JPS6144352A - Method for fluorescent marking of polydeoxyribonucleotide or polyribonucleotide - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To enhance the detection sensitivity of marked polynucleotide by an optical marking method, by introducing an optical marking compound into the thiophosphoric acid group of a nucleic acid constitutional element. CONSTITUTION:The fluorescent marking of polynucleotide is performed by converting the phosphoric acid bond of polynucleotide to a thiophosphoric acid bond and reacting the thiol group of the thiophosphoric acid bond with a covalently bondable fluorescent marking compound specifically reacting said thiol group. The above-mentioned polynucleotide having the thiophosphoric acid bond can be synthesized by an org. synthesis method or enzymatic method. Especially, in the former org. synthesis method, it is easiest to introduce the thiophosphoric group into both terminal hydroxyl groups of polynucleotide and thiophosphoric acid, thiophosphoryl chloride or derivatives thereof may be reacted under a known condition.

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はリン戯結合の少なくとも１個以上がチオリン０
結合であるポリデオキシリボヌクレオチドまたはｓｆリ
リ１ドヌクレオチド（以下１．Ｉ？ポリヌクレオチド総
称する）のチオリン酸結合のチオール基に共有結合性螢
光標識化合物を反応させることからなるぼりヌクレオチ
ドの螢光標識化法に関するものであシ、本発明により得
られる螢光標識化された特定の塩基配列含有するポリヌ
クレオチドは標的遺伝子の同定および抽出に使用され、
遺伝子工学、臨床診断および食品等の分野で巾広く利用
され得るものである。Detailed Description of the Invention (Industrial Field of Application) The present invention provides that at least one of the phosphoryl bonds is
Fluorescent labeling of nucleotides consisting of reacting a covalent fluorescent labeling compound with the thiol group of the thiophosphoric acid bond of a polydeoxyribonucleotide or sf nucleotide (hereinafter collectively referred to as 1.I? polynucleotide), which is a bond. The fluorescently labeled polynucleotide containing a specific base sequence obtained by the present invention is used for identifying and extracting a target gene,
It can be widely used in fields such as genetic engineering, clinical diagnosis, and food.

（発明の背景） 近年遺伝子工学の研究が盛んになるに伴い、有用物質の
生産に必要な遺伝子の検出に、特定の塩基配列を有する
ポリヌクレオチドが用いられるようになってきている。(Background of the Invention) As genetic engineering research has become more active in recent years, polynucleotides having specific base sequences have come to be used to detect genes necessary for producing useful substances.

例えば臨床と断の分骨においては現在免疫学的方法およ
び生物学的方法が用いられているが、前者は検査時間は
一般に数分と短いものの交差反応や干渉作用のためにし
ばしば不明瞭な結果を与え、また後者は培養に長時間を
要するなどの欠点を有する。For example, immunological and biological methods are currently used in clinical and bone fracture analysis, but although the test time for the former is generally short (a few minutes), the results are often unclear due to cross-reactivity and interference effects. However, the latter has drawbacks such as requiring a long time for culturing.

これに対して、遺伝子を検出することで疾患の診断を行
なうポリヌクレオチド法は、検査時間は一般に数時間ｔ
−要するが、検出感度ばかりでなく特異性も非常に高く
、また誤差がきわめて小さいという利点を有し、感染症
のみならず免疫学的方法では検出できない潜在性ウィル
スも検出可能であるため、これに適し九ポリヌクレオチ
ドの開発が要望されている。In contrast, the polynucleotide method, which diagnoses diseases by detecting genes, generally requires several hours of testing time.
-In short, this method has the advantage of not only high detection sensitivity but also very high specificity and extremely small error, and can detect not only infectious diseases but also latent viruses that cannot be detected by immunological methods. There is a need for the development of nine polynucleotides suitable for this purpose.

（従来の技術） ポリヌクレオチドを用い、交雑法によって標的遺伝子を
検出するさいは、ポリヌクレオチド金停識化する必要が
ある。標識化は放射性同位元素を用いる方法と光標識法
に大別される。現在放射性同位元素１呻を用いる方法が
最も利用されており、特開昭５８−１７０４９６号公報
にはＡＴＰ（ｒ−”Ｐ）とキナーゼでポリヌクレオチド
の５′−末端位に１！Ｐで標識したリン酸基を導入し、
Ａｌｐから放射されるβ線でフィルムを感光させ、その
黒斑点によって標的遺伝子の存在を検出する方法が開示
されている。放射性同位元素による標識化は感度の点で
優れている反面、使用にさいし■取シ扱い上熟練が必要
■法規上の規制が厳しく、特別の施設および測定機器が
必要であり、またその限定された場所でしか取り扱えな
い■健康上の問題○使用後の廃棄の問題■半減期に合せ
て予約購入するため実験の期日がそれにより制約される
などの難点がある。(Prior Art) When detecting a target gene by a hybridization method using a polynucleotide, it is necessary to bind the polynucleotide to gold. Labeling is broadly divided into methods using radioisotopes and optical labeling methods. Currently, the method using radioactive isotope 1 is most commonly used, and JP-A-58-170496 describes labeling the 5'-end of polynucleotide with 1!P using ATP (r-''P) and kinase. Introducing a phosphoric acid group,
A method is disclosed in which a film is exposed to β rays emitted from Alp and the presence of a target gene is detected by the black spots. Although labeling with radioisotopes is superior in terms of sensitivity, it is difficult to use. ■ Requires skill in handling. Legal regulations are strict and special facilities and measurement equipment are required, and their limitations are limited. Health issues - Problems with disposal after use - Pre-purchases are made based on the half-life period, which limits the experimental dates.

これに対して放射性同位元素音用いないＣ４識化法とし
て光標識化法が提案され、特開昭５８−２３７９５号公
報および特開昭５８−４００９９号公報には化学発光、
生体発光、螢光を利用する方法が開示されている。しか
し光標識法としては、チミジンあるいはウリジンアナロ
ーブとしてそのＯ−５位にアミド結合を介してビオチン
を付した５’−０−）リホスフエートを酵素的ニックト
ランスレーションの手法で２リヌクレオチド九組み込ん
で標識化し、標的遺伝子を検出する方法（Ｐｒｏｅ、　
Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、８ｏ１．　Ｕ８Ａ　、　、第８
０巻、第４０４５頁（１９８３年）〕が実用化されてい
るのみである。In response to this, an optical labeling method has been proposed as a C4 identification method that does not use radioisotope sound, and JP-A-58-23795 and JP-A-58-40099 disclose chemiluminescence,
A method using bioluminescence and fluorescence is disclosed. However, as a photolabeling method, 5'-0-)rephosphate, which has biotin attached to its O-5 position via an amide bond, is incorporated as a thymidine or uridine analog by enzymatic nick translation. Method for labeling and detecting target genes (Proe,
Natl, Acad, 8o1. U8A, , 8th
Volume 0, page 4045 (1983)] has been put into practical use.

（発明が解決しようとする問題点） 核酸は核酸塩基、糖、リン酸の３つの構成要素から構成
され、それぞれの構成要素全光標識化することが可能で
あるが、そのさいポリヌクレオチドが標的遺伝子とハイ
ブリットする性質全損うことのないよう標識化合？ｌを
導入する必要がある。しかし、核酸塩基部全光標識化す
る場合、ピリミジン系塩基では０−５位に標識化合物１
ｆｄ：、々導入することが可能であるが、プリン系塩基
については立体化学的に空いているのは０−８位とＮ７
位であり、０−８位に標識化合物を導入すると塩基と糖
が３ｙｎ型配座をとるために−、役的には二重ら線が右
巻きである場合はハイブリット能を失い、またＮ−７位
に導入する場合は）Ｒネが四級となシ、糖と塩基部のグ
リコシド結合が切れる、いわゆる脱プリン反応が生起し
〜でずくなるためプリン系塩基を光標識化することは困
難である。従って核酸塩基部の先口脆化はピリミジン系
塩基の場合のみ有効でちり、ポリヌクレオチドの塩基配
列がプリン系塩基のみの場合は光標識化ができ難いとい
う不都合を生じる。次Ｋ、糖部を光ｍ胞化する場合、ポ
リデオキシリ−ヌクレオチドでは両末端の水ラン基しか
利用できず、４リリ７〆ヌクレオチドでは理区、）的に
は２′−位置「・戊基が利用可能であるが、この位置に
光標識化合物の如き大きさの分子を導入するとハイブリ
ット形成に彰響ヲ及はすため、ポリデオキシリボヌクレ
オチドと同様に両末端の水酸基しか利用できず検出感度
が低下する。(Problems to be Solved by the Invention) Nucleic acids are composed of three components: nucleobases, sugars, and phosphoric acids, and each component can be fully optically labeled, but in this case, it is possible to label the polynucleotide with the target. Is it a labeled compound that does not completely lose the property of hybridizing with genes? It is necessary to introduce l. However, when performing full optical labeling of the nucleic acid base, the labeling compound 1 is added to the 0-5 positions of the pyrimidine base.
It is possible to introduce fd:, etc., but for purine bases, the stereochemically vacant positions are 0-8 and N7.
When a labeling compound is introduced into the 0-8 positions, the base and the sugar adopt a 3yn conformation, so if the doublet is right-handed, the hybrid ability is lost, and the N If it is introduced at the -7 position, the Rne becomes quaternary, and the glycosidic bond between the sugar and the base part is broken, a so-called depurination reaction occurs, which makes it difficult to photolabel purine bases. Have difficulty. Therefore, the tip embrittlement of the nucleic acid base portion is effective only in the case of pyrimidine bases, and when the base sequence of the polynucleotide consists only of purine bases, it is difficult to photolabel. When converting a sugar moiety into a photomolecule, in polydeoxylynucleotides, only the water radicals at both ends can be used; Although it is possible, introducing a molecule as large as a photolabeling compound into this position will affect hybrid formation, and as with polydeoxyribonucleotides, only the hydroxyl groups at both ends can be used, reducing detection sensitivity. .

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは光標識法によシ標識化したポリヌクレオチ
ドの検出感度を向上させるため種々検討を加えた結果、
核酸構成要素のリン酸基に光標識化合物を導入すること
により、ポリヌクレオチドの任意の位置に任意の数の光
標識化合物の導入を可能とすることを見い出すと共に、
リン酸基の代わりにチオリン酸基金選択し、このチオリ
ン酸基と光標識化合物を反応させてチオリン酸基金光標
識化することにより、リン酸基金光標識化するときに生
ずる■合成法によるポリヌクレオチド合成後の脱保護工
程での標識化合物の脱離あるいはインターヌクレオチド
結合の切断Ｏリン原子がキラリティー全方することによ
る得られた光標識ポリヌクレオチドのすン原子の立体化
学の不統一、という問題も解決し、また、光標識化合物
としてチオール基と特異的に反応する共有結合性螢光標
識化合物を用いることによシ所期の目的を達成すること
を見い出し不発明を完成したものである。(Means for Solving the Problems) The present inventors have conducted various studies to improve the detection sensitivity of polynucleotides labeled by optical labeling, and have found that:
We have discovered that by introducing a photolabeling compound into the phosphate group of a nucleic acid component, it is possible to introduce any number of photolabeling compounds into any position of a polynucleotide;
By selecting a thiophosphoric acid group instead of a phosphoric acid group and reacting this thiophosphoric acid group with a photolabeling compound to photolabel the thiophosphoric acid group, a polynucleotide produced by the synthetic method is generated when photolabeling the phosphoric acid group. Problem of stereochemistry inconsistency of the Sun atom in the obtained photo-labeled polynucleotide due to removal of the labeled compound in the post-synthesis deprotection step or cleavage of the internucleotide bond O Phosphorus atom has full chirality. In addition, they discovered that the desired object could be achieved by using a covalent fluorescent labeling compound that specifically reacts with a thiol group as a photolabeling compound, and completed the invention.

（ポリヌクレオチドの螢光標識化） 本発明の、１？　ｌ）ヌクレオチドの螢光標識化は、ポ
リヌクレオシドのリン酸結合に代えてチオリン酸結合と
し、このチオリン酸結合のチオール基と特異的に反応す
る共有結合性螢光標識化合物を反応させることくよフ螢
光標識化するものである。(Fluorescent labeling of polynucleotide) 1? of the present invention? l) Fluorescent labeling of nucleotides involves replacing the phosphate bonds of polynucleosides with thiophosphate bonds and reacting with covalent fluorescent labeling compounds that specifically react with the thiol groups of the thiophosphate bonds. It is a fluorescent label.

本発明におけるチオリン酸結合を有するポリヌクレオチ
ドは有機合成的方法あるいは酵素的方法によって合成さ
れ得る。有機合成的方法では、４？リヌクレオチドの両
末端水酸基にチオリン酸基を導入するのは最も容易であ
シ、チオリン酸、チオホスホリルクロリドあるいはその
誘導体を公知の条件下に反応させればよい。しかし更に
検出感度を向上させるためには、両末端　　　；にチオ
リン酸基を導入し螢光標識化するのみでなく、インター
ヌクレオチド結合部にチオリン酸基１：導入し螢光標識
化するのが望ましい。なお、このさい得られる螢光標識
化されたポリヌクレオチドが、立体化学的に標的遺伝子
とハイブリット可能であることが必要である。有機合成
的にインターヌクレオチド結合部にチオリン酸基を導入
するには、ホスホトリエステル法（Ｔｅｔｒａｈｓｄｒ
ｏｎ　Ｌ＠ｔｔｅｒｓ　＋第１１５７頁（１９６７年）
　、Ｎｕｏｌｅｉｏ　Ａａｌｄｉ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　
、第２巻、第１頁（１９７５年）〕とホスファイト法（
ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬ＠ｔｔｅｒｓ　、第３８３５
頁（１９７８年）および第２１巻、第１１２１頁（１９
８０年）および第２３巻、第４２８９頁（１９８２年）
、日本化学会４９春季年会３Ｖ３３）が利用され得るが
、後者の方が高い収率金与える。たとえば、ヌクレオシ
ド（反応式（１）の化合物の）に亜リン酸誘導体（反応
式ＣＩ）の化合物■）を反応させて単賛体（反応式ＣＩ
）の化合物■）とし、次いで化合物のと５７−水酸基が
保護されていないヌクレオシド（反応式［１）の化合物
■）ｔ−縮合させて二怠　　　た体（反応式（１）の化
合物■）とする。　　　　　　　オこのさい３′−水酸
基の保護基であるＲ４は几１．　　れＢ２　、　Ｂｊの
保護基とは別異であル選択的に除去　　　ができる保署
基であることが望ましいが、几１の保　　　し護基と同
一の条件で除去できる保護基でもよく、　　３′ま′ｆ
ｃ場合によっては保護基を有するリン酸基で　　　化も
よい。次に化合物■で示される二量体にヨウ　　　几２
素−水で酸化する代わりに硫黄を反応させて、　　　で
インターヌクレオチド結合としてチオリン酸結　　　除
合を有する二量体（反応式（１）の化合物■）と　　　
のする。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　た
化合物■で示される二ｆｔ体のリン原子は結合　　　よ
している基が全て異なるためキラリティーを有　　　（
するようＫなシ、絶対光示法でＲ体と８体の２個のジア
ステレオマーの混合物となるが、この２個のジアステレ
オマーはシリカゲルクロマトグツフィーで分離し、立体
化学的に単一の二量体とすることができる。またＲ４が
保護基１ｊＩ：有するリン耐基の揚台はジエステルの形
に誘導しのち、液相あるいは同相法によるポリヌクレチ
ドの合成に用いられるが、化合物■で示さる二量体では
キラリティーを有するリン原子２個となシ、４個のジア
ステレオマーが生成立体異性体の分離が困難となるので
、几４は一末端水酸基が遊離の二量体（反応式ＣＩ）の
合物■）に誘導できる保護基、すなわちＢｊ。The polynucleotide having a thiophosphoric acid bond in the present invention can be synthesized by an organic synthetic method or an enzymatic method. In the organic synthetic method, 4? The easiest way to introduce thiophosphoric acid groups into both terminal hydroxyl groups of a polynucleotide is to react thiophosphoric acid, thiophosphoryl chloride, or a derivative thereof under known conditions. However, in order to further improve detection sensitivity, it is desirable not only to introduce thiophosphoric acid groups at both ends and perform fluorescent labeling, but also to introduce thiophosphoric acid groups 1: at the internucleotide binding site and perform fluorescent labeling. . In addition, it is necessary that the fluorescently labeled polynucleotide obtained at this time can stereochemically hybridize with the target gene. The phosphotriester method (Tetrahsdr.
on L@tters + page 1157 (1967)
, Nuoleio Aaldi Re5earch
, Volume 2, Page 1 (1975)] and the phosphite method (
TetrahedronL@tters, No. 3835
Page (1978) and Volume 21, Page 1121 (19
1980) and Volume 23, Page 4289 (1982)
, Chemical Society of Japan 49 Spring Annual Meeting 3V33) can be used, but the latter gives higher yields of gold. For example, by reacting a nucleoside (compound of reaction formula (1)) with a phosphorous acid derivative (compound of reaction formula CI),
), and then t-condensation of the nucleoside (compound ■ of reaction formula [1)] in which the 57-hydroxyl group of the compound is unprotected (compound ■) of reaction formula (1)) and the resulting product (compound ■ of reaction formula (1)). do. In this case, R4, which is a protecting group for the 3'-hydroxyl group, is 1. It is preferable to use a protecting group that is different from the protecting groups of B2 and Bj and can be selectively removed, but it may also be a protecting group that can be removed under the same conditions as the protecting group of 3. 'ma'f
(c) In some cases, a phosphoric acid group having a protective group may be used. Next, add iodine to the dimer represented by compound ■.
By reacting sulfur instead of oxidizing with hydrogen and water, a dimer (compound ■ of reaction formula (1)) having a thiophosphate bond and elimination as an internucleotide bond is formed.
to wear. The two-ft phosphorus atom shown in the compound ■ has chirality because all the bonding groups are different (
As a result, a mixture of two diastereomers, R-form and 8-form, is obtained by absolute photometry, but these two diastereomers are separated by silica gel chromatography and stereochemically monotonized. It can be a single dimer. In addition, the phosphorus-resistant platform in which R4 has a protecting group 1jI: is induced into a diester form and then used for the synthesis of polynucleotides by a liquid phase or in-phase method, but the dimer shown by compound ① has chirality. Since separation of the stereoisomers produced by two phosphorus atoms and four diastereomers becomes difficult, 几4 is a compound of a dimer (reaction formula CI) with one terminal hydroxyl group free. A derivatized protecting group, namely Bj.

、几８の保護基とは別異で、！１り遷択的に除去きるか
、またはＲ１の保護基と同一の条件で失できる保護基で
あることが望ましい。後者場合は３／　、　５／−両末
端水酸基ｔ−遊離のルにしのち５′−末端水酸基のみを
再保護することにシ化合物ので示される二は体とする。, which is different from the protecting group of 几8,! A protecting group that can be removed selectively or removed under the same conditions as the protecting group for R1 is desirable. In the latter case, both the 3/ and 5/-terminal hydroxyl groups are freed, and then only the 5'-terminal hydroxyl group is reprotected to form the 2-isomer of the compound.

以下余白） 反応式（Ｉ） （反応式（１）において、Ｂ′は保護基を有することも
ある塩基式基金、Ｘはノーロゲン原子または二級アミノ
基金、妃は水素原子またはモノメトキシトリチル基、ジ
メトキシトリチル基などの保護基金、几２は水素原子、
水酸基または保護基を有する水酸基を、ｐ−８は水素原
子またはメチル基、シアンエチル基、トリクロロエチル
基、トリクロロジメチルエチル基などの保護基金、ＴＬ
４は水素原子またはモノメトキシトリチル基、ジメトキ
シトリチル基、アシル基、ターシャリ−ブチル−ジメチ
ルシリル基などのＩＬ”−？Ｒ”の保護基と別異でちゃ
選択的に除去できる保護基または保護基を有するリン酸
基を示す。） ＤＮＡおよびＲＮ人はそれぞれ４種類のヌクレオシドか
らなシ、化合物ので示される１６種類の二量体を予め調
製しておくことにより、いかなる塩基配列のポリヌクレ
オチドの合成も可能である。化合物■は３′−末端水酸
基’ｔ−’Ｊン酸化または亜リン酸化したのち、固相あ
るいは液相トリエステル法で希望する塩基配列のｙｔｒ
　１７ヌクレオチド合成に用いられるが、変型ホスファ
イト法（Ｔｅｔｒａｈａｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　＋
第２４巻ｆ第ｘｏ１９Ｗ（１９８３年）〕を利用すれば
・化合物■の３７−末端水酸基を予めリン酸化または亜
リン酸化することなくポリヌクレオチドの合成に用いる
ことができる。二道体−二世体間のリン酸結合は完全脱
保護後キラリティーをもたず、従って化合物■で示され
る８体または８体いずれか一方のジアステレオマー二量
体を用いて合成、脱保護、精製されたインターヌクレオ
チド結合に部分的にチオリン酸結合を含むポリヌクレオ
チドは、立体化学的に単一である。この場合チオリン酸
結合は最大限１こおきに導入される。ただし、停的Ｋｌ
伝子とのハイブリット形成に影［−及ぼさない限シリン
原子のキラリティーは統一されていなくてもよい。また
硫黄の導入は祁１合毎でもよいし、所定の長さのポリヌ
クレオチドを合成したちと一度に行なってもよい。(Left space below) Reaction formula (I) (In reaction formula (1), B' is a basic group that may have a protecting group, X is a norogen atom or a secondary amino group, B is a hydrogen atom or a monomethoxytrityl group, Protection funds such as dimethoxytrityl group, 几2 is a hydrogen atom,
A hydroxyl group or a hydroxyl group having a protective group, p-8 is a hydrogen atom or a protection fund such as a methyl group, a cyanethyl group, a trichloroethyl group, a trichlorodimethylethyl group, TL
4 is a hydrogen atom or a protective group or a protective group that can be selectively removed if it is different from the protective group of IL"-?R" such as a monomethoxytrityl group, a dimethoxytrityl group, an acyl group, a tert-butyl-dimethylsilyl group, etc. Indicates a phosphate group with ) DNA and RN It is possible to synthesize polynucleotides of any base sequence by preparing in advance 16 types of dimers, each consisting of 4 types of nucleosides and compounds. Compound (2) is oxidized or phosphorylated with the 3'-terminal hydroxyl group 't-', and then converted to ytr of the desired base sequence using the solid-phase or liquid-phase triester method.
Although it is used for 17 nucleotide synthesis, the modified phosphite method (Tetrahadron Letters +
24, f, xo 19W (1983)], the 37-terminal hydroxyl group of compound (1) can be used for polynucleotide synthesis without prior phosphorylation or phosphorylation. The phosphate bond between the two-way form and the two-way form does not have chirality after complete deprotection, therefore, synthesis using either the 8-body or 8-body diastereomer dimer shown in compound (■), A deprotected and purified polynucleotide containing a partial thiophosphate linkage in an internucleotide linkage is stereochemically single. In this case, thiophosphoric acid bonds are introduced at most every other link. However, the temporary Kl
The chirality of the syrin atoms does not need to be uniform as long as it does not affect the hybrid formation with the gene. Further, sulfur may be introduced every time, or may be introduced once a polynucleotide of a predetermined length is synthesized.

ポリヌクレオチドに含まれるチオリン酸結合の個数は、
ポリヌクレオチドのＦｌ長、検出感度、ハイブリッド条
件等に合わせて自由に選択することができる。このほか
、ポリヌクレオチドの両末端の螢光標識化法として、一
般的にリン酸エステル類はトリエステルからジエステル
になるとそれ以上加水分解を受けにくくなること、従っ
て２リヌクレオチドをトリエステル法で合成した場合に
、最終工程の脱保護反応条件下でもリン酸ジエステルの
段階で加水分解がとどまシ、さらに反応が進んでインタ
ーヌクレオチド結合が切断するのは稀であることを利用
して式［１１のようにポリヌクレオチドの両末端リン酸
にジエステルの形で蛍光標識化合物を導入することも可
能である。The number of thiophosphate bonds contained in a polynucleotide is
It can be freely selected depending on the Fl length of the polynucleotide, detection sensitivity, hybrid conditions, etc. In addition, as a method for fluorescently labeling both ends of a polynucleotide, it is generally known that phosphoric acid esters become less susceptible to further hydrolysis when they change from triesters to diesters, so two nucleotides are synthesized using the triester method. In this case, even under the deprotection reaction conditions in the final step, hydrolysis remains at the phosphodiester stage, and it is rare for the reaction to proceed further and the internucleotide bond to be cleaved. It is also possible to introduce a fluorescent labeling compound in the form of a diester to both terminal phosphates of a polynucleotide.

（以下余白） 式ＣＤ （式（ＩＩ）において、Ｂは塩基３５１基を、Ｖは木葉
原子または水酸基を、Ｙは螢光標識化合物を、ｎは任意
の整数を示す。） また、チオリン酸結合を有する一すヌクレオチドは、式
（１）で示されるヌクレオチドーダー〇−（１−チオト
リホスフェイト）ｔ−基質として酵素法によっても合成
できる。(Space below) Formula CD (In formula (II), B represents a base 351 group, V represents a leaf atom or a hydroxyl group, Y represents a fluorescent labeling compound, and n represents an arbitrary integer.) In addition, a thiophosphoric acid bond The mononucleotide having the formula (1) can also be synthesized by an enzymatic method using the nucleotide d-(1-thiotriphosphate) t-substrate.

式〔亘〕 □ （式（Ｉ）において、Ｂおよび几蓼は前記と同一でおる
。） このヌクレオシド−５’−０−（１−チオトリホスフェ
イト）は、α位のリン原子に関して絶対表示法で孔体と
８体のジアステレオマーの混合物でもよ＜、ＤＮＡおよ
びＡＮＡポリメラーゼは混合物のうちＳ体ｔ−基質とし
て立体反転を伴って取フ込み、リン原子に関して孔体を
もつ立体化学的に単一のポリヌクレオチドを与える。Formula [Wataru] □ (In formula (I), B and 几蓼 are the same as above.) This nucleoside -5'-0-(1-thiotriphosphate) is expressed in absolute terms with respect to the phosphorus atom at the α-position. Even if it is a mixture of 8 diastereomers with a pore structure, DNA and ANA polymerases take up the S-form t-substrate from the mixture with stereoinversion, and stereochemically have a pore structure with respect to the phosphorus atom. Gives a single polynucleotide.

１人されるチオリン酸結合の数は、４種類のヌクレオシ
ドトリホスフェイトのうちどれをチオトリホスフエイ）
Ｋ置き換えるかで自由に選択できるが、４種類のヌクレ
オシド−５’−０−（１−チオトリホスフェイト）全反
応液中に加えることで、全てのリン酸結合金チオリン酸
結合に代え、しかもリン原子のキラリティーにつめて統
一されたポリヌクレオチドを得ることができる。このほ
か式（１）の基質を用いニックトランスレーションの手
法を用いてもチオリン酸階合の導入は可能であシ、また
３／　、　５／−両末端水酸基のチオリン酸化はアデノ
シン−ｓ／　＋　Ｑ　−（３−チオホスフェイト）とキ
ナーゼ、チオリン酸とりガーゼを用いてそれぞれ可能で
ある。　　実本発明で用いる螢光標識化合物は、チオリ
ン　　　　チ酪結合のチオール基と％異的な共有結合性
をも　　　オニつ螢光標識化合物であれば全て使用する
ことが　　　０．２でき、ダンシルアシリジン、５−ヨ
ードアセト　　　ムパアミドフルオレセイン、１−プロ
モノマイマン、応す。The number of thiophosphate bonds per person is determined by which of the four nucleoside triphosphates (thiotriphosphate)
You can freely choose whether to replace K or not, but by adding four types of nucleoside-5'-0-(1-thiotriphosphate) to the entire reaction solution, you can replace all phosphate bonds with gold thiophosphate bonds, and It is possible to obtain unified polynucleotides by focusing on the chirality of atoms. In addition, it is also possible to introduce a thiophosphoric acid chain using the nick translation method using the substrate of formula (1), and the thiophosphorylation of both 3/ and 5/-terminal hydroxyl groups can be performed using adenosine-s/ + This is possible using Q-(3-thiophosphate), a kinase, and a thiophosphate gauze. In fact, any fluorescent labeling compound used in the present invention can be used as long as it has a covalent bonding property that is 0.2% different from the thiol group of the thiolysylbutylene bond. , 5-iodoacetamide fluorescein, 1-promonomyman, corresponding.

Ｎ−［ｐ−（２−ベンズイミダゾリル）フェニ　　　Ｈ
Ｐル〕マレイミド、Ｎ−（３−ピレン）マレイミ　　　
濃度シトなどが例示されるがこれらに限定されるもの　
　　クシではない。　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　の螢：チオリン酸結合のチオール基と共有結合性
螢　　実施例光標識化合物の反応はきわめて容易に進行
し、　　　　コ。N-[p-(2-benzimidazolyl)pheny H
Pru] maleimide, N-(3-pyrene) maleimide
Examples include, but are not limited to, densities.
Not Khushi.
Firefly: thiol group of thiophosphoric acid bond and covalently bonded firefly Example The reaction of the photolabeled compound proceeds extremely easily.

両者を混合することで反応は瞬時に終了し螢光　　　以
下。By mixing the two, the reaction ends instantly and no more than fluorescence occurs.

標識化は完了する。　　　　　　　　　　　　　　　ｍ
りを。Labeling is complete. m
Riwo.

なお、本発明における。ｔｒ　＋７ヌクレオチドとは、
　　臭化ｊ少なくとも１個のチオリン酸結合を有する２
個　　　し、（以上の単量体よシ成）、ポリヌクレオチ
ドの鎖　　　ロフ。Note that in the present invention. What is tr +7 nucleotide?
Bromide j2 with at least one thiophosphoric acid bond
(composed of more than one monomer), a chain of polynucleotides.

長やその塩基配列は限定されることなく、目的　　　キ
シコミジル（３／、ダ）−チミジルーホスホロチート３
μｍｏｌ　ｔ−０，５ゴの水に溶解し、これに５１１Ｌ
ｌのアセトニトリルに溶解したモノブロイマン４．４μ
ｍｏｌを加え、室温で１時間反ぜる。反応液を濃縮した
のち、逆相（ｅｒａ　）Ｉ、　Ｏに添加し、水−アセト
ニトリルの直線勾配をかけて溶出させ、目的物を含むフ
ラツタを３９５　ｎｍの光で励起し、４７０　ｎｍｙＣ
を測定した。The length and base sequence are not limited, and the purpose is
Dissolve in μmol t-0.5g of water and add 511L
4.4μ of monobroiman dissolved in l of acetonitrile
Add mol and stir at room temperature for 1 hour. After concentrating the reaction solution, it was added to reversed phase (era) I, O, eluted with a linear gradient of water-acetonitrile, and the flutter containing the target product was excited with 395 nm light and incubated at 470 nmC.
was measured.

ハクｒＪ１ｔ−介してチミジンを担持（３０μｍｏｌ／
トシリカゲル）したシリカゲル３３０、■ニトロメタン
ーメタノールに溶解した■鉛で処理して５′−水酸基の
保設基をはずＤニトロメタン、メタノール、テトラヒト
ジンで洗浄したのち、■約２０当量のメト「トスホロジ
テトラゾリドの０．３　ｍテトラヒに関し８体の立体配
置金もつ約５当量の５−ジメトキシトリチルチミジル（
３／　、　ｓ／　）−チミジル−〇−メトキシホスホロ
チオエートを少量のテトラヒドロフランに溶解して加え
て５分間反応させる。■ナト２ヒドロフラン：水：ルチ
ジン（２：２：１）で洗浄し、■ヨウ素の０．１ｍテト
ラヒドロ７ラン：水：ルチジン（２ｊ１１）溶液金加え
１分間酸化したのち、［相］アセトニトリル、テトラヒ
ドロフランで洗浄する。■ジメチルアミノピリジンの０
．１ｍｍテラヒドロフラン溶液および無水酢酸：ルチジ
ン（１：２Ｖ／Ｖ　）　１加えて未反応の５′−水醪基
を保護したのち、■メタノール、ニトロメタンで洗浄す
る。Thymidine supported via Haku rJ1t (30 μmol/
After removing the 5'-hydroxyl retaining group by treating with lead dissolved in nitromethane-methanol and washing with nitromethane, methanol, and tetrahydrodine, approximately 20 equivalents of methacrylate Approximately 5 equivalents of 5-dimethoxytrityl thymidyl (
3/, s/)-thymidyl-〇-methoxyphosphorothioate was dissolved in a small amount of tetrahydrofuran, added, and reacted for 5 minutes. ■Wash with nato2hydrofuran:water:lutidine (2:2:1), ■Iodine 0.1m tetrahydrofuran:water:lutidine (2j11) solution, add gold and oxidize for 1 minute, [phase] acetonitrile, tetrahydrofuran. Wash with ■Dimethylaminopyridine 0
．． A 1 mm solution of terahydrofuran and acetic anhydride:lutidine (1:2 V/V) were added to protect unreacted 5'-water groups, and then washed with methanol and nitromethane.

次いで、■から■までの操作を７回縁シ返して１５量体
を合成した。これをジオキサン中でトリエチルアミンお
よびチオフェールで処理してメトキシ基金除去し、次に
アンモニアで処理してシリカゲルからはずした１５量体
を、セファデックスＧ−５０カラム（０，１ｍＴＥＡＢ
）、逆相シリカゲルカラム（０，１ｍＴＥＡＡ−アセト
ニ）　＋フル直線濃度勾配）で積りし、８０％酢酸で処
理してジメトキシトリチル基１ｆ：除去したのち、再び
逆相シリカゲルカラムでｍＷして、リン原子の立体配置
が８体であり、１つおきにチオリン酸結合である１５飛
体１０１００Ｄ（２６０ｎを得た。　この１５量体をｏ
、　ｉ　ｍｌの水に溶解し、１０−′ｍｏｌ／−のＮ−
（：ｐ−（２−ベンズイミダゾリル）フェニルコマレイ
ミドのアセトン溶液０．０１　ｍｌ、　０．４　ｍｏｌ
リン酸緩衝液（ｐｍ６．８５）０．５ｄｔ″加え、ＯＣ
で１時間反応したのち、水を加えて全量を２．５−とし
、３２０　ｎｍの光で励起し、３６０　ｎｍの螢光を測
定した。Next, the operations from ■ to ■ were repeated seven times to synthesize a 15-mer. This was treated with triethylamine and thiophel in dioxane to remove the methoxy group, and then treated with ammonia to remove the 15-mer from the silica gel.
), loaded on a reversed-phase silica gel column (0.1 mTEAA-acetonium + full linear concentration gradient), treated with 80% acetic acid to remove the dimethoxytrityl group 1f, and then applied to the reversed-phase silica gel column again at mW to remove phosphorus. The steric configuration of atoms is 8 bodies, and every other one is a thiophosphoric acid bond, 15 bodies 10100D (260n was obtained. This 15mer is o
, dissolved in i ml of water and containing 10-'mol/- of N-
(: Acetone solution of p-(2-benzimidazolyl)phenylcomaleimide 0.01 ml, 0.4 mol
Add 0.5 dt'' of phosphate buffer (pm6.85), OC
After reacting for 1 hour, water was added to make the total amount 2.5-, excited with 320 nm light, and fluorescence at 360 nm was measured.

手彰２ネ「口正書 昭和５９年１０月３１日 １、　８件の表示 昭和５９年特許願第１６５３６１号 ２、　発明の名称 ポリデオキシリボヌクレオチドまたは ポリリボヌクレオチドの螢光標識化法 ３、補正をする者 °１（叶との関係　　特許出願人 東京都中央区京橋二丁目１７番４号 、ｈ機合成薬品工業株式会社 代表者　王　重　雅　雄 ４、代理人 ５゜　補正の対象 ６、　補正の内容 （１）明Ｐ４書第７頁８行目の「ヌクレオシド」をｒヌ
クレオチド」と補正する。Handsho 2 Ne, "October 31, 1980 1, 8 indications 1982 Patent Application No. 165361 2, Name of the invention Method for fluorescent labeling of polydeoxyribonucleotides or polyribonucleotides 3, Amendment 1 (Relationship with Kano Patent applicant 2-17-4 Kyobashi, Chuo-ku, Tokyo, H Kisei Yakuhin Kogyo Co., Ltd. Representative Masao Wang 4, Agent 5 Subject of amendment 6, Amendment Contents (1) "Nucleoside" on page 7, line 8 of Mei P4 is corrected to "r nucleotide."

（２）　　同書第２０頁５行［／）　ｒｔｏｏｒ）Ｊ　
を［ｉ’１ＯＯＤｊと補正する。(2) Same book, page 20, line 5 [/) rtoor)J
is corrected to [i'1OODj.

以上that's all

Claims (1)

【特許請求の範囲】[Claims] １、リン酸結合の少なくとも１個以上がチオリン酸結合
であるポリデオキシリボヌクレオチドまたはポリリボヌ
クレオチドのチオリン酸結合のチオール基に共有結合性
螢光標識化合物を反応させることを特徴とするポリデオ
キシリボヌクレオチドまたはポリリボヌクレオチドの螢
光標識化法。1. A polydeoxyribonucleotide or a polydeoxyribonucleotide in which at least one of the phosphate bonds is a thiophosphate bond, or a polydeoxyribonucleotide characterized by reacting a covalent fluorescent labeling compound with a thiol group of the thiophosphate bond of the polyribonucleotide. Fluorescent labeling method for polyribonucleotides.