JPS61502444A - Purified chymopapain B: industrial preparation and therapeutic compositions - Google Patents

Purified chymopapain B: industrial preparation and therapeutic compositions

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JPS61502444A
JPS61502444A JP60501768A JP50176885A JPS61502444A JP S61502444 A JPS61502444 A JP S61502444A JP 60501768 A JP60501768 A JP 60501768A JP 50176885 A JP50176885 A JP 50176885A JP S61502444 A JPS61502444 A JP S61502444A
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chymopapain
enzyme
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buffer
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オーレイ，ベデイイ・エヌ
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シモンズ，ジエ−ムス・ダブリユ−
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    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
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    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96466—Cysteine endopeptidases (3.4.22)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

【発明の詳細な説明】 ｖｉＭキモパパインＢ： 工業的製法および治療用組成物 技術分野 本発明はババイア乳液ま几は粗製キモパパイン製剤よす多量のキモパパイン（Ｃ 五ｙｒｎｏｐａｐａｉｓ　）　ＥおよびキモパパインＣを単離する工程に関する 。上述の発明工程は相互混入がなく、他の蛋白質の含まれない均一集団のキモパ パイ／ＢおよびキモパパインＣを合成する。上述の発明工程は発熱性物質が低レ ベルである工業的／大賞生産規模で多量のキモパパインＢ２よびキモパパインＣ ｆ曾成する。上述の発明工程は迅速で、簡単で、そして大きな改造や複雑化なし で工業用規模への拡大に適している。[Detailed description of the invention] viM Kimopapain B: Industrial processes and therapeutic compositions Technical field The present invention provides that the Bavaia emulsion is a crude chymopapain preparation and contains a large amount of chymopapain (C). Regarding the step of isolating chymopapains) E and chymopapain C . The above-described inventive process is free from cross-contamination and produces a homogeneous population of chymopathies free of other proteins. Pi/B and chymopapain C are synthesized. The above-mentioned inventive process produces low levels of pyrogenic substances. Kymopapain B2 and Kymopapain C are produced in large quantities on an industrial/prize production scale. f. The invention process described above is quick, easy, and requires no major modifications or complications. suitable for scale-up to industrial scale.

本発明は本質的にキモパパインＣの混入のないキモパパインＢからなる治療用組 成物をも包含する。キモパパインの活性測定の新規の方法をも提供する。The present invention provides a therapeutic composition consisting essentially of chymopapain B without contamination with chymopapain C. It also includes compositions. A novel method for measuring the activity of chymopapain is also provided.

従来技術 キモパパインは一般にはスルフヒドリル蛋白質分解酵素の一部に属し、現在パパ インとは全く別のものであり、ｐ吋αン　より得られる粗製パパイア乳欣の王狭 成分を構成していることが認められている。キモパパインは最初ジャンセン（Ｊ ａｎｓａｓ　）とボールズ（Ｂａｌ１ｇ）により１９４１年に一部、特性が明ら かにされた。ジャーナルオフ′　バイオロジカル　ケミストリー（Ｊ、　Ｅｉｏ ｔ、　Ｃ五線ンなると考えられておシ、そのうちの２つはキモパパイ／Ａとキモ パパインＢで８９、約３５．０００の分子量を持ち、研究室では単離され研究さ れている。ザ　メルクインデックス（Ｔｈｅ　Ｍａｒ６ｈ　Ｉｎｄｅｘ　）第１ ０版（１９８３）、項目番号２２４４．１．３２２を参照せよ。Conventional technology Chymopapain generally belongs to a group of sulfhydryl proteolytic enzymes, and is currently known as chymopapain. It is completely different from the inn, and the crude papaya milk powder obtained from the It is recognized that it constitutes an ingredient. Kymopapine was first identified by Janssen (J Part of the characteristics were clarified in 1941 by Ansas) and Balls (Bal1g). I was attacked. Journal Off' Biological Chemistry (J, Eio It is thought that the t and C staves are on the staff, two of which are gross/A and creepy. Papain B has a molecular weight of approximately 35,000 and has been isolated and studied in the laboratory. It is. The Merck Index (The Mar6h Index) 1st 0 edition (1983), item number 2244.1.322.

パパイアより得られた蛋白質分解酵素は長い間工業的に使用されている。一般的 には次のものを参照せよ二米国特許第１．８２６．４６７号（１９３１年１０月 ６日、ハルテネツク（Ｈｃｒｔ＠％ｏａｋ　）へ発席、生絹からのセリシンの除 去およびゴム乳液の凝固ノ；米国特許第１．９６７゜らへ発布、皮革の脱毛）； 米国特許第２．０９５．３００号（１９３７年１０月１２日、ウオーラーシュタ イン（ＷａｌＬａｒｇｕｉ％〕　へ発布、絹からのセリシンの除去）；米国特肝 第２，２１９．２０９号（１９４０年１０月２２日、ニューフェルト（Ｎｍｓｆ ａｌｄ）へＲ４，食肉（７）軟化）；　米国特許第２．４６４．２００号（１９ ４９年３月１５日、ホール（Ｈａ（すへ発布、食肉の軟化ン；木国特許第３．２ ３５．４６８号（１９６６年２月１５日、ホーガン（ＨａσＧ切に発布、食肉の 軟化）；米国特許第３．２９６゜蒲、食肉の軟化ン；米国特許第３，４６６．７ ０６号（１９６９年５月２７日、ピユータＣＢｇｕｋ　）へ発布、食肉の軟化ン ；木国％Ｈ第３，７０９，７９０号（１９７３年１月９日、ピユータ（Ｂａ５ｋ 　）へ発布、食肉の軟化〕；米国特註第３．７７６，６９３号（１９７３年１２ 月４日、スミス（Ｓｍｉｔｈ）らへ発布、ドライクリーニング）：（Ｒ６ｍｍａ 　ｌりらへ発布、ビールの低温混濁防止９゜このような産業的使用に伴って、こ れらの酵素を活性化したり安定化するための勢力がかなり行なわれ九。一般的に は次のものを参Ｒ＠せよ：木国特ＦＦ第１．８２６，４６７号（１９３１年１０ 月６日、ハルテネック（Ｈａｒｔｓ％Ｈｋ）（１９５４手４月２０日、ヒンヶル ＣＨｔｓｋａりへ発願〕；第３．７０９．７９０号（１９７３年１月９日、ピユ ータ（１９７７年３月８日、ディール（Ｄイーｈｔ）　らへ発７Ｆ５）；発布。Proteolytic enzymes obtained from papaya have been used industrially for a long time. general See also U.S. Pat. No. 1.826.467 (October 1931). On the 6th, departed for Hartenetsk (Hcrt@%oak) to remove sericin from raw silk. Coagulation of rubber emulsions; U.S. Patent No. 1.967 et al., depilation of leather); U.S. Patent No. 2.095.300 (October 12, 1937, Wallerstad) Issued to WalLargui%, Removal of sericin from silk; US special liver No. 2,219.209 (October 22, 1940, Newfeld (Nmsf) ald) to R4, meat (7) tenderization); U.S. Patent No. 2.464.200 (19 March 15, 1949, published by Ha (meat tenderization; Wooden Patent No. 3.2) No. 35.468 (February 15, 1966, published by HaσG, Tenderization of meat; U.S. Patent No. 3,296; U.S. Patent No. 3,466.7 No. 06 (May 27, 1969, Piyuta CBguk), meat tenderization ; Mokukuni%H No. 3,709,790 (January 9, 1973, Piyuta (Ba5k ), Meat Tenderization]; U.S. Special Note No. 3.776,693 (December 1973) May 4th, Issued to Smith et al., Dry Cleaning): (R6mma 　Issued to lira, Prevention of Low Temperature Turbidity of Beer 9゜With such industrial use, this Considerable efforts are made to activate or stabilize these enzymes. Typically Please refer to the following: Mikuni Toku FF No. 1.826,467 (October 1931) Harts%Hk (1954 hand, April 20th, Khingal) Application to CHtskali]; No. 3.709.790 (January 9, 1973, Piyu Data (March 8, 1977, 7F5 from Deal (Dieht) et al.); Issued.

最近ババイアから得られた蛋白質分解酵素の医薬としくＢｌｏ６ｋ）らへ発布、 かさぶ几、血液および膿の生理的壊死組織除去ノ；木国特許第３．０７２．５３ ２号（１９６３年１月８日、インナーフィールド（１％％−ｒｆｔｇｌｄ）へ発 布、化学療法）；米国特許第３，３２０，１３１号（１９６７年５月１６日、ス ミス（Ｓｔｒｔｔｈ）へ発布、椎間板ヘルニアの治療屈木国特許第３，５５８， ４３３号（１９７１手１月２６日゛、スターン（Ｓｔげｆｓ）へ発布され、バタ スターラボラトリーズ（Ｂａｔｔｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｔｅａ＋　１％６・ ）へ指定、椎間板ヘルニアの治療および冷凍外科的治療後の過程の促進ン；米国 特許第４，３７４．９２６号（１９８３年２月２２日、スターン（ｓｔａｒ％） へ発布され、スミスラボラトリーズ（Ｓｍｉｔｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 　Ｉｎｏ、）へ指定、椎間板の異常、損傷またはヘルニアの治療〕。Recently, a proteolytic enzyme obtained from Bavaia was announced as a medicine to Blo6k) et al. Physiological necrotic tissue removal of scab, blood and pus; Mokukuni Patent No. 3.072.53 No. 2 (January 8, 1963, issued to Inner Field (1%%-rftgld) cloth, chemotherapy); U.S. Patent No. 3,320,131 (May 16, 1967, Issued to Mr.Strth, Kureki National Patent No. 3,558 for the treatment of intervertebral disc herniation. No. 433 (January 26, 1971, issued to St. Fs. Star Laboratories (Batter Laboratortea + 1%6・ ) designated for the treatment of intervertebral disc herniation and to accelerate the process after cryosurgical treatment; United States Patent No. 4,374.926 (February 22, 1983, Stern (star%) published by Smith Laboratories, Ino, ) for the treatment of intervertebral disc abnormalities, injuries, or hernias.

パパイアから得られる蛋白質分解酵素の＠僚的な使用は男性および抗原性の問題 により遅延されている。死亡直前に食間の軟化を果たすためこの＃素を生きてい る牛に注射すると不利な生理的効果が観察された。一般には（１９６６年２月１ ５日、ポーガンＣＨｏｇａｎ）　ヘ発布〕；ピュ！　ＣＢａｔｔｋ　）　ヘ発布 ノ；米国特許第３，７０７，７９０ヘス（Ｈａｍｓ　）らへ発布ノは細菌濃度の 低いパパインのような植物酵素製剤の製法を報告した。米国特許第（Ｒ６聾りへ 発布）は食品程度ま丸は粗製パパインによる静脈内への死亡直前の注射が報告の ようには不利な生理的反応を生じないという処理方法を報告した。７２８５号特 許は粗製も食品程度のパパインも絢方とも純粋なパパイン以外にいくつかの蛋白 質分解酵素が存在し、キモパパイン蛋白＃索は食品程ｉｉ？よび粗製パパイン市 販粉末中、全蛋白酵素の９０％近くを占めることも示した。The systematic use of proteolytic enzymes obtained from papaya poses male and antigenic problems. has been delayed. Just before death, I live this #elementary life in order to soften between meals. Adverse physiological effects were observed when injected into cattle. In general (February 1, 1966 On the 5th, published by Pogan); Pyu! CBattk) Issued to U.S. Patent No. 3,707,790 issued to Hams et al. A method for producing a low papain-like plant enzyme preparation was reported. US Patent No. (R6 Deafness) (promulgated) is a food grade mamaru that has been reported to have been injected with crude papain into a vein just before death. reported a treatment method that does not cause any adverse physiological reactions. No. 7285 special In addition to pure papain, both crude and food-grade papain are available. Is there a protein-degrading enzyme present and the chymopapain protein complex is as high as in food? and crude papain It was also shown that it accounts for nearly 90% of the total protein enzymes in commercially available powder.

米国特許第４，３７４，９２６号（１９８３年２月２２日、スターン（Ｓｔｇｒ ｌ）へ発布フは＊験動物へ静脈内２よび皮内に注射する場合に毒性の危険が低く 、感受性傾向が低い改良されたキモパパインの投法を開示した。U.S. Pat. No. 4,374,926 (February 22, 1983, Stgr. l) Has a low risk of toxicity when injected intravenously or intradermally into test animals. , disclosed an improved method of administering chymopapain with reduced susceptibility.

キモパパイン製剤の毒性と抗原性による問題が化学的髄核分解療法の発達を今ま で阻害している。キモパパイン製剤は一般的には椎間板、特に腰部椎間板のヘル ニアそ生する臨床的な発症を軽減する大きな可能性を有ｌ−でいる。成人のを柱 は骨格の柔軟な中心軸を形成する２４個の一連の骨である。を柱はを髄を凹入、 頭を上方に支持し、肋骨を横に保持し、腰帯と下方で付いている。を柱を構成す る骨はを椎骨と呼ばれている。各を椎骨は本質的には上方と下方の表面が平面に なったくぼんだ円柱の骨である。を髄と神経が中央の空洞を通っている。隣接す るを椎骨の平坦な異面は軟骨性の椎間板により相互に連結されている。椎間板は いくらか柔軟性かめり、を椎を曲げることができる。各椎間板はその円周の外側 と内側に沿って線維輪と呼ばれる強い線維性軟骨の輪を持つ。これらの輪は緩衝 装置として働く髄核と呼ばれる柔軟な圧縮性中心を囲み、制限している。髄核は 背の下部に位置し上部の胴のｌｔを支えている５個の腰部を椎骨の間の椎間板で は特によく発達している。これらの下部椎間板は大きな力を受けており、ヘルニ アに最もなりや丁い：すなわち線維輪や周囲の帯の損傷や衰弱化によシ髄核が神 経管内に押し出されを髄から足や胴の下部へ伸びる神りそ圧迫する。胴の下部の 痛み、坐骨神経痛および麻痺という臨床的な発症が生じうる。Problems with the toxicity and antigenicity of chymopapain preparations have hindered the development of chemonucleolytic therapy. It is inhibited by Chymopapain preparations are generally used to improve the health of intervertebral discs, especially lumbar discs. It has great potential to reduce the clinical manifestations of near-infection. pillar of adulthood is a series of 24 bones that form the flexible central axis of the skeleton. The pillar is recessed, It supports the head upwards, holds the ribs to the sides, and is attached below to the waist girdle. make up the pillars These bones are called vertebrae. Each vertebra has essentially flat upper and lower surfaces. It is a hollow cylindrical bone. The spinal cord and nerves pass through the central cavity. Adjacent The flat surfaces of the vertebrae are interconnected by cartilaginous intervertebral discs. The intervertebral disc Has some flexibility and can bend the vertebrae. Each disc is outside its circumference and a strong fibrous cartilage ring called the annulus fibrosus along the inside. These rings are a buffer It surrounds and confines a flexible compressible center called the nucleus pulposus, which acts as an apparatus. The nucleus pulposus is The five lumbar regions located at the bottom of the back and supporting the upper torso are connected by intervertebral discs between the vertebrae. is particularly well developed. These lower intervertebral discs are under a lot of force and are prone to herniation. In other words, the nucleus pulposus deteriorates due to damage or weakening of the annulus fibrosus and surrounding bands. It is pushed out into the canal and compresses the nerves that extend from the spinal cord to the legs and lower part of the torso. lower part of torso Clinical manifestations of pain, sciatica and paralysis can occur.

化学的髄核分解は保存的療法で好ましい反応を示さない腰部椎間板ヘルニアの治 療に椎弓切除術や椎間板摘出術のような外科的方法の代わりとして将来有望なも のでるる。皮下注射針を注意深く挿入し、ヘルニア化し几髄核内に入れ、少量の 蛋白質分解＃素を注入して髄核を溶解し、を髄神経への圧力を社滅する。キモパ パインは髄核の軟骨ムコ蛋白質を選択的に加水分解するが、コラーゲン性線維輪 にはわまり作用しないので化学的髄核分解用の蛋白質分解酵素として選択される 。一般的な化学的髄核分解の技法は２０年以上前に知られている；例えば米国特 許第３．３２０．１３１号（１９６７年５月１６日、スミス（Ｓｗｉｔｈ）へ発 布され、ノくクスターラボラトリーズ（ＢａｉｔげＬａｂｏｒａｔｏｒｉｇａ＋ 　Ｉｎｃ、）へ指定）を参照せよ。しかしこの”化学的外科”の見込みは、特に 今まで入手できたキモパパイン製剤の著しい毒性３よび抗原性により阻止されて いる。比較的精製したキモパパイン製剤でさえ注射後全患者の約１％に軽度から 重度のアナフィラキシ一様の反応が観察され、こわらの反応は、もし即座に通切 な治療を行なわないと生命を危険にするものでろる。アレルギー性の反応は注射 直後または１時間後塘でに生じ、数分から数時間継続しうる。更に反疹、じん麻 疹やかゆみのような反応は従来技術のキモパパイン製剤による化学的髄核分解後 、２週間後まで起こジうる。Chemonucleolysis is used to treat lumbar disc herniations that do not respond favorably to conservative therapy. A promising alternative to surgical methods such as laminectomy and discectomy for medical treatment. Node Ruru. Carefully insert the hypodermic needle into the herniated nucleus pulposus and administer a small amount of A proteolytic substance is injected to dissolve the nucleus pulposus and relieve pressure on the nerve pulp. Kimopa Pine selectively hydrolyzes cartilage mucoproteins in the nucleus pulposus, but collagenous annulus fibrosus It is selected as a proteolytic enzyme for chemically decomposing nucleus pulposus because it has no significant effect on . General chemical nuclear pulpolysis techniques have been known for more than 20 years; for example, in the US No. 3.320.131 (May 16, 1967, issued to Swith) Nokkustar Laboratories (Baitge Laboratoriga+) Inc.). However, the prospects of this "chemical surgery" are particularly This has been hampered by the significant toxicity3 and antigenicity of currently available chymopapain preparations. There is. Even relatively purified chymopapain preparations cause mild to severe symptoms in approximately 1% of all patients after injection. A severe anaphylactic-like reaction was observed, with a stiff reaction occurring if it resolved immediately. Without appropriate treatment, it can be life-threatening. injection for allergic reactions It may occur immediately or after an hour and may last from minutes to hours. Furthermore, rash and hives Reactions such as rash and itching occur after chemical pulpolysis using conventional chymopapain preparations. , may occur up to two weeks later.

アナフィラキシ−の危険のため、化学的髄核分解は以前しこ何らかの型のキモパ パインを注射された７＠者でも現在は禁忌されている。Because of the risk of anaphylaxis, chemical pulpolysis has previously been used to treat some types of chymopathy. Even for those who have been injected with pine, it is currently contraindicated.

従来技術に２けるキモパパイン組成物は一般にノ゛バイアから蛋白質分解酵素の 単離において代表的な初期の精製法である抽出操作により単離された。この初期 の方法は一般に不純物を析出および酵素活性を示すパパイン分画を回収するため の種々の塩析工程そ宮んでいた。一般には次の米国特許を参照せよ：第１，９５ ９．７５０号（１９３４年５月２２日、ワダ（Ｗαｄａ）へ発布、アセト２．４ ９２．５８０号（１９４９年１２月２７日、カウフマンＣＫａｕｆｆｍａｎ　） へ発願ン；第２．６６９，５９９号（１９５４年２月１５日、レイド（Ｊｔａｔ ｄ）へ発布、イオン交換樹月旨による塩析ン；第２．９５０．２２７号（１９６ ０年８月２３日、ギビアン（Ｇｉｂｓα％）へ発布、チオシアネイトによる析出 ノ；第２．９５８．６３２号（１９６０年１２月１日１シユワルツ（Ｓｏｈ賛α ｒｔｇ）　らへ発布、硫酸塩によるレスクＣＬｅｇｕｋ）へ発布、低級アルカナ ールによる析出）；３０１号、第３．２７４，０７２号と第：３．２７４，０７ ３号（それぞれ１９６４年７月２１日、１９６６年４月２６日、１９６６年４月 ２６日、１９６６年９月２０日と１９６６年９月２０日にプルディック（Ｅｕｒ ｄｉａｋ）に元号（１９６５年１０月５日、タイル（Ｃａｙｌｇ　）　ヘ発７ｔ ５、（１９７２年９月２６日、ボーダルト（Ｅｏｓｄａｒｔ　）へ発７５）。Chymopapain compositions in the prior art are generally derived from proteolytic enzymes from Novaya. It was isolated by extraction, which is a typical initial purification method. this early The method is generally used to precipitate impurities and recover the papain fraction exhibiting enzymatic activity. Various salting-out processes were underway. See generally U.S. Pat. No. 1,95 No. 9.750 (May 22, 1934, issued to Wαda, Aceto 2.4 No. 92.580 (December 27, 1949, Kauffman CKauffman) No. 2.669,599 (February 15, 1954, Reid (Jtat) d) Issued on salting out by ion exchange tree; No. 2.950.227 (196 Issued to Gibbian (Gibsα%) on August 23, 0, precipitation with thiocyanate No. 2.958.632 (December 1, 1960 1 Schwarz (Soh praise α) rtg) issued to et al., issued to resk CLeguk) by sulfate, lower arcana No. 301, No. 3.274,072 and No. 3.274,07 No. 3 (July 21, 1964, April 26, 1966, April 1966, respectively) 26th, September 20th, 1966 and Prudic (Eur. diak) and the era name (October 5, 1965, 7t from Caylg) 5, (September 26, 1972, 75 to Eosdart).

この塩析工程は一般に種々のクロマトグラフの分離操作で補われる。以下参照ぜ よ：木国待、ｆｆ第３，１０４．２０６発ａ）はデ命ストランカラムでのパパイ ンのゲル濾過を報告した：木国特計第３．９８３，００１号（１９７６年９月２ ８日、クーペツク（Ｃｏｗｐσに〕へ発布すはｐ−アミノフェニル酢酸水銀と共 Ｍ結合で結付したヒドロキシエチルメタタリレイトゲルのカラムに２けるパパイ ンの単離を報告した；米国特許第４．０２　Ｕ、２６　ｓ号（１９７７年４月２ ６日、ニジカワ（Ｎｉｘｈｔｋαｖ）ａフヘ発涌ノはカルボキシメチルセルロー スや条横テキストランのようなアフィニティー吸盾剤のカラムによるパパインの 単離を報告した：木国奇、ｙｌ−第４．３１１ｊ、９９０号（１９８２年３月９ 日、トンプソン（Ｔんｏｍｐｓｏｎ）らへ’１５）はチタニア粒子のカラムＶＣ よるパパインの分離を報告した。This salting out step is generally supplemented by various chromatographic separation operations. See below Yo: Mikuni Machi, ff No. 3,104.206 a) is Papai at Demei Strangaram Reported on gel filtration of On the 8th, an announcement was made to Cowpσ along with mercury p-aminophenyl acetate. Two papayas are applied to a column of hydroxyethyl metatallate gel bound by M bonds. U.S. Pat. No. 4.02 U, 26S (April 2, 1977) On the 6th, Nijikawa (Nixhtkαv) a fuhe was released with carboxymethyl cellulose. Determination of papain by columns of affinity shielding agents such as Reported isolation: Mu Guoqi, yl-No. 4.311j, No. 990 (March 9, 1982) Thompson et al. '15) used titania particle column VC. reported the separation of papain by

バッチとクロマトグラフ技法を組付ぜｆｃｖ、ｍ々の単離パラメーターのめる積 の最塩化を連成するために必要なものを教授すΦよ５な他のいくつかの単隘手旭 が仰らレスクＣＬａａｘｋ）へ発布ンは水に粗′！Ｊ１酵禾を分散し、蛋白質分 解＃素の初期析出点１での盆の水混相江低級アルカノールを冷加し、それにより 低級アルカノール不溶性不純物の大部分を析出させ溶媒相には正常の蛋白質分解 活性を保持することＶこよりパパインを精製する工程を報告した。精製した＃素 の蛋白質分解活性を最篩に析出嘔せろためには、使用する低級アルカノールの最 適嫉琥をｌず決定することが有利でらることも述べられ友。例えば、２４℃で１ ２０−の水に粗製バパイ／１００．ｉｉｌを分散しその一部に種々の童のメタノ ールを添加し、溶媒相に２いて６０〜９０％Ｃｖｉｖノの範囲のいろいろな溶媒 １！１に度を作る。２４℃で１時間平衡化し友後、それぞれの析出物を単離し、 析出した酵素の蛋白質分解活性をそれぞれ定量的ＶＣ−犬定した。Combining batch and chromatographic techniques fcv, the product of m isolation parameters I will teach you what is necessary to couple the chlorination of Φ5 and some other simple methods. However, the announcement to Resk CLaaxk) is extremely rude! Disperse J1 yeast and protein content Solution # The water mixed phase lower alkanol in the basin at the initial precipitation point 1 of the element is cooled, thereby Most of the lower alkanol-insoluble impurities are precipitated and the solvent phase contains normal protein degradation. We have reported a process for purifying papain from V-copper that maintains its activity. Refined #element In order to maximize the proteolytic activity of the lower alkanol used, Friend also mentioned that it would be advantageous to decide without choosing one's suitability or jealousy. For example, 1 at 24℃ 20-crude vapay in water/100. Iil is dispersed and a part of it contains various kinds of methane. and various solvents ranging from 60 to 90% Cviv in the solvent phase. 1! Make a degree to 1. After equilibrating for 1 hour at 24°C, each precipitate was isolated, The proteolytic activity of each of the precipitated enzymes was determined by quantitative VC-kening.

カートイス（Ｃｏｕｒｔｏｉａ）へ発布）は非イオン型アンバーライ）（Ａ情ｂ −デＨ１り樹脂による醗酵スーブからのアルカリ性浴媒中で活性な蛋白酵素の抽 出のための工程を報告した。一般的な笑りでは処理する醗酵スープ１を当り１０ ０〜５００■の樹脂を報告されているように−（！ｌ！Ｉま几は数回で添加した 。一般に樹脂への蛋白酵素の成層を４央にするため樹脂を２〜１５時間＃酵スー プと接触させた。次いで樹脂を単純なふるいのようなもので全醗酵スープから単 離した。単離しｙｃ［脂をカラム中ＫｔＩＬ＜のが報告されたように最も好都合 でろり、次いで蛋白質分解酵素を浴出した。これにより、蛋白酵素は醗酵スープ から回収され、収率は７０〜９０％でめった。Issued to Courtois) is a non-ionic amber ray) (A information b) - Extraction of protein enzymes active in alkaline bath media from fermentation broths with DeH1 resin. We reported the process for the production. In general, 10 per fermented soup is processed. 0 to 500 ■ resin was added in several times as reported. . Generally, the resin is fermented for 2 to 15 hours to form a layer of protein enzymes on the resin. contact with the tap. The resin is then filtered through a simple sieve from the whole fermented soup. I let go. Isolating the yc[lipid] in a column of KtIL is most convenient as reported. Then, the proteolytic enzyme was removed. This allows the protein enzyme to become a fermented soup. The yield was 70-90%.

ラクシュミナラヤ（Ｌａｋｓｈｍｔｎ＋げαｙａ）へ発布用ま亜鉛イオンによる 上述植物組織の水性抽出物の処理を含んだ植物組織からのペルオキシダーゼ酵素 を単離する方法を報告した。この処置に続いて、透明な醇素俗欣に含水カルボキ シメチルセルロース（セファテックス（ＳｅｐにＧ−ｄｇｚ）　Ｃ５０）を添加 し選択的に吸着させる。含水カルボキシメチルセルロースは利用できる全ペルオ キシダーゼ活性の約７０％を吸着すると報告されて２す、残欣は次のバッチで再 利用きれた。次いでカルボキシメチルセルロースを濾過で分離し、得られた塊を 洗浄し俗離した。Promulgated to Lakshminaya (Lakshmtn+geαya) by zinc ion Peroxidase enzymes from plant tissues, including treatment of aqueous extracts of the above-mentioned plant tissues. reported a method to isolate. Following this procedure, the transparent liquid carboxylic acid is added to the hydrous carboxylic acid. Addition of dimethylcellulose (Sephatex (Sep to G-dgz) C50) and selectively adsorb it. Hydrous carboxymethyl cellulose is a It has been reported that approximately 70% of the oxidase activity is adsorbed2, and the residue can be reused in the next batch. It was used up. Carboxymethylcellulose is then separated by filtration and the resulting mass is Cleaned and isolated.

木国特計第４，２４６，３５１号（１９８１年１月２０日、ミャケ（Ｍ　ｉ　ｙ αにりらへ発布〕は蛋臼負一般、とりわけパパインを吸着すると言われでいる集 血合体吸着剤を報告した。一般に蛋白質の吸着は蛋白質浴液への吸着剤の添加（ バッチ式）かまたは吸着剤を詰めたカラムに蛋白質浴ｇを通す（連続式シことに よって、蛋白質の浴液や分Ｙｉ、准を吸着剤との接触によると報告された。吸虐 剤の量や吸着される蛋白質のｔ炉ｉｌ大すると吸着速度が速くなるので、使用す る吸着剤の菫は吸着させる蛋白質の量および吸着の希望時間ｖｒ−よって決定す べきであると報告されている： “笑際の成層操作の前に最適条件への設定が必要である。こｎは時間の経過に従 い吸着剤の液層舵力を定責同ンこ決定することによジ達成されうる。吸着剤の蛋 白質吸７Ｓｆｉ刀は次の手ｊ＠で決定嘔れた。まず、吸着をバッチ式で夫見した 場合には、処理済みの溶液または分散液中の蛋白質の績度を決定した。吸着剤に より吸着され九蛋白質のｔは最初の溶液や分散液中の蛋臼實―度と処理済みの浴 液や分散成牛の蛋白質ｍ１度との間の差異からル士算した。矢に吸着を連続式で 実施しｆｃ場合には、吸７ｔ＃後吸看剤粒子の間に存在する蛋白質溶成や分散ｇ 、をその浴液や分散液の溶媒と同一の溶媒を用いて洗浄した。洗浄に用い九溶媒 の容積は吸着剤の児掛けの容積の５倍でめった。Mikuni Special Plan No. 4,246,351 (January 20, 1981, Myake [Issued to αNirira] is a collection that is said to adsorb papain in general and papain in particular. A blood coalescence adsorbent was reported. Generally, protein adsorption is achieved by adding an adsorbent to the protein bath solution ( (batch method) or pass the protein bath g through a column packed with adsorbent (continuous method) Therefore, it has been reported that the protein bath solution and fractions are absorbed by contact with the adsorbent. Absorption The adsorption rate increases as the amount of agent and temperature of the protein to be adsorbed increases. The violet size of the adsorbent is determined by the amount of protein to be adsorbed and the desired adsorption time vr. It is reported that you should: “It is necessary to set the optimum conditions before the stratification operation. This can be achieved by simultaneously determining the liquid layer steering force of the adsorbent. Adsorbent protein The white matter sucking 7Sfi sword made a decision with the next move. First, I tried adsorption in batch mode. In some cases, the performance of the protein in the treated solution or dispersion was determined. to adsorbent The amount of adsorbed protein is determined by the protein content in the initial solution or dispersion and the treated bath. Calculations were made from the difference between the liquid and dispersed adult beef protein m1 degree. Continuous adsorption to arrows When carrying out fc, the protein dissolution and dispersion g existing between the inhalation agent particles after 7t# of inhalation , was washed using the same solvent as that of the bath solution or dispersion. Nine solvents used for cleaning The volume of the adsorbent was five times the volume of the adsorbent.

況ｇをさ”んだ処理慌み俗欣や分￥１故甲の蛋白質の１を決定した。最初の陪腹 や分散液中の蛋白質の童と処理済＾冷液や分散腹中の蛋白質の菫との間の差異は 吸虐剤によって吸着″された蛋白質の址を界わす。We determined the amount of protein in the processing in a hurry and 1 yen per minute.The first harvest. The difference between the protein powder in the liquid or dispersion and the protein powder in the processed cold liquid or dispersion is Determines the location of the proteins adsorbed by the absorbent.

吸着剤の蛋白質吸看舵力は乾燥吸看剤ダラム当りのｅ、７ｆされた蛋日負■艮よ って算出する。”　（Ｃｏｂ１４．１．４４〜Ｃｏｔ、１５　、　１．２８参照 せよ。〕′３５１号符許中の全ての実施例は一般的な蛋白質吸看剤によろりらか しめ決められｍ電の純粋の蛋白質の吸着を宮む；特定の＃素に加えて他の蛋白質 を含有する複雑な混合物から特定の酵素の吸着を検出することは示されて号（そ れぞれ１９８３／４６月１４日２よび２８日、ヨノヘンセン（Ｊｏｂａｎｓ　ａ ｎ　）へ発布ノは工業的規模でのＣ塾、２界−スーパーオキシドテイスムターゼ の回収法を報告した。The protein adsorption force of the adsorbent is e and 7f per dry adsorbent duram. Calculate. ” (See Cob14.1.44~Cot, 15, 1.28 Do it. ] All examples in the '351 patent are based on common protein sorbents. Prefers the adsorption of pure proteins of a defined amount; in addition to specific # elements, other proteins Detection of adsorption of specific enzymes from complex mixtures containing 1983/4 June 14th 2nd and 28th, respectively. n) The publication of the C school on an industrial scale, 2 worlds - superoxide taste mutase reported the recovery method.

実施例１では、緩衝液と平衡にしｍ微粒子カルボキシメチルセルロースを濃縮し 九酵母の粗抽出物に添加し、混合物を１時間撹拌し次。次いでカルボキシメチル セルロースを圓往３０−のカラムＶこ果め、緩衝放で況浄し、次に直径１０口の カラムに移して俗離した。In Example 1, microparticle carboxymethylcellulose was concentrated by equilibration with a buffer solution. 9 yeast crude extract and stirred the mixture for 1 hour. Then carboxymethyl The cellulose was packed in a 30-mm column, cleaned with buffer, and then placed in a 10-neck column with a diameter of 10 mm. It was moved to a column and separated from the public.

矢の材計はキそパパインの檀々の単離手順を開示してジャンセン（Ｊａｎｓｇｎ ）らへ発ａ）はパパイア乳液からキモパパインと命名された新規の蛋白質労鱗酵 素の表造を報告した。不純物はｐＨ２の酸析出２よび牛飽和食塩水による塩＠に よって非乾燥乳層の浴液から除去された。Arrow Timber disclosed the isolation procedure for Kisopapain and Jansgn (Jansgn). ) A) is a novel protein fermentation named chymopapain derived from papaya emulsion. We reported the basic surface structure. Impurities are caused by acid precipitation at pH 2 and salt from bovine saturated saline. Therefore, it was removed from the bath solution of the undried milk layer.

次いでほぼ純粋のキモパパイン蛋白質を報告されているように塩濃度をｐＨ２で 飽和１で上昇させることにより析出させた。上６己蛋白質は報告されているよう に更に再析出と再結晶によって精製できた。Almost pure chymopapain protein was then prepared at a salt concentration of pH 2 as reported. It was precipitated by increasing the saturation level to 1. As reported, the upper 6 self-proteins It was further purified by reprecipitation and recrystallization.

ホーカン（１１ｏｇαりへ発布〕は粗製臂パインから純粋のキモパパインのよう な極めて精製された物質の単離を報告した。しかし七の開示には分離方式につい ては報告さスターン（Ｓｔａプリへ発弗され、バクスターラボラトリーズ（Ｂａ ｓ！ｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｇｓ＋　Ｉｎｃ、ンへ指足月ま水性緩衝液と平 衡に達し、次いでクロマトグラフのカラムの平衡に使用した緩衝液とほぼ同じｐ Ｈだがイオン強度のより大きい水性緩衝液で解離したカルボキシメチル置換架橋 デキストラン共重合体（好適なのはセファテックス（Ｓｇｐｈａｄｍｚ　）　Ｃ Ｍ　−５０を用いて粗製キモパパインやパパイア乳准の水性抽出物のクロマトグ ラフ法によってキモトリプシンを精製する方法を報告した。上記粗製キモパパイ ンとは塩分画、溶媒分画、ｐＨＨｇＩ２たは同様の方法によってババイアから分 離されたキモパパンを意味する。スターン（Ｓｔａデ５ンはカルボキシメチル［ 換架欄デキストラン共重合体といつカラム型式が必須条件であり、バッチ式では 満足のいく分離ができないことを明示した。更に７４３３号％肝は実質的に供給 された全ての蛋白質が保持され、カラムを通過する間１ｃ成分かよく分離するの に光分な遊離のカルボキシメチル置換架橋デキストラン共重合体の量にカラム容 積を丁べきことを明示した。共Ｎ−８一体のゲル濾過とイオン父換性の両方を実 質上完全にキリ用するため、スター７（Ｓｔａｒｔ＋→はキモパパインを共重合 体の飽和該度よりかなり低くくシだカラムへ元墳すべきでろることを示した。堆 −の実施例に２いて、４／のキモババイ／の水浴液をカラムの頂点に直接添加し 、２５℃で約２０　ｄ／　ｈｒの流速で４００−の浴出孜で浴離した。報告され たようにキモトリプシンｌおよびｎは、それぞれ約５０％と８０％塩飽和で脱着 した０４ｊＪ（Ｄ梢Ｈキモパパインから２．２５０　ｙのキモパパイン１、！＝ ０．４３０ｙのキモパパイン■が得られた。スターン（Ｓｔｅｒｎ）は本質的に 純粋なキモパパインｌと■が単離されたと報告したが、彼の１気泳動の結果は相 互混入があることを示している。異なり九蛋白質は電気泳動にｐいて異なった帝 を形成すると述べた仮、スターン（Ｓｔ−ｒｎ）はセルロースアセチイトでの電 気泳動後、単一の蛋白’！帝の形成を報告した。更に′４３３号峙計の図１に表 わされた浴離図は名分ｉｉ！ｉｉを全蛋白質含量の＾で追ったものでめった。Hokan (promulgated to 11og αri) is like pure Kimopapine from crude pine pine. reported the isolation of highly purified material. However, the disclosure in No. 7 contains information about the separation method. It was reported to Stern (Sta) and Baxter Laboratories (Ba s! Laboratories + Inc., aqueous buffer and normal Equilibrium is reached and then the pH of the buffer is approximately the same as that used to equilibrate the chromatographic column. Carboxymethyl-substituted crosslinks dissociated in H but higher ionic strength aqueous buffers Dextran copolymer (preferably Sephatex (Sgphadmz) C Chromatography of crude chymopapain and aqueous extract of papaya milk using M-50 We reported a method for purifying chymotrypsin by the rough method. The above crude Kimopapai Separated from Bavaia by salt fractionation, solvent fractionation, pHHgI2 or similar methods. It means separated Kimopapan. Stern (Staden is carboxymethyl [ The exchange column dextran copolymer and column type are essential conditions, and batch type It has been demonstrated that a satisfactory separation is not possible. Furthermore, No. 7433% liver is substantially supplied. All proteins contained in the sample are retained and the 1c component is well separated during passage through the column. The amount of free carboxymethyl-substituted cross-linked dextran copolymer varies by column volume. It was clearly shown that the product should be divided into two. Both N-8 gel filtration and ion paternal exchange are performed. In order to completely cut the quality, Star 7 (Start+→ is copolymerized with chymopapain) It was shown that the tomb should be buried in a kushida kalam at a level considerably lower than the saturation level of the body. Compilation - In Example 2, 4/2 of the water bath solution was added directly to the top of the column. The bath was removed at a flow rate of about 20 d/hr at a temperature of 400°C at 25°C. reported Chymotrypsin l and n were desorbed at approximately 50% and 80% salt saturation, respectively. 04jJ (D Kozue H Kimopapain to 2.250y Kimopapain 1, != 0.430y of chymopapain ■ was obtained. Stern is essentially He reported that pure chymopapain I and This indicates that there is mutual contamination. Different nine proteins are subjected to electrophoresis and have different kinetics. Stern (St-rn), which is said to form a cellulose acetite, is After pneumophoresis, a single protein’! Reported the formation of the Emperor. Furthermore, it is shown in Figure 1 of the '433 countermeasure. The wawarashi yurizu drawing is a good thing! ii was followed by the total protein content.

米国特許第３．６２７．６４０号（１９７１年１２月１４日、プルムベルグ（Ｅ Ｊｓ渦ｂａｒｇ）らへ発布用ま共有結合をした重合体−酵素生成物の形′Ｉｆｉ 、による比較的粗製のけ素の精製、脱色法を報告した。酢累かキモパパインでろ る上記の方法は七の特許請求の範曲９の題目でめった。U.S. Patent No. 3.627.640 (December 14, 1971, Plumberg Covalently bonded polymer-enzyme product form 'Ifi reported a purification and decolorization method for relatively crude silica. Use vinegar or Kimopapain. The above-mentioned method was unsuccessful in the subject matter of Patent Claim No. 9.

は蛋白＃素の任仇下、ペプチド合成の反応生成物からキモパパインのような蛋白 酵素の回収方法を報告した。Under the control of protein molecules, proteins such as chymopapain are produced from the reaction products of peptide synthesis. A method for recovering the enzyme was reported.

米国峙、ｆＦ第４．３７４．９２６号（１９８３年２月２２日、スターン（Ｓｔ ａｒ％）へ発布され、スミスラボラトリーズ（Ｓｍ１ｔｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｉａｓ＊　Ｉｎｃ、）へ指足りは改良キモパパインと呼ばれたものの製造方法を 報告した。上記の方法は原理的にはスターン（Ｓｔａｒ％）の′４３３号％肝で 報告されたカルボキシメチルテキストランゲルをカルボキシメチルアガロースゲ ルにＩｔ侠したものでめった。粗製キモパパイン（約２９ｙ）を水浴液とし、カ ルボキシメチルアガロースゲル樹脂のカラムに添加し、約４６１の面出ｇ、を約 ４０時間で俗離した。７９２６号特肝の図１に表わされた溶１図は全蛋白質含量 と＃累活注の両方で追つたものであった。蛋白黄金ｊｌＬＶｒ−よると、キモパ パインｌの報告された収量はキモパパイン■のものの約５倍でｂつた。更に＃″ Ａ活性曲蛛は全蛋白金貨の曲線から明らかに置き換えられる。このような相殺は 不純物の存在を示すと酵素学者は認識する。キモパパイン１と塁を含む浴離散分 画を一緒にし２、運上ｒし、凍結乾燥した。キモパパインを２つの活性成分に精 製することにより、より毒性の低い矛盾のない生成物が製造きれると報告された 。United States, fF No. 4.374.926 (February 22, 1983, Stern (St. ar%) and was issued to Smith Laboratories (Sm1th Laboratories). ias* Inc.) to learn how to produce what was called improved chymopapain. reported. The above method is based on Stern's No. 433 % liver in principle. Reported carboxymethyl text range gel to carboxymethyl agarose gel I really liked it. Crude chymopapain (approximately 29 y) was used as a water bath solution, and About 461 g of surface weight was added to a column of ruboxymethyl agarose gel resin. I became obsessive in 40 hours. Figure 1 shows the total protein content of No. 7926 special liver. It was followed in both the #Customer Notes. According to Protein Gold JlLVr-, Kymopa The reported yield of Pine I was approximately five times that of Cymopapain II. Further #″ The A activity curve is clearly displaced from the total protein curve. This kind of offset is Recognized by enzymologists as indicating the presence of impurities. Bath discrete component including Kimopapain 1 and Base The images were combined, washed, and lyophilized. Chymopapain is refined into two active ingredients. It was reported that a consistent product with lower toxicity could be produced by manufacturing .

種々のキモパパイン組成物が従来技術で開示されている；一般には次の木国瞥計 中の拍求の範囲を参照せよ：第１．９６７．６７９号（１９３４年７月２４日、 ミュンチ（Ｍｓａｎｃｈ）へ発布、古性化ババイ７ｍり；第２．６７６゜（１９ ６２年１月３０日、ブロッナＣＥｌｏｃん〕らへ発布、活性化パパイン組成物〕 ；第３，２８４，３１６号（１９６６年１１月８日、ケイル（ＣａｙＬｍ）へ発 布、保管中安定なパパイン訴導体う；第４・０１１・１６９号（１９７７年３月 ８日、ディール（ＤｉａｈＬ）らへ発布、ペプチドペプチド加水分解酵素官有組 成物ン。２つのキモパパイン組成物が化学的Ｍ核分解僚法への使用用に現今、全 国的および国際的に売買されている。ディスカーゼ■（Ｄ＜　ａａａａｇ勅はバ クスターートラベノールラボラトリーズ（Ｅａｚｔａｒ−Ｔｒａｖｅｎｏｌ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ＋　ＩｎＣ，〕の製品でｂす、パパイア乳液から生成し た蛋白質分解酵素、キモパパインの無菌製剤として１９８２年７月の製品招弁会 社報に記述されている；報告されているように蒐気泳ｗＪによる決定で央買上不 純物のないパパインである。キモジアクチン■（Ｃにνｍｏｄｉａａｔｉ％■ン はスミスラボラトリーズ（ＳｍｉｔｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉａａ＋　Ｉｎｃ、） の製品でろり、１９８３年１月の枳品招介会社報でババイア（Ｃａｒｉａａ　ｐ ａｐαＶａ）の木の粗乳液から得られた２穐の酵素活性蛋白′Ｘ成分を官有する 梢製蛋自分解酵素として記述されている。Various chymopapain compositions have been disclosed in the prior art; See scope of appeal in: No. 1.967.679 (July 24, 1934, Issued to Msanch, 7m long antiquity; No. 2.676° (19 Published on January 30, 1962 by Brona CEloc et al., Activated papain composition] No. 3,284,316 (issued November 8, 1966 to CayLm) No. 4.011.169 (March 1977) On the 8th, issued to DiahL et al., Peptide Peptide Hydrolase Government Association Composition. Two chymopapain compositions are currently available for use in chemical M-nucleolysis methods. It is bought and sold nationally and internationally. Discase ■ (D< aaaag Eaztar-Travenol Laboratories (Eaztar-Travenol L) It is a product of laboratories + InC, produced from papaya emulsion. A product exhibition was held in July 1982 as a sterile preparation of chymopapain, a proteolytic enzyme. As stated in the company newsletter; as reported, the It is pure papain. Chymodiatin (vmodiaati%) is Smith Laboratories (Smith Laboratories + Inc.) Cariaa p. apαVa) contains two enzyme active protein'X components obtained from the crude latex of the tree. It has been described as a treetop proteolytic enzyme.

発明の詳細な説明 不発明はパパイア乳漱または粗製キモパパイン製剤から多ｉのキモパパインＢ２ よびキモパパインＣの単離法に関スる。キモパパインＢ２よびキモパパインＣの 均一集団を相互混入なしで工業的数量で別々に回収できる。Detailed description of the invention The non-invention is to extract chymopapain B2 from papaya milk strain or crude chymopapain preparation. and a method for isolating chymopapain C. Kimopapain B2 and Kimopapain C Homogeneous populations can be recovered separately in industrial quantities without intercontamination.

不発明はキモパパインＣや他の蛋白質のような他の蛋白酵素による混入のない兼 買上純粋なキモパパインＢからなる治療用組成物にも関する。本発明のこの治療 用組成物は特に椎間板ヘルニア組織の化学的髄核分解にＭ用であり、七の例外的 な純度は重いアナフィラキシ一様２よび他のアレルギ一様反応の危険をかなり軽 減するという改善をする。不発明は光分な再現性をもつキモパパインＢ２工びキ モパパインＣの活性を検足する新規の方法をも供給する。Non-inventive means that there is no contamination by other protein enzymes such as chymopapain C or other proteins. The present invention also relates to therapeutic compositions comprising purchased pure chymopapain B. This treatment of the invention The composition is particularly suitable for the chemical nucleus pulposus decomposition of herniated disc tissue and contains seven exceptional High purity significantly reduces the risk of severe anaphylaxis and other allergic reactions. Make improvements by reducing The uninvented feature is the Kimopapain B2 process, which has optical reproducibility. A novel method for testing mopapain C activity is also provided.

発明の詳細な説明 現在ババイア乳敢中には少なくとも６桟の蛋白酵素（パパイン、キモパパインＡ 、キモパパインＢ１〜Ｂ３、およびキモパパインＣ）が発見されている。不発明 の精製法は均質な型でキモパパインＥ′ｓ？よびキモパパインＣの単離そ生する 。現在キモパパインＢはキモパパインＢ、〜Ｂ、と呼んでいる３ａのサブフオー ムが存在し、このキモパパインＢの３徨のすブフォーム（ＥＩ−Ｂｓ）はこのジ チオール蛋白質分解酵素中のＳＲ基の酸化状態の違いによることが明らかにされ ている。Detailed description of the invention Currently, there are at least six protein enzymes (papain, chymopapain A) in Bavaia milk. , chymopapain B1-B3, and chymopapain C) have been discovered. non-invention The purification method is a homogeneous type of chymopapain E's? and isolation of chymopapain C . Currently, Kimopapain B is a subform of 3a called Kimopapain B, ~B. The three-legged subform of chymopapain B (EI-Bs) It has been revealed that this is due to the difference in the oxidation state of the SR group in thiol proteinase. ing.

不発明は単独の均質な酵素として大量規模のキモパパイ７Ｅ５？よびキモパパイ ンＣの単離法の開発を目標としている。今回キモババイ７Ｅ２よびキモパパイン Ｃの純粋な分画を単離する蝦も好ましい方法を、生のパパイア乳欲を出発物質と して詳細に述べる。また、もしも特に精製したキモパパインが出発物質として利 用される場合には、次の手順の工程１〜１０は除外でき、製造手順は工程１１お よび１２の選択性の高いバッチ吸着過程から開始できることも注意すべきでるる 。Is the non-invention of Kimopapai 7E5 on a large scale as a single homogeneous enzyme? Call Kimopapai The goal is to develop a method for isolating C. This time Kimobabai 7E2 and Kimopapain A preferred method for isolating pure fractions of C. and will be described in detail. Also, if specifically purified chymopapain is used as a starting material, If used, steps 1-10 of the following procedure can be omitted and the manufacturing procedure It should also be noted that it is possible to start from a highly selective batch adsorption process of .

％にことわらない限り、全工程は、できるだけ細菌の混入の可能性を最少にし、 ＃累活性を保つため約４℃で笑施する。全工程を通して発熱性物質を含−！ｌｌ ／′１蒸留水を使用する。%, all processes should be carried out to minimize the possibility of bacterial contamination as much as possible. #To maintain cumulative activity, apply at approximately 4°C. Contains pyrogens throughout the entire process! ll /'1 Use distilled water.

工程１：６リツトルの容器の中に２ｋｇのパパヤラテックスを計量して入れ、３ ．２１の蒸留水を加え、この混合物を呈温で（２２〜２５℃で）１時間撹拌した 。Step 1: Weigh and put 2 kg of papaya latex into a 6 liter container, ．． 21 distilled water was added and the mixture was stirred at room temperature (22-25°C) for 1 hour. .

工程２：この混合物を急いで遠心分離しく９０００Ｇ。Step 2: Quickly centrifuge this mixture at 9000G.

３０分〕、ペレットを捨てた。このペレットはパパイ／を言んでいた。上清を次 の工程で１更用するためにとってふ・く。30 minutes], the pellet was discarded. This pellet said papai/. Next supernatant Save it for one more use in the process.

工程３：硫酸アンモニウムを少量（５〜１０ｙ）ずつ一度に上ＴｆｔＶこ加えて 硫酸アンモニウムの濃度４５％となるようにした。得られたスラリーを３０分撹 拌した。Step 3: Add ammonium sulfate in small amounts (5-10y) at a time to the top. The concentration of ammonium sulfate was set to 45%. Stir the resulting slurry for 30 minutes. Stirred.

工程４　：　９０００　Ｇで３０分遠心分崩し、ペレットを捨て上ｆ＃を久の工 程１でとって２く。Step 4: Centrifuge at 9000 G for 30 minutes, discard the pellet, and remove the top f# Take it in step 1 and take it in step 2.

工程５　：　１＃　ＨＣｌＣ８５ｔｎｔ嬢塩酸を９１５−の蒸留水に加えること によって調製）をｐＨが２．０となるまでゆっくり加えると濁った浴液か生じる 。Step 5: Adding 1# HClC85tnt hydrochloric acid to 915-distilled water (prepared by .

工程６：上記浴液を９０００Ｇで３０分間遠心分離し、ペレットを捨て、上清そ 矢の工程までとって２く。Step 6: Centrifuge the above bath solution at 9000G for 30 minutes, discard the pellet, and remove the supernatant. Let's take a look at the arrow process.

工程７：硫酸アンモニウムを少量（５〜１０ｙ）ずつ１度に加えて上清の硫酸ア ンモニウム濃度を７５％にする。Step 7: Add ammonium sulfate in small amounts (5 to 10y) at a time to remove sulfuric acid from the supernatant. Adjust the ammonium concentration to 75%.

得られたスラリーを１時間攪拌する。The resulting slurry is stirred for 1 hour.

工程８ニスラリ−を３０分間９０００Ｇで遠心分離する。Step 8 Centrifuge the Nis slurry at 9000G for 30 minutes.

上清を傾瀉し捨てる。キモパパインＢとキモパパインＣｆ　言：ＷＴるペレット を次の工程のためにとって２く。Decant and discard the supernatant. Kimopapain B and Kimopapain Cf Words: WT Ru Pellets Save 2 for the next process.

工程９：工程８からのペレットを最小容量（１００〜２００４）の帆２Ｍ酢酸ナ トリウム緩衝ｇＣｐＨ５，０）に溶解する。Step 9: Pellets from step 8 are added to a minimum volume (100-2004) of 2M sodium acetate. Dissolve in thorium buffered gC pH 5,0).

工程１０：侍られた浴液を透析管（蒸留水で前身って況っておく〕に移し、０． ２Ｍ酢酸す）　ＩＪウム緩衝液ＣｐＨ５，０）に対して透析する。数回（３〜５ 回）該緩衝顕をとり換える。生成した透析保留物を部分的に精製するがまだいく つかの蛋白質を言んでいる。この粗製キモパパインを以下に従って精製する。Step 10: Transfer the prepared bath solution to a dialysis tube (previously filled with distilled water) and reduce the temperature to 0. Dialyze against 2M acetic acid buffer (pH 5,0). Several times (3-5 3) Replace the buffer microscope. Partial purification of the generated dialysis retentate is still in progress. I'm talking about some protein. This crude chymopapain is purified as follows.

工ＷＩＩ：４６のビーカーにカルボキシメチル−セファデックス（Ｃａｒｂｏｚ ｙｍａｔｈｙｌ　−８ｇｐｈａｄａｚ　）　１００　ｆｌを測る。０．２Ｍ酢酸 ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，０，）を３．Ｏ２加え撹拌する。この混合液を一晩 ４℃に放置し、膨潤したカルボキシメチル−セファデックス（約３ｔ）を次の工 程に用意する。Engineering WII: In a 46 beaker, add carboxymethyl-sephadex (Carboz). Measure ymathyl-8gphadaz) 100 fl. 0.2M acetic acid 3. Add sodium buffer (pH 5, 0,). Add O2 and stir. Leave this mixture overnight The swollen carboxymethyl-Sephadex (approximately 3 tons) was left at 4°C for the next process. Prepare accordingly.

工程１２：工程１０からの透析保留物を工程１１からのカルボギシメチルーセフ ァデツクスに刃口え、ガラスの撹拌棒で簡単に撹拌し、カルボキシメチル−セフ ァデックスを沈殿さぜる。吏Ｖこ下で記述される標準化検定法を用いて上清の− ｍ（５０μｔ）のキモパパイン活性を測定する。キモパパインがマトリックスに 選択的に結合し、最初の活性の５％以下しか溶液中に残留しなくなるまでカルボ キシメチル−セファデックスを加えてこの操作を繰り返す。Step 12: The dialysis retentate from Step 10 is treated with carboxymethylceph from Step 11. Add a blade to the adex, stir easily with a glass stirring rod, and prepare carboxymethyl-ceph. Stir the Addex to precipitate. The supernatant was assayed using the standardized assay method described below. Measure the chymopapain activity of m (50 μt). Kimopapain in the matrix selectively binds and the carboxylic acid binds selectively until less than 5% of the initial activity remains in solution. Add oxymethyl-Sephadex and repeat this operation.

工程１３：キモパパイン結合カルボキシメチルーセフアデンクスを適当なカラム に詰める。溶出液の吸収（２８０１りが基線のレベルになるまでカラムを０．２ Ｍ酢酸ナトリウムで洗浄する。Step 13: Transfer chymopapain-conjugated carboxymethyl-sephadenx to an appropriate column. Fill it in. Absorb the eluate (2801) until the column is at the baseline level. Wash with M sodium acetate.

工程１４：酢酸ナトリウムの０．２〜１．　ＯＡｆ（ｐＨ５，０〕の直線性勾配 によシカラムから酵素を溶離する。分画は蛋白質含量と酵素活性を検査する。典 型的な溶離曲線を図１に表わす。初期分画に出現する大きな蛋白質ピークはキモ パパイン活性がないが仮で溶離する２つの活性を臂する分画はキモパパインＢと キモパパイン活性示す。Step 14: 0.2-1. Linearity gradient of OAf (pH 5,0) Elute the enzyme from the column. Fractions are tested for protein content and enzyme activity. Noriyoshi A typical elution curve is depicted in FIG. The large protein peak that appears in the initial fraction is a The two active fractions that do not have papain activity but tentatively elute are chymopapain B and Shows chymopapain activity.

工程１５：浴離奴の代表的分画を酸ポリアクリルアミドゲルＴ１１気泳動を行な う。純粋なキモパパインＢを富む分画と純粋なキモパパインＣを言む分画を決定 する。典型的な′」気ｖＫｔｍの図を図２に示す。Step 15: Perform acid polyacrylamide gel T11 pneumophoresis on the representative fractions of the bathed tofu. cormorant. Determine the fraction enriched with pure chymopapain B and the fraction enriched with pure chymopapain C. do. A diagram of a typical vKtm is shown in FIG.

工程１６：純粋なキモパパインＢを言む分画をプールし、凍結乾燥または限外濾 過によって容積を減少させる。純粋のキモパパインＣを冨む分画は別にプールし て濃縮する。Step 16: Pool fractions representing pure chymopapain B and lyophilize or ultrafiltrate. Reduce volume by filtration. Fractions enriched with pure chymopapain C were pooled separately. and concentrate.

工程１７：前工程からの濃縮キモパパインＢ俗欣を蒸留水に対して透析して少な くとも３回水を交換するかまたはセファデックスＧ−２５ゲル濾過カラムにａ縮 酵素溶液を通して塩を餘く。セファテソタスＧ−２５ゲル濾過モババインＣを脱 塩する。Step 17: Dialyze the concentrated chymopapain B from the previous step against distilled water to Change the water at least three times or add a Pass the enzyme solution through with salt. Cefate Sotas G-25 gel filtration removes Mobabin C Salt.

工程１８：生成した一＃、塩浴欲を凍結乾燥し、ふわふわした結晶性キモパパイ ンＢを得る。別に脱塩したキモパパインＣを凍結乾燥する。Step 18: Lyophilize the generated salt bath to obtain fluffy crystalline Kimopapai. Obtain B. Separately desalted chymopapain C is freeze-dried.

この手順は出発物置として２時のパパイア乳故によって記述しであるが、手順に 大きな遅延や変化なしで例えば１０倍Ｖこ規模を大きくすることができることが 示されている。倒えば工業的規模の精製が工程１２での出発物置として６０！！ のｆｆ１ｉキモパパインを使用して実行された。This procedure is described with two papaya milks as a starting stock, but the procedure This can be increased by a factor of 10, for example, without significant delays or changes. It is shown. If it falls down, industrial scale refining will be 60 as a starting storage in step 12! ! was performed using the ff1i chymopapain.

不発明は不純物の塩析の好適な方法としてアＢ２．０で４５％硫安、欠いて７５ ％硫安ｅこよる粗製キモパパインの塩析を記述しであるが、他の手順で製造され た粗製キモパパインも都合よくそして不当な実験なしで工程１２のＶ［規の選択 的バッチ吸着過程に使用できることも明示されている。部分的に精製された商品 のキモパパインを前述の工程１１〜１８によってＭ製する実施例２を参照ぜよ。The present invention uses 45% ammonium sulfate in AB2.0 as a suitable method for salting out impurities. Salting out of crude chymopapain using % ammonium sulfate is described; Crude chymopapain can also be prepared conveniently and without undue experimentation in Step 12. It has also been demonstrated that it can be used in batch adsorption processes. Partially refined products See Example 2, in which chymopapain was prepared by M according to steps 11 to 18 described above.

同様に好適な酢酸ナトリウム以外の塩の０．２〜１．０＆　（ｐＨ５，０）の直 線性勾酸を用いて素足できる溶離が達成されうろことも期待される。Similarly, a suitable salt other than sodium acetate with a pH of 0.2 to 1.0 (pH 5,0) It is also expected that barefoot elution will be achieved using linear acidic acid.

本発明の工程のうち重大な景素は（前述の工程１２）の選択性の高いバッチ吸着 工程でろる。粗製キモパパイン溶液を陽イオン交換樹脂（好適なのはカルボメチ ル置換架橋テキストラン共重合体ンのバッチで混合し、俯脂上にキモパパイン酵 素を特異的に吸着し不純物を溶液中に残す。次いで上清は溶液中の残余キモパパ イン活性を決定するため検定される。溶液から更にキモパパイン酵素を特異的に 吸着するため更に陽イオン交換樹脂を添加し、次いで上溝を再検足する。陥イオ ン交換樹脂によるこの浴液の滴定は、飽ｉ１に決定したキモパパインの残余活性 が浴液中で変わらなくなる鷹で、すなわちキモパパイン酵素が陽イオン交換樹脂 の利用できる結合部位をほとんど飽和するまで継続する。An important feature of the process of the present invention is the highly selective batch adsorption (step 12 above). It's a process. The crude chymopapain solution is treated with a cation exchange resin (preferably carbomethi Mix in batches of substituted cross-linked textran copolymer and chymopapain fermentation onto the fat It specifically adsorbs elements and leaves impurities in the solution. The supernatant then removes any remaining chymopapa in solution. assayed to determine inactivity. More specific chymopapain enzymes from solution Add more cation exchange resin for adsorption and then re-examine the upper groove. Fallen Io Titration of this bath solution with an exchanger resin reveals the residual activity of chymopapain determined at saturation i1. does not change in the bath solution, that is, the chymopapain enzyme is absorbed by the cation exchange resin. Continue until the available binding sites are nearly saturated.

上清の残余活性がＰＡ製キモパパイン溶液の初期の全活性の約１０％以下、より 好適なのは約５〜２％以下になるまで樹脂を徐々＆Ｌ添加することが有利である 。最適には、初期のキモパパイン活性の少なくとも約２％は俗准に残すべきであ る。The residual activity of the supernatant is approximately 10% or less of the initial total activity of the PA-made chymopapain solution. Advantageously, the resin is added gradually to less than about 5-2%. . Optimally, at least about 2% of the initial chymopapain activity should be left at normal. Ru.

前述の陽イオン父挾樹脂はカルボキシメチル置換架橋テキストラン共亘合体でろ る。カルボキシメチルセファデックス（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　） ！ｊ　）　Ｃ−５０型は待に好ましいが、Ｃ−２５型も満足される。カルボキシ メチルアガロースゲルも満足されるだろうと期侍される。The aforementioned cationic sulfate resin is a carboxymethyl-substituted cross-linked textran conjugate. Ru. Carboxymethyl Sephadex (Pharmacia) ! j) C-50 type is most preferred, but C-25 type is also satisfactory. Carboxy It is anticipated that methyl agarose gels will also be satisfactory.

従来のカラムクロマトグラフ法の工程と一緒にした新規の選択的バッチ吸着過程 は、全ての不純物がカラムを先生に辿ってし１つ単純なカラムタロマドグラフの 手順よりもいくつかの長所を与えることが明らかでろる。不発１男の遇択的成層 過程は実質上混入物のカラム通過を避ける。混入物は１徹イオン父換側脂上に吸 着されないため、カラムを通り抜けない。キモパパイン酵素は選択された樹脂上 に特異的に、優先的に吸着し、前述の滴定工程は不過当な樹脂を糸ｌこ加えると 不純物も吸着されることを確証している。租裂＃累浴漱への樹脂の両足は酵素へ の樹脂の飽和点近くで、超過する前にやめる。飽和点では不純物はその時利用で さる過剰の結合部位に吸着する。A novel selective batch adsorption process combined with traditional column chromatography steps Here is a simple column talomagraph with all impurities traced down the column. It should be clear that this method offers some advantages over the procedure. Selective stratification of the first son who failed The process virtually avoids passage of contaminants through the column. Contaminants are absorbed onto the 1% ionized fat. Because it is not coated, it does not pass through the column. The chymopapain enzyme is placed on the selected resin. The titration process described above will not work if you add a thread of unsuitable resin. It is confirmed that impurities are also adsorbed. The legs of the resin to the fissure #cum bathing to the enzyme near the saturation point of the resin, stop before exceeding it. At the saturation point, impurities are available at that time. adsorbs on excess binding sites.

でれて目的の生成物の回収は最少の混入で最高になりうる。Recovery of the desired product can be maximized with minimal contamination.

この選択的な前光塙の他の利点としては工業的抽出、単離、ｆＲ製をｉＪ籠にす る操作時間の迅速化や規模の拡大が挙げられる。前述の具体例では、充分なカル ボキシメチルデキストランの−Ｉ、Ｌヲギモババイ／酵素とほとんど先金に結合 させるために添加する。これによりイオン交換の効率を最高になるし、不純物を 七の後に作ったカラムに苦労して詰める必要がないので、ずっと速い操作が可能 である。操作時鵠が最終生成物の発熱性物質官省に影曽する因子であり、このパ ラメーターは今回のように静―剤の添加が＃素を不活性化するような場＠′＋ｆ 、に亀裂になることが知られている。表１は内毒素レベルに関して本発明のキモ パパインＢの代表的央例を安約する。Other advantages of this selective Maekohana include industrial extraction, isolation, and the ability to use fR products in iJ cages. These include speeding up operation time and expanding scale. In the specific example above, sufficient cal Boxymethyl dextran -I, L wogi mobabai/enzyme and almost pre-bonded Add to This maximizes the efficiency of ion exchange and eliminates impurities. No need to painstakingly pack columns made after 7, allowing for a much faster operation It is. During operation, the pyrogen content of the final product is a factor that affects the government, and this parameter The parameter is @′+f when the addition of a static agent inactivates the # element as in this case. , is known to cause cracks. Table 1 shows key points of the present invention regarding endotoxin levels. A representative example of papain B is shown.

発熱性？！ｌ買１５ｍｇ酵索 ロット帯号　ロットｉｔ（内毒素単位）０３０８−３０７　７・４グラム　３　 Ｅ、Ｕ・０３０８−２０２　２．４グラム　３０　Ｅ、Ｕ・０３（１７−４００ ４，０グラム　３Ｅ・Ｕ・０３０８−４０８　８．２グラム　３　Ｅ、Ｕ。Pyrogenic? ! l buy 15mg yeast Lot number Lot IT (endotoxin unit) 0308-307 7.4 grams 3 E, U・0308-202 2.4 grams 30 E, U・03 (17-400 4.0 grams 3E・U・0308-408 8.2 grams 3E, U.

０３０８−５０３　３．６グラム　３０　Ｅ、Ｕｔｇ　Ｌｙｓａｔｅ＊　ＬＡＬ 　）　アンシエイツオプケイプコツド（Ａｓ５ｏＣｉａｔｅｓ　ｏｆ　Ｃａｐｓ 　Ｃｏｄ＋　Ｉｎｃ、）ウソズホール（Ｗｏｏｄｓ　Ｈｏ１ｅ　）、マサチュー セッツ（Ｍａａａａｃｈｗｓｇ−ｔ　ｔａ）　） 更に不発明のバッチ滴定法は溶離の前にカラムに不純物を辿す必要を省く几め、 製造規模を容易に増大しつる。0308-503 3.6 grams 30 E, Utg Lysate* LAL ) As5oCiates of Caps Cod+ Inc, Woods Hole, Massachusetts Sets (Maaaachwsg-tta)) Additionally, the inventive batch titration method eliminates the need to trace impurities through the column prior to elution. Manufacturing scale can be easily increased.

キモパパイン酵素は今や１莱的規模で別々に速かに回収することができ、得られ る＃素の均質な純度は他ＶＣ存任している１朶的方法により製造されるものより も着しく良い。The chymopapain enzyme can now be rapidly recovered separately on a one-gallon scale, and the The homogeneous purity of the raw material is higher than that produced by other existing VC methods. It's also nice to wear.

前述の精製手順の欠くことのできない要素はキモパパインＢとキモパパインＣの 最適な充填（工程１２）と回収（工程１３）を達成するのに必要でろる憚準化酵 素活注検足の採用でろる。An essential element of the aforementioned purification procedure is the separation of chymopapain B and chymopapain C. Required leveling fermentation to achieve optimal filling (step 12) and recovery (step 13) I will be hiring for a basic examination of my feet.

キモパパインＢの標準化きれ定置現性のめる９累検定を確立する心安がめった。It was a relief to establish a nine-time test that included the standardized and stationary properties of chymopapain B.

基質としてカゼインを使用する在米の方法はいくつかの理由にニジ不十分であっ た。The American method of using casein as a substrate is inadequate for several reasons. Ta.

第１に、カゼイ／はペプチドの混合物からなる不均質な基質であり、更に各加水 分解開裂により異なった親和力や触媒性パラメーターをもつ新規の異なった基質 を生ずる。このため非直線性速度論は反応速度の再現性の欠除や非直線性を生す る。第２ＶＣ−、カゼインによる検定操作は煩雑で時間を涌買し、反応の連続的 測定ができない。First, casei/casei is a heterogeneous substrate consisting of a mixture of peptides, and each hydrated Novel and different substrates with different affinities and catalytic parameters upon decomposition cleavage will occur. Therefore, nonlinear kinetics leads to lack of reproducibility and nonlinearity in reaction rates. Ru. The second VC-, the assay operation using casein is complicated and time-consuming, and the reaction is continuous. Unable to measure.

第３に、この方法は分当りの形成産物のダのような標準単位で酵素活性を表現で きない。代わりの方法として台底基質ＤＬ−ベンゾイルアルギニン−ｐ−ニトロ アニリド（ＢＡＰＮＡ）を使用した。この基質は均質でろり、加水分解で単−型 の帝を与える。この基質は反応を測光的に測定できるのでより便利で迅速な検定 が可舵である。しかしＥＡＰＮＡ　を用いた以前の測定は基質飽和条件下、すな わち次数Ｏの速度論では実行されない。非飽和条件下では！負濃度のわ丁かな変 化が反応運車に大きな変化を生じ、それゆえ非憚単化ＨＡＰＮＡ測定は再現性を 欠く。更に以前のＢＡＰＮＡ測定は国際＃素単位（μＭ／ｍ１ｔｓ）による活性 表現よりも古風なに値やｐＫ値を用いている。倒えは米国特許第４．３７４．９ ２６号を参照せよ。Third, this method does not allow for the expression of enzyme activity in standard units such as da of products formed per minute. I can't. Alternatively, the platform substrate DL-benzoylarginine-p-nitro Anilide (BAPNA) was used. This substrate is homogeneous and thick, and can be hydrolyzed into a single form. give the emperor of This substrate allows for a more convenient and rapid assay since the reaction can be measured photometrically. is steerable. However, previous measurements using EAPNA were performed under substrate saturation conditions, i.e. That is, it is not carried out with order O kinetics. Under non-saturated conditions! Negative density difference tion causes large changes in the reaction vehicle, and therefore unrestrained single HAPNA measurements have poor reproducibility. lack Furthermore, previous BAPNA measurements were based on the activity in international elementary units (μM/mlts). Old-fashioned values and pK values are used rather than expressions. U.S. Patent No. 4.374.9 See No. 26.

かくてカルボキシメチルテキストランゲルへのキモパパインＢＩ）選択的バッチ 式光填を最善の状態にし、次に形成されたカラムからの裕ｉ＠叡をより良く測定 するためには、酵素活性に最適な条件下、蕪買飽相状態でＢＡＰＮＡ’ｉ用いて 、キモパパインＢの標準的慣定を達成する必要がろった。酵素学の技術に詳しい 人は、このよ５な標準化した検定案を工大する前に、仄のパラメーター）Ｉｒ− 調べて確立しなければならないことを仰っているでろろう。すなわち、最適な検 定条件下のＥＡＰＮＡの加水分解産物の分子吸元係数、＃素のｉ＃Ｌ過ｐＨ，酵 素の活性化の最適条件２よび：ｊｈ／Ｘ飽相曲線飽和る。Thus chymopapain to carboxymethyl text Langer BI) selective batch Optimize the formula light filling and then better measure the yield from the formed column In order to achieve this, BAPNA'i is used under optimal conditions for enzyme activity and in a state of saturation. , it was necessary to achieve standard practice for chymopapain B. Familiar with enzymology techniques Before engineering such a standardized test plan, one should consider the following parameters: Ir- I'm sure you're saying something that needs to be investigated and established. In other words, the optimal Molecular absorption coefficient of hydrolysis product of EAPNA under constant conditions, #element i #L excess pH, fermentation Optimal condition 2 for elemental activation: jh/X saturation curve saturates.

上記吸Ｖ保数は久のようにして確立された。キモパパインがＢＡＰＮＡを加水分 解すると、生成物ｐ−ニトロフェノールは可視領域で元を吸収する。検定条件下 でのこの生成物の分子吸元係数を確立する必要がめる。The above-mentioned V retention was established as described by Hisashi. Kymopapain hydrolyzes BAPNA To understand, the product p-nitrophenol absorbs the original in the visible region. Test conditions It is necessary to establish the molecular absorption coefficient of this product.

ＢＡＰＮＡ’Ｅ：キモパパインＢで元金に加水分解し、ギルフォード（Ｇｉげｏ ｒｄ）モデル２６００分光ｌｊｊ計を用いて可視吸収スペクトルを測定する。図 ４はＥＡＰＮＡとＢＡＰＮＡの加水分Ｎｆｆ１物の内方の吸収スペクトルを示す 。ＢＡＰＮＡの吸収がないので、検定用波長とじて４１０ｎｍが退択埒れた。４ １０％鶏の波長を全ての研究で使用した。０．１０Ｍ　ＢＡＰＮＡ標早牧は１３ ０．４７〜のＢＡＰＮＡ（シグマケミカル（ＳｉｇｒｎａＣんｇｍｉｃａすＣｏ 、、　ＩＪ品４−ｇ４ｉＢ−４８７５、分子量４３４．９　）　ｆ　３．０れた 。この溶成をＤＭＳＯで希釈してｌＵｍＡ（と１ｍＭの貯蔵浴ｅ、を作製した。BAPNA'E: Hydrolyzed into base metal with Kimopapain B, rd) Measure the visible absorption spectrum using a model 2600 spectrometer. figure 4 shows the inner absorption spectrum of the hydrolyzed Nff1 of EAPNA and BAPNA. . Since there is no absorption of BAPNA, 410 nm was chosen as the assay wavelength. 4 The 10% chicken wavelength was used in all studies. 0.10M BAPNA mark Hayamaki is 13 BAPNA of 0.47 ~ (Sigma Chemical Co., Ltd.) ,, IJ product 4-g4iB-4875, molecular weight 434.9) f 3.0 . This solution was diluted with DMSO to create lUmA (and 1 mM stock bath e).

ＢＡＰＮＡが水に容易には各所しないのでＤＭＳＯに溶解する心安がおる。１ｍ Ｍ浴放の一部８検定用後偏漱（０，ＩＭクエン教す）　ＩＪクム。Since BAPNA does not easily dissolve in water, there is no need to worry about it dissolving in DMSO. 1m Part 8 of M bath release after partial test (0, IM Quen teaching) IJ Kum.

０．５倶ＭＥＩ）ＴＡ、３．６〜／−システィン、ｐＨ６，４）を入ｎたセルに 桜し、４１０ｔ％鴨で分′ｊｔ、元度法の苓基線を測定した。次に基質をトリプ シンまたはキモパパインの一部（３０μｔ）を用いて＃素的に加水分解した。全 ての基質が加水分解され、吸収の増加が見られなくなるまで反応を述＠的に測定 した。反応の完了は酵素または恭賀の一部を史に徐加することに工９立証した。0.5 MEI) TA, 3.6 ~/- cysteine, pH 6,4) in a cell. Cherry blossoms were harvested, and 410 t% duck was used for min'jt, and the base line of Gento method was measured. Then try tripping the substrate. A portion (30 μt) of chymopapain was #elementally hydrolyzed. all The reaction is measured visually until all of the substrate has been hydrolyzed and no increase in absorption is observed. did. Completion of the reaction was demonstrated by gradually adding the enzyme or part of the enzyme to the reaction mixture.

表２に衣わした結果は４１０外憔でのＨＡＰＮＡの加水分解産物の平均ｍＡｆ吸 −）を係数が４．８６　ｍＭ−’（ｚ”でろると確立する。The results shown in Table 2 show the average mAf absorption of the hydrolyzate of HAPNA at 410 -) with a coefficient of 4.86 mM-'(z'').

表　２ 内　容　〔ＢＡＰＮＡ３　ΔＡ４１０　ｍＭ−’ｃｍ’１００μｔ　ｏｆ　１ｍ Ｍ　ＢＡＰＮＡ　Ｏ，１ｍＭ　Ｏ，４９２４，９２８７０μＬｏｆ検足用緩衝液 ：３０μＬ　ｏｆ酵素 １００μＬｏｆ　１ｒｒＬＭ　ＥＡＰＮＡ　０．１ｍＡｆ　Ｏ，４８７４，８７ ８７０μｔｏ／検定用緩Ｓｇ。Table 2 Contents [BAPNA3 ΔA410 mM-'cm'100μt of 1m M BAPNA O, 1mM O, 4924, 92870 μLof foot test buffer :30μL of enzyme 100μLof 1rrLM EAPNA 0.1mAf O,4874,87 870 μto/Low Sg for assay.

３０μＬ　ｏｆ酵素 ５０μＬｏｆ１ｒｓ）ｄＢＡＰＮＡ　Ｏ，Ｏ５ｎ５Ｍ　Ｏ，２４０４，８０８７ ０ｆｉｔ　ｏｆ検定用級＠ソ ３０μｔｏｆ酵素 キモパパインＢに最通ｌアＨは久のよりンこして確豆された。キモパパインＢ右 狂は５ｍＭ　ＢＡＰ！０．を用いてｐＨを変数として測定した。全てのインキュ ベーションは上述の０．１Ｍクエン酸ナトリクム検定用緩衝欣中で行なった。図 ５はこの研究結果を示す。全ての研究は検定へのｉ＆通ｐＨとしてｐＨ６，４を 用いた。30μL of enzyme 50μLof1rs) dBAPNA O, O5n5M O, 2404, 8087 0fit of certification grade @ 30μtof enzyme Kimopapain B and IAH were confirmed through Hisano Yorin. Kimopapain B right Madness is 5mM BAP! 0. was used to measure pH as a variable. all incubus The vation was carried out in the 0.1M sodium citrate assay buffer described above. figure 5 shows the results of this study. All studies used pH 6.4 as the i&to pH for the assay. Using.

最適の酵素検定条件：活性化剤システィンは酵素の必須のＳＨ基が還元されたｔ ｌでろることそ確夫にするために含める。ＥＤＴＡは重金属による不ｆ？５性化 を防止するために加える。クエンＭ緩衝奴もそのキレート江のため同じ項目を補 助する。全検定は人間の体温に最も近似している３７°で行なう。化学的髄核分 解へこの酵素は３７°で使用されるはすでｂる。酵素は異なった温度でも検定す ることはできるが、酵素反応速度への＠度の看しい＃書への補正が必要になるで ろろ９゜基質の飽和は次のようにして確豆された：精製キモパパインＢを飽和曲 線の確立に利用した。一定型の＃索を用い、前述の検定用緩衝液中でＨＡＰＮＡ 濃度を変数として検定した。キモパパインＢｔ＆ｌへ（ＤＢＡＰＮＡ＠此の影＃ を水製する結果を表３に報告し、図６に飽和曲線として表わす。Optimal enzyme assay conditions: The activator cysteine is a t-molecule in which the essential SH group of the enzyme has been reduced. I'm including it to make it a certain husband. Is EDTA defective due to heavy metals? Pentasexuality Added to prevent. Quen M buffer guy also supplemented the same item for that chelate river help All assays are performed at 37°, which most closely approximates human body temperature. chemical nucleus pulposus Solution: This enzyme is used at 37°. Enzymes can be assayed at different temperatures. However, it is necessary to make corrections to the enzyme reaction rate. Saturation of the Roro 9° substrate was ensured as follows: Purified chymopapain B was saturated. Used to establish lines. HAPNA in the assay buffer described above using a fixed type Concentration was tested as a variable. To Kimopapain Bt&l (DBAPNA@Kono no Kage # The results are reported in Table 3 and are represented as a saturation curve in Figure 6.

ＣＢＡＰＮＡ〕１姻　ΔＯＤ／倶楕　Ｉ・Ｕ・　１／（ＢＡＰＮＡ）０．２　０ ．００５０　０Ｄ０１０２８８　５　９７２Ｄ１０．５　０．０１１０　０１） ０２２６３４　２　４４１ｆ＋２１、ｏ　θ、０１ｔｉ３　０．００３３５３９ 　１　２９８１６２．０　θ、０３００　０．００６１７２８　（１，５１６２ ，００Ｂ、０　０．０３５８　θ、００７３６６３　Ｕ、３３　１３５−７５４ ．０　０．０４８２　０．００９９１７７　０．２５　１００Ｂ３５．０　θ、 ０４７５　Ｕ、００９７７３７　０．２　１０２３２図７は次式で計鼻して二本 相反ラインウィーバ一一バークプロット（Ｌｉｎｇｗａａｖｇｒ−Ｂｗｒｋ　Ｐ Ｌｏりでこの資料を表わす： 相関＝０．９９９５６ 切片＝７７．９４８ 傾き＝１７９．３８ Ｋ　ｍ　＝　２−３　ｍ　Ｍ ２−３ｍＭというＫｍｉ直は、この濃度のＥＡＰＮＡで反応速度が最大の３’ｌ になることを示す。理想的し亡はＩＯＸＫｍの基質濃度が矢数００速度論を確実 にするために使用され、る。しかし、ＥＡＰＮＡをｐＨ６，４のＶ：、、衝欣で その娘度に俗解することはでさない。最良の妥協として、５ｍＡｆ濃度を酵素の 検定に使用する。０れは基質が１だ可溶性である最高り度である。更に５ｍＭで は反応速度がＶｌ、８に近似するのでＢＡＰＮＡ濃度に２けるわずかな変化は測 定中の速度に２いては小さな変化しか生じない。CBAPNA〕1　ΔOD/〶〶　　I・U・　1/(BAPNA)0.2　0 ．． 0050 0D010288 5 972D10.5 0.0110 01) 022634 2 441f+21, o θ, 01ti3 0.0033539 1 298162.0 θ, 0300 0.0061728 (1,5162 , 00B, 0 0.0358 θ, 0073663 U, 33 135-754 ．． 0 0.0482 0.0099177 0.25 100B35.0 θ, 0475 U, 0097737 0.2 10232 Figure 7 shows two noses calculated using the following formula. Reciprocal Lineweaver-Bwrk plot (Lingwaavgr-Bwrk P Indicate this material with Lo: Correlation = 0.99956 Intercept=77.948 Slope = 179.38 K m = 2-3 m M Kmi direct of 2-3mM is the 3'l which has the maximum reaction rate at this concentration of EAPNA. Indicates that The ideal outcome is that the substrate concentration of IOXKm ensures the arrow number 00 kinetics. used to make and be. However, when EAPNA was exposed to pH 6.4, You can't make any snobbish sense of that girl. The best compromise is to reduce the 5 mAf concentration to Used for testing. 0 is the highest degree to which the substrate is soluble. Another 5mM Since the reaction rate is close to Vl,8, a slight change in BAPNA concentration by 2 cannot be measured. At a constant speed of 2, only small changes occur.

上述の最適条件が確立されるとキモパパインＢ用の標準化された？８現住のめる 酵素検定が考案された。次の浴ｇ、を使用する：検定用緩衝液、ＢＡＰＮＡ貯蔵 浴故、キモパパインＢ浴液。検定用緩衝液は０．１　Ｍクエン酸ナトリウム、３ ．６１ｎ９７−システィ／、０．５ｔｒ＞ＭＥＤＴＡ。Once the above-mentioned optimal conditions were established, it was standardized for chymopapain B? 8 Current residence An enzyme assay was devised. Use the following baths: assay buffer, BAPNA storage. Kimopapain B bath liquid. Assay buffer is 0.1M sodium citrate, 3 ．． 61n97-cysti/, 0.5tr>MEDTA.

ｐＨ６，４である。２９．４１ｐのクエン酸ナトリウム（Ｈａ＠Ｃ６１１＠０１ 　・２Ｈ２０；　Ｍ−Ｗ−＝　２９４．１０　：フィッシャーサイエンティフィ ック（Ｆｉａｈａｒ　Ｓａｓｇｎｔｉｆｉｔ　Ｃｏ、３）を１ｔの蒸留水に溶層 する。３．６９のシスティンと１６８．１１ｎ９のＥＤＴＡ２ナトリウＡｍ　（ Ｍ、Ｗ、＝３３．６２；シグマセミカル（Ｓり雷αＣｈｅ扁１ｃａｒ　Ｃｏ、） 　ｓ　ｈ品番号り′Ｄ２５５）を添加し、俗解するまで撹拌する。１９．２ｇの クエン酸（ｎ、Ｗ、＝１９２．１３　；　、Ｖ　ＣＢマニュファクチャリングケ ミスソ（ＡイａｎｕｆａｅＩｕｒ＄ｔｓｇ　Ｃ入１ｒｎｉａｔｓ）を１ｔの水に 俗解して作った０１Ｍクエン酸でｐＨを６゜４に調整する。Ｂ　Ａ　Ｐ　Ｎ　Ａ 貯戚溶成は１００　ｍＭ　ＨＡＰＮＡのＤＭＳＯ浴准でめる。１３０．４７＋１ １９のＨＡ　Ｐ　Ｎ　Ａ　（、Ｓ（，１４／。The pH is 6.4. 29.41p of sodium citrate (Ha@C611@01 ・2H20; M-W-=294.10: Fisher Scientific (Fiahar Sasgntifit Co, 3) was dissolved in 1 t of distilled water. do. Cystine of 3.69 and EDTA2 Natrium of 168.11n9 ( M, W, = 33.62; Sigma Semical (S Rirai αChe flat 1 car Co,) Add sh product number D255) and stir until mixed. 19.2g Citric acid (n, W, = 192.13;, V CB Manufacturing Co., Ltd. Add miso (A anufae Iur$tsg 1 rniats containing C) to 1 ton of water. Adjust the pH to 6.4 using 01M citric acid. B A P N A The reservoir solution is prepared in a DMSO bath containing 100 mM HAPNA. 130.47+1 19 HA PNA (,S(,14/.

＝４３４．９；ングマケミカル、製品番号Ｂ−４８７５）を３７℃で３．０−の ＤユＳｆ　Ｓ　Ｏ＆こ溶解する。酵木溶成は８〜のキモパパインＢを１．０ｒｎ ｌの蒸留水に溶解して作る。= 434.9; Nguma Chemical, product number B-4875) at 37°C. DyuSf　S　O&ko dissolves. Yeast dissolution contains 8 to 1.0 rn of chymopapain B. Make by dissolving it in 1 liter of distilled water.

標準検建十順を仄に不す：標竿検定手順ではＢＡＰＮＡ碌及は５ｍ＝〜イでめる 。記録用分元元度計を４１０ｎｍ（弓視元諒〕に設定し、温度は３７℃斡一般定 する；９４０μｔの０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ６，４）、３．６〜／− システィン、０−５　ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａと５０μＬの１００ｍＭＢＡＰＮＡ のＤＭＳＯ浴欣を溶成０ｍｌのセル（１０元路長）に入れる。セルの内容￥！ｌ Ｊを混甘し、セルを分元元度紅の内（３７℃）Ｋ入ｎる。もしＢＡＰＮＡが浴液 でなくなった場合は、全てのＢＡＰＮＡを３７℃にしてｆ６液にする。記録計を 作動させ′４基祢をｊｉ　Ａ　Ｐ　Ｎ　Ａの非酵素性カロ水分解のないことを確 認するために決定する。次に１０μｔのキモパパインＢ酵素浴Ｑをセルに加え、 内容物を混合し、＃素泊性を４１０ｎｍで測定し記・録する。Subtly violating the standard Kenken Jujun: In the standard rod inspection procedure, BAPNA success is 5m = ~ A. . The recording wavelength meter was set to 410 nm, and the temperature was set at 37°C. 940μt of 0.1M sodium citrate (pH 6,4), 3.6~/- cysteine, 0-5 mM EDT A and 50 μL of 100 mM BAPNA Place the DMSO bath into a 0 ml cell (10 ml path length). Cell contents ¥! l Mix the J and add the cell to the boiling temperature (37°C). If BAPNA is a bath liquid If it is no longer present, bring all BAPNA to 37°C and use it as an f6 solution. recorder Activate the '4 base to make sure that there is no non-enzymatic carohydrolysis of A.P.N.A. decide to approve. Next, 10 μt of chymopapain B enzyme bath Q was added to the cell. Mix the contents and measure and record the #transparency at 410 nm.

キモババ４７Ｂの１国際酵素率位（ＩＥＵ）は３７℃、ｐＨ６，４でＢＡＰＮＡ 基質の５濯Ｍ浴該から１分当９１μｍｏｌ−のアーニトロフェノールを生成する ＃素置でｂる。Kimobaba 47B's 1 International Enzyme Unit (IEU) is BAPNA at 37℃ and pH 6.4. 91 μmol of arnitrophenol per minute is produced from a 5-M bath of substrate. ＃Brull in plain setting.

憚準化検矩ＶＣシ・ける決定的な性格の東大な特色２工び明日な変更は遅枕釣測 定でろる。キモトリプシン−＼の以前の酵素検定では、不宿性、王女定性および 再現性の問題点が錦織さｎていた。例えは米国時計第２，６７６．１３８号を参 照せよ。本発明は酵素−基質反応の生成物から吸収の増加を連続的に測定すると いう検定法の提示によりこれらの問題を専決する。例えばこの測定法は柿々のキ モパパイン試料が酵素奉賀と反応する前にスルフヒドリル試薬を再び受答して活 性を回復するという変わりやすい速度についての問題を回避する。University of Tokyo characteristics of decisive character that will be used for standardization examination It's fixed. Previous enzymatic assays for chymotrypsin-\ Nishikori had problems with reproducibility. For example, see U.S. Clock No. 2,676.138. Shine on. The present invention continuously measures the increase in absorption from the product of the enzyme-substrate reaction. These issues will be decided exclusively by presenting the verification method called ``. For example, this measurement method Before the mopapain sample reacts with the enzyme Hoga, the sulfhydryl reagent is applied again to activate the mopapain sample. Avoiding problems with the variable speed of sexual recovery.

上記の標卑恢足手順は不発明の好適な其捧例であるが、検定手順は技術の原理に 従って筏々の異なった方法に変更できることは理解されるでろろう。例えはｆｆ １Ｍイオンは検定用緩衝叡や七の混曾物には１１３１富混入していないので、ｈ “Ｄ　Ｔ　Ａや同じようなキレート剤の使用はＭ密に言えは必要ない。しかしＥ ＤＴＡＬ７）ようなキレート剤の添加は、もし金稿イオンが存在する場合Ｖ（− は、その影響を軽減するであろう。Although the above standard procedure is a good example of non-invention, the verification procedure is based on the principles of technology. It will therefore be understood that different methods of rafting can be modified. The analogy is ff Since the 1M ion is not 1131-rich in the assay buffer or the mixture of 7, h “The use of DTA and similar chelating agents is not necessary. However, E Addition of a chelating agent such as DTAL7) can reduce V(- would reduce its impact.

システィンの代わり、またはシスティンと共同で他のスルフヒドリル試薬を使用 することができる。このようなスルフヒドリル試薬としてはジチオスレイトール 、ベーターメルカプトエタノールおよびゲルタナオンが挙げられる。リン酸や酢 酸緩衝液のような一般的に使用されている緩衝液をクエン酸ナトリウムと置換し うるし、約０．２５〜０．０２５　Ｍの範囲の緩衝液濃度も使用できる。Use other sulfhydryl reagents in place of or in conjunction with cysteine can do. Dithiothreitol is an example of such a sulfhydryl reagent. , beta-mercaptoethanol and geltanone. phosphoric acid or vinegar Replace commonly used buffers like acid buffers with sodium citrate Buffer concentrations ranging from about 0.25 to 0.025M can also be used.

キモパパインＢやキモパパインＣに河して種々の基質が酵素活性の尤度測定への 均質で非蛋白質性の尤度基質として有効でめ９うる。ＢＡＰＮＡの他に、０のよ うな基質として次のＬつなものが卒げられるがヤれらに限定芒イするもので：； 、ｔい、Ｎ−アルファーベンゾ４ルーＬ−アルキニンエチルエステル（ＢＡＥＥ ）；Ｎ−フルファーベンノイル−Ｌ−アルギニンメチルエステル：Ｎ−アルファ ーベ／シイルーＤ、Ｌ−アルギニン−ベーターナフチルアミド；Ｎ−アルファー ベンゾイル−Ｄ、Ｌ−アルキニン−バラ−ニトロアミド。ＢＡＰＮＡ目身はキモ パパインの測定に胃効であると他から報告されている。例えば本田特許第４，４ ３９，４２３号を参照ぜ工。Various substrates for chymopapain B and chymopapain C can be used to measure the likelihood of enzymatic activity. It is likely to be effective as a homogeneous, non-proteinaceous substrate. Besides BAPNA, 0's The following L types can be used as substrates, but they are limited to: , t, N-alphabenzo 4-L-alkinine ethyl ester (BAEE ); N-furfurbennoyl-L-arginine methyl ester: N-alpha -Be/Cilu D, L-arginine-beta naphthylamide; N-alpha Benzoyl-D,L-alkynine-bala-nitramide. BAPNA's eyes are disgusting It has been reported by others to have a gastric effect on the measurement of papain. For example, Honda Patent Nos. 4 and 4 See No. 39,423.

ＢＡＰＮＡや他の基質の濃度は約５ｍＡｆが好適であるが、夾質旧にｌＯＸＫｍ ’以下の場合、約５　ｍ　、％ｆよりも低いかまたは向い諌Ｉ！ｊが本発明の標 準化検定手順の実施（こ原則的に有効でろ９、適切ｌ再現性を遅成しつづげるこ とか理解されるであろう。不発明の標準化倹疋の再現性はＢＡＰＮＡの場合で約 ２ＸＫｍ’または５ｍＭで火付された検定で期待式れるものよりも大きいことは 卸らｎている。The concentration of BAPNA and other substrates is preferably about 5 mAf, but the concentration of 'If below, about 5 m, lower than %f or opposite I! j is the mark of the invention Implementation of standardization verification procedures (which may be effective in principle, but can continue to slow down appropriate reproducibility) It will be understood. The reproducibility of uninvented standardization is approximately 2XKm' or greater than what would be expected in an assay ignited at 5mM. There are wholesalers.

キモババ１ン用の上８己の標準恢定手ｊ−はキモパパインＣとして知られている キモパパインのＣ型の測定１こも使用できる。例えば図１を参照せよ。これら２ つの型のキモパパインは過去には他の部名法で呼ばれていた。The upper 8 standard set hand for Kimobaba 1 is known as Kimopapain C. A measurement of chymopapain type C can also be used. See, for example, FIG. These 2 The two types of chymopapains have been called by other names in the past.

酵素検定の一般的ｙＡ埋に従い、キモパパインＥ）４４の上記の憚準検足手順は 温度、容積、圧力２よび反応物の濃度を変えることによって改良されうる。こイ Ｌらのパラメーターならびに他のものの変化は本発明の範囲内にｈるものと考え られる。In accordance with the general practice of enzyme assays, the above preliminary testing procedure for chymopapain E)44 is Improvements can be made by varying temperature, volume, pressure 2 and concentration of reactants. carp Variations in the parameters of L et al. as well as others are considered to be within the scope of this invention. It will be done.

図面の簡単な説明 不出願に祭付図１１１１１を参照として付ける：図１は実施例４に記述したモル 濃度２よび分画番号に河する２　８０　ｎｍに２ける吸収単位による全蛋日黄金 祉（Ｘ−Ｘ）および１ｒｎｔ当りの国際酵素単位で表わした酵素活性（○−○） をプロットしたグラフでろる；図２は実施例２に記述した浴離液分画の１０不ご との酸ポリアクリルアミドゲル上の電気ｖＫ動分析で倚られたゲルプレートでめ る； 図３は脱塩後の典型的な溶離曲線を描いたグラフでろＶ（詳細な侃明の工程１７ を癖照ハ　１−当りの国際単位で表わした＃索活性（○−○）２よび伝４４の機 ｉで衣わした塩濃度（Ｘ−Ｘ）の溶離分画番号に幻するプロットである； 図４は詳細な説明にｄＣ述したＢＡＰＮＡとＢＡＰＮＡの加水分解産物の両方の 吸収スペクトルを示すグラフでろり、波長に河する吸収のプロットで必る；図５ は詳細な説明に記述したキモパパインＢＯａ適ｐＨを決定するグラフであり、ｐ Ｈ１こ刈する国際酵素単位で表わした酵素活性（千単位うのプロットでろる；図 ６は表３に報告されたＢＡＰＮＡ濃度（ｍＭ月こ河して国際酵素単位で表わした 酵素活性（千単位ンをプロットしたグラフでろる； 図７は衣３中の質料の二重相反ラインウイーバー−バ−クブロソト（Ｌｔｎｅｗ ｅａｖａｒ−１１ｕｒｋ　Ｆｒｏｇ　）で必る；そして 図８は実施例６に６己運した４種のキモパパイン活性剤。Brief description of the drawing Reference is made to Figure 11111 in the non-application: Figure 1 shows the mole described in Example 4. Total protein gold by absorption unit at 2 80 nm depending on concentration 2 and fraction number activity (XX) and enzyme activity expressed in international enzyme units per rnt (○-○) Figure 2 is a graph plotting the 10 fractions of the bath separation liquid described in Example 2. Electrical vK dynamic analysis on acid polyacrylamide gels with gel plate Ru; Figure 3 is a graph depicting a typical elution curve after desalting (detailed step 17). # search activity (○-○) 2 and Den 44 machine expressed in international units per 1- This is a plot of the elution fraction number of the salt concentration (X-X) colored by i; Figure 4 shows the results of both BAPNA and BAPNA hydrolysis products mentioned in the detailed description. A graph showing an absorption spectrum, and a plot of absorption over wavelength; Figure 5 is a graph for determining the optimum pH of chymopapain BOa described in the detailed explanation, and p Enzyme activity expressed in international enzyme units (1,000 units); 6 is the BAPNA concentration reported in Table 3 (expressed in mM International Enzyme Units). Enzyme activity (graph plotted in thousands) Figure 7 shows the dual reciprocity of the materials in the batter 3, Lineweaver-Burkebrosoto (Ltnew eavar-11urk Frog); and FIG. 8 shows the four chymopapain activators used in Example 6.

テイスカーゼ■（Ｄｉｓｅａｓｅ■、一番左側う、ケモラー述（Ｃｈｅｍｏｒａ ｓｇ■・圧力）ら２査目ノ、キモジアクチン■（Ｃｈｙｍｏｄｉａｃｔｉｎ■右 から２香ｕ）ｂ−↓び杢％”Ａの精製キモパパインＥ（Ｃにｙｍｏｐａｐａｉｌ Ｂ、−香石側す、の酸ポリアクリルアミドゲル上の電気に動分Ｄｉで得られたゲ ルプレートでめる。Disease■, far left, Chemora sg■・pressure) and the second test, Chymodiactin■ (right) Purified chymopapain E (from C) B. - The gel obtained with the electrodynamic component Di on the acid polyacrylamide gel on the side of Koseki. Get it with Le Plate.

当業者が不発明を１９元分に理解できるように次（こ実施例を示す。これらの実 施例は単に例示の目的で不すものであり、もし添付される請求の範囲に示づれて いないとしても駆足を表わしていると解されるべきではない。In order to help those skilled in the art understand the non-invention, the following (examples are shown). Examples are provided for illustrative purposes only, and if set forth in the appended claims. Even if it is not present, it should not be interpreted as representing a gallop.

不発明の標準化さｎた酵素検定により決定され、〜当りの国際酵素単位（こ０で は”ｓ？＆ｉｔ”として示されるりで表現さ不しる千モババづンＢの酵素活性の 典型的な１舅を以下に示した。Determined by a standardized enzyme assay, the number of international enzyme units per is expressed as "s?&it" and is expressed as "s?&it". A typical calf is shown below.

８ｍ９のケモラーゼ■（ファルモテツタス（Ｐルατｍｏｔ−ｚ＋Ｉｎｃ、　） 、ロット番号０１１５３−３８）を１．ｏ−の蒸留水に浴かした；この酵素浴液 １０μｔを検定した。8m9 Chemolase ■ (Pharmotetutus (Pruατmot-z+Inc, , lot number 01153-38) 1. o-distilled water; this enzyme bath solution 10μt was assayed.

緩衝液（０，１Ｍタエン鼓ナナトリウム３．６〜／−システィン、０．５　ｍＭ 　ＥＤＴＡ、　ｐＨ６，４）を前記に従って調整した。９４０μｔの上述緩衝欣 を本検定に使用した。Buffer (0.1M sodium chloride 3.6~/- cysteine, 0.5mM EDTA, pH 6.4) was adjusted as described above. The above-mentioned buffer of 940μt was used for this test.

ＢＡＰＮＡ貯蔵浴欣（１溶成雷Ｍ　ＢＡＰＮＡのＤＭＳＯ溶液）を前記に従って 調整した。５０μｔの上述ＢＡＰＮＡ貯蔵隘叡を不決定に使用した。Prepare BAPNA storage bath (1 M BAPNA in DMSO solution) as described above. It was adjusted. The 50 μt BAPNA storage chamber described above was used indefinitely.

標準的検定手積８以下に示した。１．０ゴセルに上述の緩衝液とＢＡＦＮＡ浴欣 を入溶成分光光笈計内で３７℃にし、４１０％鴨での零基線を決ｊｌＬだ。次に 上述の酵素浴ｅ、を加えて混合し、３７℃で４１０ｓｎｓの吸収の変化を測定し た。上述の測定された吸収（Ａ）の変化は０．０４４　／　ｍｉ外でめった。The standard test procedure is shown below. Add the above buffer and BAFNA bath to the 1.0 gel. The temperature was set at 37°C in a light meter for dissolved components, and the zero baseline at 410% duck was determined. next Add the above enzyme bath e, mix, and measure the change in absorption at 410 sns at 37°C. Ta. The change in absorption (A) measured above was rarely outside 0.044/mi.

関連した式は Ａ＝吸ｊＬ：、度＝　０．０４４７　ｍｓｘε＝吸元係数”　４．’６６　ｍＭ −’ｃｍ→ｂ＝尤路長 Ｃ−濃度 である。式をｌｉｔき換えると μγ助ｈｓ セル中の最終容積は１−で１Ｌｎｔｔ＝□であるので、μ動ｔｅａ　μ悟ｏ１ｇ ｔｒ （０，００９０５３５、）（１ｍす＝０．００９０５３５−７−　＝ｍ１ｍｓｎ 　ｍａｎ ９．０５３５Ｘ１０”ｕｎｉｔ　０１０μｔのケモラーゼを検定に使用したので 、検定に使用さｎたケモラーゼは（！Ｗ＞（０，０１０ｍ　）＝０．０８〜でろ る。ヤれゆえ９−０５３５Ｘ　ｌ　Ｏ−’　ｕｎｉｔｓ７０．０３Ｉｎ９＝　０ ．１１３　ｘｓ４ｔａ／測足したケ測定−ゼの■ 実施例２゜ 不発明のｆ＃製方法を、出発物質を部分的に精製されたキモパパインを用いた以 下の製造実験で例示する。The related expression is A = absorption jL:, degree = 0.0447 msxε = absorption coefficient” 4.’66 mmM −’cm → b = likelihood path length C-concentration It is. If you change the formula to lit, μγ assistance hs The final volume in the cell is 1- and 1Lntt = □, so μ motion tea μ Go o1g tr (0,0090535,) (1mS=0.0090535-7-=m1msn man 9.0535X10"unit 010μt of chemolase was used for the assay. , the chemolase used for the assay is (!W>(0,010m)=0.08 ~ Ru. Yare Yue 9-0535X l O-’ units70.03In9=0 ．． 113 xs4ta/Measured ke measurement-ze's■ Example 2゜ The uninvented f# production method was further developed using partially purified chymopapain as the starting material. This is illustrated in the manufacturing experiment below.

１００ｙのカルボメチル−デキストランＣＣＭ−セファデツタス井籾子を３ｔの ０，２Ｍ酢欲す）　ＩＪウム緩衝敵、ｐＨ５・Ｏに懸濁させ、４℃で一晩放置し た。翌朝、膨潤したＣＭ−セファテックスは使用する準備かでさた。3t of 100y of carbomethyl-dextran CCM-Sephadets (0.2M vinegar) Suspended in IJum buffer, pH 5・O, and left at 4℃ overnight. Ta. The next morning, the swollen CM-Sephatex was ready for use.

３０ｙの部分的精製されたキモパパイン（シグマ、ロット番号１３Ｆ−８１５５ ）を２６のビーカー中で磁石の撹拌棒を用いて、１．５ｔの０．２Ｍ酢酸す）　 Ｉ）ワム緩備液、ｐＨ５，０に溶かした。生成した粗鋼酵素浴液の一部を実施例 １に記述された手順を用いて、活性を検定すると、１５００ｍｌの全＃索活性は ５２４５国際酵素単位ｌたは３．４９７　ｕ九ｉｔｓ／ｍｌ″″Ｃあると計算て れた。30y partially purified chymopapain (Sigma, lot number 13F-8155 ) in 26 beakers with 1.5 tons of 0.2M acetic acid using a magnetic stirring bar). I) Dissolved in Wham's buffer solution, pH 5.0. Example of a part of the produced crude steel enzyme bath solution When the activity was assayed using the procedure described in 1, the total activity of 1500 ml was It is calculated that there are 5245 international enzyme units l or 3.497 u9its/ml''C. It was.

約１．５ｔの沈殿したＣＭ−セファテックス粒子と７５０−の粗製酵素浴液を一 緒に混合し、ガラス禅で撹拌した。Approximately 1.5 tons of precipitated CM-Sephatex particles and 750-liter crude enzyme bath solution were combined. Mix together and stir with a glass zener.

粒子を沈殿させ、上清の酵素活性を検定すると、活性は認められなかった。When the particles were precipitated and the supernatant was assayed for enzyme activity, no activity was observed.

更に２５０−のｆｆｉ製酵素浴液を添加し撹拌した。ＣＭ−セファテックス粒子 が沈殿した後、上清の一部を検定すると、わずかな酵素活性が認められた。Furthermore, a 250-ml enzyme bath solution manufactured by ffi was added and stirred. CM-Sephatex particles After precipitation, a portion of the supernatant was assayed and a small amount of enzyme activity was observed.

Ｆｕニ約６５０　ｒｄのＣＭ−セファテックスと残ジ１５００ゴの精製＃累溶成 を添加し撹拌した。再び上清を検定すると今度は計算上の全活性の５％以下のわ ずかな＃素泊性が認められた。Purification of approximately 650 rd of Fu CM-Sephatex and 1500 rd residue #Cumulative melting was added and stirred. When the supernatant was assayed again, this time it was less than 5% of the calculated total activity. A slight level of #freedom was observed.

生成したキモバパイ／結合ＣＭ−セファデックスを５ｘｌｏｏαカラムに詰め、 α２Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ５，０によｐｌ、５ｗＬｔ／値算の流速で一晩洗浄した 。The generated Kymovapai/conjugated CM-Sephadex was packed into a 5xloooα column, Washed overnight with α2M acetate buffer, pH 5.0, at a flow rate of 5 wLt/value. .

０．２ＭＰｊび１．ＯＭの酢酸ナトリウム溶液、ｐＨ５，０，４ｔをカラムに詰 め、ｐＨ５，０で０．２→１．ＯＭの浴出准の直線性のイオン強度勾配を作表し た。上述勾配を約４日間かけてカラムに通した。カラムから出てきた浴１１ｔｌ 液を逐統的に２．５−の分画として集めた。0.2MPj and 1. Fill the column with OM sodium acetate solution, pH 5.0, 4t. 0.2 → 1.0 at pH 5.0. Tabulate the linear ionic strength gradient of the OM bath. Ta. The gradient described above was run through the column over approximately 4 days. 11 liters of bath came out of the column The fluid was collected sequentially in 2.5-fractions.

１０本ごとの分画のキモパパイン活性を検定し、酸ポリアクリルアミドゲル上で の［気泳動分析にもかけたＯ不笑験で試験された分画からのゲルプレートを図２ に複写した。キモパパインＢは上部のｉ＋占め、キモパパインＣは高いモル濃度 で俗離する分画での＾見られる下部の＠を占めることを注目すべきでろる。The chymopapain activity of every 10th fraction was assayed and analyzed on an acid polyacrylamide gel. Figure 2 shows a gel plate from the fractions tested in the O2 experiment, which was also subjected to pneumophoresis analysis. Copied to. Kymopapain B occupies the upper i+, and chymopapain C has a high molar concentration It should be noted that ＠ occupies the lower part of ＠ that can be seen in the fraction that separates from common people.

キモパパインＢのみを含む分画（特に分画１５０−２２０による図８に示きれた もの〕をためて凍結乾燥して少谷鼠にした。次にこの濃紬液を蒸留水に河して透 析し、水を４回交換した。生成した透析保持物を凍結乾燥しふわふわした結晶性 キモパパインＢを得た。Fractions containing only chymopapain B (particularly fractions 150-220 shown in Figure 8) I saved up some stuff, freeze-dried it, and made it into Shoya Nezumi. Next, pour this concentrated pongee liquid into distilled water. The water was exchanged four times. Freeze-dry the resulting dialysis retentate to create a fluffy crystalline product. Kimopapain B was obtained.

発熱性物質含量をカブトガニ＾形細胞リザートシエイツオブケイブコソド（Ａｓ ｏｃｉｔｘｔｅｓ　ｏｆ　Ｃａｐｓ　ＣｏｔＬＩｎＣ・へ私誓和２４４、ウソヅ ホール（Ｗｏｏｄｓ　Ｈｏ１ｅ〕、マサチューセソッ（Ｍａｓｓａｃｈｘｓａｔ ｆ←りを用いて検定した。結果は３発熱性物質単位１５Ｉｎ９の結晶性キモパパ インＢの存在を示した。The pyrogenic substance content of horseshoe crab-shaped cell reservoirs of caves ocitxtes of Caps CotLInC・Eshiwa 244, Usozu Woods Ho1e, Massachusetts It was tested using f←ri. The result is a crystalline chymopapa of 3 pyrogen units 15In9 The presence of InB was shown.

実施例８゜ 上記の方法による数回の実験で生成した７、４３の精製キモパパインＢは帆１５ １ｔｎｉｔｓ／ｍｃ）の比活性を持つことが測定さｎた。この７．４ｙの精製キ モパパインＥすなわち１１１０国除酵基準位を化学的髄核分解僚法への使用のた めのケモラーゼ組成物作袈に部付の艮い賦形剤との混合するためロット番号０３ ０Ｍ−３０７としてコンナートラボラトリーズ（Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ）へ送った。Example 8゜ Purified chymopapain B of 7,43 produced in several experiments according to the above method was 15 It was determined to have a specific activity of 1 tnits/mc). This 7.4y refining key Mopapain E, the 1110 national fermentation reference level, for use in chemical pulpolysis methods. Lot number 03 for mixing with the excipients included in the chemolase composition. Connaught Labo as 0M-307 rations, Inc.).

ケモラーゼは椎間数円注射用の無菌の凍結乾燥による蛋白質分解醇系粉禾でろる 。ケモラーゼは６１際酵素単位のキモパパインＢ、３．５〜のＬ−システィン塩 酸塩−水相物あ・よび０．３７＋１１９のシンテイワムエナイテ４トを言んで２ り、配合時（こ１■のメタ亜倣酸す）　ＩＪウムを姉加する。上述の治療１↑う 組成物は実買上ギモバパインＣや他の混入蛋白質との混合のないキモパパインか らなる。Chemolase is a sterile, freeze-dried proteolytic powder for intravertebral injection. . Chemolase has 61 enzyme units of chymopapain B, and 3.5 to 3.5 L-cysteine salts. Say the acid salt-aqueous phase and 0.37 + 119, and say 2. When blending (adding the meta-mimetic acid in this 1), add IJum. Treatment 1 above↑ Is the composition made from purchased kimopapain without mixing with gimovapain C or other contaminant proteins? It will be.

実施例４゜ −１は不発明方法により行なわれた全回収を表わす俗離曲線を不している。モル 塩龜度を糾称に、分画番号を横座標にして酵素活性（国際酵素単位／ゴジ２よび 全蛋白ｆＸ言童（２８０？Ｉｙｎｌこ２ける吸光度〕を縦座標にプロットする。Example 4゜ -1 is the deviation curve representing the total recovery made by the uninvented method. mole Enzyme activity (International Enzyme Unit/Goji 2 and The total protein fX (absorbance at 280?Iynl) is plotted on the ordinate.

最初に俗離してくる大きな蛋白質ピークは蛋臼負分解＃索活性を欠くが、仄ｆこ カラム力）ら俗離した２つの分画は酵素活性を示した。キモパパインＢは第２分 画として約０．６５〜０．７５Ｍの塩濃度（片回は分画１６５〜２２０）でカラ ムから溶離した。キモパパインＣは第３分画として約０．８０〜０．９０Ｍの塩 濃度（片目は分画２３０〜２８０）で溶離した。The first large protein peak that separates lacks negative decomposition activity; Two fractions separated from the column showed enzyme activity. Kimopapain B is the 2nd minute Color with a salt concentration of about 0.65 to 0.75M (fraction 165 to 220 in one run). eluted from the sample. Kymopapain C is a salt of about 0.80-0.90M as the third fraction. concentration (one eye was fraction 230-280).

実施例５゜ 実施例２の典型約手ｊ―で単ｉ＋！きれた楕製キモババイ／の生理化学的性質を 調べた。上述の均負なキモババイ／Ｂはポリアクリルアミドゲルの電気泳動で３ つの接近した関連のるる帝を示した。この３つの帝はＢ、〜Ｂ、と呼ばれている キモパパインＢの３ａ［のザブフオームを表わすことがわかって２り、これらは このジチオール蛋臼質分解酵素上のＳＨ基の酸化状態の違いによるものでおる。Example 5゜ Typical concise move j- in Example 2 makes single i+! Physiological and chemical properties of cut oval Kimobabai/ Examined. The above-mentioned even-negative Kimobabai/B was found to be 3 by polyacrylamide gel electrophoresis. Two closely related Ruru Emperors were shown. These three emperors are called B, ~B. It has been found that they represent the subform of 3a of chymopapain B, and these are This is due to the difference in the oxidation state of the SH group on this dithiol protease.

キモパパインＢ１〜Ｂ、は酸化や還元によって相互文換できる。例えば図８は部 分的に還元された状態（左から２番目、システィン含Ｍ）と部分的に酸化された 状態（−香石側、システィンなし）の両方に２ける精製キモパパインＥ（Ｄｒ′ ｕＬ気激動ゲルを示す。これらの帝はしばしば単一の蛍に合併し、従来技術では キモパパインＥＣｘたはキモパパインｌ）と見なさｎている。Kymopapains B1 to B can be interchanged by oxidation or reduction. For example, Figure 8 shows the section Partially reduced state (second from left, cysteine-containing M) and partially oxidized state Purified chymopapain E (Dr' The uL agitated gel is shown. These emperors often merge into a single firefly, and conventional techniques It is regarded as chymopapain ECx or chymopapain I).

５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルより、不発明のキモパパインＢの分子量は３４ 〜３５ＫＴｈるらしい。我々の最良の計ｆｌｌｌｉ憧は３５，２００でめった。From 5DS-polyacrylamide gel, the molecular weight of uninvented chymopapain B is 34. It seems to be ~35KTh. Our best total was 35,200.

この酵素は率童体である。This enzyme is sterile.

不発明のキモパパインＢの等１ＪＬ点は、かなり塩基性である。′電気泳動や等 電点を焦点とした研究はキモパパインＢ（Ｂ１−Ｂｓ）が見かげ上ｐＩ＝ｔ　０ ．３〜１０．５であることを示している。The equivalent 1JL point of uninvented chymopapain B is quite basic. 'Electrophoresis, etc. Research focusing on electrical points shows that chymopapain B (B1-Bs) has an apparent pI=t0 ．． 3 to 10.5.

不発明のキモパパインＢのＮ−床端分析はまずチロシンを示した。これはキモパ パインＡがＮ−床端グルタミン酸、キモパパインＣはＮ−木端ロイシンを持つこ とを水袋する文献中の発見と一致する。N-bed edge analysis of the uninvented chymopapain B initially showed tyrosine. This is Kimopa Pine A has N-end glutamic acid, and chymopapain C has N-end leucine. This is consistent with findings in the literature regarding water bladders.

本発明のキモパパインＢの２つの代表附試料のアミノ酸組成は従来の技法で決定 された。紹来を弐４に示す。The amino acid composition of two representative samples of chymopapain B of the present invention was determined by conventional techniques. It was done. The introduction is shown in 24.

表　４ アスパラギン酸　２３．７　２３・３　２３スレオニ／１９・８　２０・１　２ ０ セリン　２３．４　２３・４　２３ グルタミン酸　２６．３　２５．７　２６グリシン　３９．２　３８・９　３９ アラニン　１４．１　１２・５　１３ バリン　２１−７　２０．７　２１ メチオニン　１．Ｑ　１．０　１ インロイシン　７・６７・５８ ０イシン　１１．７　１１．３　１１ チロシン　２８．２　２７．４　２７ フエニルアラニン　９．４　９．３　９リジン　２６−１　２６．６　２７ アルギニン　９．１　８．９　９ ヒスチジン　６．５　４．５　５ プロリン　１２．９　１３．２　１３ 番　これらの試料は不研冗やδる論争の諌題でめるシステイン２よびトリプトフ ァンの値を言んでいない。Table 4 Aspartic acid 23.7 23.3 23 Threoni/19.8 20.1 2 0 Serin 23.4 23.4 23 Glutamic acid 26.3 25.7 26 Glycine 39.2 38.9 39 Alanine 14.1 12.5 13 Barin 21-7 20.7 21 Methionine 1. Q　1.0　1 Inleucine 7/67/58 0 Ishin 11.7 11.3 11 Tyrosine 28.2 27.4 27 Phenylalanine 9.4 9.3 9 Lysine 26-1 26.6 27 Arginine 9.1 8.9 9 Histidine 6.5 4.5 5 Proline 12.9 13.2 13 These samples contain cysteine 2 and tryptopol, which are the subject of much controversy. It doesn't say the fan value.

文献に報告さｎたキモパパインＢのＳＨ含量は２〜１１′ＩＡ基の範囲である。The SH content of chymopapain B reported in the literature ranges from 2 to 11'IA groups.

従来トリプトファンは酸加水分解で破壊されるので、正確な決定には問題があり 、通常は別のスペクト・ル分析が必俵である。我々はいくつかの別々の方法によ り完全なトリプトファン分析に真に着手しつつある。Traditionally, tryptophan is destroyed by acid hydrolysis, making accurate determination problematic. , a separate spectrum analysis is usually required. We can do it in several different ways We are now truly embarking on a complete tryptophan analysis.

不発明の方法により製造されたキモパパインＢは我々の方法によって排除され、 治療用組成物に混入していないキモパパインＣ（キモパパイン■とも呼ばれｆＣ ，）トは明らかに区別される。不発明の方法によす単離されたキモパパインＣの 予備的研死はこのモノチオール酵素が単量体であるらしく、またババイアからの 他のチオール蛋白質分解酵素と近似の大きさであるらしいことを示している。こ のキモバパイ／ＣはキモパパインＢよ５も塩基＋１’６す、１０．８付近の２１ を持つ。このキモパパインＣはＢＡＰＮＡ加水分解活注を示活性比活性では、キ モパパインＢよりも速いＢＡＰＮＡ代謝回転を持つ。Chymopapain B produced by the uninvented method is eliminated by our method; Chymopapain C (also called chymopapain■) that is not mixed into therapeutic compositions , ) are clearly distinguished. Chymopapain C isolated by an inventive method Preliminary research suggests that this monothiol enzyme is a monomer, and that This indicates that it appears to be similar in size to other thiol proteinases. child Kimopapain/C is Kimopapain B, 5 is base + 1'6, 21 around 10.8 have. This chymopapain C exhibits BAPNA hydrolysis activity. It has a faster BAPNA turnover than Mopapain B.

４ａ［のキモパパイン組成物を以下の手順による酸性条件下のゲルを気泳動によ り分析した：　Ｊ、Ｍ、メイゼル（Ｍａ　ｉ　ｔ−リ、メンツズインバイロロジ −（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＶｉｒｏｌｏｇｙ）、第５巻、第５章、３ｙ、１７９ 〜２４６（１９７１）。The chymopapain composition of 4a was subjected to gel electrophoresis under acidic conditions according to the following procedure. Analyzed by: J. M. Maisel. -(Methods in Virology), Volume 5, Chapter 5, 3y, 179 ~246 (1971).

結果を図８に表わす。一番左側はテイスカーゼ■（Ｄｉｓｃα８−［Ｆ］爪バク スターートラペノールラボラトリーズ（Ｂａｔｔｅｒ−ＴｒａｖｇｎｏＬ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ八　ロット番号ＡＶＩＳＦ５Ｍ）である。左から２番目は ケモラー（■（Ω−ｍｏ１ａｓ−■）（ロット番号０２１０３１−８Ｊでろり、 実施例の方法よりも入念な実験方法で製造した精製キモババイ／Ｂを示し、Ｌ− システィン塩酸塩−水和物とジンティクムエディティトを含み、添加時にメタ亜 硫酸ナトリウムを混合する。右から２番目はキモジアクチン■（ｃｈｙ毒ｏｃｔ ｔａｃｔｔｎ［Ｆ］ノ　（スミスラボラトリーズ（５ｔｎｉｔｈ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｉｅｓ　）、ロット番号ＢＭ２０１）でるる。そして−香石側は実施例２ の方法で精製されたキモパパインＢの代表的試料でるる。The results are shown in FIG. The leftmost one is Teiscase ■ (Discα8-[F] Tsume Baku Batter-TravgnoL Laboratories (Batter-TravgnoL La boratories lot number AVISF5M). The second from the left is Chemoller (■ (Ω-mo1as-■) (lot number 021031-8J), Purified Kimobabai/B produced by a more elaborate experimental method than the method of the example is shown, and L- Contains cysteine hydrochloride-hydrate and zincicum editite, and when added Mix in the sodium sulfate. The second from the right is Chymodiatin■ (Chy poison oct tacttn[F]ノ (Smith Laboratories (5tnith Labora tories), lot number BM201). And - Koishi side is Example 2 This is a representative sample of chymopapain B purified by the method described above.

テイスカーゼとキモジアクチンはキモパパインＢ（上刃の帝）とＣ（下方の帝） の混合物であるのに対して、不発明の組成物はキモパパインＣの混入していない キモパパインＢ１１−含んでいること（こ注目すべきでろる。Teiscase and chymodiatin are chymopapain B (upper blade emperor) and chymopapain C (lower blade emperor) The uninvented composition contains no chymopapain C. Contains chymopapain B11 (this is noteworthy).

２＆類のキモパパイン組成物：物の毒性２よび抗原性を二１盲検法で比較した。2&class chymopapain compositions: The toxicity and antigenicity of the compounds were compared in a blinded manner.

実施例３で記述した不発明の精製キモパパインＢを混合して製造されたケモラー ゼ■ｍ成物をキモパパイ７Ｅｆ？よびＣの両方を含むキモジアクチン■（スミス ラボラトリーズノと比較した。偽薬を用いない二重盲検関連対照研兜はＦＤＡの 賛助で人間患者での化学的髄核分解を含めてエール大学で行なわれた。参加した 医者も患者も上述の２棟類のキモパパイン組成物のいずれを用いたのかは知らな かった。Chemolar prepared by mixing uninvented purified chymopapain B described in Example 3 Ze■m composition is gross papai 7Ef? Chymodiactin (Smith) containing both C and C Compared to Laboratorino. A double-blind, non-placebo related control study was conducted by the FDA. The research was carried out at Yale University with the support of chemical nuclear dissection in human patients. Participated Neither the doctor nor the patient knew which of the two types of chymopapain compositions mentioned above were used. won.

４３例のうち、多分アレルギ一様反応である不利な反応が１例報告され、次いで キモジアクチン■化合物を注射した。この場合には、参加した医者は全！の皮屑 発珍か製剤（後にキモジアクチン■化合物でろると判明した）の注射後２４〜４ ８時間に生じたと報告した。この記録は罹患した患者が以前にこのような反応の 前歴を持っていたことを示唆する。参加した医者は笑際こｎが桑の反応でろると は納得していないが、キモパパイン注射の後、同様の血清病様の反応が以前医学 文献に報告されて２り、不臨床観察はＦＤＡに報告された。これらの予備的な結 果は、実質上キモパパインＣの混合のないキモパパインＢからなる本発明のｌＢ 規の治療用ｍ放物が多量のキモパパイン酵素を含んだ組成物の注射に相対してい る不利なアレルギー反応の危険を減少させうろことを示している。Of the 43 cases, one adverse reaction, probably an allergic reaction, was reported, followed by Chymodiactin ■ compound was injected. In this case, all the participating doctors! skin dregs 24 to 4 days after injection of a drug preparation (later found to be a chymodiactin compound) It was reported that it occurred within 8 hours. This record indicates that the affected patient has had this reaction before. This suggests that he had a previous history. The participating doctors laughed and said that this was a mulberry reaction. Although I am not convinced, a similar serum sickness-like reaction after chymopapain injection has previously been reported in medical studies. There have been reports in the literature, and non-clinical observations have been reported to the FDA. These preliminary conclusions The result is the lB of the present invention consisting of chymopapain B substantially free of chymopapain C. This therapeutic compound is suitable for injection of compositions containing large amounts of chymopapain enzyme. This has been shown to reduce the risk of adverse allergic reactions.

この示唆は、いかなる型のアレルギー反応の危険を最小にするため、接楕物中へ は最少種類の蛋白質を混合することが責明でろるという一般的な提認を起こす。This suggestion is to minimize the risk of any type of allergic reaction. gives rise to the general proposition that it is responsible to mix a minimum number of proteins.

本発明は特足の具体例に関して記述されたが、更に変更が可能であり、不出願が 、不発明の精神２よび添付される請求の範凹内にある、一般的に不発明原理に従 ったシ、不発明に関係する技術内に位置したシ前に示した不質的特色を用いるよ うな不開示からの新発展を含む不発明のいかなるに更、利用、または応用をも包 含することを意味していると理解されるでろろう。Although the invention has been described with respect to specific embodiments, further modifications are possible and may be avoided. , generally in accordance with the principles of non-invention within the spirit of non-invention and the scope of the appended claims. In order to make use of the above-mentioned innate features located within the technology related to the non-invention, It encompasses any further development, use, or application of the non-invention, including new developments from such non-disclosure. It will be understood that it is meant to include.

ＦＩＧ、　２ 活牲　（単位／ＭＬ） 吸光度 ＦｔＧ。８ 手続補正書（方式） ％式％ １５事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８５１００５５９ ２、発明の名称 精製キモパパインＢ：工業的製法および治療用組成物３、補正をする者 事件との関係　出　願　人 住所 氏　名　シモンズ、ジエームズ・ダブリュー４、代理人 住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６号室 ５、補正命令の日付　昭和６１年　６月１０日　（発送日）６、補正の対象 （θ特許出願人名義変更届 萎倭≠拓許楚 国際！Ｊ！４査報告FIG. 2 Activity (unit/ML) absorbance FtG. 8 Procedural amendment (formality) %formula% Display of 15 incidents PCT/US85100559 2. Name of the invention Purified chymopapain B: industrial production method and therapeutic composition 3, corrector Relationship to the incident: Applicant address Name: Simmons, James W. 4, Agent Address: Room 206, Shin-Otemachi Building, 2-2-1 Otemachi, Chiyoda-ku, Tokyo 5. Date of amendment order: June 10, 1985 (shipment date) 6. Subject of amendment (θ Patent applicant name change notification Withering away≠Takuxuchu international! J! 4th inspection report

Claims (26)

【特許請求の範囲】[Claims] （１）（ａ）上清中の蛋白質分解酵素活性があらかじめ決定された最少レベルに 減少するまで、前記複合溶液に陽イオン交換樹脂を増加しながら混合し蛋白質分 解酵素の全てではなく、いくらかを選択的に吸着し；（ｂ）その樹脂から蛋白質 分解酵素を溶離することを特徴とする、複合溶液からキモパパイン蛋白質分解酵 素を精製する方法。(1) (a) The protease activity in the supernatant reaches a predetermined minimum level. Mix increasing amounts of cation exchange resin into the complex solution until protein content decreases. selectively adsorbs some, but not all, of the degrading enzyme; (b) removes the protein from the resin; Chymopapain proteolytic enzymes from complex solutions characterized by elution of degrading enzymes A method of refining raw materials. （２）複合溶液が粗製キモパパインの水溶液である請求の範囲第１項記載の方法 。(2) The method according to claim 1, wherein the composite solution is an aqueous solution of crude chymopapain. . （３）粗製キモパパインを （ａ）パパイア乳液を含有する水性分散液を作り；（ｂ）前記分散液を遠心分離 し、上清と沈殿を得；（ｃ）工程（ｂ）の上清に４５％硫安になるまで硫安を加 えて上清と沈殿を生ぜしめ； （ｄ）工程（ｃ）の上清を約ｐＨ２．０の酸性にして溶液と沈殿を生ぜしめ； （ｅ）工程（ｄ）の溶液に７５％硫安になるまで硫安を加えて粗製キモパパイン を沈殿させ； （ｆ）沈殿した粗製キモパパインを回収することによりパパイア乳液から単離す る請求の範囲第２項記載の方法。(3) Crude chymopapain (a) making an aqueous dispersion containing papaya emulsion; (b) centrifuging the dispersion; (c) Add ammonium sulfate to the supernatant of step (b) until it becomes 45% ammonium sulfate. to produce a supernatant and a precipitate; (d) acidifying the supernatant of step (c) to about pH 2.0 to form a solution and a precipitate; (e) Add ammonium sulfate to the solution of step (d) until it becomes 75% ammonium sulfate to produce crude chymopapain. precipitate; (f) Isolation from papaya emulsion by collecting precipitated crude chymopapain The method according to claim 2. （４）陽イオン交換樹脂がガルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルア ガロースおよびその類似物のような重合した炭水化物のカルボキシメチル誘導体 である請求の範囲第１項記載の方法。(4) The cation exchange resin is galboxymethyl dextran, carboxymethyl dextran, Carboxymethyl derivatives of polymerized carbohydrates such as galose and its analogs The method according to claim 1. （５）陽イオン交換樹脂がＣＭ−セフアテツクスである請求の範囲第４項記載の 方法。(5) The cation exchange resin according to claim 4, wherein the cation exchange resin is CM-Sephatex. Method. （６）あらかじめ決定された最少蛋白質分解酵素活性が複合溶液に最初に存在し た全蛋白質分解酵素活性の約５％より少なく約２％よりも多い請求の範囲第１項 記載の方法。(6) A predetermined minimum protease activity is initially present in the complex solution. Claim 1: less than about 5% and more than about 2% of the total protease activity Method described. （７）溶離をカラムクロマトグラフイーで実施する請求の範囲第１項記載の方法 。(7) The method according to claim 1, wherein the elution is performed by column chromatography. . （８）溶離を溶出剤の直線性イオン強度勾配で実施する請求の範囲第１項記載の 方法。(8) The method according to claim 1, wherein the elution is performed using a linear ionic strength gradient of the eluent. Method. （９）溶離を０．２〜１．０Ｍ（ｐＨ５．０）の酢酸ナトリウムの直線性勾配で 達成する請求の範囲第８項記載の方法。(9) Elute with a linear gradient of 0.2-1.0M (pH 5.0) sodium acetate. 9. A method according to claim 8, which achieves. （１０）キモパパインＢをキモパパインＣから別々に回収する請求の範囲第１項 記載の方法。(10) Claim 1, in which chymopapain B is separately recovered from chymopapain C. Method described. （１１）本質的に、請求の範囲第１項記載の方法で生成した純粋なキモパパイン Ｂからなる組成物。(11) Essentially pure chymopapain produced by the method according to claim 1. A composition consisting of B. （１２）本質的に、請求の範囲第１項記載の方法で生成した純粋なキモパパイン Ｃからなる組成物。(12) Essentially pure chymopapain produced by the method according to claim 1. A composition consisting of C. （１３）本質的に、キモパパインＣを含まずキモパパインＢからなる治療用組成 物。(13) A therapeutic composition consisting essentially of chymopapain B without chymopapain C thing. （１４）適切な製薬賦形剤と混合した請求の範囲第１３項記載の治療用組成物。(14) The therapeutic composition of claim 13 in admixture with suitable pharmaceutical excipients. （１５）システノンおよびジソデイウムエデイテイトと混合した請求の範囲第１ ４項記載の治療用組成物。(15) Claim 1 mixed with cystenone and disodium editate The therapeutic composition according to item 4. （１６）二亜硫酸ナトリウムと混合した請求の範囲第１５項記載の治療用組成物 。(16) The therapeutic composition according to claim 15 mixed with sodium disulfite. . （１７）（ａ）（１）スルフヒドリル試薬および（２）均質な光度測定用基質を 含有する適当量の緩衝液を作り、（ｂ）前記緩衝液を充分なキモパパインと接触 させて検出可能な光度変化を起させ、 （ｃ）前記光度変化を該変化が生じるままに連続的に監視するという工程からな るキモパパインの酵素検定法。(17) (a) (1) sulfhydryl reagent and (2) homogeneous photometric substrate (b) contacting said buffer with sufficient chymopapain; to cause a detectable change in luminosity, (c) The step of continuously monitoring the light intensity change as it occurs; An enzyme assay method for chymopapain. （１８）前記キモパパインがキモパパインＢである請求の範囲第１７項記載の酵 素検定法。(18) The enzyme according to claim 17, wherein the chymopapain is chymopapain B. Basic test method. （１９）前記基質がＢＡＰＮＡである請求の範囲第１８項記載の酵素検定法。(19) The enzyme assay method according to claim 18, wherein the substrate is BAPNA. （２０）前記緩衝液が約０．０２５〜０．２５Ｍのモル濃度のクエン酸ナトリウ ムである請求の範囲第１８項記載の酵素検定法。(20) The buffer solution is sodium citrate with a molar concentration of about 0.025 to 0.25M. 19. The enzyme assay method according to claim 18, which is （２１）前記クエン酸ナトリウム緩衝液が約０．１Ｍのモル濃度である請求の範 囲第２０項記載の酵素検定法。(21) The sodium citrate buffer has a molar concentration of about 0.1M. Enzyme assay method according to item 20. （２２）前記緩衝液がキレート化剤を含有する請求の範囲第１８項記載の酵素検 定法。(22) The enzyme test according to claim 18, wherein the buffer solution contains a chelating agent. Statutory law. （２３）前記スルフヒドリル試薬がシステイン、べーターメルカプトエタノール またはグルタチオンである請求の範囲第１８項記載の酵素検定法。(23) The sulfhydryl reagent is cysteine, betamercaptoethanol or glutathione, the enzyme assay method according to claim 18. （２４）前記スルフヒドリル試薬がシステインである請求の範囲第２３項記載の 酵素検定法。(24) Claim 23, wherein the sulfhydryl reagent is cysteine. Enzyme assay method. （２５）前記光度変化を約４１０ｎｍで監視する請求の範囲第１９項の酵素検定 法。(25) The enzyme assay according to claim 19, wherein the light intensity change is monitored at about 410 nm. Law. （２６）（ａ）約３．６ｍｇ／ｍｌのシステイン、約０．５ｍＭのＥＤＴＡおよ び約５ｍＭのＢＡＰＮＡを含んだ約ｐＨ６．４の約０．１Ｍクエン酸ナトリウム 緩衝液を適当量作り、この緩衝液を３７℃に平衡させ； （ｂ）前記緩衝液を充分なキモパパインＢと接触させ、約４１０ｎｍでの吸光度 を検出可能な程度に増加させ；（ｃ）４１０ｎｍでの吸光度の前記増加を該増加 が生じるままに連続的に監視する工程からなるキモパパインＢの酵素検定発明の 詳細な説明(26) (a) About 3.6 mg/ml cysteine, about 0.5 mM EDTA and and about 0.1M sodium citrate at about pH 6.4 containing about 5mM BAPNA. Make an appropriate amount of buffer solution and equilibrate this buffer solution to 37°C; (b) Contacting the buffer with sufficient chymopapain B to obtain an absorbance at about 410 nm. (c) detectably increasing the absorbance at 410 nm; This invention is based on an enzyme assay for chymopapain B that consists of a step of continuously monitoring as it occurs. detailed description
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2193720B (en) * 1986-08-15 1990-09-19 Agricultural & Food Res Payaya proteinase b separation and uses
GB8909836D0 (en) * 1989-04-28 1989-06-14 Boots Co Plc Therapeutic agent
CN114054301B (en) * 2021-12-27 2022-06-24 南通世睿电力科技有限公司 Construction process of acrylic acid adhesive for plugging of power equipment under low-temperature condition

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3412150A (en) * 1965-01-15 1968-11-19 Navy Usa Nalpha-benzoyl arginine p-nitroanilide hydrochloride
US3558433A (en) * 1967-11-07 1971-01-26 Baxter Laboratories Inc Process for purification of chymopapain
US3623955A (en) * 1968-08-14 1971-11-30 Monsanto Co Purification and recovery of alkaline protease using cationic-exchange resin
FR2093139A5 (en) * 1970-06-03 1972-01-28 Roussel Uclaf
YU40433B (en) * 1975-02-20 1986-02-28 Lek Tovarna Farmacevtskih Process for obtaining pure, proteolytically active anzymes
US4086139A (en) * 1976-04-09 1978-04-25 Gb Fermentation Industries Inc. Differential inactivation of amylase in amylase-protease mixtures
US4390628A (en) * 1979-05-17 1983-06-28 De Forenede Bryggerier A/S Process for isolating Cu, Zn-superoxide dismutase from aqueous solutions containing said enzyme together with accompanying proteins
DE3278934D1 (en) * 1981-05-13 1988-09-29 Flint Lab Inc Improved chymopapain and method for its production and use

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