JPS61500688A - 核酸の交雑検定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は特異な核酸塩基配列の同定用プローブ（ｐｒｏｂｅｓ）に関するもので あり、さらに限定すれば単ストランドの相補的配列上の特異なりＮＡおよび／又 はＲＮＡ配列の位置をきめるための相補的ＤＮＡ及び／又はＲＮＡプローブに関 するものである。

背景技術 ＤＮＡ組み換え技術の応用は分子診断学の分野で有力な方法として着目されてい る。例えばビールスやバクテリアのゲノムや哺乳動物の染色体における遺伝的欠 損に対する検出用のＤＮＡおよびＲＮＡ分子分子−ロープ発が現在の免疫化学的 方法に入れかわる可能性がある。

非培養法によって特殊なビールスやバクテリアその他の生物の存在を決定しモし て／又は特異なゲノム部位の存在を検出して哺乳動物細胞中の遺伝学的欠損を決 定することがロス他のＰｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、米国、６９ 巻２６４頁（１９７２年）での発表、ハリソン他のネーチャー、ロンドン版、２ ３９巻２１９頁（１９７２年）での発表、サリパン他のジャーナルバイオロジカ ルケミストリイ（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）　２４８巻７５３０頁（１ ９７３年）での発表、およびサザンのＪ、　Ｍｏ１．　Ｂ１１１．、９８巻５０ ３頁（１９７５年）での発表の方法によって可能となった。

この場合に、例えば特殊なビールスからのＤＮＡ又はＲＮＡあるいは哺乳動物細 胞からのＤＮＡがＤＮＡを特異なヌクレオチド配列の所で切断し、より小さい断 片にする制限酵素エンドヌクレアーゼによって消化（ｄｉｇｅｓｔ　）される。

この断片はゲル電気泳動法および核酸断片を吸収する層状ケ゛ルフィルターを使 用して分子量により分離される。

このフィルターには研究対象の遺伝子の近くのケ゛ツム部位と相補性のある塩基 配列を持った単ストランドＤＮＡ又はＲＮＡからなる放射線で標識付けしたプロ ーブ（通常リン−３２（５２ｐ））が埋め込んである（　１ｎｃｕｂａｔｅ　） 。このプローブは相補性のある核酸配列を含んだ断片とだけ交雑を起す。そして この交雑は自動放射線写真法によって検出される。自動放射線写真上の交雑核酸 バンド形状の存在によって特殊なビールス又はバクテリアのゲノムの存在、又は 例えば哺乳動物染色体遺伝子の欠損が示される。

核酸プローブの標識として５２ｐの核種を使うのは多（の理由で望ましいことで はない。第一に３２ｐの半減期は１４．５日と言う比較的短いものである。その ために、交雑の操作を行う直前に相補ＤＮＡプローブを造らねばならない。第二 に５２ｐの崩壊エネルギーが大きいため操作上の困難さがあり又危険を生じるの で望ましいものでない。

従って大抵の場合、危険性が少（プローブの保存寿命が長くなる標識を使うのが 得策である。比活性の大きいトリチウムを標識にしたプローブが１つの代案とし て考えられる。自動放射線写真法で検出する従来の交雑法では長時間の曝露を必 要としたのでトリチウムは一般的に有用とは考えられて来なかったが液体シンチ レーション計数法を使って標識プローブを検出する溶液法は高感度であり望まし いものである。５２ｐよりエネルギー的に少なくかつ長い半減期の別のアイソト ープはカーボン−１４である。

核酸プローブの非放射性標識の開発によって別の代案が得られる。最も高感度の ＤＮＡ非放射性標識方法の１つがランガー他によってＰｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、米国７８巻、６６３３頁（１９７８年）に記載されている。

この方法はニックトランスレーション法によってビオチン化デオキシウリジン三 リン酸をＤＮＡプローブに組み込むことが基本になっている。この結果得られる ビオチン化ＤＮＡプローブは安定であり、ビオチン化しないＤＮＡプローブのよ うな挙動をする。ビオチン化ＤＮＡの検出は固定化（ｆｉｘｅｄ）細胞内又は正 常部位交雑後の組織内の特異なりＮＡおよびＲＮＡ配列の検出に適用されている し、またゲル電気泳動法とニトロセルローズフィルターへの転移によって分離し たＤＮＡ断片の雑種形成における特異なりＮＡおよびＲＮＡ配列の検出にも適用 されている。交雑ビオチン化プローブの検出は蛍光抗体技術又は酵素増巾技術に よって行われる。これ等の技術はガードナーによってバイオテクニックス、１巻 、３８頁（１９８３年）に、またレウイ７　（Ｌｅｗｉｎ）によってサイエンス ２２１巻１１６７頁（１９８３年）にさらに詳しく述べられている。

今までに記載されている他の非放射性の方法ではテトラメチルローダミン又はフ ルオレスセインイソチオシアネートの様な蛍光性の分子を単ストランドのＲＮＡ の３′−末端に結合させることを包含している。これ等の蛍光性ＲＮＡプローブ は細胞化学的交雑に応用されており、バウマン（Ｂａｕｍａｎ　）他雑誌組識化 学及び細胞化学、２９巻、２２７〜２５８頁（１９８１年）に記載している。

本発明の開示 本発明は単ストランドの目的ポリヌクレオチド上の特異なりＮＡおよびＲＮＡ塩 基配列の存在を決定する方法および試薬を提供するものである。この方法と試薬 を適用すればバクテリアやビールスの特異なゲノムの検出が可能になるし哺乳動 物の染色体における何らかの欠損も検出できる。この方法には２価の架橋分子が 共有結合して組み込まれた特異な単ストランドのリボ核酸又はデオキシリボ核酸 分子の製造法が含まれる。この組み込みは架橋分子がプローブにとっては目的物 であるバクテリア、ビールス又は哺乳動物の染色体の核酸にさらに付加できる力 を残しているように行われる。

単ストランドのＤＮＡ又はＲＮＡプロニブはその核酸塩基配列がバクテリア、ビ ールス又は哺乳動物の染色体の目的配列の独特の部位と相補的であるように設計 される。

例えば血液、組織、細胞サンプルからの核酸はそのプローブと目的物との交雑が 起る条件の下でプローブと反応する。交雑の後で、サンプルは光化学的又は化学 的処理を受け、それによってプローブと目的物相補的配列との架橋が起こる。も し目的染色体配列が無い時、その時はプローブの架橋は起こらない。場合によっ ては、プローブが目的物に交雑する時に２価架橋試薬の両方の反応が進むことが ある。

架橋に続いて、単ストランドのプローブと２本ストランド（ｄｏｕｂｌｅ　５ｔ ｒａｎｃｌｅｄ）のプローブ−目的複合体を分けるいくつかの方法の中の１つを 使って、未架橋プローブを共有的に架橋して（・るプローブ−目的物複合体から 分離する。その方法には、ゲル濾過、水酸化リン酸カルシウム（ｈｙｄｒｏｘｙ ｌ　ａｐａｔｉｔｅ）クロマトグラフィー、酵素消化、アルカリ性加水分解、未 架橋の架橋用分子の光回復現象又は化学的回復現象（ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｒｅｖ ｅｒｓａｌ　）が例として含まれる。

架橋した雑種の存在は、ビールス、バクテリア又は哺乳動物の特異な染色体目的 物の存在を診断するのに役立つ。通常目的物雑種の検出はプローブに結合してい る架橋分子に、放射性又は非放射性の標識を組み込むことによって行われる。場 合によっては、標識は目的物の中として、プローブの中にも組み込まれる。標識 が、プローブの単一付加物となっている架橋分子のみと結合しているので極めて 低い濃度の核酸塩基配列の存在を決定するのに極めて高感度の方法が得られる。

目的ケ゛ツムがない時、標識は全部単ストランドプローブと結合したまへ残る。

目的ゲノムがある時は標識を含んだ試薬は架橋されてその結果変性の出来ない２ 本ストランドの雑種構造となる。この２種類の核酸を完全に分離すると、２本ス トランドの形の中の標識の有無に基づいて目的ゲノムの有無を明らかに決定する ことが可能になる。

普通は、交雑工程と架橋工程は溶液中で行われ、電気泳動ゲル分離法又は吸い取 り法を必要としない。この方法は取扱い方法が簡単であり高感度で基底値（ｂａ ｃｋｇｒｏｕｎａ　）が低いので他の交雑測定法より明らかに有利である。この 架橋方法を雑種の安定化を行う正常部位交雑や他の方法に適用すると取扱い手順 が簡単になりかつ感度が増大する。

本発明の最良の実施形態 本発明はある既知の塩基配列を持つ目的ＤＮＡ又はＲＮＡと、単一付加物の標識 架橋性化合物を含有していて目的ＤＮＡ又はＲＮＡに対し相補性のあるポリヌク レオチドプローブとを交雑し例えば光化学又は化学的な技術を用いて架橋させて 極く低濃度の特異な核酸塩基配列の存在を決定する方法と試薬を提供するもので ある。

に調製された塩基が１０〜２００の長さのＤＮＡ又はＲＮＡ　：Ｉ？リヌクレオ チドかメツセンジャーＲＮＡおよび単ストランドのＤＮＡ又はＲＮＡゲノムを含 めたより長い単ストランドの配列から構成される。標識された架橋分子は、適切 に修飾されたヌクレシド又はヌクレオチド誘導体を使って合成する時に合成、＋ ６　リヌクレオチドの中に直接組み込むことができる。別の方法として、標識さ れた架橋分子は光化学的又は化学的率−付刃口によってプローブ上に導入するこ とができる。普通、架橋分子が標識を持っていて次の検出が可能になるがその標 識を直接核酸プローブ又は目的物上に付けることもできる。

交雑では通常単一付加プローブが大過剰にある所で目的ＤＮＡ又はＲＮＡの変成 を行う。復元後交雑したプローブは光化学的に、又は化学的に目的ＤＮＡ又はＲ ＮＡと架橋する。この架橋によって、従来は交雑したプローブもかなりロスにな っていた変性条件で目的ＤＮＡ又はＲＮＡから遊離のプローブを除去できるよう になる。この方法によると、基底値が非常に低くなり従って高感度が得られる。

交雑し、架橋したプローブから遊離のプローブを分離するのに数種の操作法が使 用できる。第１の方法は変性条件において適当な分子量決定用のカラムを使った 交雑反応混合物のゲル濾過である。第２の方法は交雑反応混合物（これは遊離プ ローブと大量の目的核酸も含有している）中の単ストランド核酸を全部酵素消化 し続いて交雑プローブ（これは２本ストランドになっている）を回収するもので ある。消化は例えばヌクレアーゼ８１、ヤエナリのヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ Ｂａ１３１、エクソヌクレアーゼ■又はＴ４　ＤＮＡ　＃？リメラーゼを使って 行うことができる。

２本ストランド核酸は例えば水酸化リン酸カルシウムかにンゾイルナフトイルジ エチルアミノエチルセルローズ（ＢＮＤセルローズ）を使ったクロマトグラフィ ー又は酸による沈澱とガラスファイバーのフィルター上での捕集によつて回収で きる。

第５の技術は単独で、又は上記の操作法と組み合わせて使えるものであるが遊離 ゾロープ上の単一付加架橋用分子の光回復現象又は化学的回復現象と、例えばゲ ル濾過、エタノール沈澱、又は酸沈澱による分離を行うものである。目的ＤＮＡ 又はＲＮＡと結合した架橋したプローブ分子は此の条件では光学的に逆転したり 化学的に逆転したりしない。この技術によると、標識が普通架橋分子上に含まれ ているから基底値が減少する。

第４の単離技術は目的ＤＮＡの存在下におけるＲＮＡプローブに適用できるもの であるがこの技術では、例えば全ＲＮＡを酵素消化又はアルカリ性加水分解して 遊離のヌクレオモノリン酸塩にしてその後、目的ＤＮＡを例えばゲル濾過、エタ ノール沈澱、又は酸濾過によって回収することができる。この方法では目的ＤＮ Ａと共有的に結合したもの以外は全ての標識付き架橋分子は取り除かれる。

第５の単離技術ではプローブと例えばシリカ又は制御孔ガラスのような固体担持 体との化学結合を利用できる。

交雑したプローブの検出は交雑、光化学的又は化学的架橋、遊離プローブの除去 の後に架橋分子上の標識を測定することにより行なわれる。架橋分子上の特別な 標識には例えば陽子をトリチウム、炭素−１４又は他の放射性原子で置き換えて 導入した放射性核種があり、又は架橋分子に連鎖場所を与えるために連鎖基で修 飾した配位子類似体がある。配位子や連鎖基があると、それは放射性核種で標識 付けした微量の分子や、発色性分子、蛍光性分子、発光性分子、又は帯磁粒子を その配位子又は連鎖基に付けることができるような化学的特性又は機能を持つこ とができる。配位子は抗体分子が配位子の所に引き出されるように、受容分子を 引き出すような化学的特性を持つことができる。受容分子は放射性核種、発色性 、蛍光性、発光性染料分子や帯磁粒子又は適当な基質の中で発色性、蛍光性、お よび／又は発光性の生産物を造る能力のある酵素系と複合的に結合できる。

標識の定量には多くの方法又は処理手順が使用できる。

その中に例えば放射線免疫検定法（Ｒ工Ａ）、免疫放射検定法（工ＲＭＡ）、サ ンドウィッチＩＲＭＡ　１蛍光免疫検定法（ＦＩＡ）　、化学発光検定法、生物 発光検定法および酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬ工ＳＡ）を特に挙げることがで きる。

固有の塩基配列が判明している特別な目的ＤＮＡ又はＲＮＡを目的物とする。単 −付加物のような標識付き架橋分子を含みかつ目的物に相補的な塩基配列を持つ 特別のポリヌクレオチドをプローブとする。プリンとピリミジン塩基間の氷菓結 合による塩基対合の機構によって目的物と相補的プローブポリヌクレオチドの両 者を結びつけることを交雑と呼びその結果得られた複合体を雑種と名交雑測定用 の架橋剤はプローブ分子と目的ゲノムな共有的に架橋する２価の分子であればど れでもよい。一般に架橋剤はプローブの分子と単一付加物を造り、一方光励起に よって目的ゲノムと共有結合する光化学的付応残査を残している２価の感光性試 薬で良い。場合によると架橋分子は化学的と光化学的結合性を交えた２価の試薬 であってもよい。そしてこれは光化学的にではなくアルキル化、縮合又は付加の 化学反応によってプローブ分子又はプローブ修飾分子と結合し、次に目的ゲノム 又は修飾された目的ケ゛ツムと光化学結合を起こすものである。交雑後触媒を使 うか高温にして活性化される２価の化学的架橋分子もまた使用されてよい。

２価の感光性試薬の例として、フロクマリン、ペンゾジピロンおよびビスアジド エチジウム臭化物のようなビスアジドがある。化学的結合の半面と光化学的結合 の半面の両方を備えた２価の混合試薬の例にはハロアルキル−フロクマリン、ハ ロアルキルベ／ゾジピロン、ハロアルキル−クマリンおよび各種のアジドヌクレ オシド三リン酸がある。

架橋剤は普通法の活性面の中のどれかを持っている。

ここでＲ１からＲ６までは例えばＨＩＣＨｓ、ｃＨ２ｃｉ、ＣＨ２Ｂｒ。

［Ｈ２Ｎ、ＣＨ２０Ｈ，ＣＨ２００Ｈ３、ＤＨ２ＮＨ２、ｎ３ｃｏｏＨ，ｃｏｏ ｃｂ、Ｃ００ＣＨ２ＣＨ３、ＮＨ２、Ｎ０２、ＣＦ３、Ｃ（［５、ＣＨ（ＣＨ３ ）２、ｃ（ｃＨ３）３、Ｃ２、Ｂｒ、　Ｉ、Ｆで構成される群から選ばれるもの である。

直鎖７０クマリン（プソラレン）が交雑検定用の２価の化学的、又は光化学的試 薬の実際例である。プソラレンの構造（１）（すなわちこ〜ではＲ１＝Ｒ２＝Ｒ ３＝Ｒ４＝Ｒ５＝Ｒ６＝Ｈ）を上に示している。自然に発生しかつ潜在的に有用 なプソラＶノには８−メトキシプソラレン（すなわちＲ１，Ｒ５−Ｈ；Ｒ６＝Ｏ ＣＩ（３）、５−メトキシゾソラレン（すなわち、Ｒ１＝Ｒ２＝Ｒ４ツＲ５＝Ｒ ６＝Ｈ：　Ｒ３＝ＯＣＨ！！　）、および４　、５’、　８−トリメチルプンラ レン（すなわちＲ１÷Ｒ５＝Ｒ４＝Ｈ：　Ｒ２＝Ｒ５＝Ｒ６＝ＣＨｘ　）がある 。これ等に加えて、天然に発生する他のプソラレンが３０から４０種報告されて おりその中の多くのものは本発明を実施するのに有用である。

ＤＮＡと有効に架橋を造るプソラレンはどれでも交雑検定に使用できる。多くの 種類のプンラレ／の合成は現在では簡単であり新しい化合物が容易に製造される 。プソラレンの置換基の形を変えたり位置を変えると核酸との反応の各段階で驚 くべき効果がある。〔アイザークス他、イントレ／ズ、インフォトバイオロジイ 　ヘＶンほか、ｃｄｓ、。

２７９頁（１９８２年）〕。溶解度、光化学的、又は熱的安定性、ＤＮＡに対す る暗結合親和性、　ＤＮＡに対する光化学的又は熱的結合速度、光化学的付加反 応の量子収量、生成される付加生成物の型（例えばプソラレンの場合、フラン側 か、ピロン側か）および架橋形成範囲等の／ξミラメーター全て合成法の設計、 エネルギー活性化中の緩衝条件および照射の場合は使用する光の強さや波長を組 み合わせることによって容易に制御できる。

プソラレンは交雑検定に必要な鍵要素を含有しているが、他の試薬も使用可能で ある。例えばシスーベンゾジピロン（２）ヤトランスーベンゾジピロン（３）は 共に可能な核酸架橋剤である。両化合物共、溶液中のピリミジン塩基およびある 種の枯草菌株中の光誘導−突然変異に対し反応性がある〔バーター他、フォトケ ミストリイ及びフォトバイオフ２４２０巻、４０７〜４１３頁（１９７４年）〕 。別の方法では光励起硝酸カリ中間体を経由して架橋プローブと目的物を受容し 得るポリヌクレオチドプローブ中にアジド置換塩基を組み込んだプローブを使用 する。このようなアジドアデノシン化合物は製造されている。他のアジド型に修 飾した塩基でポリヌクレオチドに組み込んだものは通常の熟線化学者なら調製可 能である。

放射線標識の架橋剤 一般に、放射線で標識付けた架橋剤はトリチウム、カーボン−１４、又は他の放 射活性原子を構造に組みこまれるという化学的合成により製造される。比活性の 高い放射線標識架橋剤は交雑検定法に望ましいと考えられており、又その方法の 最終の感度を決定するものである。例えば放射線標識プンラレンを製造するのに 開発された合に利用できる。標識付けする架橋剤の特徴に基いてそれぞれ特別な 方法が用いられる。

ゾンラＶンの様な標識付き試薬の製造用に開発された合成手順には基本的に２つ の型がある：　（１）　）　ＩＪチウムガス又はＨＴＯとの交換反応であってこ の方法では比活性の比較的低い無作為標識のプソラレンが得られる。（２）標識 付きアルキルハライドによるアルキル化、三重水素化ホウ素ナトリウムによる還 元、トリチウムガスによる触媒還元又はトリチウムガスによる水素化分解によっ てカーボン−１４又はトリチウムの何れかの場所指定組み込みを行う。場所指定 標識材プソラレンには交換法で製造したプソラレンより一般にずっと高い比活性 がある。

分子内の既知の場所にアイソトープを組み込んだ比活性の高いプソランンを得る のに４つの方法が用いられてきた〔アイザクス他ジャーナル　ラベルド　コンバ クノドアンド　ラジオファーマシューテイカルズ（、Ｔ、　Ｌａｖｅｌｅｄ　Ｃ ０ｎｐｏｕｎｄＳ＆　Ｒａｄｌｏｐｈａｒｍａｃａｕｔｉｃａｌｓ）第１９巻、 ３４５頁（１９８２年）；アイザクス他国際癌学会（Ｊ、　Ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａ ｔｉｏｎａｌ　工ｎ５ｔｉｔｕｔｅ）、（１９８３年）刊行物〕 （Ａ）　カーボン−１４又はトリチウム標識のアルキルノ・ライドによるアルキ ル化 一メトキシ〕プソラレンは両方とも脱メチル化反応による相当−ｊるフェノール への転換およびそれに続りトリチウム標識ヨウ化メチルによるアルキル化によっ て合成される。これ等化合物の比活性はミリモル当り２から３キユリーであった 。類似のカーボン−１４標識の８−ＭｏＰと５−ＭｏＰもまたカーボン−１４標 識のヨウ化メチルを使って製造される。この方法は脱アルキル化に続いて標識付 きアルキルハライドによる再アルキレーションを行つのに適した置換基のあるプ ンラレン誘導体に適用できる。

０３）　三重水素化ホウ素ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ　Ｂｏｒｏｔｒｉｔｉｄｅ ）　元ホルミル又はアルキルクトン置換基を持つプソラレ／は三重水素化ホウ素 ナトリウムで還元されて、それぞれ対応の１級又は２級アルコールとなりトリチ ウムがカルボニルの炭素の所に組み込まれる。この方法は４′−ホルミル−４， ５’、８−　）リメチルゾソラレンから４’−（（３Ｈ，）−ヒドロキシメチル ］　−４，５’、８−トリメチループソラレン（ＨＭＴ）を合成したり、４′− アセチル−４，５’、８−トリメチルプソラレンから４′−ａｆｔ−Ｃ（’Ｈ１ ）−ヒドロキシ−エチル）　−４，５’、８−　）リメチルプソ２レンを合成す るのに用いられている。市販されている。三重水素化ホウ素ナトリウムを使って （４８キユ一リー／ミリモル）１２キユ一リー／ミリモルの比活性を持つＨＩＩ Ｔが製造されている。標識付ＨＭＴは塩化チオニルを使って容易に４’−Ｃ（’ Ｈｉ）　−クロロメチル〕−４，５’、８−　）リメチルプンラレンに変換され それから多くの標識性プソラレ／に変換できる。この方法によって非常に水溶性 の４７−［（’Ｈ４）−アミノメチル：］　−４，５’、８−トリメチルプソラ レンが１２キユ一リー／ミリモルで製造されている。

（Ｃ）トリチウムガスによる触媒還元 トリチウムガスによる触媒還元は、アルキル化又は三重水素ホウ素ナトリウムに よる還元が適用できない各種標識性プソラレ／の製造に用いられている。触媒還 元によって製造したプソラレンの比活性はミリモル当り３から２０キユーリーの 範囲である。この方法によると３．４．４’および５′カーボンの所に標識が組 み込まれた三重水素標識のプソラレンが得られる。４’、５’　（７ラン）の２ 重結合は３，４（ピロン）の２重結合より前に、かつより速（還元されるからこ の方法を使って４’、　５’カーボンにおける選択的標識付けができる。部分的 還元によって（４’、５’−３Ｈ２）プソラレ／が得られこれは単離され脱水素 されてフラン側に標識のある化合物となる。一方、完全に還元して（３，４，４ ’、５’−５Ｈ４）プソラレンにするとフランとピロンの両方の２重結合に標識 のある化合物が得られる。

トリチウムの組み込み度合いは還元に使用する溶剤と触媒の特別な組合せによっ て異る。木炭上に１０％担持されたパラジウムと氷酢酸を使うと、同位元素組み 込み量が許容しうる程度になると共に還元速度が速くなる。

脱水素は普通木炭担持パラジウムの存在のもとに、還元済みのプソラレンをジフ ェニルエーテル中に還流して行われる。触媒還元法によって、（５，４，４’、 ５’−３Ｈ４）プソラレン（４，４キユ一リー／ミリモル）、（３１４’−’Ｈ ２）−４，５’、８−　）リメチルプソラレン（１７，６キユ一リー／ミリモル ）、（４，５’−５Ｈ２）　−５メチルイソゾンラレン（７４キユ一リー／ミリ モル）および（４’＋５’　−５Ｈ２）　−５−カルベトキシフタラジン（２０ キユ一リー／ミリモル）が製造されている。〔アイザークス他、ジャーナルオブ 　ザ　キャンサー　インスティテユート　（１９８３年）刊行物〕。この方法は 置換されていないフタラジン、アルキルフタラジン、および触媒還元に対して安 定な他の置換基を持つフタラジンに対して適用できる。

Φ）　トリチウムガスによる水素化分解３−ブロモ−４１−フタールイミンドメ チル−４，５’、８−トリメチルフタラジンの水素化分解による（３−６Ｈ，） 　−４／−アミノメチル−４，５’、８−　）リメチルプソラレン（ＡＭＴ）の 合成が報告されている。この化合物のヒドラジン分解によって比活性７．４６キ ユ一リー／ミリモルの標識材ＡＭＴが得られている。〔リーブマン、Ａ、Ａ、お よびデラニイ、Ｃ，Ｍ、、ラベルド　コンパウンド　アンド　ラジオファーマシ ューテイカルズ１８（８）、１１６７頁（１９８１年）〕要約すると、数種の方 法によって比活性の大きいトリチウム標識のプソラレ／を製造することが可能で ある。

三重水素化ホウ素又は触媒還元の何れを使っても１ｏキユ一リー／ミリモルから ２０キユ一リー／ミリモルの範囲の比活性が得られる。これ等の既知の方法を改 良することによって、例えば担持体のないトリチウムガスによる触媒還元に非プ ロトン溶剤を使うと一層高い比活性が得られる（４０〜６０キユ一リー／ミリモ ル）。

非放射性標識 非放射性標識は本書では「標識」と呼ぶことにするが、（１１）配位子に２区分 できる。標識は次の系統図に示したように架橋分子に付けられる。

連鎖群を使用する場合、連鎖群は通常大まかに言って、標識を架橋分子に結びつ ける鎖の幹の中に１個から４０個の原子があるものでよい。もつと一般的には６ 個から２０個の原子、さらに好ましいのは８個から１５個の原子が良い。環状構 造が含まれる場合は環状構造の数は鎖と同様の長さとする為に、原子の数に等し いものとする。

連鎖群は約１個から４０個Ｏ例えば炭素、水素、酸素、窒素、リンおよび硫黄で 構成できるし、４個から３０１固の原子が好ましい。

次の表は架橋分子や標識に与える作用の異る各種連鎖群の例を説明するために示 すものである。指摘したもの以外の連鎖群は標識やそれが結びつく架橋分子の官 能基上に１から２の原子価と結びつく。

標　識　架橋分子 アミノ（−Ｎ）１−）又はヒドロキシ＃（ｏａ）　１級アミノ（−Ｎ［（２）　 、ヒドロキー７Ａ（ＯＨ）　。

又はカルボキシル（Ｌ’Ｏ−）　２級アミン（−ＮＲＨ）　、メルカプト（−８ Ｈ）Ｎ−（ｃＨ２）２−０−（ｃＨ２）２−０−（ＣＨ２）ｚ−−ｃ−（ＣＨ２ ）ｎ−ｃ−（ＣＨ２ン。−ここでｎは１から１２までである。

染　料 染料は普通８個から４０個の炭素原子のものであるが９個から６０個の炭素原子 の場合の方が多い。この染料はさらに、普通酸素、窒素、又は硫黄のようなヘテ ロ原子を１個から１０個含有する。そして普通ヨウ素、臭素、塩素、フッ素であ る、ハロゲン原子を０から１０個含有する。発色染料の例にフェノールスルホン フタレンおよびテトラゾリウム類似物がある。

蛍光染料の例にはフルオレセインイソチオシアネート、ジクロロトリアジニルア ミノフルオレセイン、モルホリノローダミン、インチオシアネート、テトラメチ ルローダミンイソチオシアネート、および４−アセトアミド−４−イソチオシア ノ−スチルベン−２−２′−ジスルホン酸がある。

化学発光性染料の例には５−アミノ−２，３−ジヒドロフタラジン−１，４−ジ オン（ルミノール）、イソルミノールノ誘導体とアクリジンのエステル類カある 。

配位子 その配位子に対し満足な特性を持っている受容体が見つかっている場合ならどの ような配位子も使用できる。

配位子はダルトン分子量がおよそ１００がら１０，０００の有機化合物から選ば れるが普通はダルトン分子量が１２５から３．０００のもの、もつと普通にはダ ルトン分子量１２５から１．０００のものから選ばれる。６位子は普通約８個か ら１００個の炭素原子および１個から５（Ｎｌｆｆｉのへテロ原子を含むことが できる。

配位子は一般的に、炭素、窒素、酸素、硫黄、リン、へロケ゛ンおよび主として その陽イオンとして例えばアルカリ土類金属、希土類金属のような金属とから構 成される。

構造的には、この配位子は単量体又は重合体、非環状か、又は炭素環式の環が複 素環式の環を持った単環状又は多環状のものである。配位子は例えばハロ、オキ ソカルボニル、非オキソカルボニル、アミン、オキシ、ヒドロキシ、アリールオ キシ、アルキロキシ、環式アリルオキシ、チオオキシ、ジチオおよびビドラゾと 言った各種の機能性を持っている。

配位子はまた受容体に対し各種の関係を持っている。

その第１は背椎動物の血液流に抗原を導入すると抗体を生成する抗原である。第 ２は背椎動物の血液流内に導入した時、必らず免疫性の担体と結合しノ・ブテン −担体となりその結果としてハプテンに対する抗体が生ずるようなハプテンであ る。配位子の第３のグループには例えば蛋白質のアビジンが受容体であるビオチ ンのように天然に発生する受容体を持つものが含まれる。

連鎖群によってビオチンが付いたゾソラレン類似物の例は次の通り： その他の配位子には特殊な単糖類があり特殊なレクチンがその受容体である。そ の他の方法として免疫学的応答を試験管内で行わせることが可能である。

受容体 本発明の大抵の場合は、受容体はその固有の構造を判別する部位を持った巨大分 子でおれば良い。最も興味のある巨大分子は蛋白質でちる。これ等には、例えば アビジンやレクチンのような抗体や天然の受容体がある。この受容体は発色性、 蛍光性および／又は化学発光性の染料又は適当な基質を通して発色性、蛍光性お よび又は発光性の生産物を生じる能力のある酵素系と複せすることができる。

ビオチンが配位子でアビジンが受容体である場合には、ビオチン化酵素例えばビ オチン化−アルカリ性ホスホモノエステラーゼ、ベーターガラクトシグーゼ、グ ルコースオキシダーゼ、ホースラディツシュにロキシダーゼ、ピルベートキナー ゼのようなものがプローブ上のビオチン配位子標識と結びつくアビジン上で残り ６つのビオチン結合部位と複合体をつくることができる。次に、使用したビオチ ン化屏素の過剰分を除去した後、特定の酵素に適合していて従来の方法及び／又 は計器で検出しうる発色性、蛍光性および又は化学発光性の産物を生じる基質を 加える。ビオチ／を配位子としアビジンを受容体とする別の例では、牛の血清ア ルブミンのようなビオチン化蛋白質にフルオレスセインイソチオクアネートのよ うな蛍光性染料が複合しているものを使用する。この時は、蛍光性のビオチン化 された牛の血清アルブミンはプローブと結びついているア゛ビジン上の残り６つ のビオチン結合部位と複合体を生じ蛍光標識を造ることができる。

検出の限界 放射線標識架橋分子においては、検定の感度は使用する架橋剤の比活性によって 決定される。検定の感度は（ａ）架橋分子の比活性を増加する、（ｂ）プローブ 分子当り架橋分子の数を増加する、（Ｃ）目的ＤＮＡ又はＲＮＡに交雑するプロ ーブの分子数を増加する、（ｄ）崩＄１エネルギーの大きい放射核種を使用する ことによって増加しうる。

実　験 次の例は説明のために用意したものであって、本発明を制限するものと解釈され るものではない。

シス又はトランスーペンゾジピロン（１ミリモルン、木炭担持・ξラジウム（１ ０％、１ミリモル）および適当な溶媒（例えば氷酢酸）を丸底フラスコに入れ混 合物を凍結させて大気ガスを除去する。この組成物に担体のないトリチウムガス を装入し、混合物を２０℃から８０℃で、トリチウムガスが吸収されな（なるま で攪拌する。トリチウムの残部を除去して触媒を戸別し溶媒を蒸発させる。

この残部をシリカケ゛ルクロマトグラフカラムに装入しクロロホルム／メタノー ルで溶離してＣ３１４，６，７−５Ｈ４）−３，４，６，７−チトラヒドロベン ゾジピロンを単離する。

それからテトラヒドロ化合物を等モルの木炭担持１０％／ξラジウムとジフェニ ルエーテルの中に出発物質が全部なくなるまで還流する。調製用カラムクロマト グラフィいで高圧液体クロマトグラフィーで精製する（２から４０レンホスホル アミダイトの合成 りＮＡ又はＲＮＡ　、ｔ　＋）ヌクレオチドは確立された方法によって化学的に も酵素を使ってでも合成できる。ＣＴ、Ｃ。

アトキンソン、バイオテクニックス（３〜４月）６−１０（１９８３年））。特 殊なヌクレオシドモノホスフェイトが標識架橋分子を含むように修飾されると、 標識架橋分子はポリヌクレオチドの合成の時にその中に直接組み込むことができ る。

例えばゾソラレンに単一付加したチミジン、８−メトキシプソラレンｓ　４ｙ５ ′ｙ８−　）リメチルプソラレンおよび４′−ヒドロキシメチル−４，５’、３ 　””　）リメチルプソラレンはプソラレン誘導体とデオキシリボ核酸との反応 とそれに続くこのＤＮＡ０溝素的、又は化学的加水分解およびチミジン：プンラ レン単一付加物のクロマトグラフ単離によって製造されている。〔ストラツプほ か、ジャーナルアメリカン　ケミカル　フサイエティー１０３巻２３４７〜２３ ５５頁（１９８１年）；カン他、バイオクミストリー２１巻８６１〜８７１頁、 １９８２年、別の方法としてチミジン＝８−メトキシプソラレン単一付加物はそ の２つの化合物を共に混合Ｌ７た薄いフィルムを照射することによってその単量 体から調製されている。〔シム他、フオトケム、フォトパイオ（ｐｈｏｔｏｃｈ ｓｍ、　ｐｈｏｔｏｂｉｏ　）、３８巻２６５〜２７１頁（１９８３年）〕。〕 ウリジン：４′−ヒドロキシメチル４　、５’、　８−トリメｆＡ−’プ７　ラ Ｖ７単一付加物は４′−ヒドロキシ−メチル−４，５’、８−　）リメチルゾソ ラレンとリボ核敏との反応。

とそれに続＜　ＲＮＡの酵素的又は化学的加水分解と、ウリジン：４′−ヒドロ キシメチル−４’、５’、８−　）リメチルプソラレン単一付加物のグロマトグ ラフ単離によって製造されている。〔アイザークス他、フォトタム。フォトバイ オ、３７巻、〔サブルメント）　８１００　（１９８３年）〕。上記のピリミジ ン：プソラレン単一付加物は適切に修飾してポリヌクレオチド合成の時に使用で きる。

例えば、上述の方法で製造したチミジンと８−メトキシプ７うＬ／７の７ラン側 単−付加物を４，４′−ジメトキシトリチルクロライドと適当な無水溶媒と室温 で反応させて５′−ジメトキシトリチルチミジン二８−メトキシプソラレン単一 付加物が得られる。高圧液体クロマトグラフによる精製の後、この化合物を室温 でクロロ−Ｎ、Ｎジイソプロピルアミノメトキシホスフィンと適当な溶媒の中で 反応させると５′−ジメトキシトリチルチミジンホスホルアミダイト＝８−メト キシプソラレン単一付加物が得・られる。それからこの化合物は活性化した保護 ヌクレオシドホスホルアミダイトとして普通の亜リン酸塩トリエステルポリヌク レオチド合成に使用される。８−メトキシプソラレンの半面の立体化学的測定結 果は次の相補性配列への交雑の時の架橋形成に対して妥当なものになっている（ すなわち、ｃｉｓ−ｓｙｎ　）。

例　３ 生物資源からのＲＮＡおよびＤＮＡの単離とそれに続く架橋剤の単−付加 一方、プローブのＤＮＡ又はＲＮＡは生物資源から単離できるし続いて問題の標 識付架橋試薬と反応できる。単ストランドのＤＮＡは直接にはＭ１３又はφ×１ ７４のような単ストランドのビールスのゲノムから得られるし間接にはストラン ド分離によって、２本ストランドのゲノム又はプラスミドから得られる。プロー ブの大きさは単ストランドのＤＮＡのエクソヌクレアーゼ処理、および二本鎖ス トランドのＤＮＡの制限又はＢａ１３１による消化などの酵素処理によって制御 できる。またＤＮＡプローブは、又適当な核酸基質から酵素を使って製造できる 。例えば、　ＤＮＡは逆転写酵素を使ってｍＲＮＡから得られる。ＲＮＡプロー ブはビールスのゲノム（Ｒ１７、Ｆ２、ＱＢ　）又はｍＲＮＡの形の生物資源か ら直接得られる。別の方法として、適当な鋳型から試験管内で酵素を使って合成 できる。例えば、　ＲＮＡポリメラーゼを使って２本ストランドＤＮＡから転写 するとプローブＲＮＡが得られる。

これ等の生物学的に得られたＤＮＡ又はＲＮＡプローブは、それから、架橋分子 の光化学的又は化学的のどちらかの付加反応によって架橋剤と単一付加物を製造 する。例えば塩基５０個当り１１＠０４′−ヒドロキシメチル−４，５’、８φ １７４は次のようにして製造される。単ストランドφ×１７４　ＤＮＡはピエツ テ他がフオトタム。フォトバイオ、３５巻７０５−７０８頁（１９８２年）に述 べているようにして得ることができる。

１０ミリモルのトリス（ｐＨ８，０）中に１　ミリリットル当り０．１グラムの φ１ｘＳＳ　ＤＮＡ　、　１ミリモルのＥＤＴＡおよび５０又は６０ミリモルの 塩化ナトリウムを含有した５０リツトルの溶液とＨ−Ｉ（ＭＴを１０塩基対当り 薬品１の割合で混合した。このＤＮＡプソラレン混合物を１０℃でゼネラルエレ クトリックの水銀蒸気ランプ４００Ｗ２基で照射した。照射容器内には３４０か ら３８０ナノメーターの範囲外の光を除去するフィルターの作用をする硝酸コバ ルト溶液（４０％重量／重量）を入れた。光反応を起こしたＤＮＡを照射容器か ら取り出し、共有結合していない薬品はクロロホルム抽出２回、エーテル抽出２ 回その後エタノール沈澱分離２回行ってＤＮＡから除去した。

単一付加ＤＮＡおよびＲＮＡプローブを調製する別の方法は次の通りである。２ ０がら８００の塩基をもっ４　＋）ヌクレオチドが十分確立された遺伝子工学の 方法を使ってＭ１３又は単ストランドＰＢＲ３２２に挿入されている相補性配列 と交雑する。雑種分子（０，１０Ｄ）の８−メトキシプソラレン（３５グラム／ ミリリツトル）はトリス塩酸４（０，０１Ｍ）、およびｐＨ７，５のＥＤＴＡ（ ０，００１Ｍ）か！’、ｌる緩ｉ液中で３時間、５２０から３８０ｎｍで照射さ れる。照射についで、この反応混合物をクロロホルムで５回抽出し、それからエ タノール沈澱処理する。そのＲレットをＯ，１ミリリツトルの蒸留水に再び葱濁 させそれから１０分から２０分間２５４　ｎｍで照射する。当然、再照射する光 の特定波長はこの例で用いた特定雑種用として最適なものである。他の雑種の場 合は勿論最適の結果が得られるように別の波長の光を照射する。

反応混合物を変性条件で寒天又はポリアクリルアミドケ゛ルに乗せ、電気泳動を 行う。単一付加ヌクレオチドを含むバンドは切除され電気溶出されイオン交換ク ロマトグラフおよびエタノール沈澱によって精製される。場合によっては、この 精製された単一付加ポリヌクレオチドは２０個から５０個の塩基数の小断片にす るため化学的か触媒を使って無作為に消化される。

蛍光染料標識架橋試薬の１例として４’−Ｎ−（Ｎ−へキシルアミド−Ｎ−フル オレスセイニルウレ７　）　−４，５−８−トリメチルプソラレンの製造につい て述べる。

４′−アミノメチル１−４．５’、８−　）リメチルプソラレ／は無水のジメチ ルホルムアミドニメチレ／クロライド１：１の容積／容積の中で６−Ｎ−ｔｅｒ ｔ−ブトキシーカルボ二に一カー１０ン酸のＮ−ヒドロキシサクシンイミドエス テルと反応する。生成物の４’−Ｎ−（Ｎ−へキシルアミド−Ｎ−ｔｅｒｊ−ブ トキシカルボニル）　−４，５’、８−）リメチループソラレンを弱酸で処理し てｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基を除去し、ケイ酸な充填したカラムでクロロ ホルムとメタノール混合物を用いて精製する。その結果得られる４’−Ｎ−（Ｎ −へキシルアミド−６−アミン）−ａ、５’、８−　）リメチルゾソラレンを無 水のジメチルホルムアミド又ハシメチルスルホキシドの中で過剰のフルオレスセ インインチオシアネートと反応させる。そして得られる４’−Ｎ−（Ｎ−へキシ ルアミド−Ｎ−フルオレスセイニルウレア）　−４，５’、８−　）リメチルー プソラレンは暗所で分取薄層クロマトグラフで精製される。

配位子標識架橋試薬の１例として、４’−Ｎ−（Ｎ−へキシルアミド−Ｎ−ビオ チンアミド）　−４，５’、８−トリメチルプソラレンの製造について説明する 。

ビオチンのＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステルを無水のジメチルホルムアミ ド中で６−アミノカプロン酸と反応させる。その生成物のカプロアミドビオチン を無水のジメチルホルムアミドの中でＮ、Ｎ’−カルポニルジミダゾールおよび Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドと反応させてそのＮ−ヒドロキシサクシンイミド エステルに転換させる。カプロアミドビオチンのＮ−ヒドロキシスクシンイミド エステムを含む反応混合物に無水のメチレンクロライド中に前もって溶けている 過剰の４′−アミノメチル−４，５’、８−　）リメチルプンラレンを加える。

この反応の進行はシリカゲＡ／Ｇにおける薄層クロマトグラフィーによってモニ ターされる。その結果得られる４’−Ｎ−（Ｎ−へキシルアミド−Ｎ−ビオチン アミド）　−４，５’、８−トリメチルプソラレンはケイ酸充填カラムクロマト グラフィーでクロロホルムとメタノール混合物を使って精フオトアフイニテイラ ベルプローブＤＮＡの鋳型ＤＮＡとの交雑 ダーナムやパルミターがアナリテイカル　バイオケミストリイ、１６１巻、６８ ５頁、（１９８３年）で説明している交雑方法では次の緩衝液を使っている。緩 衝液Ａは１０ミリモルトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス〕およ び０．２５ミリモルのエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ　）、ｐＨ７，４ である。緩衝液Ｂは１０チのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１００ミリモ ルのトリス、５０ミリモルのＥＤＴＡ％ｐ８７．５を含有する１０ｘストツクと して製造する。交雑用の塩（１０Ｘストツク）は３モルの塩化ナトリウム（Ｎａ Ｃｊ！　）、１００ミリモルのトリス、２０ミリモルのＥＤＴＡ、　、　ｐ）＋ 　７．５を含有する。

全核酸（ＴＮＡ）サンプルは問題の目的ゲノムを含んだ特定の組織２５ミリグラ ムから５０ミリグラム又はミリリットル当り１０６から１０７個の細胞を、プロ テイナーゼＫを１ミリリットル当り５０から２００マイクログラム含有した１× 緩衝液Ｂの中で均一化することによって製造できる。サンプルは４５℃で１時間 保温しフェノール／クロロホルムで抽出し、クロロホルムで２回再抽出し、２倍 容のエタノールで沈澱だする。エタノールで沈澱した沈澱物は０２Ｘの緩衝液Ｂ 中に再び懸濁し一２０℃で保存する。ＴＮＡ濃度は、１ミリリットル当り１ミリ グラムの溶液は２６０　ｎｍの吸光度が２０であると仮定して分光光度法によっ て決定する。

ＤＮＡ濃宜は比色検定法又は蛍光検定法の何れかで決定する。

交雑反応には０．６モルの塩化ナトリウム、４ミリモルのＥＤＴＡ、１０ミリモ ルのトリス、ｐＨ７，５，４０パーセントホルムアミド、０から２０マイクログ ラムのＴＮＡ　、および間呟の目的ゲノムに相補的な塩基配列を含み今後はｒ　 ｐＤＮＡ　Ｊと呼ぶ３Ｈプソラレン単一付加プローブＤＮＡの５０から１００倍 過剰モルが全体で０．０３ミリリツトルの中に含まれている。反応は１．５ミリ リツトルの微小遠心管内で行われる。上記の組成をするためにｃＬ０１ミリリッ トルのＴＮＡサンプルを１つの管内か又は１組の管の中に入れそして６０チのホ ルムアミド、０．９％の塩化ナトリウム、６ミリモルのＥＤＴＡ、６０ミリモル のトリス、ｐＨ７，４およびマイクロリッター当り２５０がら５００カウント／ 毎分を与えるｐＤＮＡを入れる。後者の溶液は６容の脱イオンホルムアミド、５ 容の１０Ｘ交雑頃類、および１容のｐＤＮＡを１管あたり十分なカウント７分が 得られるように０．２×緩衝液Ｂの中で反応させて製造する。それからこれ等を パラフィン油（約０．１ミリリツトル）で覆い簡単に遠心分離にかげてから暗所 で約１６から１８時間６８℃に保温する。感度の違いに対応して保温時間が数時 間から数日まで変わり得ることは注目すべきである。

それから交雑サンプルは４０％（重−ｉ／型重量の硝酸コバルトが液体フィルタ ーとして入っている冷却された反応容器内で４℃で３４０　ｎｍから３８０　ｎ ｍの照射を受ける。この容器はサンプルの所で約１００　ｍＷ／ｃｍ２の光り強 さになるように２つの４００Ｗ水銀蒸気ランプの等間隔位置におく。照射時間が ３０分間あると交雑物質の光化学的架橋ができる。交雑の後で、サンプルを１０ ０℃で熱変成して未交雑物質および未架橋物質は全て確実に単ストランドの状態 にする。２０分後、サンプルを６０℃に冷し、これに０．３モルの塩化水素１ミ リリツトル、酢酸ナトリウム３０ミリモル、酢酸亜鉛３ミリモルおよびアスはル ギルスオリザーエによるＳ１ヌクレア一ゼ１０単位を含むニシンの***ＤＮＡ　 １００マイクログラムを添加しノミラフイン油が完全に浮き上がるように十分サ ンプルの渦流攪拌を行う。この溶液は１容の１０×８１ヌクＶアーゼ緩衝液、１ ミリグラム／ミリリツトルのイワシの***ＤＮＡ　１容、蒸留水８容、および溶 液ミリリットル当りＳ１ヌクレア一ゼ１０単位を反応させて製造されることは注 目すべきである。Ｓ１ヌクレア一ゼ反応を５５℃から６０℃に１時間保温して、 ６モルの濃度の三塩化酢酸１ミリリツトルを添加して終る。渦流攪拌の後、この サンプルを２．４　ｃｍのワットマンＧ　Ｆ／Ｃフィルター上で濾過する。フィ ルターは最初３チの三塩化酢酸と１チのピロリン酸ナトリウムで濡らしサンプル を供給してそれから管とフィルターを３チ三塩化酢酸／１％ピロリン酸ナトリウ ムで３回洗浄し最後ｉｃｙ　５％エタノールで洗滌する。それからフィルターに ２ミリリツトルのトルエン−オムニフルオロシンチレーション溶液を加え各１０ 分間カウントする。

非放射性アイソトープ標識ゾローブの場合はフィルターを、０．０１モルのトリ ス−塩酸緩衝液−Ｚ５中にミリリットル当り１００マイクログラムのアビジンを 含有した溶液の中に１５分から６０分間入れる。フィルターを同じ緩衝液中で簡 単に洗滌し、それから０．０１モルのトリス−塩酸緩衝液ＰＨ７，５の中に１ミ リリットル当り１００マイクログラムのビオチン化したホースラデイシュ／ξ− オキシダーゼを含有する溶液中にそのフィルターを３０分から１２０分間置きそ れから過剰のビオチン化ホースラデイシュパーオキシダーゼを除去するため十分 に洗滌する。それからこのフィルターを０．０２５モルのクエン酸ソーダと０． ０５モルのリン酸ソーダ、ｐＨ５，０の中に０．４ｔｑ／ｍｅのオルソ−フェニ レンジアミンの溶液を含みまた０、０１％過駿化水素を含有する容器の中に入れ る。特定の時間の後１反応は２．５規定の硫酸の添加で終了とする。

着色溶液の１つのアリコートを取り、４９２ｎｍでの吸光度を測定しブランクと 比較する。そしてこのブランクは交雑できる目的核酸が存在しないこと以外は同 じやり方でつ（られたサンプルを使って上記操作を全て行ったものである。この 方法によるとガードナーがバイオテクニックス、１巻３８頁（１９８３年）に述 べているように約２０フエムトモルのビオチンが検出可能である。放射線標識プ ローブに対して述べたのと同降にして感度を数倍増加できる。

手続補正書 昭和６０年／／月１日

Claims (32)

【特許請求の範囲】
1. １．目的核酸分子中の定義付けされた領域に対し実質的に相補的な塩基配列を持 つ単ストランド核酸分子と当該単ストランド核酸分子に付着し当該単ストランド 核酸分子と当該目的分子の間に共有架橋を造る能力がありそれにより共有結合し た標識プローブの量を測定することによって特異な核酸塩基配列の存在が決定さ れる標識付架橋分子からなる目的核酸分子中の特異な核酸塩基配列の存在を決定 するプローブ。
2. ２．当該標識が放射性であることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載のプ ローブ。
3. ３．架橋分子が放射性核種、発色性標識、蛍光性標識、化学発光性染料および配 位子からなる群から選ばれたもので標識付けされることを特徴とする特許請求の 範囲第１項に記載のプローブ。
4. ４．当該共有架橋が化学的に製造されることを特徴とする特許請求の範囲第１項 に記載のプローブ。
5. ５．当該共有架橋が光化学的に製造されることを特徴とする特許請求の範囲第１ 項に記載のプローブ。
6. ６．当該架橋分子がフロクマリン、ベンゾジピロン、およびビスアシドからなる 群から選ばれたものからなることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載のプ ローブ。
7. ７．当該架橋分子がビスアジドエチジウムブロマイドからなることを特徴とする 特許請求の範囲第６項に記載のプローブ。
8. ８．当該架橋分子がプソラレンからなることを特徴とする特許請求の範囲第１項 に記載のプローブ。
9. ９．当該架橋分子がハロアルキルフロクマリンからなることを特徴とする特許請 求の範囲第６項に記載のプローブ。
10. １０．当該架橋分子がハロアルキルベンゾジピロンからなることを特徴とする特 許請求の範囲第６項に記載のプローブ。
11. １１．当該架橋分子がハロアルキルクマリンからなることを特徴とする特許請求 の範囲第６項に記載のプローブ。
12. １２．当該架橋分子がアジドヌクレオシドトリフオスフェートからなることを特 徴とする特許請求の範囲第６項に記載のプローブ。
13. １３．当該架橋分子が次式 ▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等があります▼、及び ▲数式、化学式、表等があります▼ から選んだもので構成され、Ｒ１からＲ６までは同じものか又は別のものであり 、おのおのがＨ、ＣＨ３、ＣＨ２ｃｌ、ＣＨ２Ｂｒ、ＣＨ２Ｉ、ＣＨ２ＯＨ、Ｃ Ｈ２ＯＣＨ３、ＣＨ２ＮＨ２、Ｎ３、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＣＨ３、ＣＯＯＣＨ２Ｃ Ｈ３、ＮＨ２、ＮＯ２、ＣＦ３、ＣＣｌ３、ＣＨ（ＣＨ３）２、Ｃ（ＣＨ３）３ 、Ｃｌ、Ｂｒ、ＩおよびＦからなる群から選んだものであることを特徴とする特 許請求の範囲第６項記載のプローブ。
14. １４．架橋分子がプソラレン、３‐メトキシプソラレン、５−メトキシプソラレ ン、４′，５′，８−トリメチルプソラレン、４′−ヒドロキシメチルー４，５ ′，８−トリメチルプソラレンおよび４′−アミノメチルー４，５′，８−トリ メチルプソラレンよりなる群から選ばれたメンバーで構成されることを特徴とす る特許請求の範囲第８項に記載のプローブ。
15. １５．当該標識が３Ｈ又は１４Ｃであることを特徴とする特許請求の範囲第３項 に記載のプローブ。
16. １６．Ａ．目的分子中の定義づけされた領域に対して実質的に相補的な塩基配列 を有する単ストランド核酸分子をつくること、 Ｂ．当該単ストランド核酸分子と当該目的分子の間に共有架橋を形成することが でき標識付き架橋分子を当該単ストランド核酸分子に付着させること、Ｃ．当該 単ストランド核酸分子と当該目的分子中の当該定義づけされた領域とを交雑させ ること、Ｄ．当該標識付架橋分子と目的分子間に共有結合を起こさせること、お よび Ｅ．当該目的分子上にある当該標識付架橋分子と単ストランド架橋分子の量を測 定することからなる目的核酸分子中の特異な核酸塩基配列の存在を決定する方法 。
17. １７．区分Ｅの測定段階の前に、目的分子と共有結合を形成しなかった架橋分子 を架橋を造ったものから、単ストランド複合体と２本ストランド複合体を分ける 技術を使って分離することを特徴とする特許請求の範囲第１６項に記載の方法。
18. １８．当該技術が未架橋分子のゲルろ過、水酸化リン酸カルシウムクロマトグラ フイ、酵素消化、および光反転又は化学反転からなる群から選ばれることを特徴 とする特許請求の範囲第１７項に記載の方法。
19. １９．架橋分子がプソラレン、８−メトキシプソラレン、５−メトキシプソラレ ン、４，５′、８−トリメチルプソラレン、４′−ヒドロキシメチルー４，５′ ，８−トリメチルプソラレンおよび４′−アミノメチルー４，５′，８−トリメ チルプソラレンからなる群から選ばれることを特徴とする特許請求の範囲第１６ 項に記載の方法。
20. ２０．架橋分子が放射性核種、発色性標識、蛍光性標識、化学発光染料および配 位子からなる群から選ばれた標識で標識付されることを特徴とする特許請求の範 囲第１６項に記載の方法。
21. ２１．当該標識が３Ｈ又は１４Ｃであることを特徴とする特許請求の範囲第２０ 項に記載の方法。
22. ２２．架橋分子がフロクマリン、ベンゾジピロン、およびビスアジドからなる群 から選ばれた１つであることを特徴とする特許請求の範囲第１６項に記載の方法 。
23. ２３．当該共有結合が化学的に形成されることを特徴とする特許請求の範囲第１ ６項に記載の方法。
24. ２４．当該共有結合が光化学的に造られることを特徴とする特許請求の範囲第１ ６項に記載の方法。
25. ２５．当該単ストランド核酸分子がＲＮＡプローブからなり当該目的物がＤＮＡ 分子からなり、又当該技術がアルカリ性加水分解により構成されることを特徴と する特許請求の範囲第１７項に記載の方法。
26. ２６．Ａ．目的分子中の定義付けされた領域に本質的に相補的な塩基配列を有す る標識付単ストランド核酸分子をつくること、 Ｂ．当該標識付単ストランド核酸分子と当該目的分子間に共有架橋を形成するこ とのできる架橋分子を当該標識単ストランド核酸分子に付着させること、Ｃ．当 該標識付単ストランド核酸分子を当該目的分子の当該定義付けされた領域と交雑 させること、Ｄ．当該架橋分子と目的分子間に共有結合を形成すること、および Ｅ．当該目的分子に共有結合している当該標識付単ストランド核酸分子の量を測 定することからなる目的核酸分子中の特異な核酸塩基配列の存在を決定する方法 。
27. ２７．Ａ．標識付目的分子内の定義付けされた領域に本質的に相補的な塩基配列 をもつ単ストランド核酸分子をつくること、 Ｂ．当該単ストランド核酸分子と当該標識付目的分子間に共有架橋を形成するこ とができる架橋分子を当該単ストランド核酸分子に付着すること、Ｃ．当該単ス トランド核酸分子を当該標識付目的分子の当該定義付けされた領域に交雑させる こと、Ｄ．当該架橋分子と目的分子間に共有結合を形成すること、および Ｅ．当該単ストランド核酸分子に共有的に架橋した当該標識付目的分子の量を測 定することからなる標識付目的核酸分子中の特異な核酸塩基配列の存在を決定す る方法。
28. ２８．当該単ストランド核酸分子が化学的に固体の担持体に結合することを特徴 とする特許請求の範囲第１６、２６、又は２７項に記載の方法。
29. ２９．当該固体の担持体がケイ素からなることを特徴とする特許請求の範囲第２ ８項に記載の方法。
30. ３０．当該固体の担持体が制御孔ガラスからなることを特徴とする特許請求の範 囲第２９項に記載の方法。
31. ３１．当該架橋分子がフロクマリンおよびシクロブタン架橋結合を通じてピリミ ジンに単一付加したベンゾジピロンからなる群から選ばれたもので構成されるこ とを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載のプローブ。
32. ３２．当該単ストランド核酸分子が特許請求の範囲第３１項に記載の当該分子を 用いて化学的に合成されることを特徴とする特許請求の範囲第１６、第２６、又 は第２７項に記載の方法。