JPS6147194A - Preparation of n-carbamoyl-d-valine or d-valine - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To produce efficiently (N-carbamoyl-)D-valine by the use of the action of a fungus, by bringing a culture mold, etc. of a sepecific fungus into contact with L-(or DL-)isopropylhydantoin. CONSTITUTION:A fungus [e.g., Candida philyla MT-40361(FERM-P7763)] belonging to the genus Candida, capable of racemizing isoprophylhydantoin, forming (N-carbamoyl-)D-valine from D-isopropylhydantoin, is used. Namely, a culture solution of the fungus, or a culture mold (treated material of the culture mold) is blended with L-(or DL-)isopropylhydantoin, reacted at about 10-50 deg.C at about 3-10pH, and (N-carbamoyl-)D-valine is collected from the reaction solution.

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の目的） 産業上の利用分野 本発明は、Ｎ−カルバモイル−Ｄ−バリンｔたはＤ−バ
リンの製造法に関する。更に詳しくは、微生物の作用に
より、Ｌ−またはＤＬ−イソプロピルヒダントインｔ’
基質ＫＬ、て、Ｎ−カルバモイル−Ｄ−バリンまたはＤ
−バリンを製造する方法に関する〇 而して、その目的とするところは、員薬等の原料として
工業的に重要な物質であるＤ−バリンを安価に製造する
ことＫある。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION (Object of the Invention) Industrial Field of Application The present invention relates to a method for producing N-carbamoyl-D-valine or D-valine. More specifically, due to the action of microorganisms, L- or DL-isopropylhydantoin t'
Substrate KL, N-carbamoyl-D-valine or D
-Regarding a method for producing valine The purpose of this method is to produce D-valine, which is an industrially important substance as a raw material for pharmaceuticals, at a low cost.

Ｎ−カルバモイル−Ｄ−バリンは、それ自体では大きな
工業的用途はないが、化学的または時素的に容易ＫＤ−
バリンに変換出来るので、Ｄ−バリンの製造原料として
の用途がある。Although N-carbamoyl-D-valine itself has no major industrial uses, it can be easily converted into KD-valine chemically or chemically.
Since it can be converted to valine, it can be used as a raw material for producing D-valine.

従来の技術 従来、微生物の作用で、Ｄ−イソプロピルヒダントイン
からＮ−カルバモイル−Ｄ−バリンまたはＤ−バリンを
製造する方法は既に知られている。2. Description of the Related Art Conventionally, a method for producing N-carbamoyl-D-valine or D-valine from D-isopropylhydantoin by the action of microorganisms is already known.

しかし、微生物の作用で、Ｌ−イソプロピルヒダントイ
ンからＮ−カルバモイル−Ｄ−バリンおよび／またはＤ
−バリンを製造する方法は知られていない。However, due to the action of microorganisms, L-isopropylhydantoin is converted to N-carbamoyl-D-valine and/or D-valine.
- There is no known method for producing valine.

イソプロピルζプントインは水溶液中でわずかにラセミ
化することが知られている。従って、Ｌ−身ノグロビル
ヒダントインを原料として使用しても、微生物の作用で
、わずかにＮ−カルバモイ゛ルーＤ−バリンまたはＤ′
−バリンを生成させる、ことができないではない。しか
し、その生成速度は非常に遅（実用的な方法とはとうて
い言い難い。Isopropyl ζ-puntoin is known to slightly racemize in aqueous solution. Therefore, even if L-noglobilhydantoin is used as a raw material, due to the action of microorganisms, a slight amount of N-carbamoyl, D-valine or D'
-It is not impossible to generate valine. However, the production speed is very slow (it is hardly a practical method).

発明が解決しようとする問題点 杢発明者らは、この点につき鋭意研究を実施した結果、
イソプロピルヒダントインをラセミ化する能力を有し、
且つ、Ｄ−イソプロピルヒダントインからＮ−カルバモ
イル−Ｄ−バリンまたはＤ−バリンを生成する能カン有
する微生物を発見し、これに基いて本発明を完成した。The problem that the invention aims to solveThe inventors conducted intensive research on this point and found that
Has the ability to racemize isopropylhydantoin,
Furthermore, a microorganism capable of producing N-carbamoyl-D-valine or D-valine from D-isopropylhydantoin was discovered, and the present invention was completed based on this finding.

本発明の方法によれば、化学合成法で製造されたＤＬ−
イソプロピルヒダントインを原料にして高収率でＤ−バ
リンを製造することができるので、“産業上極めて有利
なり一バリンの製造法となる。According to the method of the present invention, DL-
Since D-valine can be produced in high yield using isopropylhydantoin as a raw material, it is an industrially extremely advantageous method for producing monovaline.

発明の構成 本発明に使用する微生物としては、キャンデイダ属に属
する微生物、例えは、キヤンデイダ・フイツク（Ｃａｎ
ｄｒｄａ　ｐｈｉｌｙｌａ）ＭＴ　　４０３５１　　（
微工研菌寄　第り’）ｔ、３ｇ）、キヤンデイダ・ビナ
リア（Ｃａｎｄｉｄａ　ｖｉｎａｖｉａ　）　ＭＴ　−
４０３６２（微工研菌寄第りク≦秘すなどであり、Ｄ−
バリン合成反応にこれらの微生物を使用するときは、こ
れらの微生物の培養液、または、培養菌体、またはこの
菌体を破砕して得られる無細胞抽出液、または菌体な固
定化して得られる固定化物などを用いることかで”　き
る。Structure of the Invention The microorganisms used in the present invention include microorganisms belonging to the genus Candida, for example, Candida
drda phillyla) MT 40351 (
Candida vinavia MT -
D-
When using these microorganisms in the valine synthesis reaction, use the culture solution of these microorganisms, the cultured cells, the cell-free extract obtained by crushing the cells, or the cell-free extract obtained by immobilizing the cells. This can be achieved by using immobilized substances.

上記微生物の培養は、通常は振１培養あるいは通気・攪
拌深部培養などの好気的条件下で行なう。The above-mentioned microorganisms are usually cultured under aerobic conditions such as shaking culture or submerged culture with aeration and stirring.

培養温度は１０〜３５℃、好ましくは２５〜３５℃であ
り、培養ＰＨは３〜８、好ましくは４．５〜６．５であ
る。The culture temperature is 10-35°C, preferably 25-35°C, and the culture pH is 3-8, preferably 4.5-6.5.

培地に使用する炭素源および窒素源は、使用菌σ利用可
能なものならば何れの種類を用いてもよい。即ち、炭素
源としては、グルコース、ガラクトース、鐘粉加水分解
液、糖寅などの炭水化物、更にグリ七ロール、クエン酸
、エタノールな゛ども使用できる。窒素源としては、ア
ン％ニア、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、ｔＪ
Ｅ化アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの各種の無機
および有機アンモニウム塩類、または肉エキス、酵母エ
キス、麦芽エキス、コーン・スチープ・リカー、カゼイ
ン加水分解物、フイツシエミールなどの天然有機窒素源
も使用可能である。天然有機窒素源の多（の場合は、窒
素源であると°ともに炭素源にもなり得る。無機物とし
て燐酸−水素カリウム、燐酸二水素カリウム、塩化カリ
ウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄
なども必要に応じて使用すると好都合である。As the carbon source and nitrogen source used in the culture medium, any type of carbon source and nitrogen source that can be used by the bacteria used may be used. That is, as carbon sources, carbohydrates such as glucose, galactose, bell flour hydrolyzate, and sugar tora, as well as glycerol, citric acid, and ethanol can be used. Nitrogen sources include ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium carbonate, tJ
Various inorganic and organic ammonium salts, such as ammonium chloride, ammonium acetate, or natural organic nitrogen sources, such as meat extract, yeast extract, malt extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, fussier meal, etc., can also be used. In the case of many natural organic nitrogen sources, it can be both a nitrogen source and a carbon source. Inorganic substances include potassium hydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, potassium chloride, sodium chloride, magnesium sulfate, and ferrous sulfate. It is convenient to use the following as needed.

更にイソプロピルヒダントインまたはＮ−カルバモイル
バリン０．５〜１０ｆ／ｌ、好ましくは１〜５ｔ７ｔの
濃度で培地に添加しておくと菌体中の本反応に関与する
酵素の活性が高められる。Furthermore, if isopropylhydantoin or N-carbamoylvaline is added to the medium at a concentration of 0.5 to 10 f/l, preferably 1 to 5t7t, the activity of enzymes involved in this reaction in the bacterial cells is increased.

反応に使用する基質であるＬ−またはＤＬ−イソプロピ
ルヒダントインの濃度Ｋ特に制限はないが通常１〜４％
の濃度が用いられ、反応温度は１０〜５０℃、好ましく
は２５〜４０℃、反応ＰＨは３〜１０、好ましくは６〜
９である。Concentration K of L- or DL-isopropylhydantoin, which is the substrate used in the reaction, is not particularly limited, but is usually 1 to 4%.
The reaction temperature is 10-50°C, preferably 25-40°C, and the reaction pH is 3-10, preferably 6-40°C.
It is 9.

反応液中からのＮ−カルバモイル−Ｄ−バリンまたはＤ
−バリンの単離は、濃縮、中和、イオン交換樹脂処理な
どの公知の方法により行なうことができる。N-carbamoyl-D-valine or D from the reaction solution
- Isolation of valine can be performed by known methods such as concentration, neutralization, and treatment with an ion exchange resin.

次に実施例により本発明を更に詳明するが、本発明はこ
れらの例のみに限定されるものではない。Next, the present invention will be explained in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.

実施例１ キヤンデイダ・フイツクＭＴ−４０３６１を５００ｄ容
坂ロフラスコ中の１００艷の培地（組成は第１表に示す
）Ｋ接種し、３０℃で４８時間振盪培養を行なった。培
養終了後、遠心集菌し、１００−の生理食塩水を加えた
後再び遠心集菌し、この菌体を０．９％食塩水５０−に
懸濁して菌体懸濁液とした。Example 1 Candida Fikku MT-40361 was inoculated into 100 medium K (composition shown in Table 1) in a 500 d Sakalo flask, and cultured with shaking at 30°C for 48 hours. After completion of the culture, the cells were collected by centrifugation, and after adding 100 ml of physiological saline, the cells were again collected by centrifugation, and the cells were suspended in 0.9% saline at 50 ml to obtain a cell suspension.

この菌体懸濁液１−と２％のＬ−インプαビルヒダ／ト
イン溶液（第２表に示した種類の０．２Ｍ濃度の緩衝液
にとかしである）１−を混合した後、３０℃、１７時間
攪拌しながら反応させた。After mixing this bacterial cell suspension 1- with a 2% L-imp alpha virhida/toin solution 1- (dissolved in a 0.2M concentration buffer of the type shown in Table 2), the mixture was heated at 30°C. The reaction was allowed to proceed with stirring for 17 hours.

反応終了後Ｄ−バリンを液体クロマトグラフィーで定量
した。一方、上記反応条件下で菌体ｌｌＩ！！濁液を加
えない場合のＬ−イソプロピルヒダントインのラセミ化
率を旋光度を測定することＫよって求めた。得られた結
果を第２表に示した。After the reaction was completed, D-valine was quantified by liquid chromatography. On the other hand, under the above reaction conditions, bacterial cells llI! ! The racemization rate of L-isopropylhydantoin when no suspension was added was determined by measuring the optical rotation. The results obtained are shown in Table 2.

第１表　培地組成 第２表　反応結果 実施例２ Ｌ−イソプロピルヒダントインの代りＫＤＬ−反応終了
後、生成させたＮ−カルバモイル−Ｄ−パリ／およびＤ
−バリンの生成量を第３表に示した。Table 1 Medium composition Table 2 Reaction results Example 2 KDL instead of L-isopropylhydantoin - N-carbamoyl-D-paris/and D produced after completion of the reaction
-The amount of valine produced is shown in Table 3.

第３表反応結果 実施例３ キヤンデイダ・フィリラＭＴ−４０３６１の代りにキヤ
ンデイダ・ビナリアＭＴ−４０５６２７に用いた他は実
施例１と・同様の操作を実施した。得られた結果を第４
表に示した。Table 3 Reaction Results Example 3 The same procedure as in Example 1 was carried out except that Candeida Vinaria MT-405627 was used instead of Candeida Firilla MT-40361. The obtained results are shown in the fourth
Shown in the table.

第４表反応結果 実施例４ キヤンデイダ・フイリラＭＴ−４０３６１の代りにキヤ
ンデイダ・ビナリアＭＴ−４０３６２を用（・た他は実
施例２と同様の操作を行なった。得られた結果を第５表
に示した。Table 4 Reaction Results Example 4 The same operation as in Example 2 was performed except that Candeida Vinaria MT-40362 was used instead of Candeida Firilla MT-40361.The obtained results are shown in Table 5. Indicated.

第５表　反応結果 −へｑＣTable 5 Reaction results -toqC

Claims (1)

【特許請求の範囲】[Claims] キヤンデイダ属に属し、イソプロピルヒダントインをラ
セミ化する能力を有し、且つ、Ｄ−イソプロピルヒダン
トインからＮ−カルバモイル−Ｄ−バリンまたはＤ−バ
リンを生成する能力を有する微生物の培養液、培養菌体
、または培養菌の処理物をＬ−またはＤＬ−イソプロピ
ルヒダントインに接触させることを特徴とするＮ−カル
バモイル−Ｄ−バリンまたはＤ−バリンの製造法。A culture solution, a cultured bacterial cell, or a microorganism that belongs to the genus Candeida and has the ability to racemize isopropylhydantoin and to produce N-carbamoyl-D-valine or D-valine from D-isopropylhydantoin. A method for producing N-carbamoyl-D-valine or D-valine, which comprises contacting a treated product of cultured bacteria with L- or DL-isopropylhydantoin.