JPS61502889A - 化学的にラベルした刻酸、その利用法およびその実行用キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 化学的にラベルした核酸、その利用法 およびその実行用キット 本発明は修飾（ｍｏｄｉｆ　１ｅｄ）核酸またはこの酸の配列、その調製法、そ の研究の利用、特に核酸または核酸の断片の、特に特定の遺伝子の、検出、位置 づけ、特性づけおよび／または精製への利用に関する。本発明は更にこのような 修飾核酸を、この核酸や修飾された断片に親和性を示す生物由来の分子の分離精 製に利用することに関する。更に本発明はこのような利用を実行するのに必要な 装置すなわち“キット“に関する。

いかなる生物も核酸の１個乃至数個の分子によって構成された遺伝形質を有して いる。これら分子の基本的構成放物（デオキシリボヌクレオチドまたはりボヌク レオチド）の連鎖は多種類の配列（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を生ずる。これらの配列 はコード化された方法で生命に必要な情報を伴っている；すなわちこれら配列は 生物を特性づけるものである。核酸またはその断片の特に特定の遺伝子の研究特 に検出、位置づけ、特性づけおよび／−１，たけ精製は、多数の他の配列中に存 在する特徴のある配列をもつ生物試料において寡□ｖｉｔｒｏで同定することに よって特に人間または動物における成る種の生来の異常性の調査において、また は病気特に伝染性疾患の早期診断において増大する興味を提供する。

特定の核酸中の核酸の組成を検出あるいはさらに濃縮するためには、探求中の特 定の核酸と位置づけを可能にする標識を伴った“プローブ（ｐｒｏｂｅ）“との 間のハイブリッド化の技術に依存することが知られている。

このようなプローブについては既に記述がある；これらのプローブは一般にＩＪ 　ｇ核酸（囲Ａ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ　）よシ成っている。ＲＮＡ はそれが由来するＤＮＡのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列をもっ ていることが知られている。この相補性は、これらの予め変性した（ｄｅｎａｔ ｕｒａ、ｔｅｄ）　ＤＮＡが、例えば強力なイオン力を持った媒質（ｍｅｄｉｕ ｍ）中で高温で培養後、初期には二重鎖をもっているので、これらＲＮＡが予め 変性したＤＮＡに相当する配列と混合ノ・イブリッドを形成する能力があること によって立証されている。

これらのプローブはまた、場合によっては予め変性後相補的配列をもった核酸と ノ・イブリッド化が可能な特定の配列のＤＮＡによって構成することができる。

核酸はまた遺伝子を位置づけまたは精製するために用いることもできる。固体担 体に耐着して、それらはまたヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、ジャイレースや核酸 を基質として用いる他の酵素のような核酸に親和性を示す分子の精製に用いるこ ともできる。他の用途も考えられる。例えばポリウリノル酸塩またはポリウリノ ル酸塩をナイロンまたはセルローズフィルターに付着させて特にメツセンジャー 四Ａを保持するフィルタ−をつくることができる。

しかし、核酸は化学的には非常に不活性である。他の分子例えば標識と結合する 際に生ずる困難は、特に非放射性標識の場合または他の種類の担体との場合に知 られている。

現在効果的な結合を完成する技術は僅かしか知られていない。フランス特許７８ １０９７５（公告番号２４２２９５６）ではＤＮＡ　ｔントクロムＣ由来の基を 含む錯体によってビオチン捷たはアビジンのような分子と結合することが提案さ れている。関係する核酸を上記のような精製技術で処理しなければならぬ場合は 、このようにして得られた結合は必ずしも必要な強さを示すとは限らない。他の 方法は分離したヌクレオチドを予め修飾しつづいてこれを酵素反跳によシ修飾す べき核酸の鎖に、特に鎖を構成するいくつかのヌクレオチドを予め修飾したヌク レオチドと交換することによって、挿入することより成る。このような技術はヨ ーロッパ出願特許６３８７９号に開示されている。この技術は二重鎖のＤＮＡに 適用して、これらを適当な媒質中で予め修飾したモノヌクレオチドとヌクレアー ゼおよびポリメラーゼの存在下で接触させることにある。次にヌクレアーゼの機 能は二重鎖の核酸の鎖の一方または他方を構成するヌクレオチドのいくつかを“ 抽出“することであり、ポリメラーゼの機能は予め修飾したヌクレオチドを含む 他のヌクレオチドの挿入を促進することである。この技術は効率的ではあるが実 行することが著しく難かしい。

本発明の目的は核酸の化学的不活性と今日迄にその構造を修飾する際に遭遇した 困難さの両者を克服し他の分子または担体との結合（ｃｏｕｐｌ　ｉｎｇ）を可 能にすることである。特に本発明の目的は、核酸が相補的核酸配列と、その修飾 の有無にかかわらず、ハイブリッド化する能力を保持しつつ、結合基を核酸中に 導入するための特に簡素なプロセスを提供することである。

本発明は特定のヌクレオチド配列と相補的な配列をハイブリッド化する能力はそ のシチジン、チミジンおよび／またはウリソン基全部の本来の性質の保持を必要 とすることを意味しないという発見を利用している。

特に核酸のハイブリッド化能力はＤＮＡに関してはチミジンおよび／またはデオ キシチミジンのような或はＲＮＡに関してはウリジンまたはシチジン基のような そのピリミジンヌクレオシドの部分分解によって本質的に影響をうけない。この ような部分分解した核酸は未だその重合性を保持しておシ、時として“アビリミ ジン酸“と呼ばれる。

このようなアビリミジン酸はデオキシリボ核［ＤＮＡ）をヒドラゾンで処理する ことによって得られることは既に知られている（特にＡ、　Ｒ，Ｃａｓｈｍｏｒ ｅ等、Ｂｏｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　１７４．　（１９６９）　ｐ、５９１−６０３ 参照）。

これらの“アピリミジン酸“には少くともあるデオキシシチジンまたはチミジン 基の場所にけ）式で示される基があシ （１９６４）、　ｐ、　４６２−４７６）によって確立された知見に従ってその 鎖の中でデオキシシチジンまたはチミジン基の少くとも一部をおきかえている。

しかしながらＡ、几、　Ｃａｓｈｍｏｒｅ等およびＡ、　Ｔｅｍｐｅ　ｒ　Ｉ　 ｉ等によってなされた研究には本質的な目標として関係する核酸中のプリンヌク レオチドの構造の研究があった。

ヒドラジンによる核酸の攻撃反応の他の重要な応用は、従ってピリミジン酸とし ての核酸の遷移全件っており、ＤＮＡ配列の研究を目標としている。

Ａ、　Ｍ、　ＭＡＸＡＭとＷ、　０ＩＬＢＥＲＴ　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ　ｔ　１ ．　Ａｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ、　ＵＳＡ。

二（２）、　１９７７、　ｐ、５６０−５６４）の周知の方法によれば、ヒドラ ノンはチミンやシトシン塩基を切断するのに用いられ、ヒドラノンの作用は次に 修飾された塩基のレベルで核酸を分解しヒドラノンの全反応生成物を糖から分離 しリン酸塩のβ−説離に触媒作用を及ぼすビイラノンの作用によって引き継がれ る。

しかしながら前述のタイプの応用に於て相当する核酸のかわシに“アビリミジン 酸“タイプの化合物を用いることは提案されたことはなかったしまた示唆さえも されなかった。この代用はアピリミジン酸が特別に反応しやすい基、特に適当な 結合基のこれらアピリミジン酸への固定に利用されうる一ＮＨ２基の担体である という点で特に有利である。これらのこのように修飾したアピリミジン酸は従っ て、それらが由来する核酸に相補的な核酸とのハイブリッド化能力を保持しつつ 、容易に得られる新生酸物を形成する。わかシ易く云えば、下記の記述において 本発明に従って１個乃至数個の結合基で修飾したアビリミジン酸に相補的な“核 酸“に言及するときはいつでも、このことは問題のタイプの修飾アピリミジン酸 が由来する核酸に相補的な核酸にあてはまると当然理解すべきであることはいう までもない。

本発明に従って結合基で修飾した核酸（またはアピリミジン酸）の構造はこのよ うにデオキシリボ核酸（またはリボ核酸）鎖から導かれ、デオキシシチジン−リ ン酸塩（またはシチノンーリン酸塩）基の少くとも一部または場合によってはチ ミジンーリン酸塩（またはウリノン−リン酸塩）基の少くとも一部を、鎖の中で 類似基またはヌクレオチドそのものと結合する式（Ｉｌｌで示される基： 薯 （式中几は結合基を表わす）で置換することを特徴とする。

注意すべきことは、チミジン−リン酸塩（またはウリソンーリン酸塩）基のすべ ては、特に原料の核酸のヒドラ・シンによる処理が媒質中でチミン（またはウラ シル）基をヒドラゾンの作用から保護するのに十分な濃度の塩化ナトリウムの存 在下で行われる場合、もとのままであシうることである。ＭＡＸＡＭとＧＩＬＢ ＥＲＴの方法では濃度２ＭのＮａ　ｃｌを存在させるとシトシン基を選択的に開 環させることを想起すべきである。

本文に於て、“結合基（ｃｏｕｐｌｉｎｇ　ｇｒｏｕｐ　）　”とはその存在が アピリミジン酸が相補的核酸とハイブリッド化する能力をそこなわない置換基ま たは基を意味する。

このような基の例は例えば前記ヨーロツ・ぐ出願特許第６３８７９号に開示され ている。本発明によって修飾されたアピリミジン酸をグローブとして使用する場 合、結合基は酵素、螢光分子または容易に具象化しうる他の標識のような標識と 直接または間接的に容易に結合しうるものの中から選ばれる。

例として、この基はその存在を特定のビオチシーアビノン反応を利用することに よって証明できるビオチンで構成すると有利であると云ってよい。本発明によυ 修飾されビオチン置換基を伴う核酸を利用する個々の実施態様を、このような核 酸の応用に関して以下によシ詳細に説明する。反対に、結合基はアビジンによっ て構成することもできる。この場合ビオチンはアビジン基を伴うハイブリッド化 されたグローブの検出に用いられる。

フェリチンのような特色のある錯体をつくる他の結合基も使用することができる 。

結合基は、その存在が既知の方法に従って抗原あるいはハプテンに特有な抗体に よって立証できる抗原またはハプテンによって構成してもよい。この目的に適し たハシテンまたは抗原として非限定的に次のものをあげることができる：ビオチ ン、ジニトロフェニル基、種々の一２ｆチド、グリコ被ゾチドあるいはポリペプ チド。結合基はプロティンＡのような“一般的抗体（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ａｎ ｔｉｂｏｄｙ）”タイプの物質によって有利に構成することもできる。

他の実施態様に従えば、結合基はとりわけナイロンの名で知れるポリアミドタイ プの合成樹脂、セルローズ、アガローズまたはラテックスによって構成される固 体担体との連接（！ｉｎｋｉｎｇ）を可能にする。

一般的には、本発明の好ましい生成物は更に一般式（文中、−文字Ｂ、　Ｂ’・ ・・は各々プリン、７−デアザプリンまたはピリミジン基を示し、これらの基Ｂ 、　Ｂ’・・・はそれぞれ、プリン基まだは７−デアザプリン基の場合はそのＮ ０位置のレベルでまたピリミジン基の場合はそのＮ１位置のレベルで相当する糖 基とそのＣＩ位置で共有結合しておシ、 一部は親和性のある分子、ポリ−２ｆチドまたは抗体によって、あるいは更に他 の分子または担体のいづれかが伴う他の官能基と共有結合可能な基によって識別 可能な結合基を示し、 −Ｚは−Ｈまたは−ＯＨを示し、 −ｍおよびｎはそれぞれ零または整数でｍ　＋　ｎの和が有利には１００乃至１ ０．ＯＤＤ好ましくは３００乃００１と０．０５の間にあるのが有利である）で 表わされる。

本発明によって修飾されたアビリミジン酸は核酸または核酸の断片をヒドラゾン で処理し引きつづき結合基を固定することによって得られ、特に蛋白接合の既知 方法で処理される。

好都合にも、核酸は例えば３００乃至２，０００対の塩基を含有する断片に分け られる。この断片化は音波処理によって行われる。

ヒドラノンの使用量は本質的に所望の反応部位＝Ｎ　−ＮＨ２基の量による。例 をあげると、濃度０．５　ｍ９７　ａｔの水溶液の形で、核酸μノ当り０．５な いし４μｔの無水ヒドラジンを用いると興味ある結果が得られる。

例えばヒドラノンで修飾した核酸を冷エタノールで沈澱させであるいは例えばエ チルエーテルのような水と不溶な溶媒を用いてヒドラジンを抽出して過剰のヒド ラジンを除去した後に、所望の結合基をヒドラジン処理によって核酸中に導入さ れた遊離アミン機能上に固定する。

この固定は蛋白接合の既知の方法に従って行われる。

例をあげると： 一アピリミジン酸を少くとも１個の遊離アミン機能を有する化合物とグルタルア ルデヒドの存在下で縮合することができる： 一アビリミジン酸を少くとも１個の遊離カルボキシル機能を有する化合物と、水 溶性カルビジィミドの存在の下に水相で、あるいは油溶性カルボジイミドの存在 の下に例えばツメチルホルムアミド（ＤＭＦ）　、テトラヒ］・０ロフラン（Ｔ ＨＦ　）またはトルエンのような不活性有機溶媒中で縮合することができる；好 ましい水溶性カルボッイミドはＮ−シクロヘキシル−Ｎ’−（（５−（Ｎ−メチ ル−モルホリノ）エチル〕−力ルはジイミドｐ−トルエンスルホン酸塩および（ ３−メチル−アミノプロピル−カルボジイミド塩酸塩である；ノシクロヘキシル ー力ルヂジイミドが有機溶媒中の反応に特に適している； −アヒリミジン酸を少くとも１個のカルボキシル機能を有する化合物と、この化 合物を例えばトルエン中で第三級アミンの存在下で（Ｃ２−Ｃ４）アルキルカー ゴネートと先づ反応させ次に得られた混合無水物をヒドラノンで修飾した核酸と 反応させることによって、縮合することもできる。

−ｔたアピリミジン酸を少くとも１個のカルボキシル機能を有する化合物と、こ の化合物の活性化エステル、例えばそのスクシンイミドエステルまたはＮ−ヒド ロキシスクシンイミドエステル、またはｐ−ニトロフェノールとの反応生成物を 好ましくは極性を示す不活性有機溶媒中で反応させることによって、縮合するこ とができる；ジメチルホルムアルデヒドが好マシい：−アビリミジン酸を少くと も１個のアルデヒド機能を有する化合物と、例えばＣ２几、Ｇｒａｙによって発 表された方法［Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、　１６３　（１９ ７４）、ｐ４２５）に従ってこの二つの試薬間のシック塩基をつくり場合によっ ては還元して、縮合することができる。

本発明の他の目的は本発明によって修飾したアビリミジン酸の使用である。利用 の様式に従って、本発明によシ修飾された核酸は、核酸または相補的核酸の配列 とのハイブリッド化の反応に使用される。

驚くことに、上記の修飾は修飾アビリミジン酸が相補的核酸と結合する全能力を 保持し、このことは修飾アピリミジン酸が断片化したときもあてはまるというこ とが事実上確認されている。この場合ハイブリッド化がさらに容易になることを 知ることは価値がある。

本発明によって修飾した核酸は、核酸または核酸の断片時に遺伝子を、検出し、 位置づけ、同定しさらに定量するために利用される。これらは特に“ラベルする ことのできる“グローブとして遺伝学的異常を診断する際にあるいは病原となる 因子を検出するために用いることができる。

本発明に従って修飾アピリミジン酸を例えばナイロン、セルローズ、アガローズ またはラテックスによって構成された固体担体上に固定した結果できた結合物は 修飾をうけた核酸に親和性を示す物体を選択的に保持するために利用できる。こ れらの結合物は従って核酸を基質として利用して、特にヌクレアーゼ、ポリメラ ーゼ、ノヤイレースのような酵素を精製するために使用できる。これらはまた特 に遺伝子やメツセンジャー几ＮＡを保持するフィルターをつくるのに利用できる 。

後者の場合、このフィルターは上記の技術に従って修飾すれ、ナイロンまたはセ ルローズフィルターに結合したポリウリツル酸塩またはポリウリツル酸塩を有利 に含有することができる。

本発明に従って修飾した核酸に相補的な核酸またはその断片の検出、位置づけ、 同定および定量のために、結合基は例えばこの基に親和性のある分子によってま たはこの基に特有な抗体によって検出されるようにする。後者の場合、抗体は有 利にラベルされるかあるいはそれ自身、基質への作用によってまたは螢光抗体分 子にＩつて検出可能な酵素でラベルされた他の抗体によって識別することができ る。

当業者には周知の種々のタイプのものから選ばれた酵素抗体反応はいくぶん複雑 である。この反応は特にいくつかの抗体および／またはいくつかの酵素および酵 素の基質に依存する。

簡単な実施態様によると、この反応は置換基として作用するハシテンまたは抗原 に特有なただ１個の抗体とこの抗体に結合したただ１個の酵素を必要とする。例 として、結合基はビオチンであってよいことを述べるべきである。このビオチン は簡単な実施態様によれば、基質と反応して直接的または間接的に検出可能か測 定可能な反応を生ずる酵素でラベルされたアビジンと選択的に反応する。この反 応は好都合にもとシわけ発色反応、発光に導く反応（生物発光）、または容易に 同定可能かまたは定量可能力化合物の生成に導く反応である。

好都合にも、この酵素はオルソニトロフェノールガラクトシド（ＯＮＰＧ）と発 色反応をするβ−ガラクトシダーゼによって構成されている。

有利な実施態様によれば、結合基は、シグマ社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｏｍｐａｎｙ） 市販の“ＦＡＳＴ　ＢＬＵＥ　ＲＲ５ａｌｔ″（ＳｉｇｍａＦ５００）と称され る色原体を装造者の仕様（技術報告用８５）に従って用いて立証することができ る錯体をつくるためにＪ、Ｊ、　Ｌｅａｒｙ等の方法［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳ　８０（１９８３）、　ｐ、　４０４５−４０４９）に従って調製されたア ビジン／ビオチン化アルカリホスファターゼのポリマーの混合物と反応するビオ チンである。

結合基がビオチンである他の実施態様ではビオチンは前述と同様の機能をもつ酵 素でラベルされた抗ビオチン抗体と選択的に反応する。

他の実施態様では、結合基は通常の方法に従って例えばヒドラジン変性核酸を１ −フルオロ−２，４−ソニトロベンセンと重炭酸す）　ＩＪウムの存在下で反応 することによって導入されるジニトロフェニル（ＤＮＰ　）基である。ＤＮＰ基 は例えば酵素によってラベルされた抗ＤＮＰ抗体によって識別される。

いづれにしても、本発明によって修飾した核酸を含有するプローブまたはフィル ターをつくる場合、このプローブに伴われる結合基またはフィルターの担体は引 キつづき起るグローブのハイブリッド化を妨けないかあるいは場合によっては引 きつづき起る修飾核酸とこれに選択的な親和性を示す分子との間の反応を妨げな いことを確めることが必要である。

本発明に従って修飾した核酸を用いると、核酸または用いたプローブに相補的な 遺伝子の生物学的試料中の存否をすみやかに確認することができる。このことは 司成りの量の他の核酸の存在下においても可能である。ハイブリッドを十分精製 した後に、確認した活性特に酵素活性を定量することによって調査されるべき核 酸中の研究中の生物学的試料の濃度に関する情報或いは精製ＤＮＡ中の調査され るべき遺伝子の分布の割合に関する情報をうろことは可能である。

研究中の核酸の試料を原料として、先づ修飾したグローブとのハイブリッド化、 過剰に存在しうるハイブリット化されないグローブの分離または分解、一方には ハイブリット化したグローブに伴われる結合基と他方には標識、例えばその存在 が公知の方法で適当な基質に対する作用によって検出される酵素、との間の結合 反応を行うことができる。

本発明はさらに本発明により修飾した核酸の利用を実行するのに必要な全試薬を 保有する“キット“に関する。このキットには特に例えばウィルスまたはバクテ リアのＤＮＡに相当するグローブの見本、通常研究の対象となる病原ウィルスま たはバクテリア、分析される生物学的試料特に血液試料中に通常台まれる特別な 遺伝子に関するウィルスバクテリアも含まれている。

この点において、本発明は以下に記すことを特徴とする器具すなわち“キット“ に関する。すなわち“キット“は 一本発明により修飾した核酸によシ構成され、調査すべき核酸配列または核酸を 特徴とする特定の結合基をもつ少くとも１個の特定なグローブ、−修飾した核酸 の結合基と錯体をつくる能力のある、特に酵素あるいは螢光または発光分子によ ってラベルされた物体、あるいは少くとも内１個がラベルされた物体の集合、 一出来うれば可能性のある酵素に特有な基質１一研究中の細胞媒質特に血液由来 のもののリーシスに、またこの媒質の細胞から核酸の抽出に、ならびに関与する 核酸の変性に必要な試薬、 よシなっている。

本発明は勿論他の応用分野特に問題のＤＮＡの遺伝子型を確立することを目的と する周知の遺伝学実験においてＤＮＡのある種の断片をラベルする際に実施する ことができる。特に本発明は遺伝子のふるい分けに関し例えば問題のＤＮＡの断 片を含有する異種ＤＮＡで感染された細胞のＤＮＡの形質転換の操作または反対 に通常細胞のＤＮＡ中に含まれる問題のＤＮＡの断片を細胞などの感染のために 用いられるウィルスのＤＮＡ中に組み込むことよシなる形質導入の操作よシなる 実験において、特定のＤＮＡの断片が組み入れたか否かの決定に適用することか できる。もちろんこのためには研究の対象となる核酸の断片に相補的なＲＮＡま たはＤＮＡの断片によって構成されたグローブが入手できねばならない。

研究室で行われた試験に関する次の記述は本発明によシ修飾した核酸の調製と利 用を説明するためだけのものである。

試験はラムダファージのＤＮＡについて行った。このＤＮＡを０．５μ？−／μ ｔの濃度をつるために水にとかす。

２０μｔの５アリコートを用いる。１アリコートは比較対照として用い他の４ア リコートを無水とドラノンで下記に示すようにその量を増して最初は０°Ｃで５ 分間、次に２０°Ｃで３５分間処理する。

アリコート番号　ヒドラジン（μ２） ２　５　（比較対照） 処理終了後とのヒドラジン修飾ＤＮＡを次の操作法１または２のいづれかに従っ て分離する。

１、ＤＮＡを７５０μｔのエタノールと０．６ｍ醋酸ナトリウム（ｐ’ｌ）を各 アリコートに加え２０分間−８０°Ｃに保つことによシ冷エタノールで沈澱させ る。各アリコートを次に１０，０００ｙ−で１０分間遠心分離する。

上澄み液を分離し、遠心分離されたイレットをエタノールで洗滌し次に真空で乾 燥する。

２　各アリコー１−　ｆエーテルで抽出する。ＤＮＡは水溶液中にのこり、ヒド ラジンはエーテル中にうつシテカンテーンヨンされる。

ＤＮＡの分離は操作法１または２に従って行われ、各遠心分離にレットはクエン 酸ナトｌ）ラム緩衝液（１０ｍＭ　、　ｐＨ７）　７０μｔに再溶解する。比較 対照試験管では、緩衝容積とモル濃度を同じ価に調節する。

反応で生成した尿素をモレキュラーシーブ〔例えばファルマンア社（Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ　Ｃｏｍｐａｎｙ）よりセファデックスＧ　５０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　 Ｇ　５０）の商品名で市販の三次元架橋の多糖〕を通して除去する。

各試験管に２μｔの活性化ビオチン溶液〔スルフオーＮ−ヒドロキシスクシンイ ミド−ビオチン、ピアス社（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｏｍｐａｎｙ）より市販〕を加え ジメチルホルムアミド中で２０μｙ−／μｔとする。反応は３７℃で１６時間行 われ次いで水中２０％グリシン溶液５μｔを加えて反応を停止する。このように して得られたビオチン化された酸はモレキュラーシーブ例えばセファデックスＧ ５０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　５０）を通して精製する。

ＤＮＡと結合したビオチンの存在は、各試験管のいくつかの稀訳物の１μｔの液 滴をニトロセルローズフィルター上に析出させることによって確認される（　Ｄ ＮＡ１００ｐ？に対し１ｎ！？の析出）。

フィルターを乾燥し、あとでアビノン吸収全妨害するのをさけるために蛋白で飽 和し、次にアビノン［ＡｖＤＨ，ベクトル研究所（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｉｅｓ））と［、Ｌ　Ｊ、　Ｌｅａｒｙ等の方法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、 　Ａｃａｄ　、　Ｓｃｉ　、　ＵＳＡ　８０（１９８３）　ｐ、４０４５−４０ ４９）に従って調製した〕ビオチン化されたアルカリフォスファターゼのポリマ ーの溶液中に浸漬する。

洗滌後、フィルターを製造者の仕様（技術報告ＮＣＬ８５）に従って色原体“Ｆ ａｓｔ　Ｂｌｕｅ　ＲＲ５ａｌｔ″（Ｓｉｇｍａ　Ｆ　５００　）で処理する。

ヒドラジン処理ＤＮＡによって生じた析出物のみが発色し、発色の強度は使用ヒ ドラノンの量、すなわち生成−ＮＨ２基の量、従ってビオチン化の程度に比例す る。

ビオチン化したＤＮＡが再度結合する能力は、適度および高度にビオチン化した ＤＮＡ、　（アリコートＦＪＱ２および４）をグローブとして用い、標的として ニトロセルローズフィルター上に析出したラムダファージの変性ＤＮＡを用いて しらべる。処理ＤＮＡと・・イブリッド化可能な（塩基）配列を有しないヘリン グ***変性ＤＮＡを同じフィルター上に負の比較対照として析出する。

それぞれ３２０，１６０．８０および４０ｎｇ　の４つの析出物を各ＤＮＡでつ くる。グローブのないフィルターを比較対照として同じ条件で処理する。６５° Ｃで１７時間ハイブリット化し、アビジン／ビオチン化したアルカリフォスファ ターゼのポリマーの混合物にさらし、色原体を析出させると、ラムダファージの ＤＮＡでつくられ、本発明によるラムダファージのビオチン化したＤＮＡでハイ ブリッド化した析出物のみが呈色し、その強度は高度にビオチン化したプローブ はど強い。

検出限界の評価は次のようになされる。ニトロセルローズフィルターを２５０　 ｎＪ’ないし３ｐノのラムダファージの変性ＤＮＡの８個の析出物を５倍にうす めだものと変性へリング***ＤＮＡ　２５０ｎｙ−の対照析出物を用いてつくっ た。上記のように６５°Ｃで１７時間ハイブリッド化すると、１６ピコグラムの 析出物まで含めてラムダファージのＤＮＡでつくった析出物のみを見ることがで きる。

いうまでもなく、本発明は上に述べた好ましい実施態様の可能な代案にもかかわ る。特に下記の特許請求の範囲にチミンまたはウラシル基およびシトシン基がそ のままのものでありおよび／またはアデノシンまたはグアノシン基を反応基を伴 う鎖の断片でおきかえた修飾核酸が含まれる。この場合更にポリマー核酸の一般 骨格は相補的核酸配列とハイブリッド化する能力を同様に保持される。

更に特許請求の範囲に、最初のアピリミジン酸のアミン化された基によって最初 に伴われる二個の水素をおきかえたいかなる修飾アビリミジン酸も含まれること はいうまでもない。

同様に次の基 −＋−０−ＣＨｚ　−ＣＨＯＨ−ＣＨ ＣＨ２−ＣＨ＝　Ｎ　−ＮＨ−Ｒ が更に他の置換基を伴うかあるいは内部基のあるものが他の基によっておきかえ られたすべての修飾アビリミジン酸も、もしこのような修飾が修飾されたアピリ ミジン酸の相補的ヌクレオチド配列とノ・イブリッド化する能力を実質的に減少 させる結果とならなければ、特許請求の範囲に含まれる。

更に特に特許請求の範囲に含まれるものは式中のｍまたはｎが、例えばピペリジ ンによるヒドラジン修飾ピリミジン塩基のレベルでの核酸の切断のために零であ る弐■で示される本発明の核酸である。

国際調査報告 ＡＮ’１ＪＥＸ　Ｔｏ　ＴＢ４Ｅ　ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　５ＥＡＲＣＨ ＲＥＰＯＲＴ　０ＮＩＮＴＥＲＮＡＴ噸ＮＡＬ　ＡＰＰＣＪＣ，ＩＩＴｒＯＮ　 Ｎｏ、　ＰＣＴ／ＦＲ１３５１０Ｏｉ５１　（ＳＡ　９８２４）−一−−−−− 鴫鋤−−轡−−彎一＋＋＋−＋−−−＋＋愕−一　・−―−＋暢−＋噌−＋＋＋ ・−−・―＋−−−−・−−一

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．アピリミジン酸とヌクレオチド配列をハイブリツド化することによる、プロ ーブまたはより一般的には検出に用いられる配列の構成、および場合によつては 媒質に含まれる相補的核酸のヌクレオチド配列の分離へのアピリミジン酸の適用 。
2. ２．アピリミジン酸をアピリミジン酸が伴う反応機能と共有結合する結合基（こ の結合基は他の分子あるいは化学または免疫学的物体に固定するかまたは１個の 適当な反応機能を有する担体に固定するために或は相補的核酸を検出するために 引き続いて化学反応に関与する能力がある）で修飾することを特徴とする特許請 求の範囲第１項記載の適用。
3. ３．デオキシリボ核酸（またはリボ核酸）鎖由来の修飾アピリミジン酸よりなり 、デオキシシチジン−リン酸（またはシチジン−リン酸）基の少くとも一部ある いは場合によつてはチミジン−リン酸（またはウリジン−リン酸）の少くとも一 部を類似の基またはヌクレオチドそのものと鎖中で結合した一段式ＩＩ▲数式、 化学式、表等があります▼（ＩＩ）（Ｒは結合基を表わす）で示される基と置換 することを特徴とする修飾核酸。
4. ４．一段式ＩＩＩ ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中−文字Ｂ，Ｂ′は各々プリン、７−デアザプリンまたはピリミジン基を示 し、これらの基Ｂ，Ｂ′はそれぞれプリン基または７−デアザプリン基の場合は そのＮ９位置のレベルでまたピリミジン基の場合はそのＮ１位置のレベルで相当 する糖基とそのＣ１位置で共有結合しており、 −Ｒは親和性のある分子、ポリペプチドまたは抗体によつて、あるいは更に他の 分子または担体のいづれかが伴う他の官能基と共有結合可能な基によつて識別可 能な結合基を示し、 −Ｚは−Ｈまたは−ＯＨを示し、 −ｍおよびｎはそれぞれ零または整数でｍ＋ｎの和が有利には１００ないし１０ ，０００好ましくは３００ないし２０００の間にあり、 −ｐは少くとも１に等しい整数でＰ／ｍ＋ｎ＋ｐの比が０．０１と０．０５の間 にあるのが有利である）を特徴とする特許請求の範囲第３項記載の修飾核酸。
5. ５．ＤＮＡによつて構成されチミジン基の全部がそのままのものであることを特 徴とする特許請求の範囲第３項または第４項記載の修飾核酸。
6. ６．結合基が、この基に特別な親和性を示す分子が相当する基に相当することを 特徴とする特許請求の範囲第３項ないし第５項のいづれかに記載の修飾核酸。
7. ７．結合基が、この結合基と選択的な親和性を示す抗体に関してハプテンの性質 を示すことを特徴とする特許請求の範囲第６項記載の修飾核酸。
8. ８．特許請求の範囲第３項ないし第７項のいづれかに記載の修飾核酸の核酸の組 成物中に潜在的に含まれるＤＮＡまたはＤＮＡの特定の（塩基）配列を検出する ための非放射性プローブ（ハイブリツド化したプローブは直接間接を問わずその 結合基と特定の基質への作用によつて検出可能な酵素とのあるいは発光または螢 光分子との結合によつて検出される）の構成への適用。
9. ９．特許請求の範囲第３項ないし第７項のいづれかに記載の修飾核酸を、核酸あ るいは或る種の酵素の混合物中に含まれている相補的核酸の（塩基）配列のハイ ブリツド化によつて選択的保持を可能にするアフイニテイクロマトグラフイまた は類似物のフイルターまたは材料をつくる目的で担体に固定することへの適用。
10. １０．−アピリミジン酸によつてつくられ、調査対象の核酸配列または核酸を特 性づける特定の結合基を伴つた少くとも１個の特定なプローブ、 −修飾した核酸の結合基と錯体をつくる能力のある、特に酵素あるいは螢光また は発光分子によつてラベルされた物体、あるいは少くとも内１個がラベルされた 物体の集合、 −できうれば、可能性のある酵素の特定な基質、−研究中の細胞媒質特に血液由 来のもののリーシスに、またこの媒質の細胞から核酸の抽出に、ならびに関与す る核酸の変性に必要な試薬、 よりなることを特徴とする特許請求の範囲第１項、第２項、第８項または第９項 のいづれかに記載の適用を実行するためのキツト。