JPS61502908A - Method for measuring blood clotting time and specific reagents for it - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 凝１ｍは、フィブリノゲンが不溶性のフィブリン網目構造へと転換することによ り観察できるようになる。フィブリノゲンはトロンビンによって部分的に消化さ れフィブリン網状膜を生成し、それらは重合して鎖状のフィブリンとなり、その 鎖は、内外の１つもしくは２つの互いにからみ合う反応系の最終段でフィブリノ ライゲース（トロンビンにより活性される）により相互に結合する。[Detailed description of the invention] Coagulation 1m is caused by the conversion of fibrinogen into an insoluble fibrin network structure. You will be able to observe it. Fibrinogen is partially digested by thrombin. This produces fibrin network membranes, which polymerize into fibrin chains, which At the final stage of the reaction system, the chains are intertwined with one another (internal and external), or fibrino They are linked together by ligase (activated by thrombin).

血液の凝析メカニズムの正常性を測定するいくつかの方法が知られている。最も 重要な試験には′プロトロンビン時間１“活性化部分トロンボプラスチン時間“ および“トロンビン時間“がある。Several methods are known to measure the health of the blood coagulation mechanism. most Important tests include 'prothrombin time 1' 'activated partial thromboplastin time' and “thrombin time.”

（Ｒ，ラベル（Ｒａｖｅｌ　）　、臨床実験医学（Ｃ１ｉｎｉｃａｌ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ）　７１−７３　（４版、１９８４）これらの試 験を簡単に記述しである。）上述の試験は血液そのものではなく血売もしくは血 清について行なわれるものである。(R, Ravel), Clinical Experimental Medicine (C1inical Labo) RatoryMedicine) 71-73 (4th edition, 1984) These trials The following is a brief description of the experiment. ) The above test is not performed on blood itself, but on blood sales or blood. It is carried out regarding Qing.

血餅の形質を視覚的に観察することによって血１１ｉ凝血要素の終点を決定する のは難しいことが知られている（グロス（Ｇｒｏｓｓ　）　、米国特許第３，４ ５８，２８７号）。我々はフィブリン網状Ｍ　（ｗｅｂ　）の形成時間を測るこ とによって凝血時間を測定することが可能であり、ここで請求の範囲に入れてい る特定試薬の使用によってこの網状股を容易に観察できることを発見した。Determining the endpoint of blood 11i clotting elements by visually observing clot characteristics (Gross, U.S. Pat. Nos. 3 and 4) No. 58, 287). We measured the formation time of the fibrin network M (web). It is possible to measure the clotting time by We discovered that this reticular crotch can be easily observed by using a specific reagent.

それらの問題は、血液そのものの凝血時間の測定に使われるとうまくいかない所 にある。バタースレイ　（ＩＩａｔＬｅｒｓｌｅｙ）が米国特許第３．４９２． ０９６号で記述しているように、“非常に労力をかけ、細心の注意を払っても最 初の血餅の存在を見逃すことがある。同し色であることや、表面の物理的性状が 単にやや粘性が増すというだけの違いであることで、初期の小さな血餅を血液そ れ自身から見分けることは容易ではない。′血餅を保持するフィルターをもつ試 験管を徐々に（頃けるという彼の解決法は満足できるものではない。技術者は試 験を通じて、一方の手でストップウォッチをもち、他方の手で試験管を傾けるか 、もしくは、自動的に試験管を傾ける装置が必要である。私たちの方法は血液そ のものの凝血時間の測定にうまく応用することができる。。The problem with these problems is that they do not work well when used to measure the clotting time of blood itself. It is in. Buttersley (II at Lersley) is US Patent No. 3.492. As stated in issue 096, “Despite great effort and care, The presence of the first blood clot may be missed. be of the same color or physical properties of the surface. The difference is simply a slight increase in viscosity, which makes the initial small clot less likely to become blood clot. It is not easy to tell from yourself. 'Tests with filters that retain blood clots His solution of gradually removing the test tubes is not satisfactory. Throughout the experiment, do you hold the stopwatch in one hand and tilt the test tube with the other? Alternatively, a device that automatically tilts the test tube is required. Our method uses blood It can be successfully applied to the measurement of blood clotting time. .

また、今までは凝血時間を延ばすような操作は望ましくないということが言われ てきている。（バーブマン（Ｂａｕｇｈｍａｎ）　、米国特許第４　、２８９　 、４０８号ニシングラ−（Ｓｉｎｇｌｅｒ　）　、米国特許第２．９２１　、０ ００号）。しかしながら我々は、凝血時間の延長が、血餅形成時間とフィブリン 網状膜形成時間を明確に分離し、その結果凝血時間の測定が容易になることを発 見した。アトウッド（八ｔｗｏｏｄ）は米国特許第１．６１４，３３７号で凝析 の遅延について述べているが、彼の目的は凝血時間の測定ではなく、溶媒のない 状態での動物血液からのフィブリンの生成であった。Furthermore, until now it has been said that operations that prolong blood clotting time are undesirable. It's coming. (Baughman, U.S. Pat. No. 4, 289) , No. 408 Nishinger (Singler), U.S. Patent No. 2.921, 0 No. 00). However, we have shown that prolongation of clotting time is related to clot formation time and fibrin. It has been shown that the reticular membrane formation time can be clearly separated, thereby making it easier to measure the coagulation time. I saw it. Atwood coagulated in U.S. Patent No. 1,614,337. , but his purpose was not to measure clotting time, but rather to measure the coagulation time without solvent. was the production of fibrin from animal blood under the condition.

種々の粒子が、内的経路の関連物質であるハーゲマン因子の活性化物質として使 用されてきている。これらには珪藻土、ベントナイト、カオリン、砂およびシリ カ等が含まれる。レナハム（Ｌｅｎａｈａｍ　）米国特許第３，２９５，２１０ 号、フイナテイ−（Ｆｉｎｎｅｒｔｙ）米国特許第４．４５５，３７７号。ラテ ックス粒子はハーゲマン因子を十分に活性化しない。Various particles can be used as activators of Hagemann factor, which is a related substance in the internal pathway. It has been used. These include diatomaceous earth, bentonite, kaolin, sand and silica. Includes mosquitoes, etc. Lenaham U.S. Patent No. 3,295,210 No. 4,455,377 to Finnerty. latté x particles do not activate Hagemann factor sufficiently.

血液の診断試験にラテックス粒子を初期にとり入れたことが、シンガー（Ｓｉｎ ｇｅｒ）とプロット（Ｐｌｏｔｚ　）によって米国医学ｉ誌（Ａｍ、　Ｊ、Ｍｅ ｄ、）　２　ｔｓ、頁８８−９２　（１９５６年）に発表された。The early incorporation of latex particles into blood diagnostic tests was made by Singer (Sin ger) and Plotz in the American Medical Journal (Am, J, Me d, ) 2 ts, pp. 88-92 (1956).

ラテックス粒子法のレヴユーは、ヘチェミ−（ｌｌｅｃｈｅｍｙ　）とミカエル シン（Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ）が研究所経営（Ｌａｂｏｒａ　ｔｏｒｙ　Ｍａｎ ａｇｅｍｅｎ　ｔ）の２７−４０頁（６月号、１９８４年）と２６−３５頁（７ 月号、１９８４年）で述べている。A review of the latex particle method is by Llechemy and Michael Shin (Michaelson) is the laboratory manager. agement), pages 27-40 (June issue, 1984) and pages 26-35 (7 Monthly issue, 1984).

ラテックス粒子は、凝集免疫検定法に使われている。ここでは、抗原抗体結合と は無関係な、目視可能なフィブリン網状膜を形成するためのフィブリン鎖による 個々のラテックス粒子同志の結合が主たる現象となる。Latex particles have been used in agglutination immunoassays. Here, antigen-antibody binding and by fibrin strands to form an unrelated, visible fibrin reticular membrane. The main phenomenon is the bonding of individual latex particles.

これとは別に凝集免疫検定法では、ラテックス粒子の混合物が使用されている。Alternatively, agglutination immunoassays use mixtures of latex particles.

例えば、ウジリス（Ｕｚｇｉｒｉｓ　）米国特許第４，１９１．７３号、カンビ アソ（Ｃａｍｂｉａｓｏ）米国特許第４，１８４，８４９号、ギーバー（Ｇｉａ ｅｖｅｒ　）米国特許第４，１１５．５３５号、およびカンプメーヤー（Ｋａ＋ ＊ｐｍｅｙｅｒ　）米国特許第４，３０５，９２５号を参照せよ、しかし、これ らの文献は凝結の量や速度および凝集物の出現をコントロールするための大小粒 子の混合物の使用についてはなにも教えてくれない。For example, Uzgiris U.S. Pat. No. 4,191.73; Cambiaso U.S. Pat. No. 4,184,849, Gia ever) U.S. Pat. No. 4,115.535, and Kampmeyer (Ka+ *pmeyer) See U.S. Pat. No. 4,305,925, but this The literature of It doesn't tell me anything about using child mixtures.

さらに、いくつかの文献には、混合した粒子サイズのものを使用するのに否定的 なものもある。ドーマン（Ｄｏｒ＋ａａｎ）は米国特許第４．４２１，８９６号 の中の第１５欄１５行から第１６欄３行に渡って、粒子は単分散であるべきだと 記述している。富山（Ｔａｓｉｉｙａｍａ）は米国特許第４，３２１，０５８号 の中、第４欄２０−２３行で“測定の再現性を増すために、比較的狭いサイズ分 布の粒子を使用することが好ましい′と述べている。荷電物質が、擬像凝析検定 法中、フィブリノゲンの溶解性を変化させ、それを沈殿させる目的で、フィブリ ノゲンやその誘導体に対して使用させる。ライルナ−（Ｗｉｌｎｅｒ）著、プロ グ　ヘモスクテイス　スロツプ（Ｐｒｏｇ、　Ｈｅｍｏｓｔａｔｉｓ　Ｔｈｒｏ ｍｂ、　）　４巻２１１頁（１９７８年）を参照せよ。Additionally, some literature contains negative comments about using mixed particle sizes. There are some things. Dorman (Dor+aan) U.S. Patent No. 4,421,896 From column 15, line 15 to column 16, line 3, it states that the particles should be monodisperse. It is described. Toyama (Tasiiyama) U.S. Patent No. 4,321,058 In column 4, lines 20-23, it says, “In order to increase the reproducibility of measurements, It is preferred to use cloth particles.' Pseudo-image coagulation assay for charged substances During the process, fibrinogen was added to change the solubility of fibrinogen and precipitate it. Used against Nogen and its derivatives. Written by Wilner, Pro. Prog, Hemostasis Thro mb, ) Vol. 4, p. 211 (1978).

ペンカー（Ｂｅｃｋｅｒ）は米国特許第４，４２９．０４０号の中で、ラテック ス粒子をインキュベートし、フィブリンモノマーのラテックスへの凝集を測定す る生物学的流体の中でのフィブリノモノマー検定法について述べている。彼は、 フィブリノゲンや伯の血漿タンパク質と比較して、フィブリンモノマーが疎水性 のラテックス粒子に対し高い親和性をもつことを教えている。彼は、彼の方法が 間接的にフィブリノゲンを測定することも可能であること（フィブリノゲンをフ ィブリンモノマーに変換するトロンビンのような酵素を使った後）を示したが、 ラテックス粒子の凝血時間の測定への利用については明らかにせず、粒子径が凝 集物の性状（綿状か顆粒状か等）を決定するために重要であることを認めず、粒 子サイズを混合したものの方が、単分散の特定試薬を使って得られた凝集物より 、より観察しやすいことを考慮していない。Becker, in U.S. Pat. No. 4,429.040, incubate the fibrin monomer particles and measure the aggregation of fibrin monomers into the latex. A method for assaying fibrino monomer in biological fluids is described. he, Fibrin monomers are hydrophobic compared to fibrinogen and other plasma proteins. has a high affinity for latex particles. he has his way It is also possible to measure fibrinogen indirectly (fibrinogen can be measured indirectly). (after using enzymes such as thrombin to convert it into fibrin monomers), The use of latex particles for measuring clotting time was not disclosed, but the particle size It is not recognized that it is important for determining the properties of aggregates (floc-like or granular, etc.), and Aggregates obtained using a mixture of particle sizes are better than aggregates obtained using monodisperse specific reagents. , does not take into account that it is easier to observe.

ペンカーＣＢｅｃｋｅｒ）は第３欄、１１−１９行で、彼が測定しようと企てた ものはフィブリンモノマーと、′可溶性フィブリン”であることを強調している 。′可溶性フィブリン”という言葉はフィブリン網状膜、フィブリンーフィブリ ノゲン結合体を含み、即ちそれは定義により不溶性になるまでに重合したフィブ リンは含まない。Becker) in column 3, lines 11-19, that he attempted to measure. Emphasis is placed on fibrin monomer and ``soluble fibrin.'' . The term ``soluble fibrin'' refers to fibrin reticular membrane, fibrin-fibrin, contains a nogen conjugate, i.e. it is by definition a polymerized fibril to the point of insolubility. Contains no phosphorus.

明細書 我々の発明は、凝血時間の指標としての不溶性フィブリン網状膜の検出に基づい ている。ペンカー（Ｂｅｃｋｅｒ）は、重合したフィブリンはラテックス粒子に 高い親和性を持っていることを述べていない。Specification Our invention is based on the detection of insoluble fibrin reticular membranes as an indicator of clotting time. ing. Becker said that polymerized fibrin becomes latex particles. It does not state that they have a high affinity.

ペンカー（Ｂｅａｋｅｒ）は高濃度のラテックスを使用しているが、我々は低い 濃度を採用している。ペンカー（Ｂｅｃｋｅｒ）は非常に少量のトロンビンを使 用している（フィブリノゲンをフィブリンモノマーにするのに十分であるが、す べてのフィブリンモノマーを重合性フィブリンにするには十分ではない量）。我 々は直接投与するかもしくは別に誘導するかして過剰量のトロンビンを使用する 。ペンカ−（ＢｅＣｋｅｒ）のインキエベーシ四ン時間は５分間程の長さだが、 我々のものは、通常の検体に対しては３０〜６０秒程である。ペンカーの実施例 は血漿標本を扱っているが、我々は血液そのものを使用できる。Beaker uses a high concentration of latex, but we use a low concentration of latex. Concentration is used. Becker uses a very small amount of thrombin. (sufficient to convert fibrinogen into fibrin monomer, but (not enough to convert all fibrin monomer into polymerizable fibrin). I use excessive amounts of thrombin, either directly administered or induced separately. . BeCker's inkjet session lasts about 5 minutes, but Our method takes about 30 to 60 seconds for normal samples. Example of Penker deals with plasma specimens, but we can use the blood itself.

発明の要約 この発明は凝血時間の測定技術の改良に関するものである。凝血時間を余裕をも って延長することは、測定誤差を減じ、あやふやな血餅形成時間よりはむしろフ ィブリン網状１突の形成時間を終点として利用することを可能にする。また、室 温でしかも特殊な設備なしにできるという意味で、血漿よりむしろ血液そのもの の試料の凝血時間を測定することはより簡単である。Summary of the invention This invention relates to improvements in the technique of measuring blood clotting time. Allow extra time for blood clotting Extending the clot formation time reduces measurement error and increases clot formation time rather than ambiguous clot formation time. This makes it possible to use the time of formation of the fibrin network as the end point. Also, room In the sense that it can be done at warm temperatures and without special equipment, it can be used to treat blood itself rather than plasma. It is easier to measure the clotting time of a sample of

この発明の改善点は、ラテックス粒子の使用にあり、特にフィブリン網状膜を見 やすくする為に、２種の粒子径のラテックス粒子の混合物を使用する点にある。The improvement of this invention lies in the use of latex particles, especially for fibrin reticular membranes. For convenience, a mixture of latex particles of two different particle sizes is used.

またこの特定試薬は血液の組成や温度の影響を減少させる。This particular reagent also reduces the effects of blood composition and temperature.

本発明の方法は簡単で、安価な装置で容易に実施できる。我々の発明は生物学的 な重合反応の検出や測定にラテックス粒子を使用する意味で新しい方法である。The method of the invention is simple and can be easily carried out using inexpensive equipment. Our invention is biological This is a new method in the sense that latex particles are used to detect and measure polymerization reactions.

血液凝析の間のフィブリン網状膜の形成時間の測定に実施例の方法が応用される 。ラテックス粒子を血液に加えることにより、血液タンパク質が粒子上に吸着す る。凝析物質（例えばトロンビン、トロンボプラスチン、その他）を加えると、 吸着したタンパク質の一つ（フィブリノゲン）は吸着したラテックス粒子との相 互作用により容易に検出できる重合化したフィブリンへと変化する反応生成物（ フィブリン）を生成する。このことはフィブリン網状膜の形成時間の測定をより 容易にする。この網状膜形成時間は実際の血餅形成時間と単純な相関関係がある 。さらに、ラテックスーフィプリン網状膜の構造はフィブリノゲン濃崩に依存し 、そのため、その濃度異常の検出も同時に可能にする。The method of the example is applied to the measurement of the formation time of fibrin network membrane during blood coagulation. . By adding latex particles to blood, blood proteins are adsorbed onto the particles. Ru. Adding coagulants (e.g. thrombin, thromboplastin, etc.) One of the adsorbed proteins (fibrinogen) is in phase with the adsorbed latex particles. The reaction product transforms into easily detectable polymerized fibrin by interaction ( fibrin). This makes it easier to measure the formation time of the fibrin reticular membrane. make it easier. This reticular membrane formation time has a simple correlation with the actual clot formation time. . Furthermore, the structure of the latex sufipurine reticular membrane is dependent on fibrinogen concentration. , Therefore, it is also possible to detect the concentration abnormality at the same time.

本発明の１つの目的としては、抗凝血物質の使用の有無を問わず、血漿試料より むしろ血液そのものの試料について誘導される凝血時間の測定を可能にすること である。One object of the present invention is to obtain blood samples from plasma samples, with or without the use of anticoagulants. Rather, it is possible to measure coagulation times induced on samples of blood itself. It is.

本発明のもう１つの目的は、組成の変化が測定にあまり影響を与えないように試 料を希釈することである。Another object of the present invention is to provide a method for testing so that changes in composition do not significantly affect measurements. It is to dilute the liquid.

本発明のもう１つの対象は、ｍ認を明確にする背景を使用することで、いかなる 沈澱ヤ色の変化も目視による知覚を可能ならしめることである。Another object of the invention is that by using a background that clarifies m recognition, any Changes in the color of the precipitate also allow for visual perception.

本発明のもう１つの目的は、凝血過程の終点を決定するのに、血餅形成のあやふ やな時間よりはむしろ、フィブリン網状膜の形成の精密な時間を観測者が頼るこ とかできるようにして、凝血時間の見積りにおける測定誤差を減する目的で、凝 血時間を延長することである。Another object of the present invention is to determine the end point of the clotting process by The observer should rely on the precise time of fibrin network formation, rather than the exact time. In order to reduce measurement errors in estimating clotting time, It is to extend blood time.

本発明のもう１つの目的は、重合反応の目視による観察を可能にすることである 。Another object of the invention is to enable visual observation of polymerization reactions. .

本発明のもう１つの目的は、凝血時間を測定すると同時に、血液本発明のもう１ つの目的は、血液の凝析へと導くものとして、ある体積の血液の表面積を増す粒 子を加えることである。Another object of the present invention is to simultaneously measure blood clotting time and to measure blood clotting time. One purpose is to increase the surface area of a volume of blood by adding particles that increase the surface area of a volume of blood, leading to coagulation of the blood. It is adding a child.

添加する粒子を、これによって誘導される凝析の最大速度に必要な表面積を十分 越えるような全表面積を与える景加えて、その結果、表面積が開始や制御等の凝 析速度の変化の一要因とならないようにする。上述の粒子は表面積をかせぐ以外 にいくつかの機能との組合せが意図されている６例えば、反応の視覚化の促進の ためにラテリゾームなどがそれに当る。Add particles, thereby providing enough surface area for the maximum rate of coagulation induced. In addition to providing a total surface area that exceeds the total surface area, the resulting surface area is Avoid being a factor in changes in analysis speed. The particles mentioned above do more than just gain surface area. It is intended to be combined with several functions, e.g. to facilitate reaction visualization. This includes laterisomes.

本発明のもう１つの目的は、凝析反応の反応物もしくは生成物と会合する粒子を その反応に加えることと、その粒子を十分な量加えて、上述の反応物もしくは生 成物を１つ以上の観点（例えば反応時間）から容易に検出又は測定し、また種々 の性質の粒子反応に関連する上述の反応の特性をも（例えば凝結又は吸着）検出 又は測定す例えば、抗凝血化した血液中のフィブリノゲンは、トロンボプラスチ ンと混合すると、ある凝血因子（例えば因子Ｖｌｌ）濃度依存の時間でフィブリ ン網状膜を形成する。ある量の特定のラテックス粒子（例えば０．７５４ミクロ ン径の白色ポリスチレン）を加えるとフィブリン網状膜の形成時間をより明確に 見ることができる。ラテックス粒子が血液中に導入されると受身吸着によりフィ ブリノゲン分子と会合する。トロンボプラスチンを添加した結果、フィブリノゲ ンが重合してフィブリンになると、凝集を起して白色ラテックスは容易に検出で きる。このラテックスの媒介する、簡単に検出可能な現象の時間は因子ｖ■の濃 度に依存している。しかし、この現象の性質はフィブリノゲン濃度に依存して異 なってくる。フィブリノゲン濃度が正常の時、フィブリン網状膜は重々しい凝結 物のようであり、やや低い濃度のときは顆粒状沈澱のようであり、非常に低いフ ィブリノゲン濃度のときは、薄い東のようになる。Another object of the invention is to remove particles associated with reactants or products of a coagulation reaction. Add to the reaction and add enough of the particles to components can be easily detected or measured from one or more aspects (e.g. reaction time) and It also detects the properties of the above-mentioned reactions associated with particle reactions of the nature (e.g. condensation or adsorption). For example, fibrinogen in anticoagulated blood can be measured by thromboplastin. When mixed with certain clotting factors (e.g. factor Vll), fibrillation occurs at a time dependent on the concentration. Forms a reticular membrane. A certain amount of specific latex particles (e.g. 0.754 microns) The formation time of the fibrin network film becomes clearer when adding white polystyrene with a diameter of You can see it. When latex particles are introduced into the blood, they are absorbed into the fibril by passive adsorption. Associates with brinogen molecules. As a result of adding thromboplastin, fibrinogen When fibrin polymerizes, it aggregates and the white latex is easily detected. Wear. The time for this latex-mediated, easily detectable phenomenon is the concentration of factor v. It depends on the degree. However, the nature of this phenomenon varies depending on the fibrinogen concentration. It's coming. When the fibrinogen concentration is normal, the fibrin reticular membrane becomes heavily coagulated. It looks like a solid substance, and at a slightly lower concentration it looks like a granular precipitate, and it has a very low concentration. When the concentration of fibrinogen is high, it becomes like a thin Higashi.

本発明のもう１つの目的は、ある物質（例えばトロンボプラスチン）を加えるこ とによって引き起される検定反応中で会合を起こす粒子（例えばラテックス）の 添加のための簡単な方法を与えることである。その中で上述の粒子は、添加され る物質とは無関係に、上述の反応（例えばフィブリン形成）の組成物質（伊１え ばフィブソノゲン）と会合する。さらにその中では、２種以上の粒子を一緒に使 用することは、いかなる濃度でもその２種の粒子を単独で添加したよりもその反 応を促進する０例えば、プロトロンビン時間の中でもっとも容易に観察できる結 果としては、０．２７７ミクロン径の白色ポリスチレンをいろいろな量加えてい くと、小さな白色の塊が突如として出現することがあげられる。同物質の０．７ ６４　ｔクロン径ラテックスを使用するとより大きい塊が徐々に出現する。この ２つの粒子をうまい組合せの量添加すると大きな塊が突如として出現し、その反 応の度合は、いかなる濃度においても、その２種の粒子を単独で添加したときよ りも大きい。Another object of the invention is to add certain substances (e.g. thromboplastin) to of particles (e.g. latex) that associate in the assay reaction caused by The purpose is to provide an easy method for addition. In which the above-mentioned particles are added Regardless of the substances involved in the reaction (e.g. fibrin formation), fibsonogen). Furthermore, in this process, two or more types of particles are used together. adding more particles to the reaction than the addition of the two particles alone at any concentration. For example, prothrombin time is the most easily observed result. As a result, various amounts of white polystyrene with a diameter of 0.277 microns were added. When you do this, small white lumps may suddenly appear. 0.7 of the same substance Larger lumps gradually appear when using 64t chron diameter latex. this When two particles are added in a well-combined amount, a large lump suddenly appears; The degree of response at any concentration is greater than when the two types of particles are added alone. It's also big.

本発明のもう１つの目的は、ある反応の反応物もしくは生成物と会合もしくは相 互作用する２種類以上の粒子をその反応系に加えることであり、そして上述の反 応を容易に検出もしくは測定（促進）できるようにするか、あるいは反応物又は 生成物が単独の場合や、使用する粒子が１種類の場合よりも検出もしくは測定し にクク（阻害）するように上述の粒子の特性（例えば、粒子径）を選択すること である。Another object of the present invention is to It is the addition of two or more types of particles that interact with each other to the reaction system, and the above-mentioned reaction the reaction is easily detected or measured (promoted) or more easily detected or measured than when the product is isolated or when only one type of particle is used. Selecting the above-mentioned particle properties (e.g. particle size) to inhibit It is.

本発明のもう１つの目的は、異なる特性（例えば粒子ｐＩりをもつ粒子を反応系 に与え、その反応のある特定の特性（例えば出現時間）を粒子の無い場合もしく は１種の粒子しか存在しない場合に比べてより簡単に検出もしくは測定でき、ま た上述の反応の他の特性（例えばプロトロンビン凝血時間♂、ＩＩ定におけるフ ィブリノゲンのような組成物の濃度）をラテックス粒子の出現の性状（例えば、 高フイブリノゲン濃度では凝結が生ずるが低濃度では白い膜ができる）により簡 単に識別することができるように、その反応を促進もしくは阻害することである 。Another object of the invention is to introduce particles with different properties (e.g. particle pI) into a reaction system. and certain properties of the reaction (e.g. appearance time) in the absence of particles or are easier to detect or measure than when only one type of particle is present; and other properties of the above-mentioned reactions (e.g. prothrombin clotting time ♂, concentration of compositions such as fibrinogen) and the nature of appearance of latex particles (e.g. High fibrinogen concentrations cause flocculation, while low concentrations form a white film). simply promoting or inhibiting a reaction so that it can be identified .

本発明のもう１つの目的は、凝析、＃２簗、顆粒化もしくは凝結の開始から完了 までの時間を制御することである。Another object of the present invention is to start and complete coagulation, #2 granulation, granulation or coagulation. It is to control the time.

本発明のもう１つの目的は凝集物質のサイズと見やすさを制御することである。Another object of the present invention is to control the size and visibility of aggregate material.

本発明のもう１つの目的は凝析、凝集、顆粒化もしくは凝結反応の速度と見やす さを同時に制御することである。Another object of the present invention is to improve the speed and visibility of the coagulation, flocculation, granulation or flocculation reactions. The goal is to simultaneously control the

本発明のその他の目的は、これらの説明および請求の範囲を読んだ後はこの分野 で通常の能力を備えた人には明白であろう。Other objects of the invention will be apparent to those skilled in the art after reading these descriptions and claims. would be obvious to a person of ordinary ability.

図面の簡単な説明 図１．　単分散ラテックス分散凝血試薬の添加に対する粒子サイズ、粒子分散体 積および凝集の性質の関係 図２．２分散ラテックス分散凝血試薬の添加における０、２７７および０．７６ ４ミクロンラテックス粒子の相対濃度に対する凝集の性質の関係 望ましい具体例の詳細な説明 この分野におけるいくつかの文献では、フィブリン網状膜の形成と血餅形成を区 別する試みはほとんどなされていない。しかし、非常に低いフィブリノゲン濃度 においては、後にできる血餅をＩ８１察することなしに網状膜を観察できるので 、この区別が正しいことは明らかである。網状膜の形成によって、我々のテスト キット中のラテックスなしでは、観察チャンバーの周囲に不明瞭で白く光る糸の ようにしかみえない重合化したフィブリンへのフィブリンモノマーの重合をみて とれる。その糸がフィプリノライゲースによって相互に結合すると、糸が癒合し 厚くなり、血小板や赤血球のような他の血液要素がからまり合い、網状構造がよ り強固になって真の血餅と呼ぶところの黒い塊りとなる。Brief description of the drawing Figure 1. Particle size and particle dispersion for the addition of monodispersed latex-dispersed coagulation reagents Relationship between product and agglomeration properties Figure 2.2 0, 277 and 0.76 in the addition of dispersed latex-dispersed clotting reagents Relationship of agglomeration properties to relative concentration of 4 micron latex particles Detailed description of preferred examples Some literature in this field distinguishes between fibrin network formation and clot formation. There has been little attempt to separate them. However, very low fibrinogen concentrations In this case, the reticular membrane can be observed without detecting the blood clot that forms later. , it is clear that this distinction is correct. Our test by formation of reticular membrane Without the latex in the kit, there would be an indistinct white glowing thread around the observation chamber. Looking at the polymerization of fibrin monomer into polymerized fibrin that only looks like It can be taken. When the threads are joined together by fipurinoligase, the threads fuse together. It becomes thicker, and other blood elements such as platelets and red blood cells become entangled, creating a more reticular structure. It hardens and becomes a black mass called a true blood clot.

凝血過程の活性化から血餅の観察までの時間が凝血時間である。The time from activation of the clotting process to observation of the clot is the clotting time.

この時間間隔は、凝血過程の活性化からフィブリン網状膜の観察までの見かけの 時間間隔と容易に関係づけられ、計算できる。This time interval corresponds to the apparent time from activation of the coagulation process to observation of the fibrin reticular membrane. It can be easily related to and calculated with time intervals.

フィブリン網状膜に対するこの潜在的な時間はフィブリン系の最初の出現から網 状膜の形成完了までの網状膜形成時間と混同してはならない。後者はフィブリン 網状膜形成時間の“正確な定義”と考えることができる。This potential time for the fibrin reticular membrane varies from the first appearance of the fibrin system to the reticular membrane. This should not be confused with the time taken to form a reticular membrane until the formation of a reticular membrane is completed. The latter is fibrin This can be considered an "accurate definition" of reticular membrane formation time.

凝血は一種の“凝析”である。“凝析”集合”集積”凝集”という言葉を区別す ることは可能であるが出願人はこれらの言葉を混同して使用している。′凝結“ および“顆粒化”は、凝集の性質を言う場合に、粒状の期待される凝集物の性状 を生ずる反応を記述するのに使用される。Blood clotting is a type of "coagulation." Distinguish between the words “coagulation,” “aggregation,” and “agglomeration.” However, the applicant uses these terms interchangeably. ``Condensation'' and “granulation” refers to the nature of agglomeration, with the expected granular nature of the agglomerates. used to describe reactions that result in

（希釈と拡張） 血液の希釈は凝集時間を遅らせ、そして観察可能なフィブリン網状膜の形成と真 の観察可能な血餅形成の間の時間間隔を数秒間長くする。望ましくは、希釈物の 体積は試料体積の少なくとも４倍にすべきである。(dilution and expansion) Dilution of the blood slows down the aggregation time and leads to the formation of an observable fibrin reticular membrane. Increase the time interval between observable clot formation by several seconds. Preferably, the diluent The volume should be at least 4 times the sample volume.

さらに、血液を拡げることは網状膜形成の観察を容易にする。例えば、この発明 の方法中使用する装置の中で、観察チャンバー中５×７ｆｌの観察面積で数ミリ メートル程の厚みに血液を拡げる。Additionally, spreading the blood facilitates observation of reticular membrane formation. For example, this invention In the apparatus used during the method, the observation area of 5 x 7 fl in the observation chamber is a few millimeters. Spreads the blood to a thickness of about a meter.

（このチャンバーには液体の全体積は２．５ｍｌが好ましい。）その反応の最初 には、観察チャンバー内の、血液−トロンボブラステン溶液の薄く、きれいに澄 んだ層の端に沿って膨れが観察できる。(The total volume of liquid in this chamber is preferably 2.5 ml.) At the beginning of the reaction. The blood-thromboblasten solution is kept in a thin, clean, and clear state in the observation chamber. Blisters can be observed along the edges of the solder layer.

同時に、この希釈と拡張は標準テストの１０秒と比較して、通常の凝血時間を約 ６０秒にまで遅らせる。この事は観察者の測定誤差を６倍も減少させる。また、 この延長が簡拮な物理現象であるフィブリン網状膜の初期の形成と真の血餅形成 を数秒間分離する。この方法において、観察者は、より延長した真の血餅形成と いうよりはむしろ正確に網状膜形成を時間計測することができる。At the same time, this dilution and dilation means that normal blood clotting times are approximately Delay to 60 seconds. This reduces the observer's measurement error by a factor of six. Also, The initial formation of a fibrin reticular membrane and the formation of a true blood clot are physical phenomena that facilitate this extension. Separate for a few seconds. In this method, the observer can detect a more prolonged true clot formation. Rather, it is possible to accurately time the reticular membrane formation.

また血液の希釈はζその赤血球容積比に伴う凝血時間の実際的な変化を減少する 。希釈と拡張の双方とも光学密度を減じ、隣状膜をより容易に観察できるように する。Blood dilution also reduces the actual change in clotting time associated with its red blood cell volume ratio. . Both dilution and expansion reduce the optical density, allowing adjacent membranes to be more easily observed. do.

（対照背景と着色試薬による視覚化の促進）着色試薬（例えば、色素や染料）も しくは、着色又は螢光背景を使って、観察チャンバー内の網状膜を見やすくする 。Coloring reagents (e.g. pigments and dyes) may also Alternatively, use a colored or fluorescent background to make it easier to see the reticular membrane in the observation chamber. .

（凝血試薬） いくつかの物質は血液の凝析を誘導することができる。血液の凝析測定に使用さ れるものにはトロンビン、トロンボプラスチン、部誘導体および、ボスロブス・ アトロフクス（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ　ａＬｒｏに）の毒から単離されるトロンビン 様酵素であるレプチレースーＲ（ペンタファーム・リミテッド（Ｐｅｎｔａｐｈ ａｒｍ　Ｌｔｄ、）　４００２パスル（Ｂａｓｔｅ）スイス、米国イリノイ州、 　６００６４７．北シカゴのアボット研究所（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｉｅｓ）　＋　診療科（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｄｉｖｉ’５ｉｏｎ）から入 手できる）のような類似物質が含まれる。いずれの経路においても凝血を起こし 得るいかなる試薬も凝血試薬と考えることができる６（ラテックス粒子による視 覚化の促進）フィブリン網状膜形成をラテックスで促進した時に観察される最初 のものは、プロトロピン時間を測定するための初期の発明で測定された凝血時間 を長くするのに使われた食塩水での希釈物と異なる大きさの白いラテックス粒子 の複合集合体を混合状態である特定量含むものである。この特定物質を凝血試薬 存在下で血液に添加することは、同様の血液でラテックスなしのときに生ずるフ ィブリン閘状膜形成時と同じ時に白い塊りを形成する。プロトロンビン時間法で は５０ｔａｇのトロンボプラスチンと２．０ｍｌの希釈剤との０．５ｍｌの血液 を使用し、その凝血時間は正常人の血液に対しては約１分間である。この白い塊 りは通常のフィブリン網状膜よりも容易に見ることができる。(Blood clotting reagent) Some substances can induce blood clotting. Used for blood coagulation measurements These include thrombin, thromboplastin, derivatives, and bothrobus. Thrombin isolated from the venom of Bothrops aLro Leptilase-R (Pentaph-like enzyme) arm Ltd,) 4002 Baste Switzerland, Illinois, USA, 600647. Abbott Laboratory in North Chicago ries) + Enter from the Diagnostic Division. Contains similar substances such as Both routes cause blood clots. Any reagent obtained can be considered a clotting reagent6 (visible by latex particles). (Promotion of awakening) The initial stage observed when fibrin network formation is promoted with latex. The clotting time was measured by an early invention for measuring protropin time. White latex particles of different sizes with dilutions in saline solution used to lengthen It contains a specific amount of a complex aggregate of in a mixed state. This specific substance is used as a blood clotting reagent. Adding it to blood in the presence of A white mass is formed at the same time as the fibulin lock-like membrane is formed. By prothrombin time method is 0.5 ml blood with 50 tag thromboplastin and 2.0 ml diluent. The clotting time for normal human blood is approximately 1 minute. this white lump The fibrin reticular membrane is easier to see than the regular fibrin reticular membrane.

種々のサスペンション状態のラテックス粒子が三つの異なる製造業者から得るこ とができる。ある業者からの粒子を用いたとぎの観察結果が他の業者からの粒子 を用いたときのもので確められた。異なる業者からの同様な粒子間の差は普ｊｉ Ｉｌサスペンションの媒体（例えば表面活性剤の有無）やもしくは包装（例えば サスペンションを入れる固体容器）の違いによる。Latex particles in various suspension states can be obtained from three different manufacturers. I can do it. Observation results obtained using particles from one vendor may differ from those obtained using particles from another vendor. This was confirmed when using . Differences between similar particles from different vendors are generally Il suspension medium (e.g. with or without surfactant) or packaging (e.g. This depends on the solid container in which the suspension is placed.

最初の実験は、固型化のｖｉ察が、ある種の自然に起こる凝集によるものか、血 液の凝血と関連しているものかを決定できるように企てられた。その固型物は、 希釈した血液に添加するトロンビンやトロンボプラスチンのような凝血剤なしに は生成しなかった。固型物の生成時間はラテックスの添加というよりむしろ凝血 剤の添加時間に関係しているし、また固型物の時間は用いた血液の凝血時間によ って変化した。顕微鏡でＢ察してみるとラテックス粒子がフィブリンと密に会合 しており、この固型物は凝結反応によるものだということがわかる。界面動力学 会社（Ｉｎｔｅｒｆａｃｉａｌ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　 ）　（ラテックス粒子製造業者）の社長ジエフリー・ジ−マン博士（叶、　Ｇｅ ｏｆｆｒｅｙ　Ｓｅｅｍａｎ　）の好意により撮影され、提供された電子顕微鏡 写真は、顕微鏡観察を確証した。Initial experiments showed that the visualization of solidification was due to some kind of naturally occurring aggregation, or that blood It was designed to be able to determine what fluid is associated with blood clots. The solid material is No blood clotting agents like thrombin or thromboplastin added to diluted blood was not generated. Solid formation time depends on coagulation rather than latex addition. It is related to the time of addition of the agent, and the time of solid matter depends on the clotting time of the blood used. It changed. When observing B with a microscope, latex particles are closely associated with fibrin. It can be seen that this solid substance is caused by a coagulation reaction. interfacial dynamics Interfacial Dynamics Corporation ) (latex particle manufacturer) Dr. Jeffrey Zieman (Kano, Ge Electron microscope photographed and provided kindly by Offrey Seeman The photographs confirmed the microscopic observations.

ラテックスの存在下での反応の開始時間は食塩水のみで希釈したものについて期 待される値と変らなかった。すなわち、この発明の方法で採用される装置を室温 で使用すると、１…１の食塩水で希釈したときは約３０秒そして２ｍｌの食塩水 で希釈したときには約６０秒がフィブリン網状膜の形成にかかる。徐々に血液の 希釈を　行っていけば別であるが、粒子の存在するかどうかでフィブリン網状膜 形成時間に大きい変化が現れることはない。このように粒子の働きは開始時間を 変えるのではなく、網状膜を見やすくすることである。The onset time of the reaction in the presence of latex is estimated for dilutions with saline only. The value was the same as expected. That is, the apparatus employed in the method of this invention is kept at room temperature. When diluted with 1...1 saline solution, it takes about 30 seconds and 2ml of saline solution. It takes about 60 seconds to form a fibrin reticular membrane when diluted with . gradually of blood It will be different if you dilute it, but the fibrin reticular membrane depends on whether particles are present or not. No significant changes appear in the formation time. In this way, the particle action depends on the start time The goal is not to change it, but to make it easier to see the reticular membrane.

２つのタイプの実験で、凝結時間測定試験に対しては、凝析に先だって、化学結 合よりはむしろ血液中を循環している物質の受身吸着が重要であることが示され た。（この試験や他の試験においては、化学結合も使用され、有効ではあるのだ けれど）。表面活性剤を含むラテックス粒子サスペンションは、それを含まない もの程有効ではない。疎水的表面をコートする少量の表面活性剤をプロトロンビ ン時間凝結反応に添加すると、フィブリン網状膜は観察されるが、凝結反応は起 こらない。例えば、ラテックスによって促進された観察の闇値は、３０秒のフィ ブリン網状膜形成時間を与える条件である　０．５ｍｌの血液、５０ＩＩｖのト ロンボプラスチンおよび１．　Ｏｍｌの希釈剤を含むプロトロンビン時間の試験 条件に、ｏ、７１１ミクロン径の８．７％固体ポリスチレンラテックス粒子の表 面活性剤を含まない食塩水サスペンションを５０μｌ加えることによって与えら れる。In two types of experiments, chemical condensation is performed prior to coagulation for the setting time measurement test. It has been shown that passive adsorption of substances circulating in the blood is more important than absorption. Ta. (Chemical bonds are also used in this and other tests, although they may be effective.) However). Latex particle suspensions containing surfactants do not contain It's not very effective. Add a small amount of surfactant to prothrombin to coat the hydrophobic surface. When added to the coagulation reaction for a long time, a fibrin network membrane is observed, but the coagulation reaction does not occur. It doesn't bother me. For example, the observation darkness value facilitated by latex is 0.5 ml of blood, 50 IIv of blood, which is the condition that gives the brine reticular membrane formation time. Rhomboplastin and 1. Test of prothrombin time with Oml diluent Table of 8.7% solid polystyrene latex particles with a diameter of 711 microns. by adding 50 μl of saline suspension without surfactant. It will be done.

特に断わらない限り、ラテックス粒子の変化を伴う今後の全ての実験では、この プロトロンビン時間試験条件が使用される。表面活性剤トウィーン２０　（Ｔｗ ｅｅｎ　２０　）を２０〜４０マイクロモル加えると、フィブリン網状膜の形成 は妨げないが、ラテックスによる促進作用はなくなる。Unless otherwise noted, all future experiments involving changes in latex particles should be performed using this method. Prothrombin time test conditions are used. Surfactant Tween 20 (Tw When 20 to 40 micromoles of een20) is added, a fibrin network membrane is formed. does not interfere with the process, but the promoting effect of latex is eliminated.

別の観察によると、最初の粒子混合のときには、化学結合より受身吸着が重要で あることが示される。ポリスチレンからなる粒子は化学結合に利用しうる末端ス ルホン酸残基をもっている。他の高分子からなる粒子は一般に化学結合能を有す るヒドロキシル基、カルボニル基およびアミノ基を伴う末端官能基をもつ。ある レベルの促進作用を示すのに必要なラテックス粒子の濃度は、使用される粒子の 官能基よりもまず、粒子径や固体含有率に依存している。しかし、特別な目的を もつ利用者にとっては、特定の末端残基の使用が望ましいかもしれない。我々の 場合には、末端アミノ基に若干の有効性が認められる。Another observation has shown that passive adsorption is more important than chemical bonding during initial particle mixing. It is shown that something is true. Particles made of polystyrene have an end chain that can be used for chemical bonding. It has sulfonic acid residues. Particles made of other polymers generally have chemical bonding ability. It has terminal functional groups with hydroxyl, carbonyl and amino groups. be The concentration of latex particles required to exhibit a level of promoting effect is determined by It depends primarily on particle size and solids content rather than functional groups. But for a special purpose The use of certain terminal residues may be desirable for users with our In some cases, the terminal amino group has some effectiveness.

凝血試験において観察されるラテックスによる促進作用の性状が粒子の濃度や径 によって系統的に変化することがわかった。０．１ミクロン以下の径の粒子では 、その反応を裸眼で観察することは難しい、（シかし、螢晃や鍵力のような手段 で観察する場合には、そのような粒子も利用できる。）３．０ミクロン径以上の 粒子では体積に対する表面積比が小さいので、望ましい全表面積を達成するのに 、多量の高価な粒子が必要となる。０．１〜３．０ミクロン径の範囲の粒子が取 扱いや観察に簡便である。いかなる粒子径や最適粒子濃度も、不適当な試験なし に決定した。最適の粒子濃度から増加しても減少しても次のような順序で反応の 性質が変化する。（１）凝結量が最高値から減る。（２）多くの小さい顆粒がで きて凝結物がほとんどできない、（３）多くの顆粒しかできない。（４）顆粒及 び白くコーチインされた血餅。（５）白くコートされた血餅のみ。（６）血餅か ら分離した小さな白色のフィブリン膜。（７）促進されていないフィブリン網状 膜形成。異なる粒径の粒子量を系統的に変化させると反応の性質に特徴がでてく る。異なる粒径に対する量変化は図１に示されるような比較可能な結果を生ずる ことになる。The nature of the latex-promoting effect observed in blood coagulation tests depends on particle concentration and diameter. It was found that it varies systematically. For particles with a diameter of 0.1 micron or less , it is difficult to observe the reaction with the naked eye (methods such as Shikashi, Akira Kei, and Kagiri) Such particles can also be used for observation. ) with a diameter of 3.0 microns or more Particles have a small surface area to volume ratio, so to achieve the desired total surface area, , large amounts of expensive particles are required. Particles in the range of 0.1 to 3.0 microns in diameter are collected. It is easy to handle and observe. No inappropriate testing for any particle size or optimum particle concentration It was decided. Regardless of whether the particle concentration increases or decreases from the optimal particle concentration, the reaction proceeds in the following order: Character changes. (1) The amount of coagulation decreases from its maximum value. (2) Many small granules (3) Only many granules are formed. (4) Granules and Blood clot coated white. (5) Only white coated blood clots. (6) Blood clot? A small white fibrin membrane separated from the membrane. (7) Unpromoted fibrin network Membrane formation. By systematically changing the amount of particles of different particle sizes, characteristics of the reaction appear. Ru. Amount variations for different particle sizes yield comparable results as shown in Figure 1. It turns out.

ラテックス粒子サスペンションの体櫃当りの総表面積は固体含有率、粒子密度、 および粒径から計算できる。異なる粒径の粒子サスペンションに対してこの計算 をすると、ある総表面積はラテックス促進作用の各性状を生ずることがわかった （ある試料体積、希釈比およびフィブリノゲン濃度に対して）。The total surface area per body of a latex particle suspension is determined by the solids content, particle density, and particle size. This calculation for particle suspensions of different particle sizes It was found that a certain total surface area produces each property of latex promotion effect. (for a given sample volume, dilution ratio and fibrinogen concentration).

ラテックス粒子のある特定の表面積は凝血時間の視覚化促進の特定の性質に対応 するという結論は、その反応における初期のラテックスの会合が受身吸着に媒介 されているという観察と一致している。Certain surface areas of latex particles correspond to specific properties for promoting visualization of clotting time The conclusion is that early latex association in the reaction mediates passive adsorption. This is consistent with the observation that

ラテックス粒子上への配位子の吸着は利用可能な表面積と配位子濃度に依存する 。我々の場合、総ラテックス表面積が約１７〜１８平方センチメートルで、希釈 剤及び血液の体積は以前に与えられた通りで、フィブリノゲン濃度が標準レベル である時、フィブリノゲン分子は明らかに、最適量のラテックス上の最適使用可 能空間に吸着する。視覚化促進の性質はフィブリノゲン濃度の変化と共に変化す る。もしもフィブリノゲン濃度が正常なものなら、それは最もうまく吸着し、最 高の凝析景となるであろう。もしフィブリノゲン濃度が正常なものより低い場合 は、吸着量も減り、顆粒もしくは白色膜が生ずるであろう、トロンボプラスチン のような組織因子の添加後の血餅出現時間は、フイブリノゲン以外の循環する凝 血因子の働きに左右される。フィブリノゲン濃度は、ある構造をもったラテック ス凝集物の外観によって定性的に示される。Ligand adsorption onto latex particles depends on available surface area and ligand concentration . In our case, the total latex surface area is approximately 17-18 cm2 and the dilution The drug and blood volumes were as given previously and the fibrinogen concentration was at standard levels. The fibrinogen molecules are clearly optimally available on the latex in an adsorbs into functional space. The properties of visualization enhancement change with changes in fibrinogen concentration. Ru. If the fibrinogen concentration is normal, it is best adsorbed and It will be a highly condensed view. If fibrinogen levels are lower than normal The amount of adsorption will be reduced, and granules or a white film will be formed. The clot appearance time after the addition of tissue factor, such as It depends on the action of blood factors. Fibrinogen concentration is a latex with a certain structure. Qualitatively indicated by the appearance of gas agglomerates.

フィブリノゲンとラテックスとの結合は巨視的に見ることはできない。トロンボ プラスチンの添加後、フィブリノゲンは分解し、ある特定の時間に重合してフィ ブリンを形成する。それは会合したラテックス粒子により視覚的促進を受けた網 状膜への重合である。フィブリン分子に結合した凝集化粒子の出現時間を決定す るのはトロンボプラスチンもしくはその他の凝血試薬の添加である。この凝集反 応はラテックス粒子に対するフィブリノゲンの受身吸着という二次反応で、血液 もしくは粒子のいかなるその他の処理がない場合でも開始する。すなわち、血液 の凝析試験はワンステップのラテックス付加反応によって進行する二状態ラテッ クス反応である。The bond between fibrinogen and latex cannot be seen macroscopically. Trombo After adding plastin, fibrinogen degrades and polymerizes at a certain time to form fibrinogen. Form a brine. It is a visually facilitated web formed by associated latex particles. This is polymerization to form a membrane. Determining the appearance time of aggregated particles bound to fibrin molecules. is the addition of thromboplastin or other clotting reagent. This cohesive reaction The reaction is a secondary reaction of fibrinogen being passively adsorbed to latex particles, and blood or start even in the absence of any other processing of the particles. i.e. blood The coagulation test is a two-state latex addition reaction that proceeds through a one-step latex addition reaction. This is a reaction.

多くの分子がラテックスに対し、親和性をもっているにもかかわらず、凝析検定 には典型的に純粋なコーティング剤が使用される。Although many molecules have an affinity for latex, coagulation assays Pure coating agents are typically used.

この方法ではラテックス上でのフィブリノゲンによる純粋な意味でのコーティン グは必要とせず、むしろ、フィブリノゲンのフィブリンへの変換と、フィブリン の重合が望ましい凝集に寄与するので、ラテックス粒子上でのフィブリノゲンを 含む血液タンパク質の競合的吸着を許すものである。集合物質の構造上の変化は 微視的および巨視的に観察でき、そして誘導反応（フィブリン形成）中の前駆体 タンパク質（フィブリノゲン）の初期濃度と密接な関係がある。血液凝析試験に おいて、希釈血液は巨視的にはピンクで均一の液体である。凝血物質（例えばト ロンボプラスチン）の添加は、いくつかの因子や変数によって予め決定できる時 間にフィブリン形成を誘導する。ある量のラテックス粒子が加えられると、フイ ブリノゲン濃度が標準レベル（例えば４．０ｍｇ／ｍｌ）であるならば、最高の 凝結が起こる。凝結物質は赤い液体中に大きな白い塊りのようにみえる。In this method, a pure coating of fibrinogen on latex is produced. rather, the conversion of fibrinogen to fibrin and the fibrinogen on the latex particles because the polymerization of fibrinogen contributes to the desired aggregation. This allows for competitive adsorption of blood proteins involved. Structural changes in aggregate materials are Precursors that can be observed microscopically and macroscopically and during induction reactions (fibrin formation) It is closely related to the initial concentration of protein (fibrinogen). For blood coagulation test Macroscopically, diluted blood is a pink, homogeneous liquid. Clotting substances (e.g. The addition of rhomboplastin) can be predetermined depending on several factors and variables. Inducing fibrin formation during the process. When a certain amount of latex particles are added, the filament If the brinogen concentration is at standard levels (e.g. 4.0 mg/ml), the highest Condensation occurs. The condensed material looks like large white lumps in the red liquid.

凝結反応は、フイブリノゲン濃度が標準レベルより多くても少なくとも減少する 。凝結反応の程度が減少すればその結果として、フイブリノゲン濃度が標準レベ ルより多くても少なくとも、塊りの代りに数多くの白い顆粒力咄現する。しかし 、フイブリノゲン濃度が十分高い（例えば７．０■／ｍ１）か、もしくは十分低 い（例えば１．０■／ｍｌ）場合には、いかなる型の凝結も生ぜず、むしろ血餅 の表面を白くコーティングしたように見せる、フィブリン網状膜とラテックス粒 子との集合物を生ずる。考えられるところでは、これらの構造上変化は、反応物 を添加Ｉ＆重合するか反応してラテックスの凝集をひき起こす他の特定のタンパ ク質濃度を定性的に測定するのに用いることができる。The coagulation reaction is at least reduced even when the fibrinogen concentration is above standard levels. . As a result, the fibrinogen concentration decreases to normal levels as the extent of the coagulation reaction decreases. At least a large number of white granules appear instead of lumps. but , the fibrinogen concentration is either sufficiently high (e.g. 7.0/m1) or sufficiently low. (e.g. 1.0 μ/ml) does not result in any type of clotting, but rather clot formation. fibrin reticular membrane and latex grains that give the appearance of a white coating on the surface of Produces an aggregate with children. Conceivably, these structural changes are caused by changes in the reactants. Adding I & other specific proteins that polymerize or react and cause latex agglomeration It can be used to qualitatively measure protein concentration.

（粒子混合物による視覚化の促進） いくつかの粒径をもつ粒子の混合物は、集合物を生ずるのに単分散の粒子より、 を劾であることが分った。引きつづく実験によって、特定の粒子混合物は特定の 反応を可能にし、別の特定の混合物は特定の反応を阻害し、そして、粒径の違う 粒子の混合物が異なる相互作用をすることが診療にとって有妨であることが分っ た。(Facilitation of visualization by particle mixture) Mixtures of particles with several sizes are more effective at forming aggregates than monodisperse particles. It turned out to be a mistake. Subsequent experiments show that specific particle mixtures A specific mixture enables a reaction, another inhibits a specific reaction, and different particle sizes The different interactions of mixtures of particles have proven to be a hindrance to clinical practice. Ta.

いくつかの実験結果を編集したものが、図２に描いである。A compilation of some experimental results is depicted in Figure 2.

０．２７７および０．７６４ミクロンの粒径のみ異なる２種のラテックス粒子を 使用した。これらは食塩水中に分散させた（各々８．１％と８．７％固型物を含 む）白色ポリスチレンのラテックス粒子である（界面動力学会社　Ｉｎｔｅｒｆ ａｃｉａｌ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　）　ｏ図の各軸は粒 子サスペンションの液体体積と使用した各粒径に対する粒子サスペンションに相 当する粒子の全表面積を示している。図中に示されている量の粒子を１ミリリツ トルの食塩水に添加し、さらに　５０■の凍結乾燥したトロンボプラスチンとカ ルシラ７−（ディト（Ｄａｄｅ）　）とを混合する。その混合物に０．５ｍｌの 抗凝血化（３，８％クエン酸ナトリウム）血液を加えた。フィブリン−ラテック スの集合化の時間（約３０秒）と性状を各混合物に対して観察した。凝結生成に とって最適であるような各粒径に対する体積と対応する全表面積が決められた。Two types of latex particles differing only in particle size of 0.277 and 0.764 microns. used. These were dispersed in saline (containing 8.1% and 8.7% solids, respectively). ) White polystyrene latex particles (interfacial dynamics company Interf) acial Dynamics Corporation) Each axis in the diagram is a grain Compare the liquid volume of the child suspension to the particle suspension for each particle size used. The total surface area of the relevant particles is shown. 1 milliliter of the amount of particles shown in the diagram. of salt solution, and then added 50μ of freeze-dried thromboplastin and carbonate. Mix with Lucilla 7-(Dade). Add 0.5ml to the mixture Anticoagulated (3,8% sodium citrate) blood was added. fibrin-latek The time of aggregation (approximately 30 seconds) and properties of the mixtures were observed for each mixture. For condensation formation The volume and corresponding total surface area for each particle size were determined to be optimal for each particle size.

（例えば０．２７７　ミクロン径に対しては、１００μρ、１７〜１８平方セン チメートル、０．７６４ミクロン径に対しては、２５０μβ、１７〜１８平方セ ンチメートル）最適値から上下にズレると最大凝結のときと異なる集合体の性状 となる（例えば、小さな塊り、顆粒、白色にコートされた血餅、白色膜もしくは 促進されていないフィブリン網状膜）。これらは図１との関連でより詳しく記述 されている。集合体の性状は単一粒径の粒子が加えられたとき、加えられた粒子 の総表面積に対して決定される。最大の凝結を生ずるのに必要な表面積は、粒子 径に伴って最大の凝結のレベルにわずかな変化を示す前述の標準条件においては 常に約１７〜１Ｂｃｄであった。(For example, for a diameter of 0.277 microns, 100μρ, 17-18 square centimeters) cm, 250 μβ, 17-18 square cells for a 0.764 micron diameter. (inches) If there is a deviation above or below the optimum value, the properties of the aggregate will differ from those at maximum condensation. (e.g., small lumps, granules, white-coated clots, membrane albuginea, or unpromoted fibrin reticular membrane). These are described in more detail in relation to Figure 1. has been done. When particles of a single particle size are added, the properties of the aggregate are is determined for the total surface area of The surface area required to produce maximum agglomeration is At the standard conditions mentioned above, which show a slight variation in the level of maximum condensation with diameter. It was always about 17-1 Bcd.

最大の凝結もしくは他の特定の性状の集合体を生ずるのに必要な総表面積は異な る粒径粒子混合物によって異なる。The total surface area required to produce maximum agglomeration or other specific properties may vary. The particle size varies depending on the particle mixture.

図２の点線は１７−の一定の総表面積を生ずる粒径の異なる粒子混合物の組合せ を示しである。The dotted line in Figure 2 shows the combination of particle mixtures with different particle sizes that yield a constant total surface area of 17- is shown.

凝結反応は単一の粒径粒子を用いたときよりもある粒径粒子の組合せの時より広 い総粒子表面積にわたって検出することができる。The flocculation reaction is more widespread with certain particle size combinations than with a single size particle. can be detected over a large total particle surface area.

例えば、０．２７７　ｔクロン径の粒子のみを用いたとき、最大凝結は表面積が 約１７ｃ＋Ｊのとき起こり、表面積が１　ｃｄ増加しても減少しても大きく凝結 は減少し、それよりも大きく表面積を変化させると凝結はほとんど起こらなくな る。一方、０．７６４　ｔクロン径の粒子からなる約１０ｃｄの表面積が一貫し て用いられ、異なる量の０．２７７ミクロン径の粒子を加えると、総合計粒子表 面積が１４ｃｊ（１０＋４）ぐらい低いか、２５ａＪ（１０＋１５）もしくはそ れ以上の値のとき非常にうまく凝結を起こす。この観察値は広く範囲のフィブリ ノゲン濃度に渡って、凝血時間をより簡単に検出、測定させるものである。For example, when using only particles with a diameter of 0.277 t, the maximum condensation is Occurs at approximately 17c+J, and condensation occurs significantly even if the surface area increases or decreases by 1 cd. decreases, and if the surface area is changed larger than that, condensation will hardly occur. Ru. On the other hand, the surface area of approximately 10 cd consisting of particles with a diameter of 0.764 t is consistent. When adding different amounts of 0.277 micron diameter particles, the total particle table The area is as low as 14cj (10+4) or 25aJ (10+15) or something like that. Condensation occurs very well when the value is greater than or equal to . This observation reflects a wide range of fibrillation This makes clotting time easier to detect and measure across nogen concentrations.

その他の粒子サイズの混合物は明確な凝結を生ずるのに十分な総表面積の範囲が 減少する。例えば、ある数の０．７６４　（クロン径の粒子を総表面積が２−と なるように一定に保つと、明確な凝結が起こるのは約１４ｃａｌの総表面積のと きだけである（１８ｃｊの表面積では凝結はおこらない）。この発見の価値は狭 い範囲のフィブリノゲン濃度の検出にある。Mixtures of other particle sizes may have a range of total surface area sufficient to cause distinct agglomeration. Decrease. For example, if a particle with a certain number of 0.764 (Kron diameter) has a total surface area of 2- If the total surface area is kept constant, clear condensation will occur at a total surface area of approximately (no condensation occurs with a surface area of 18cj). The value of this discovery is Detection of a wide range of fibrinogen concentrations.

このように診療的に意味のあるフィブリノゲン（もしくはその他のタンパク質） の濃度の範囲は、粒径混合物とそれらの相対濃度を予め決定することにより検出 するのに選択される。Fibrinogen (or other proteins) that have clinical significance The range of concentrations can be detected by predetermining the particle size mixture and their relative concentrations. selected to do.

また、反応の性質を変える異なる粒径粒子の混合物に対する総表面積がある。凝 血反応において、白色コーティング血餅の出現に必要で、しかもそれ以下では膜 を視覚的に検出するのがより困難となるような最低の粒子総表面積がある。この 発見の価値は単一粒径の粒子を使用した時よりは予め選択された異なる粒径粒子 の混合物を使用した方がいろいろな濃度のフィブリノゲンをより正確に測定する ことができるということである。There is also a total surface area for mixtures of particles of different size that changes the nature of the reaction. stiffness In blood reactions, it is necessary for the appearance of white-coated blood clots, and below that, the membrane is There is a minimum total particle surface area such that particles are more difficult to detect visually. this The value of discovery is greater when using pre-selected particles of different sizes than when using particles of a single size. It is more accurate to measure fibrinogen at different concentrations using a mixture of This means that it is possible.

その他の一連の観察結果は図２に図示しである。ある種の卓越した反応が、各粒 径量をうまく組合せると起こることが示されている。A series of other observation results are illustrated in FIG. A kind of outstanding reaction occurs in each grain. This has been shown to occur when judicious combinations of diameter quantities are used.

この卓越した反応は単一粒径粒子を用いた時に観察される最もうまく進んた反応 の時の最もよい性質を助長することから生ずる結果のように思える。０．７６４ 　＜クロンの粒径粒子のみを使ったときの最も明確な反応は徐々に大きな塊りも しくはフロックの成長（１〜２秒の時間）、一方、０．２７７ミクロン径の粒子 のみのときの最も明確な反応はより少なくより小さいフロックの突然の出現であ る。この卓越した反応は、いかなる単一の粒径を用いたときよりもすみやかにそ してたくさんの突然に出現する大きなフロックの生成からなる。This outstanding reaction is the most successful reaction observed when using single-sized particles. This seems to be the result of promoting one's best qualities when 0.764 <The most obvious reaction when using only Chron's particle size particles is that the particles gradually become larger. or floc growth (time of 1-2 seconds), while particles of 0.277 micron diameter The most obvious reaction is the sudden appearance of fewer and smaller flocs. Ru. This superior response occurs more rapidly than with any single particle size. It consists of the formation of many large flocs that suddenly appear.

このことの意義は異なる粒径粒子の組合せがより明確で測定可能な反応を生ずる のに使用できることである。例えば、大多数の人はそのフィブリノゲン濃度が“ 正常″な範囲に入っている。選択された大小粒子の混合物（例えば０．７６４ミ クロン径のもの１００７７１２、と、０．２７７　ｔクロン径のもの７５μｌ） 、検出や測定をどんな初心者がやろうと十分に大きい、非常に明確な凝析反応が 起こる。検出におけるいかなる困難も異常なフィブリノゲンレベルを示すであろ う。　他の物質の検出や測定も容易になるように改善することができるであろう し、ラテックス以外の粒子も同様に使用できるであろう。The significance of this is that combinations of particles of different sizes produce more distinct and measurable reactions. It can be used for. For example, the majority of people have a fibrinogen concentration of “ A mixture of large and small particles (e.g. 0.764 mm) is within the normal range. 1007712 for chron diameter, and 75 μl for 0.277 t chron diameter) , a very clear coagulation reaction that is large enough for even beginners to detect and measure. happen. Any difficulty in detection would indicate abnormal fibrinogen levels. cormorant. It could be improved to make it easier to detect and measure other substances. However, particles other than latex could be used as well.

混合物の使用のその他の利点は経費の節減である。ラテックスは液体体積で市販 されている。時として、大きな粒子は小さいものに対し高価であり、その集合が 明確である点で有利である。しかし、より大きい粒子を用いたときは、特定の総 表面積を得るのにより多量の粒子が必要である。より少ない体積の小さい粒子を 添加することは粒子の総価格を節減する。Another advantage of using mixtures is cost savings. Latex is commercially available in liquid volume has been done. Sometimes large particles are more expensive than smaller ones, and their aggregation It has the advantage of being clear. However, when larger particles are used, certain total A larger amount of particles is required to obtain surface area. smaller particles with less volume Adding saves the total cost of particles.

出願人の発明を、観察されるラテックス粒子の促進作用に対する機構の次にあげ る要請に眼るべきではないけれども、その説明は、特定の応用にとって最も通し た特定試薬を選択するのにたいへん役に立つ。異なる粒径粒子の混合物間の促進 的又は阻害的相互作用の機構はその粒子の静電的性質に関係すると考えられてい る。ラテックス粒子はその粒径に直接かかわる負の電荷をもっている。サスペン ション中の粒子は同種電荷による相互の反発力と表面張力とによって互いにある 平均距離を保っている。これらの粒子は、粒子表面に引きつけられ、粒子間の距 離を橋渡しするのに十分な長さをもつ分子によって集合体を形成して、互いに結 合する。血液中の多くの分子はラテックス粒子に引きつけられるが、検出可能な 集合体を形成するのに十分な特性を全てのものが持つわけではない。フイプリノ ゲンはラテックスの表面に引きつけられる分子の一つであるが、粒子間の距離を 橋渡しすることはできない。しかしながら、トロンビンもしくはトロンビンと同 様な様式で生じ又は（ａ３＜物質（例えばトロンボプラスチン）を加えるとフイ プリノゲンからペプチドが切断されフィブリンモノマーが生じ、さらにそれらが 重合する。その長くなった分子鎖が、それらの集合体を作るように°粒子間の空 間を橋渡しをする。より大きい粒子はそれだけ互いの間の距離が長いので、集合 の前に生ずべきフィブリンの長さはより長いものが必要である。しかし、それが −ｍできてしまえば、その集合体は小さい粒子を使った場合に比べて、より大き く、より簡単に検出することができる。大小の粒子を特定の割合に組合せたもの を使用すると、粒子間の平均距離をより短かいものにすることができ、そのギャ ップを橋渡しをするのに初期に生成する短かいフィブリン分子の使用を許し、そ してより大ぎい粒子を含むということが容易に検出可能な集合体を作ることがで きる。集合体ができるためには、フィブリンへの重合が起こる前に、十分な量の フィブリノゲンが十分な量の粒子に吸着しなければならない。これは使用可能な 総表面積とフイプリノゲンの濃度によって決まる。しかし２つの粒子サイズを用 いたときは、重合の間にも幾分か反応する。１つの粒子の使用可能表面積が小さ いときは、あたかも使用可能なフィブリノゲンが、より大きい使用可能面積をも つ粒子に選択的に付着するかのごとくに、集合化の度合はより大きな使用可能表 面積をもつ粒子（優勢者）の表面積に依存する。十分な量のフィブリノゲンが非 優勢な粒子に吸着してしまい、その結果重合化のときに優勢者（より大きい表面 積をもつ）に弱い集合化しか起こしえない程度の量のフィブリノゲンしか引きつ けることができなくなってしまう粒子の相対濃度の領域がある。また、使用可能 フィブリノゲンが使用可能表面に吸着し、粒子当りのフィブリノゲン濃度がうま く粒子間距離に対応して、その結果より大きい表面積による集合化が起こるよう な、粒子の相対濃度領域が存在する。Applicant's invention is listed below as a mechanism for the observed promoting effect of latex particles. Although the requirements should not be overlooked, the explanation is most relevant for the particular application. This is very useful for selecting specific reagents. Promotion between mixtures of particles of different size The mechanism of the protective or inhibitory interaction is thought to be related to the electrostatic properties of the particle. Ru. Latex particles have a negative charge that is directly related to their size. Suspense Particles in the ion are held together by mutual repulsion due to like charges and surface tension. Maintains average distance. These particles are attracted to the particle surface and the distance between them increases. Molecules long enough to bridge the gap form aggregates and bind to each other. match. Many molecules in the blood are attracted to latex particles, but they cannot be detected. Not everything has enough properties to form an aggregate. fiiprino Gen is one of the molecules that is attracted to the surface of latex, but it is difficult to reduce the distance between particles. It cannot be bridged. However, thrombin or (a3< substance (e.g. thromboplastin) is added to Peptides are cleaved from purinogen to produce fibrin monomers, which are further Polymerize. The longer molecular chains create aggregates with spaces between particles. Bridging the gap. Larger particles are farther apart from each other, so they aggregate A longer length of fibrin is required to form the fibrin. But that is -m, the aggregate will be larger than when using small particles. and can be detected more easily. A combination of large and small particles in a specific ratio can be used to make the average distance between particles smaller and the gap It allows the use of initially generated short fibrin molecules to bridge the can form aggregates that can be easily detected as containing larger particles. Wear. For aggregates to form, a sufficient amount of A sufficient amount of fibrinogen must be adsorbed onto the particles. this is available Determined by total surface area and concentration of fipurinogen. However, using two particle sizes When present, some reaction also occurs during polymerization. Usable surface area of one particle is small When available fibrinogen takes up a larger usable area. The degree of aggregation increases as the particles selectively attach to particles. Depends on the surface area of the particle (dominant) with area. Sufficient amount of fibrinogen adsorption onto the dominant particles, and as a result during polymerization the dominant particles (larger surface (having a product), it attracts only an amount of fibrinogen that can cause only weak aggregation. There is a range of relative concentrations of particles beyond which it is no longer possible to Also available Fibrinogen is adsorbed to usable surfaces, resulting in a good fibrinogen concentration per particle. As a result, aggregation occurs due to a larger surface area, corresponding to a larger interparticle distance. There exists a region of relative concentration of particles.

（促　進） 我々は、小さい粒子を多く含み（１００＋＋＋１）、少量の大きい粒子を含む（ ２５ｍｌ）試料の電子顕微鏡写真を手に入れた。その写真は、その反応が長いフ ィブリン鎖よりはむしろ短いものが優先的に使われることを示している。(promotion) We have a large number of small particles (100+++1) and a small number of large particles ( An electron micrograph of the sample (25 ml) was obtained. The photo has a long reaction This indicates that short fibrin chains are preferentially used.

特定の長さの配位子が粒子間ギャップを橋渡しをするものであるか、もしくはそ うなりえるものである場合には、凝集が結果的に起こるように、互いの平均距離 を予め選択できるように粒径粒子の混合物を選択できる意味で、この仮定機構は 意義がある。Is the ligand of a certain length bridging the interparticle gap? If possible, the average distance from each other such that agglomeration will result The hypothesized mechanism is it makes sense.

この仮定された機構では“電荷゛の重要性のために、これらの測定に他の荷電粒 子が有効であると考えられている。しかし、ラテックス粒子はより有効である。Because of the importance of "charge" in this hypothesized mechanism, other charged particles are included in these measurements. child is considered valid. However, latex particles are more effective.

ラテックス分散物の安定性に関するいくつかの理論的研究が報告されている。オ ツテウイル（ＯｔＬｅｗｉｌｌ）とシラ−（Ｓｈａｗ）番よ、ファラデー学会の 論文集（Ｄｉｓｃｎｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｆａｒａｄａｙ　５ｏｃｉａｔｙ　） 　１５４〜１６３頁（１９６６年）で単分散ポリスチレン粒子の安定性を議論し ている。理論的にも実験的にも、凝結濃度は粒子径に無関係か、もしくはせいぜ い弱い依存性しかない。同報告の１５９〜１６０頁参照。２種の粒径の相反する 荷電をもった粒子の相互凝析の試験が、ＰＨの安定性ρ変化に関しては多少の粒 径の差による効果は無視してもよいことを法論づけたということがホッグ（Ｈｏ ｇｇ）等によって同誌６２ｓ１６３８〜１６５１頁（１９６６年６月）に報告さ れた。Several theoretical studies on the stability of latex dispersions have been reported. O OtLewill and Shaw, members of the Faraday Society. Discnsions of Faraday 5ociety 154-163 (1966) discusses the stability of monodisperse polystyrene particles. ing. Theoretically and experimentally, coagulation concentration is independent of particle size, or at most There is only a weak dependency. See pages 159-160 of the same report. Two contradictory particle sizes Tests of mutual coagulation of charged particles show that some particles may be affected by changes in pH stability ρ. It is said that Hogg established a legal theory that the effect due to the difference in diameter can be ignored. gg) etc. in the same magazine, pp. 1638-1651 (June 1966). It was.

ワイズ（Ｗｉｓｅ）とヒーリー（Ｍｅａｌｙ）は、同誌６６巻４９０〜４９９頁 （１９７０年）に単分散系に対しては、その分散系の安定性は粒径によって左右 されると提唱している。そして彼等はある２分散系について！Ｈｉｔしている。Wise and Mealy, Vol. 66, pp. 490-499. (1970) found that for monodisperse systems, the stability of the dispersion system depends on the particle size. It is proposed that it be done. And they are talking about a two-dispersion system! It's a hit.

もちろん、これらの理論的な解析はコーティングしていない粒子についてのもの である。コーティングしたものの間の相互作用は、分散系の安定性に明らかに影 響を与えるであろう。Of course, these theoretical analyzes are for uncoated particles. It is. The interaction between the coatings clearly affects the stability of the dispersion. It will make an impact.

（試薬の由来） トロンボプラスチンはラテックス粒子による反応でもたらされる。(Origin of reagent) Thromboplastin is produced by a reaction with latex particles.

液体のトロンボプラスチンをラテックスサスペンジツンと混合した。Liquid thromboplastin was mixed with latex suspension.

その混合物は、それらを個々に使うか又は凍結乾燥したトロンボプラスチンの軽 く、細かい粉末を単独で使った時よりも容易に測定し、取り扱うことができる。The mixture can be prepared by using them individually or by using lyophilized thromboplastin. It is easier to measure and handle than when using a fine powder alone.

凍結乾燥した混合物は装置中で乾燥した試薬として使用され、そこで希釈剤に溶 かし、観察チャンバー中の血液に加えられる。ラテックスが液体サスペンション 中にあり、トロンボプラスチンか単独で凍結乾燥されている時と同じように、ト ロンボプラスチンによる網状膜の形成も、ラテックスによる集合化も起こる。The lyophilized mixture is used as a dry reagent in the device, where it is dissolved in a diluent. blood is added to the blood in the observation chamber. latex liquid suspension in the same way as when thromboplastin or alone is lyophilized. Formation of a reticular membrane by rhomboplastin and aggregation by latex also occur.

凍結乾燥した試薬は、モーヤー（Ｍａｙｅｒ）の米国特許第３，９１８．７０８ 号、アルトシュル（＾１ｔｓｃｈｕｌ）の米国特許第３，４９７，３１９号およ びレナハン（Ｌｅｎａｈａｎ　）の米国特許第３，３９５．２１０号で知られて いるが、これらの参考文献には、凝血試薬を伴うラテックス粒子の凍結乾燥につ いては言及していない。The lyophilized reagents are described in US Pat. No. 3,918.708 to Mayer. No. 3,497,319 to Altschul and and Lenahan, U.S. Pat. No. 3,395.210. However, these references do not discuss the freeze-drying of latex particles with coagulation reagents. It is not mentioned.

他の試薬がラテックス粒子に粘着され、特定の点へとラテックスと試薬を同時に 運ぶことを保証するように反応に加えられる。Other reagents are attached to the latex particles and the latex and reagent are simultaneously delivered to a specific point. added to the reaction to ensure transport.

（表面積の制御） 凝血時間は漸近的なレベルまでは、露出する表面積に依存する。(Control of surface area) Clotting time depends, up to an asymptotic level, on exposed surface area.

観察チャンバー中の広い表面に渡って血液を拡げることは有効である。ラテック スの添加は血液に対しての露出表面の量を増加し、最大に露出することは反応の 均一性を保証する。It is useful to spread the blood over a large surface in the observation chamber. latex The addition of gas increases the amount of exposed surface to blood, and maximum exposure Ensure uniformity.

（付加的な視覚化の促進） 反応の検出をさらに促進させるために粒子の処理をすることがある０例えば色の ついた粒子を用い、集合したとき容易に検出できるように赤い血液溶液に対して 目立つ色をつかう。（例えば黄色）。(promoting additional visualization) Particles may be treated to further facilitate detection of reactions, e.g. using attached particles, against a red blood solution for easy detection when aggregated. Use colors that stand out. (e.g. yellow).

また螢光性粒子は紫外線のもとで観察され、そしてこの粒子の反応はより容易に 検出でき、低濃度のフィブリノゲンも簡単に検出できるようになった。Fluorescent particles are also observed under ultraviolet light, and the reaction of this particle is more easily It is now possible to easily detect fibrinogen at low concentrations.

（さらなる修正と応用） 二つ以上の粒子が反応に添加されると、その各々が反応の異なる組成物や生成物 と反応し、その結果粒子が存在しない場合に比べて、その反応を容易に検出、　 測定でき、異なる組成物や反応生成物も容易に検出、測定できる。(Further modifications and applications) When two or more particles are added to a reaction, each of them contributes to a different composition or product of the reaction. As a result, the reaction is easier to detect than if no particles were present. different compositions and reaction products can be easily detected and measured.

別の試薬を径の異なる粒子に結合させることができる。検出、測定をより容易に するのにつかわれる粒子に、ある物質（例えば、パーオキシダーゼ、金、ビオチ ン、デキストランその他）が吸着することがあり、そして、これらの物質は試薬 溶液中の目的とされる物質か、もしくは検出すべき反応を媒介する物質、もしく は試験中に生じた反応生成物と結合し、その結果、検出や測定の容易さをさらに 促進することがある。Different reagents can be attached to particles of different sizes. Detection and measurement made easier The particles used for dextran, dextran, etc.) may be adsorbed, and these substances may the substance of interest in the solution or the substance that mediates the reaction to be detected; binds to the reaction products generated during the test, thereby further increasing the ease of detection and measurement. It may be promoted.

上述の二つ以上の物質は、検出又は測定の容易さをさらに促進す°るために１種 の粒子よりは１種以上の粒子に付着するのであろう。Two or more of the substances mentioned above may be combined in one species to further facilitate ease of detection or measurement. The particles probably adhere to one or more types of particles rather than the other particles.

他の装置は、物質を吸着し、ある試薬の導入によって、上述の物質存在による、 試験すべき粒子を誘導（例えば磁力により）して集めるのに使われる。Other devices adsorb substances and, by the introduction of certain reagents, cause the presence of the substances mentioned above. It is used to guide (e.g. by magnetic force) and collect the particles to be tested.

他のタンパク質やラテックス粒子に吸着もしくは反応することができ、また互い に反応することができるその他の物質が、上述のフィブリノゲン濃度の検出およ び測定と同様の方法でその濃度に対して試験された。特にその反応生成物がその 物質よりかなり異なる分子をもつとき、フィブリン重合体と同様に粒子間のギャ ップを橋渡しすることができる。このように、本発明の特定試薬には、重合もし くは二量体化反応を促進するという特別の用途があることが分る。Can adsorb or react with other proteins or latex particles, or with each other. Other substances that can react with the fibrinogen concentration detection and It was tested for its concentration in a manner similar to the Especially if the reaction product is When the molecules have molecules that are significantly different from the substances, the gap between the particles, similar to fibrin polymers, can bridge the gap. In this way, the specific reagent of the present invention has the potential for polymerization. It turns out that it has a special use in promoting dimerization reactions.

ここでは、ラテックス特定試薬は、フィブリンの重合によって形成される凝集物 の視覚化を促進するのに使用されている。例えば、アンの重合°を参照せよ、ま た、ラテックス以外の粒子（例えば、シリカ、細胞、又はリポソーム）が同様の 方法で、もしくは、ラテックス粒子と共に使用することができる。Here, the latex specific reagent refers to aggregates formed by polymerization of fibrin. used to facilitate visualization. See, for example, the polymerization of Anne, Additionally, particles other than latex (e.g., silica, cells, or liposomes) may method or with latex particles.

本発明は血液そのものの試験に特定した応用性をもつものであるが適当な修正を 加えれば、血漿の標本にも使用できる。前後関係が矛盾しなく、他に断わりのな いところでは、“血液”という言葉は、１！４６征チ体にβたイララ４．りＸ仄 九・の、に賀オエイ□１゜　ＦＩＧ、１ 浄゛書（内容蚤こ変更なし） ０ｍ２＋ｏ７ａ４＋　ＦＩＧ、　２ 園 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示　ＰＣＴ／ＵＳ８５１００４９８２、発明の名称　凝血時間の測 定法とそのための特定試薬３、補正をする者 事件との関係　出願人 名　称　インターナショナル　へルス　サービセス５、補正命令の日付　昭和６ １年５月２７日国際調査報告 一一−＾ｍｃ１１−一・ｐｃ？／＋τｃ１．ｌζｌ＾酎◇。Although the present invention has particular applicability to the testing of blood per se, it is possible with suitable modifications. In addition, it can also be used for plasma specimens. The context is consistent and there is no other way to say otherwise. In some places, the word "blood" has a meaning of 1!46 and 4. riX Nine, Niga Oei□1゜FIG, 1 Pure book (no changes in content) 0m2+o7a4+FIG, 2 garden Procedural amendment (formality) %formula% 1. Indication of case: PCT/US851004982, title of invention: Measurement of blood clotting time Standard method and specific reagents for it 3. Person making corrections Relationship to the case: Applicant Name: International Health Services 5, date of amendment order: 1937 International search report dated May 27, 2017 11-^mc11-1・pc? /+τc1. lζl＾chu◇.

Claims (36)

【特許請求の範囲】[Claims] １．（ａ）凝結試薬を含む希釈液で全血液を希釈し、（ｂ）その溶液の光学密度 を減らすために、その溶液面積を拡げ、かつ （ｃ）フィブリン網状膜の形成時間を観測することからなる、全血液の凝血時間 を視覚的に測定する方法。1. (a) dilute whole blood with a diluent containing a clotting reagent, and (b) the optical density of that solution. In order to reduce the (c) Clotting time of whole blood, consisting of observing the formation time of fibrin reticular membrane. How to measure visually. ２．（ｃ）段階の前に、フィブリン網状膜の視覚化を促進する着色法で血液を処 理しておく請求の範囲第１項記載の方法。2. (c) Before step, treat the blood with a staining method that facilitates visualization of the fibrin reticular membrane. The method according to claim 1, wherein the method is managed. ３．フィブリン網状膜の形成を対照的に目立たせる背景のもとで観察する請求の 範囲第１項記載の方法。3. A method of observing the formation of a fibrin reticular membrane against a background that makes it stand out in contrast. The method described in Scope 1. ４．凝血試薬と、複数の負の電荷をもつ粒子とからなる凝結試薬。4. A clotting reagent consisting of a blood clotting reagent and a plurality of negatively charged particles. ５．粒子にラテックス粒子を用いる請求の範囲第４項記載の試薬。5. 5. The reagent according to claim 4, wherein the particles are latex particles. ６．凝血試薬にトロンビン，トロンボプラスチン，部分トロンボプラスチン，及 び活性化部分トロンボプラスチンからなる群から選択したものを用いる請求の範 囲第４項記載の試薬。6. Blood clotting reagents include thrombin, thromboplastin, partial thromboplastin, and and activated partial thromboplastin. Reagent according to item 4. ７．粒子にラテックス粒子，リボソームおよび赤血球からなる群から選択したも のを用いる請求の範囲第４項記載の試薬。7. The particles are selected from the group consisting of latex particles, ribosomes and red blood cells. The reagent according to claim 4, wherein the reagent is used. ８．凍結乾燥した形で用いる請求の範囲第５項記載の試薬。8. A reagent according to claim 5, which is used in lyophilized form. ９．粒子の平均直径が０．１ミクロンと３．０ミクロンの間であるような請求の 範囲第５項記載の試薬。9. Claims where the average diameter of the particles is between 0.1 microns and 3.0 microns. A reagent according to scope item 5. １０．粒子が付着する物質の凝集応答を促進もしくは阻害するような処理を上述 の粒子にほどこす、請求の範囲第４項記載の試薬。10. The above-mentioned treatments promote or inhibit the aggregation response of the substance to which the particles adhere. The reagent according to claim 4, which is applied to the particles. １１．結果として、粒子がフィブリン網状膜中に凝集してしまうような、予め決 定されたサイズと濃度の粒子の特定試薬の存在下で、凝血試薬と血液とを接する ことを含む凝血時間の測定法。11. As a result, predetermined Contacting blood with a clotting reagent in the presence of a specific reagent of particles of defined size and concentration A method for measuring blood clotting time, including: １２．特定試薬が複数のラテックス粒子からなる請求の範囲第１１項記載の方法 。12. The method according to claim 11, wherein the specific reagent comprises a plurality of latex particles. . １３．粒子サイズと濃度を凝集の性状が望ましいものになるように選択した請求 の範囲第１２項記載の方法。13. Claims that particle size and concentration were selected to provide desirable agglomeration properties. The method according to item 12. １４．凝集の望ましい性状が最大の集合化である請求の範囲第１３項記載の方法 。14. 14. The method of claim 13, wherein the desired property of agglomeration is maximum agglomeration. . １５．凝集の望ましい性状が最大の顆粒化である請求の範囲第１３項記載の方法 。15. 14. The method of claim 13, wherein the desired property of agglomeration is maximum granulation. . １６．粒子サイズと濃度を、フィブリン網状膜の形成時間が短かくなるように選 択する請求の範囲第１２項記載の方法。16. Particle size and concentration are selected to reduce the time required to form a fibrin network. 13. The method according to claim 12, which selects. １７．粒子サイズと濃度を、フィブリン網状膜の視覚化が最大となるように選択 する請求の範囲第１２項記載の方法。17. Particle size and concentration were chosen to maximize visualization of the fibrin reticular membrane. 13. The method according to claim 12. １８．粒子が、予め決められた濃度で、少なくとも２種の異なる予め決められた サイズをもつものである請求の範囲第１２項記載の方法。18. The particles are comprised of at least two different predetermined particles at a predetermined concentration. 13. The method according to claim 12, wherein the method has a size. １９．上述のサイズおよび濃度を、フィブリン網状膜の形成時間を最小にし、網 状膜の視覚化を最大にするように選択する請求の範囲第１２項記載の方法。19. The above sizes and concentrations are chosen to minimize the formation time of the fibrin network and to 13. The method of claim 12, wherein the method is selected to maximize visualization of the membrane. ２０．凝集の望ましい性状が、望ましいフィブリノゲン濃度範囲に渡って達成さ れる、請求の範囲第１３項記載の方法。20. The desired properties of aggregation are achieved over the desired fibrinogen concentration range. 14. The method of claim 13, wherein: ２１．粒子のサイズおよび濃度を、希釈試料の単位体積当り予め決められた粒子 総表面積となるように与えられる請求の範囲第１２項記載の方法。21. Adjust the particle size and concentration to a predetermined number of particles per unit volume of diluted sample. 13. The method of claim 12, wherein the total surface area is given as: ２２．第１粒子径が０．７６４ミクロンで、第２粒子径が０．２７７ミクロン、 そして、両方の粒径粒子の割合を図２中の“良”もしくは“優良”の領域に落ち つくように選択する、請求の範囲第１８項記載の方法。22. The first particle size is 0.764 microns, the second particle size is 0.277 microns, Then, the proportion of particles of both particle sizes falls into the “good” or “excellent” region in Figure 2. 19. The method of claim 18, wherein the method is selected such that: ２３．両方の粒子サイズのものの割合を、図２中の“優良”の領域に落ちつくよ うに選択する、請求の範囲第２２項記載の方法。23. The proportion of both particle sizes should be settled in the "excellent" region in Figure 2. 23. The method according to claim 22, wherein: ２４．フィブリン網状膜を形成させる為に、内部の特定試薬の存在下、ある量の 凝血試薬にある量の血液を混合すること、上述の特定試薬を網にとりこませるこ と、及びフィブリン網状膜の形成時間を観測することからなる凝血時間を測定す る方法。24. In order to form a fibrin network membrane, a certain amount of Mixing a certain amount of blood with a coagulation reagent and incorporating the above-mentioned specific reagent into the net. Measuring the clotting time, which consists of observing the formation time of the fibrin reticular membrane and How to do it. ２５．希釈率と固体含有量に対する調製も含めて、図１の点線によって表わされ るよりも小さく、マイクロリットルで表わされているサスベンジョン体積に相対 的な、ミクロンで示されている粒径Ｄをもつ、ある体積のラテックス粒子サスベ ンジョンと血液試料を接触させることを含む凝血時間の測定する方法。25. Including adjustments for dilution rate and solids content, represented by the dotted line in Figure 1. relative to the suspension volume expressed in microliters. A volume of latex particle suspension, with particle size D in microns, A method of measuring blood clotting time comprising contacting a blood sample with a blood sample. ２６．重合試薬の存在下分散させた粒子とモノマーを混合することと、生成する ポリマー又はオリゴマーとラテックス粒子との凝結が観察されるまでに経過する 時間を測定することからなるモノマーがポリマー化もしくはオリゴマー化するま での時間を測定する方法。26. Mixing the dispersed particles and monomer in the presence of a polymerization reagent and producing Time elapses until coagulation of polymer or oligomer and latex particles is observed. It consists of measuring the time until the monomer becomes a polymer or oligomer. How to measure time in. ２７．モノマーがフィブリンモノマーである請求の範囲第２６項記載の方法。27. 27. The method of claim 26, wherein the monomer is a fibrin monomer. ２８．フィブリンモノマーがフィブリノゲンのフィブリンヘの転換によって得ら れる請求の範囲第２７項記載の方法。28. Fibrin monomer is obtained by the conversion of fibrinogen to fibrin. 28. The method according to claim 27. ２９．モノマーがアクチンである請求の範囲第２７項記載の方法。29. 28. The method of claim 27, wherein the monomer is actin. ３０．粒子が予め決められたサイズと濃度の、少なくとも２種類のサイズのラテ ックスである請求の範囲第２６項記載の方法。30. The particles are of at least two different sizes and have a predetermined size and concentration. 27. The method of claim 26, wherein: ３１．フィブリノゲンが正常なとき粒子サイズと濃度を凝結物が生成するように 選択して、凝血試薬存在下で予め決められた粒子サイズと濃度のラテックスの特 定試薬と血液試料を混合すること、およびフィブリン網状膜の生成開始の時間と 、ラテックス粒子とフィブリンとの凝集の性状を観察することからなる凝血時間 の測定し、同時に血液中の異常なフィブリノゲン濃度を検出する方法。31. When fibrinogen is normal, the particle size and concentration are reduced to form clots. Select and characterize latex of predetermined particle size and concentration in the presence of coagulation reagents. Mixing the fixed reagent with the blood sample and determining the time and onset of fibrin network formation. , clotting time, which consists of observing the properties of aggregation of latex particles and fibrin. and at the same time detect abnormal fibrinogen levels in the blood. ３２．凝析試薬がある凝血試薬と複数種のラテックス粒子を含む請求の範囲第１ 項記載の方法。32. Claim 1 comprising a coagulation reagent and a plurality of types of latex particles. The method described in section. ３３．ラテックス粒子の粒径を変える請求の範囲第３２項記載の方法。33. 33. The method of claim 32, wherein the particle size of the latex particles is varied. ３４．各粒径の粒子が予め決められた濃度存在する請求の範囲第３３項記載の方 法。34. The method according to claim 33, wherein particles of each particle size are present in a predetermined concentration. Law. ３５．粒子にそれらの検出を促進させるように処理をほどこした請求の範囲第３ ２項記載の方法。35. Claim 3, wherein the particles are treated to facilitate their detection. The method described in Section 2. ３６．凝析試薬が集合の阻止剤もしくは促進剤を含む請求の範囲第３２項記載の 方法。36. Claim 32, wherein the coagulation reagent comprises an aggregation inhibitor or accelerator. Method.