80071), a method using an aralkyloxy group as a substituent at the 3-position of the triazole in a method similar to the above (JP-A No. 55-80071);
160793), 3-methoxycarbonyl-
1,2,4-triazole is trimethylsilylated to produce 2,3,5-tri-O-benzoyl-β-D
- A method is known in which ribofuranoside is reacted with a halide (silylation method) and then treated with ammonia (see JP-A-48-4469 and JP-A-49-86372). Such a synthesis method is
In either case, it is necessary to protect the active group of the raw material compound before the reaction, and during the reaction, ribose may need to be activated or heated to a high temperature. Furthermore, after the reaction, deprotection and amide It seems that there are problems such as complicated reaction operations such as the need for chemical reaction. Moreover, the regioselectivity of the condensation reaction does not seem to be high in either case. The fermentation method involves culturing and propagating microorganisms belonging to the genus Brevibacterium, Corynebacterium, Arthrobacter, Micrococcus or Bacillus, using carbon sources and nitrogen that are necessary for culturing the microorganisms. before or during cultivation,
1,2,4-triazole-3-carboxamide was added all at once or intermittently, and 2 to 2 hours after the start of culture.
A method is known in which ribavirin is produced and accumulated in the medium by culturing for a long period of 8 days (Special Publication No. 17830/1983, Japanese Journal of Agricultural Chemistry, 50) .
(9), 423-430 (1976)). However, this method seems to have the following drawbacks. That is, since the production of ribavirin is carried out in a nutrient medium during the growth of microorganisms, it is first necessary to prepare a medium containing various nutrient sources in order to grow the microorganisms, and these must be added before inoculating the inoculum. Pretreatment is complicated, as the culture medium must be sterilized. Cultivation involving the growth of microorganisms for the purpose of accumulating ribavirin is usually carried out at room temperature between 20 and 40°C, so not only must consideration be given to bacterial contamination, but also under these conditions ribavirin degrading activity Since ribavirin is also present, the produced ribavirin is also decomposed and the yield of the target product is reduced. Cultivation must be carried out over a long period of 2 to 8 days. Various nucleosides, phosphorylated products of ribavirin, and other metabolites are produced as by-products, and in order to recover ribavirin from the culture solution, it is necessary to separate not only the raw material compounds but also various by-products, which requires isolation and purification. is complicated. Microorganisms must be cultured each time ribavirin is manufactured. In addition, as an enzymatic production method, 1,2,4-triazole-3-carboxamide and ribose-1
A method is known in which phosphoric acid is reacted with phosphoric acid in the presence of nucleoside phosphorylase at a pH of 5 to 9 and a temperature of 0 to 50°C (see JP-A-50-29720). This method also has disadvantages, such as the ribose-1-phosphate used as the ribose donor is unstable and not easy to obtain, and a purified enzyme is used as the enzyme, making it difficult to prepare the enzyme. It seems to be. SUMMARY OF THE INVENTION The present inventors have discovered for the first time that ribavirin can be produced by an enzymatic reaction under conditions in which microorganisms do not grow, using microorganism cultures, microbial cells, or processed microbial cells as an enzyme source. The inventors have discovered that a new specific strain of Brevibacterium acetylicum has an extremely high ability to produce ribavirin, and have completed the present invention based on this knowledge. That is, the present invention relates to the new bacterial strain Brevibacterium acetylicum AT-6-7 (Feikoken No. 6305).
(No.). The production of ribavirin by this new strain is as follows: 1.
Ribavirin is produced by reacting 2,4-triazole-3-carboxamide or a salt thereof with a ribose donor in an aqueous medium under the enzymatic action of the microorganism and under conditions in which the microorganism does not grow. be able to. Here, "under the action of an enzyme" means in the presence of a culture, bacterial cells, or treated microbial cells of the microorganism used. The biggest difference between the above-mentioned method for producing ribavirin using the new strain of the present invention and the conventional fermentation method is that in the former, a microbial culture, cells, or treated product of microorganisms is used as an enzyme agent; The point is that 1,2,4-triazole-3-carboxamide or a salt thereof, which is a reaction substrate, is reacted with a ribose donor under conditions that are optimal for the enzymatic reaction so that the enzyme does not proliferate. Effects Compared to the fermentation method, the method for producing ribavirin using the new strain of the present invention has almost no bacterial contamination when the reaction is carried out under conditions where microorganisms do not proliferate, such as high temperature conditions, and ribavirin is degraded. Since the reaction is suppressed, there is no decrease in the yield of ribavirin. Since it is an enzymatic reaction, the reaction time is short, there is little generation of by-products, ribavirin can be easily isolated and purified, the enzyme source can be used repeatedly or continuously, and the enzyme source can be stored. It has the advantage that the enzyme source can be prepared and used at any time. Furthermore, compared to the enzymatic method, it has advantages such as easier preparation of the enzyme source, wider selection of ribose donors from nucleosides, nucleotides, etc., and easy availability of ribose donors. Furthermore, by using the new strain of the present invention, ribavirin can be produced at a much higher yield than those conventional methods. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to a new bacterial strain, which is particularly useful when used in the production of ribavirin as described above. Therefore, in the following description of the present invention, this strain will be used for the production of ribavirin as described above. Enzyme Source/Microorganisms Used The microorganisms used in the above ribavirin production method are such that the culture, bacterial cells, or processed bacterial cells contain 1,2,4-triazole-3-carboxamide and a ribose donor. catalyze the reaction,
It contains an enzyme system that produces ribavirin, and according to the present invention, this strain is AT-6-7, which was isolated from the sand of Koshien Stadium in Nishinomiya City, Hyogo Prefecture. The mycological properties of this strain are described below. A. Morphology (1) Cell morphology and size: short rod-like, 0.8-1.0
×1.0-1.2μm (2) Spore formation: None (3) Gram staining: Positive B. Growth status in various media (1) Broth agar plate culture (28℃, 48 hours) Colony shape: Circular Ridges on colony surface: Flat, smooth Size: 2 to 4 mm Color: Yellow to pinkish yellow (2) Juicy agar slant culture (28℃, 48 hours) Growth: Good Growth shape: Wart-like (Echinulate) (3) Broth liquid culture (28℃, 48 hours) Growth: Forms a bacterial ring on the surface and produces a slight sediment. (4) Meat juice gelatin puncture culture (20°C, 6 days): Liquefies into a Straitiform (5) Litmus milk medium (28°C, 4 days): Slight coagulation and peptonization is also observed. C. Physiological properties (1) Reduction of nitrate (28℃, 5 days): No reducing property. (2) Generation of hydrogen sulfide (28℃, 5 days): Not generated. (3) Starch hydrolysis: Degradable. (4) Catalase: Positive (5) Indole production: Not produced. (6) Formation of ammonia from peptone and arginine: negative (7) Methylred test: negative (8) V-P test: positive (9) Attitude towards oxygen: aerobic (10) O-F test (Hugh , by Leifson method):
Type F (Fermentation) Production of acid from sugars Positive: glycose, mannose, fructose, maltose, sutucarose, trehalose Negative: arabinose, xylose, galactose, lactose, sorbitol, inosyte, glycerin Growth PH range: PH6.0-9.0 〓Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (Bergey's Manual of Determinative Bacteriology)
The search was conducted using the classification criteria of Bacteriology, 7th edition (1957). As a result, strain AT-6-7 was identified as a strain belonging to the genus Brevibacterium because it is a short bacillus that is almost a coccus, is Gram-positive, does not form filaments, and produces acid from carbohydrates. It was named Brevibacterium acetylicum AT-6-7. The identification and attribution of strain AT-6-7 is based on the Virgies Manual of Determinative Bacteriology, 7th edition, and due to changes in the classification criteria, the identification of this strain may have been based on different classification criteria. If attribution is made, the microorganisms named above may belong to other species or genera, but based on the deposit with the depository institution and the above-mentioned mycological properties, It can be uniquely identified. Regarding this strain, the 1981 Ministry of International Trade and Industry Notification No.
178, we filed an application for deposit with the Institute of Microbial Technology, Agency of Industrial Science and Technology, and the deposit was made on January 13, 1981, with the deposit number being FERM P-6305. has been granted. In addition, the above-mentioned strains may undergo induced mutations by general mutagenesis methods such as physical treatments such as irradiation with ultraviolet rays, Mutant strains thus derived are also within the scope of the present invention. Preparation/Culture of Enzyme Source When culturing the AT-6-7 strain to prepare the enzyme source used in the above-mentioned ribavirin production method, the medium and culture method used should be as long as the microorganism grows. Not particularly limited. The medium used is one containing appropriate amounts of carbon and nitrogen sources that can be assimilated by the microorganisms, and to which inorganic salts, trace growth-promoting substances, antifoaming agents, etc. are added as necessary. Specifically, as a carbon source,
Sugars such as glucose, fructose, maltose, galactose, ribose, sutucharose, starch, starch hydrolyzate, molasses, blackstrap molasses, etc., or derivatives thereof such as fatty acid esters, natural carbohydrates such as wheat, rice, glycerol, mannitol, methanol, Alcohols such as ethanol, fatty acids such as gluconic acid, pyruvic acid, acetic acid, citric acid, hydrocarbons such as normal paraffin, kerosene, glycine, glutamic acid, glutamine,
Amino acids such as alanine and asparagine,
One or more carbon sources may be appropriately selected and used from common carbon sources in consideration of the assimilation ability of the microorganisms used. Nitrogen sources include meat extract, peptone, yeast extract, dried yeast, soybean hydrolyzate, soybean flour, milk casein, casamino acids, various amino acids, cornstarch liquor, cotton seed meal or its hydrolyzate, fruit meal or Organic nitrogen compounds such as their hydrolysates, hydrolysates of other animals, plants, and microorganisms, ammonium salts such as ammonia, ammonium nitrate, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate, and ammonium acetate, and nitrates such as sodium nitrate. In consideration of the assimilation ability of the microorganisms used, one or more types are appropriately selected and used from inorganic nitrogen compounds such as urea and the like. Furthermore, one or more of phosphates, hydrochlorides, sulfates, carbonates, acetates, etc. of magnesium, manganese, iron, zinc, copper, sodium, calcium, potassium, etc., may be added as appropriate as inorganic salts. If necessary, antifoaming agents such as vegetable oil and surfactants, and trace amounts of growth-promoting substances such as vitamins B ₁ and B ₂ , nicotinic acid, pantothenic acid, biotin, and p-aminobenzoic acid may be added. Furthermore, when using a mutant strain that exhibits nutritional requirements, a substance that satisfies its growth must be added to the medium. Cultivation is carried out in a liquid medium containing the above-mentioned medium components by selecting a culture method suitable for the microorganism used from among conventional culture methods such as shaking culture, aerated agitation culture, and continuous culture. Culture conditions may be selected as appropriate depending on the type of medium, but usually the pH at the start of culture is adjusted to about 6 to 8, and culture is carried out at a temperature of about 25 to 35°C. The culture period may be a period sufficient for the growth of the microorganism used, and is usually 1 to 3 days. Embodiment of enzyme source After culturing the AT-6-7 strain as described above, the obtained culture, centrifugation, sedimentation,
Live bacterial cells collected by a conventional method such as aggregation separation, or a bacterial cell treatment substance obtained by subjecting viable bacterial cells to appropriate treatment, can be used as an enzyme source in the above-mentioned method for producing ribavirin. Here, the term "culture" refers to a state in which the culture medium and cultured bacterial cells are unseparated after cultivation. In addition, the treated bacterial cells include dried bacterial cells,
Cell membrane and/or wall-denatured bacterial cells, crushed bacterial cells, immobilized bacterial cells, bacterial cell extracts, protein fractions of bacterial cell extracts having enzyme activity involved in the production of ribavirin or purified products thereof, protein fractions, It refers to the immobilized product of the purified product. The method for obtaining the treated bacterial cell product is illustrated below. That is, physical treatments such as freeze-thaw treatment, freeze-drying treatment, ventilation drying treatment, acetone drying treatment, heating treatment under acidic or alkaline conditions, grinding treatment, ultrasonic treatment, osmotic pressure difference treatment, etc. means or enzyme treatments such as lysozyme, cell wall lytic enzymes, toluene,
By applying chemical or biochemical treatments such as contact treatment with solvents such as xylene or butyl alcohol (butanol) or surfactants alone or in combination, bacterial cell extracts can be treated with
For example, by performing enzyme separation and purification methods such as salting-out treatment, isoelectric precipitation treatment, organic solvent precipitation treatment, various chromatography treatments, and dialysis treatment alone or in combination, viable bacterial cells or by the above-mentioned methods or Comprehensive treatment of processed bacterial cells,
A bacterial cell-treated product can be obtained by applying enzyme immobilization means such as crosslinking treatment and adsorption treatment to a carrier. Reaction Substrate The reaction substrate in the enzymatic reaction of the ribavirin production method described above is 1,2,4-triazole-3.
- is a carboxamide and ribose donor. 1,2,4-triazole-3-carboxamide can be used in either a free form or a salt such as a sodium salt. The ribose donor may be ribonucleoside or D-ribose, or any of their various phosphoric acid esters. That is, the base portion of the ribonucleoside may be any purine-based or pyrimidine-based base, and it can be used as long as it is derived from natural products or chemically synthesized. In addition, even if the hydroxyl group of the sugar moiety of ribonucleoside or D-ribose is unsubstituted, monophosphoric acid ester residues, di- It may have a phosphate ester residue or a triphosphate residue. Moreover, these phosphoric acid esters may be in free form,
Further, general alkali salts such as sodium, potassium, calcium, magnesium, ammonium, triethylammonium, etc. may be used. Specific examples of ribose donors include boar, ribonucleosides such as adenosine, guanosine, xanthosine, uridine, and cytidine, 5'-inosinic acid,
5′-adenylic acid, 5′-guanylic acid, 5′-xanthylic acid, 5′-uridylic acid, 5′-cytidylic acid,
2′(3′)-inosinic acid, 2′(3′)-adenylic acid,
Ribonucleotides such as 2′(3′)-guanylic acid, 2′(3′)-xanthylic acid, 2′(3′)-uridylic acid, 2′(3′)-cytidylic acid, D-ribose, D-
Examples include ribose-1-phosphate. Reaction Substrate Solution The substrate solution used in the enzymatic reaction in the method for producing ribavirin as described above is basically an aqueous liquid in which the reaction substrate is dissolved or suspended in an aqueous medium. In addition to the reaction substrates mentioned above, the aqueous liquid contains substances that promote enzyme reactions, such as phosphate ion donors, organic solvents, surfactants, metal salts, coenzymes, acids, bases, and sugars, as necessary. It may contain a substance that improves the solubility of the reaction substrate, a substance that improves the contact between the enzyme and the reaction substrate, and the like. As the aqueous medium, water or various buffers suitable for enzyme reactions (phosphate buffer, imidazole-hydrochloric acid buffer, etc.) can be used. This enzymatic reaction is mainly based on the action of nucleoside phosphorylase, and therefore requires the presence of phosphate ions in the reaction system. If phosphate ions are not present in the enzyme reaction system, it is necessary to add a phosphate ion donor. As the phosphate ion donor, any substance that can be dissociated into phosphate ions in an aqueous medium may be used, such as free phosphoric acid itself, inorganic phosphates, alkali metals such as sodium and potassium, calcium, Salts with alkaline earth metals such as magnesium and ammonium are preferably used. Furthermore, as the phosphate ion donor, a system capable of liberating phosphate ions in the enzyme reaction solution, such as a combination of a ribose donor ribonucleotide and phosphatase, or a combination of a nucleotide and nucleotase, etc. can be used. Examples of organic solvents include methanol, ethanol, propanol, butanol, pentanol, acetone, methyl ethyl ketone, ethyl acetate, toluene, tetrahydrofuran, dioxane, dimethyl sulfoxide, dimethyl acetamide, dimethyl formamide, 2-methoxyethanol, 2-ethoxy ethanol, 1 , 2-dimethoxyethane and the like. Contact method The reaction in the method for producing ribavirin as described above is as follows:
This is achieved by bringing the enzyme source derived from the AT-6-7 strain into contact with the reaction substrate in an aqueous medium under conditions in which the microorganism does not grow. The contact method may be selected as appropriate depending on the form of the enzyme source, but it is usually a batch method in which the enzyme source is suspended or dissolved in a reaction substrate solution and preferably stirred or shaken while heating, or a contact method is used. Mix with appropriate carriers, auxiliaries, and adsorbents as necessary,
Alternatively, a column method may be applied in which these are used as carriers and the reaction substrate solution is passed through the column. Concentrations or Added Amounts of Reaction Substrates and Enzyme Sources During the reaction, the substrate concentration of the reaction solution is not particularly limited, and a substrate concentration below the saturation concentration of the substrate in the aqueous medium used at the reaction temperature is usually adopted. The substrate concentration can also be increased by adding the aforementioned organic solvents, surfactants, etc. to the substrate solution. Alternatively, the substrates can be present in a suspended state at a saturation concentration or higher in the reaction solution, and each substrate can be dissolved as the reaction progresses. Alternatively, the substrate can be added sequentially during the reaction to maintain its concentration at an appropriate level. When dissolving the substrate,
The substrate concentration is usually 5-200 for 1,2,4-triazole-3-carboxamide or its salts.
It is about mM, preferably about 10 to 100 mM.
Regarding the ribose donor, if it is added separately, it is usually about 1 to 300mM, preferably 10 to 150mM.
It is about mM. The amount of the enzyme source to be used can be easily determined by a person skilled in the art through preliminary experiments, etc., taking into account the type of microorganism, its mode of use, reaction efficiency, economics, etc.; For wet bacterial cells, it is sufficient to use a substrate solution of 10 to 150 mg/ml, for dry bacterial cells, it is sufficient to use a substrate solution of 2 to 30 mg/ml, and for column methods, set the appropriate amount according to the batch method. I can do it. Reaction Conditions The reaction conditions for the method for producing ribavirin as described above are not particularly limited, except that the cells of the microorganism used as the enzyme source are subjected to the reaction under non-proliferation conditions, that is, in the state of resting or dead sterilized cells. Methods for conducting the reaction under conditions in which microorganisms do not proliferate include a method in which the enzyme reaction temperature is set within a temperature range in which the microorganisms used do not proliferate (but within a temperature range in which the enzymes involved in the ribavirin production reaction are not inactivated); After physically, chemically or biochemically treating the microorganism used as described above in advance to render it incapable of proliferating the microorganism,
The method of subjecting the reaction to the reaction and the method of adding a substance that inhibits the growth of the microorganisms used, such as toluene, to the reaction substrate solution may be used singly or in combination, but in particular, the method of manipulating the reaction temperature is the most effective. Effective and simple. As mentioned above, the reaction temperature is an important condition and characterizes the above-mentioned method for producing ribavirin. The reaction proceeds in the range of 37 to 80°C, but in consideration of practicality, the range of 40 to 70°C is preferable. Note that optimal temperature conditions vary depending on the type of reaction substrate, but can be easily determined by those skilled in the art through preliminary experiments and the like. By carrying out the enzymatic reaction at a temperature range of 40°C or higher, the growth of the microorganisms used is largely suppressed. For example, ribavirin is produced from 1,2,4-triazole-3-carboxamide when reacting AT-6-7 viable cells at predetermined temperatures of 28 to 60°C in the same manner as in Example 1. The relationship between the production rate (%) and the survival rate (%) of the microorganisms used after the reaction is shown in Table 1 below. The survival rate of microorganisms is the percentage of the number of viable microorganisms/ml after the reaction to the number of viable microorganisms/ml before the start of the reaction. [Table] As mentioned above, this reaction must be carried out under conditions where the microorganisms used do not grow, that is, under conditions where most of the microorganisms are dormant or die. Furthermore, by setting the reaction temperature within the above range, it is possible to not only increase the enzyme reaction rate but also
It was confirmed through experiments that the decomposition reaction of the produced ribavirin is suppressed. As an example, AT-6-
Table 2 shows the residual rate (%) of ribavirin when 1 ml of a suspension of live bacterial cells of 7 strains was added to 1 ml of 20 mM ribavirin solution and incubated at each predetermined temperature of 28 to 60° C. for 20 hours. [Table] From the above results, it can be confirmed that a reaction temperature of 37°C or higher is suitable. The liquid properties of the reaction substrate solution should be maintained in the range of usually PH4 to 10, preferably PH6 to 8, and the pH should be maintained within the range of PH4 to 10, preferably PH6 to 8.
When the pH fluctuates, it can be corrected to a preferred pH range using an acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid, or phosphoric acid, or an alkali such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, aqueous ammonia, or ammonia gas. The reaction time can be determined while checking the conversion rate of the reaction substrate to the target product, but in the case of a batch method, the reaction time is usually about 2 to 45 hours, preferably 24 to 36 hours. The reaction may be carried out by setting appropriate conditions according to the method. Separation and purification After the reaction, if necessary, isolate and remove bacterial cells using conventional methods such as filtration, centrifugation, or aggregation.
Subjected to ribavirin separation and purification process. Ribavirin can be separated and purified by known methods or by applying them, such as various chromatography techniques such as ion exchange chromatography, adsorption chromatography, partition chromatography, gel filtration, countercurrent distribution, General separation and purification methods such as methods that utilize distribution between two liquid phases such as countercurrent extraction, and methods that utilize differences in solubility such as concentration, cooling, and addition of organic solvents may be used alone or in appropriate combinations. . Analysis In Examples of the present invention, ribavirin and 1,2,4-triazole-3-carboxamide were analyzed by high performance liquid chromatography. When analyzed using the equipment and conditions shown below,
Ribavirin has a retention time of 1, 2, 4 around 3.50 minutes.
-Triazole-3-carboxamide retention time
It is eluted around 2.65 minutes, and the amount of each can be calculated from the calibration curve. Equipment: Shimadzu high performance liquid chromatograph LC-3A
Type (Shimadzu Corporation) Column: Micro Bonderback (μ
BONDAPAK) C ₁₈ , 4.6mm×250mm
(Manufactured by Nippon Waters Limited) Eluent: 20mM Tris-HCl buffer containing 2% acetonitrile (PH7.5) Flow rate: 1ml/min Measurement wavelength: 225nm Column operating temperature: Room temperature Experimental examples Below are experimental examples. The present invention will be described in more detail below, but these are just one mode of implementation and do not limit the scope of the present invention. Example 1 Brevibacterium acetylicum AT-6-
7 was inoculated into 5 liters of a 2% aqueous solution of powdered bouillon (manufactured by Kyokuto Pharmaceutical Industries, Ltd.) and cultured with shaking at 28°C for 24 hours. After culturing, the cells were collected by centrifugation, washed, and sterilized water was added to obtain 250 ml of cell suspension.
250 ml of the above bacterial cell suspension was added to 750 ml of an aqueous solution (PH 7.0) containing 66.7 mM 1,2,4-triazole-3-carboxamide, 66.7 mM inosine and 100 mM potassium phosphate, and reacted at 60°C for 24 hours ( Ribavirin production rate 74.88%). After the reaction solution was centrifuged to remove bacterial cells, it was passed through a cation exchange resin (H ⁺ type), and the passed water washing solution was adsorbed on activated carbon. From the activated carbon column, ribavirin was eluted with an ethanol-ammonia solution. After removing the ethanol from the eluate, it was passed through an anion exchange resin, and the washed water solution was concentrated under reduced pressure.
The volume was adjusted to 50 ml and cooled. After cooling, the precipitated crystals were separated and dried to obtain 6.5 g of ribavirin crystals. Example 2 The same bacterial strain as in Example 1 was cultured in the same manner as in Example 1 (however, each culture solution was 10 ml), and after culturing,
Bacteria were collected by centrifugation, and 1 ml of sterilized water was added to each to obtain a bacterial cell suspension. To this bacterial cell suspension, 1 ml each of an aqueous solution (PH7.0) containing 20 mM 1,2,4-triazole-3-carboxamide, 20 mM of various ribose donors shown in Table 3, and 25 mM monopotassium phosphate was added. 60
℃ for 24 hours. After the reaction was completed, bacteria were removed by centrifugation, and the supernatant was analyzed, and the production rate of ribavirin was as shown in Table 3. Note that the ribavirin production rate refers to the conversion rate (%) of 1,2,4-triazole-3-carboxamide to ribavirin. [Table] Example 3 The same bacterial strain as in Example 1 was inoculated into each 100 ml of 2% powdered bouillon medium, cultured with shaking at 28°C for 22 hours to obtain cultured bacterial cells, and then the following treatments were performed to treat the bacterial cells. A solid suspension was obtained. 1 Acetone-dried bacterial cells: Add 50 ml of acetone to live bacterial cells, let stand for 15 minutes, centrifuge, add another 50 ml of acetone to the obtained bacterial cells, perform the same treatment, and then vacuum dry. Bacterial cells were obtained. Water was added to this to obtain 10 ml of a suspension of treated bacterial cells. 2 Freeze-thawed bacterial cells: Freeze live bacterial cells at -80℃ overnight, thaw, and add water to make 10 ml of treated bacterial cell suspension.
I got it. 3 Osmotic pressure differential treatment of bacterial cells: Add 100 ml of saturated saline to live bacterial cells, cool on ice overnight, centrifuge to discard the supernatant, add water to isolated bacterial cells, and suspend the treated bacterial cells. 10 ml of liquid was obtained. 4. Ultrasonicated bacterial cells: Water was added to the live bacterial cells to make a total volume of 10 ml, and ultrasonication was performed for 20 minutes at an output voltage of 1.6 KV. 10 ml each of the above bacterial cell suspensions and Example 1
Add 20 m to 10 ml of untreated bacterial suspension obtained in the same manner as above.
Add 10 ml each of a reaction substrate solution (PH7.0) containing M1,2,4-triazole-3-carboxamide, 20 mM inosine, and 25 mM monopotassium phosphate,
After reaction at 60° C. for 24 hours, the production rate of ribavirin was analyzed and was as shown in Table 4. [Table] Example 4 The same bacterial strain as in Example 1 was inoculated into 25 ml of 2% bouillon medium, cultured with shaking at 28°C for 24 hours, and after culturing, the bacteria were collected, and water was added to each 2.5 ml of bacterial cells. A suspension was prepared. Add to this 2.5 ml each of the same reaction substrate solution as in Example 3.
was added and reacted for 20 hours at various temperatures from 28 to 70°C (Table 5), and the production rate of ribavirin was analyzed.
It was as shown in the table. [Table] Example 5 Using the same strain as in Example 1, add 2.5 ml each of the following reaction substrate solutions (A) or (B) to 2.5 ml each of the bacterial cell suspension prepared in the same manner as in Example 4. In addition, after reaction at 60°C for 20 hours, the production rate of ribavirin was analyzed and was as shown in Table 6. Reaction substrate solution (A): 20mM 1,2,4-triazole-3-carboxamide and 20mM inosine Reaction substrate solution (B): Add 25mM monopotassium phosphate to the same amount of each substrate as in reaction substrate solution (A). [Table] Example 6 2.5 ml of the reaction substrate solution (B) of Example 5 was added to 2.5 ml of the same bacterial cell suspension as in Example 5, and after reaction at 60°C for 20 hours, the bacterial cells were separated. Add 10ml of water to this isolated bacterial body and use it for the next reaction, and repeat the same reaction as above for 10 minutes.
Repeated times. The first ribavirin production rate is 100
Table 7 shows the relative production rate of each reaction when [Table] Example 7 The same strain as in Example 1 was inoculated into 1 liter of 2% bouillon medium, and after culturing with shaking at 30°C for 22 hours,
Viable cells were obtained by centrifugation. Add solution A [24 ml of 1N hydrochloric acid, Tris
Dissolve 3.425g and 0.23ml of TEMED (N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine) in water.
20 ml of aqueous solution diluted to 100 ml, 20 ml of solution B [30 g of acrylamide and 0.8 g of BIS (N,N-methylenebis(acrylamide)) dissolved in water to make 100 ml] and 20 ml of solution C [ammonium persulfate]
40 ml of an aqueous solution prepared by dissolving 0.3 g in water to make 200 ml was added and allowed to stand to immobilize the bacterial cells. After immobilization, the cells were cut into small pieces using a homogenizer to obtain 180 ml of immobilized bacterial cells. A substrate solution containing 20mM 1,2,4-triazole-3-carboxamide, 20mM inosine, and 25mM monopotassium phosphate in 10ml of the immobilized bacterial cells
ml (PH7.0) and reacted at 60°C for 24 hours. Analysis of the reaction solution revealed that 62.89% ribavirin had been produced. Furthermore, when the reaction was carried out under the same conditions using live bacteria, the production rate of ribavirin was 65.44.
It was %. Example 8 Brevibacterium acetylicum AT-6-
7 and the known strain Brevibacterium ammoniagenes (B.ammoniagenes) ATCC 6871
were cultured under the same conditions and subjected to enzyme reaction under the same conditions to compare the amount of ribavirin produced (production rate). That is, 1.5% yeast extract medium (PH7.0) each 9
Both strains were inoculated into ml and cultured with shaking at 28°C for 1 day. 10ml of a solution containing 40mM 1,2,4-triazole-3-carboxamide, 60mM disodium 5'-uridylate and 8mM monopotassium phosphate
Bacterial cells collected from the culture medium by centrifugation were added to the mixture, and the mixture was allowed to react at 45°C for 20 hours. After the reaction, the bacterial cells were removed by centrifugation, and the reaction solution was analyzed by high performance liquid chromatography, and the results were as shown in Table 8. [Table] Example 9 Strain AT-6-7 and strain ATCC6871 were cultured in 100 ml each in the same manner as in Example 8, and collected by centrifugation to obtain bacterial cells. The cells were treated with 40mM 1,2,4-triazole-3-carboxamide, 60mM uridine and 50mM 1,2,4-triazole-3-carboxamide.
The mixture was added to 100 ml of a solution containing mM monopotassium phosphate, and reacted at 45°C for 20 hours. After the reaction, the production rate of ribavirin was measured.
In the case of AT-6-7 stock, it is 86.04%,
In the case of ATCC6871 strain, it was 2.30%. Example 10 Each bacterial cell of AT-6-7 strain and ATCC6871 strain obtained in the same manner as in Example 8 (20 ml of culture solution
), 4mM 1,2,4-triazole-3-
A solution containing carboxamide, 4mM uridine and 5mM monopotassium phosphate (substrate solution A) and a solution containing 4mM 1,2,4-triazole-3-carboxamide, 4mM disodium 5'-uridylate and 1mM monopotassium phosphate (substrate solution A). It was added to each of the substrate solutions B) and allowed to react for 24 hours. In addition, the reaction is performed at 45℃ for AT-6-7 strain.
In the case of ATCC6871 strain, it was carried out at 60°C. After the reaction, the production rate of ribavirin was measured and was as shown in Table 9. [Table] Example 11 Using the same method as Example 8, strain AT-6-7 and
Bacterial cells obtained by culturing ATCC6871 strain (5 ml of culture solution)
water was added to obtain 0.5 ml of bacterial cell suspension. Add 0.5 ml of the above cell suspension to 0.5 ml of a solution (PH7.0) containing 17.8 mM 1,2,4-triazole-3-carboxamide, 81.9 mM uridine, and 58.8 mM monopotassium phosphate, and incubate at 60°C for 10 hours. Made it react. After the reaction, the amount of ribavirin produced in the reaction solution was measured, and the ribavirin production rate was calculated as shown in Table 10. [Table] Reference example In order to compare the phosphatase activities of AT-6-7 strain and ATCC6871 strain, a cell suspension of each strain was added to a 5'-uridylate disodium solution and reacted to calculate the conversion rate to uridine. was measured. The bacterial cell suspension was prepared by suspending the bacterial cells (9 ml of culture solution) obtained by culturing in the same manner as in Example 8 in 1 ml of water.
As the substrate solution, 9 ml of an aqueous solution containing 60 mM disodium 5'-uridylate was used. reaction is 45
The conversion was measured at each time period from 0.5 to 24 hours. The conversion rate was measured by high performance liquid chromatography. The results are shown in Table 11. [Table] Example 12 Various strains of Brevibacterium acetylicum shown in Table 12 were cultured in the same manner as in Example 8,
Centrifuge the culture solution to remove bacterial cells (4 ml of each culture solution)
I got it. Each of the above bacterial cells was added to 4 ml of a solution containing 40 mM 1,2,4-triazole-3-carboxamide, 60 mM disodium 5' uridylate, and 10 mM monopotassium phosphate, and reacted at 45°C for 22 hours. After the reaction, ribavirin When we measured the production rate, we found that the 12th
It was as shown in the table. [Table] Example 13 The same procedure as in Example 12 was performed except that 60 mM inosine was used as the ribose donor and the reaction temperature was 60° C., and the results shown in Table 13 were obtained. 【table】

Claims (1)

【特許請求の範囲】[Claims] １ 新菌株ブレビバクテリウム・アセチリカム
AT―６―７（微工研菌寄第6305号）。1 New strain Brevibacterium acetylicum
AT-6-7 (Feikoken Bibori No. 6305).