JPS6140789A - 新規制限酵素及びその製造方法 - Google Patents
新規制限酵素及びその製造方法Info
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- JPS6140789A JPS6140789A JP16160984A JP16160984A JPS6140789A JP S6140789 A JPS6140789 A JP S6140789A JP 16160984 A JP16160984 A JP 16160984A JP 16160984 A JP16160984 A JP 16160984A JP S6140789 A JPS6140789 A JP S6140789A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- restriction enzyme
- dna
- spli
- spirulina
- enzyme
- Prior art date
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- Granted
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
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- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規な制限酵素SpQ I及びその製造法に関
するものである。
するものである。
一般に、制限酵素は2本鎖デオキシリボ核酸(以下、r
DNAJと略称する)中のある特定の数個の塩基配列を
認識してDNA鎖を切断するDNA分解酵素である。こ
の酵素はその酵素活性により長いDNA分子の特定部位
を切断出来、それによって得られるDNA断片の分離、
塩基配列の決定等のDNAの溝造と機能の解析に有用で
ある。
DNAJと略称する)中のある特定の数個の塩基配列を
認識してDNA鎖を切断するDNA分解酵素である。こ
の酵素はその酵素活性により長いDNA分子の特定部位
を切断出来、それによって得られるDNA断片の分離、
塩基配列の決定等のDNAの溝造と機能の解析に有用で
ある。
さらに今後きわめて重要な産業的意義を持つ遺伝子工学
のための試薬として不可欠のものである。
のための試薬として不可欠のものである。
本発明者らは、このように実用性に富む重要な生化学試
薬としての制限酵素を、いまだ検束が不一十分であった
藻類について研究を行ったところ、スピルリナ属に屈す
る藻類がDNAを特異的に切断する従来未知の制限酵素
SpρIを生産していることを見い出し本発明を完成す
るに至った。
薬としての制限酵素を、いまだ検束が不一十分であった
藻類について研究を行ったところ、スピルリナ属に屈す
る藻類がDNAを特異的に切断する従来未知の制限酵素
SpρIを生産していることを見い出し本発明を完成す
るに至った。
すなわち、本発明は新規制限酵素spa I及びその製
造方法−に関するものである。
造方法−に関するものである。
本発明の制限酵素5p121の切断部位の決定にはφX
174 RF DNA (全酒造製品)を本酵素及び
性質の良く知られた制限酵素で二重消化する方法により
φX 174 RF DNA上の切断点を求めた。その
結果。
174 RF DNA (全酒造製品)を本酵素及び
性質の良く知られた制限酵素で二重消化する方法により
φX 174 RF DNA上の切断点を求めた。その
結果。
Pst I切断点を0番とする番地付けで、430±2
0番と2810±20番に本酵素の切断点があると結論
された。同様の実験をλDNAについても行ったところ
、19,000±500番に本酵素の切断点があった6
以上のデータ及びpBR322とpAO3−を切断しな
いこと、さらにC,Fuchsらのコンピュータによる
検束法(Gene第10巻、357〜370頁、198
0年)より本酵素の認識するDNA上のヌクレオチド配
列はCGTACGであると結論された。さらに本酵素の
切断点認識部位はφX 174 RF DNAを本酵素
で切断したのち得られる2本のフラグメントの末端の塩
基配列をマキサムとギルバートの方法(Proc。
0番と2810±20番に本酵素の切断点があると結論
された。同様の実験をλDNAについても行ったところ
、19,000±500番に本酵素の切断点があった6
以上のデータ及びpBR322とpAO3−を切断しな
いこと、さらにC,Fuchsらのコンピュータによる
検束法(Gene第10巻、357〜370頁、198
0年)より本酵素の認識するDNA上のヌクレオチド配
列はCGTACGであると結論された。さらに本酵素の
切断点認識部位はφX 174 RF DNAを本酵素
で切断したのち得られる2本のフラグメントの末端の塩
基配列をマキサムとギルバートの方法(Proc。
Natl、 Acat、 Sci、 USA、第74巻
、第560頁、1977年)により決定した。
、第560頁、1977年)により決定した。
詳細は以下の通りである。
すなわち、φX 174 RF DNA(全酒造製品)
を本酵素で完全に分解する。これをアルカリ性ホスファ
ターゼ(シグマ社製)で処理して、DNAフラグメント
の末端のリン酸を取り除く。その後、ポリヌクレオチド
キナーゼ(全酒造製 )と〔γ−32p〕アデノシン三
リン酸を用いて、DNAフラグメントの5′末端に放射
性リン酸を付加する。この状態ではDNAの両末端に2
2Pリン酸が付加しているので、一端のみ32Pで標識
されたフラグメントを得るためにTth H88I (
全酒造製品)により切断し、5%アクリルアミドゲル電
気泳動により分離する。この時、4本の標識されたバン
ドが検出されるが65bpと250bpの長さをもつバ
ンドを各々抽出し、その5′末端付近を、前記のマキサ
ムとギルバートの方法により分析した。その結果、切断
点付近の配列は、以下のようであることが明らかとなっ
た。
を本酵素で完全に分解する。これをアルカリ性ホスファ
ターゼ(シグマ社製)で処理して、DNAフラグメント
の末端のリン酸を取り除く。その後、ポリヌクレオチド
キナーゼ(全酒造製 )と〔γ−32p〕アデノシン三
リン酸を用いて、DNAフラグメントの5′末端に放射
性リン酸を付加する。この状態ではDNAの両末端に2
2Pリン酸が付加しているので、一端のみ32Pで標識
されたフラグメントを得るためにTth H88I (
全酒造製品)により切断し、5%アクリルアミドゲル電
気泳動により分離する。この時、4本の標識されたバン
ドが検出されるが65bpと250bpの長さをもつバ
ンドを各々抽出し、その5′末端付近を、前記のマキサ
ムとギルバートの方法により分析した。その結果、切断
点付近の配列は、以下のようであることが明らかとなっ
た。
一5’−GTACGTTTCCA−
−GCATG−5’□
ると結論できる。また、ここで調べた切断点はφX 1
74 RF DNA 414番にあり、切断部位の決定
で述べた430±20番という結果とよく一致する。
74 RF DNA 414番にあり、切断部位の決定
で述べた430±20番という結果とよく一致する。
以上より、本酵素の切断点認識部位は。
↓
5’−CGTACG−3’
3’−〇CATGC−5’
↑
であり、切断点は矢印の場所であると結論された。
本酵素はSm1thとNathansの命名法(J、
Mol。
Mol。
Biol、第81巻、419〜423頁、1973年)
に従い5pffi■と命名された。
に従い5pffi■と命名された。
制限酵素Spρ■は5基質特異性の点でヌクレイツク・
アシッズ・リサーチ(Nucleic Ac1dsRe
search、第12巻、y167頁、1984年)記
載のロバーッ(Richard J、 Roberts
)の制限酵素の表にも記載なく新規な制限酵素と認めら
れるものであり、次の様な特性を持っている。
アシッズ・リサーチ(Nucleic Ac1dsRe
search、第12巻、y167頁、1984年)記
載のロバーッ(Richard J、 Roberts
)の制限酵素の表にも記載なく新規な制限酵素と認めら
れるものであり、次の様な特性を持っている。
(1)基質特異性
この酵素による種々の基質DNAの切断個所の数は第1
表のとおりである。
表のとおりである。
第1表
λDNA l
Co11 El 2
p138322 0
φX174RF 2
↓
5’−CGTACG−3’
3’−〇CATGC−5’
↑
を認識し、矢印で示したC−0間のホスポジエステル結
合を切断し、5′末端に4塩基の長さの1本鎖を持つD
NAを生成する。
合を切断し、5′末端に4塩基の長さの1本鎖を持つD
NAを生成する。
(2)至適、)II : ;1.o〜7.5(3)至J
温度:37℃付近 (4) NthCL2fjit)Jlf: : 0〜2
00+nMで活性を有する。
温度:37℃付近 (4) NthCL2fjit)Jlf: : 0〜2
00+nMで活性を有する。
(5)活性化:5〜20mM Mg”で活性化されるが
、A T P’l’、 S−アデノシルメチオニンのよ
うなコーファクターを必要としない。
、A T P’l’、 S−アデノシルメチオニンのよ
うなコーファクターを必要としない。
上述のような制限酵素spg Iを生産する藻株として
はスピルリナ属に属するスピルリナ・プラテンシス(S
pirulina platensis) M−185
、スピルリナ・マキシマ(Spirulina max
ima) UTEX LB−2342の公領株。及び本
発明者らが独自にエチオピアの塩湖より分離したスピル
リナ・プラテンシス・サブスピーシス・サイアミーゼ(
Spirulina platensissubsp、
siamess)をあげることができる、スピルリナ・
プラテンシスト185は東京大学応用微生物研究所に微
細藻類系統保存株として保存されている公知株であり、
スピルリナ・マキシマUTEX LB−2342はテキ
サス大学の藻類保存施設(丁ha cultureCo
llection of Algae at The
University ofTexas at Au5
tin)で保存されている公知株である。
はスピルリナ属に属するスピルリナ・プラテンシス(S
pirulina platensis) M−185
、スピルリナ・マキシマ(Spirulina max
ima) UTEX LB−2342の公領株。及び本
発明者らが独自にエチオピアの塩湖より分離したスピル
リナ・プラテンシス・サブスピーシス・サイアミーゼ(
Spirulina platensissubsp、
siamess)をあげることができる、スピルリナ・
プラテンシスト185は東京大学応用微生物研究所に微
細藻類系統保存株として保存されている公知株であり、
スピルリナ・マキシマUTEX LB−2342はテキ
サス大学の藻類保存施設(丁ha cultureCo
llection of Algae at The
University ofTexas at Au5
tin)で保存されている公知株である。
スピルリナの培養は周知の培養法に従い行うことができ
る。培地の主成分として1重炭酸ソーダを含むものを用
い、培養中培地を、PH8〜9.5に保持することが好
ましい。
る。培地の主成分として1重炭酸ソーダを含むものを用
い、培養中培地を、PH8〜9.5に保持することが好
ましい。
培養終了後は、培養液を濾過し、濾紙及び濾布上に藻体
を収穫する。酵素の抽出・精製は常法に従って行えばよ
く、得られた藻体を緩衝液に懸濁し超音波破砕した後、
遠心分離などの方法で抽出液を得る。この抽出液をスト
レプトマイシン硫酸塩またはポリエチレンイミンで処理
し、更に硫酸アンモニウムで分画した後、ホスホセルロ
ースなどを用いるイオン交換クロマト法、ヘパリンアガ
ロース、DNA−セルロースなどを用いるアフィニティ
ークロマト法、又はこれらの方法の組合せにより精製し
て得られる= このように本発明は、培養並びに酵素抽出が容易である
スピルリナを用いて新規な制限酵素を提供することに成
功したもので、制限酵素を必要とする生化学研究及び各
種産業に貢献するところ大なものである。
を収穫する。酵素の抽出・精製は常法に従って行えばよ
く、得られた藻体を緩衝液に懸濁し超音波破砕した後、
遠心分離などの方法で抽出液を得る。この抽出液をスト
レプトマイシン硫酸塩またはポリエチレンイミンで処理
し、更に硫酸アンモニウムで分画した後、ホスホセルロ
ースなどを用いるイオン交換クロマト法、ヘパリンアガ
ロース、DNA−セルロースなどを用いるアフィニティ
ークロマト法、又はこれらの方法の組合せにより精製し
て得られる= このように本発明は、培養並びに酵素抽出が容易である
スピルリナを用いて新規な制限酵素を提供することに成
功したもので、制限酵素を必要とする生化学研究及び各
種産業に貢献するところ大なものである。
尚、これらspg Iを生産するスピルリナには5pf
fi夏 の他に5pjl II 、 spxmと命名し
た2種の制限酵素の存在が確認された。 5pQnは
サーマス・サーモフィラス(Thermus thar
mophilus)ストレイン111の生産するTth
lllIのアイソシゾマーであり、Spffimはフェ
モフィラス・エジプテイウス()Iaemophilu
s aegyptius) A’TCC−11116の
生産するHae mのアイソシゾマーであった。
fi夏 の他に5pjl II 、 spxmと命名し
た2種の制限酵素の存在が確認された。 5pQnは
サーマス・サーモフィラス(Thermus thar
mophilus)ストレイン111の生産するTth
lllIのアイソシゾマーであり、Spffimはフェ
モフィラス・エジプテイウス()Iaemophilu
s aegyptius) A’TCC−11116の
生産するHae mのアイソシゾマーであった。
以下、実施例を示して本発明の詳細な説明する。
実施例1
スピルリナ・プラテンシスト185を第2表に示したS
OT培地に○D 560nmで0.1となるよう1.5
であった。この培養液5(Mlを500メツシユの濾布
により濾過して湿重量で約100gの藻体を収穫した。
OT培地に○D 560nmで0.1となるよう1.5
であった。この培養液5(Mlを500メツシユの濾布
により濾過して湿重量で約100gの藻体を収穫した。
第2表 SOT培地の組成
NaHCO316,8g/l
K2HPO40,5g/l1
NaNO32,5g/R
K2S0. 1.0 gif
tNaCl 7.Og/n
恥S04・71120 0.2
gIQCaC12’71120
0.04 gIQFcS(14・71120
0.01 gIQIEDTA
0.08 giftAl、
溶液 1 d/QA5溶液 11300コ
2.85 g/gMnC12・
41120 1.81 g/R
。
tNaCl 7.Og/n
恥S04・71120 0.2
gIQCaC12’71120
0.04 gIQFcS(14・71120
0.01 gIQIEDTA
0.08 giftAl、
溶液 1 d/QA5溶液 11300コ
2.85 g/gMnC12・
41120 1.81 g/R
。
ZnSO4・7H200,22g/42CuSO4・5
1120 0.08 g/IMO
O:1 0.015g/
llまた制限酵素spa I活性は、基質DNAとして
Cot Elを1/IZIE含む反応液(10+++M
hリス塩酸。
1120 0.08 g/IMO
O:1 0.015g/
llまた制限酵素spa I活性は、基質DNAとして
Cot Elを1/IZIE含む反応液(10+++M
hリス塩酸。
10mM MgCl2.7+uM 2−メルカプトエタ
ノール、50mM NI+C1,pH7,5)に酵素を
加えて50μ2とし、37℃、1時間反応させた後、反
応生成物をアガロース電気泳動法で分析した。上記反応
条件で1μgのDNAを完全分解する酵素活性を1単位
とした。
ノール、50mM NI+C1,pH7,5)に酵素を
加えて50μ2とし、37℃、1時間反応させた後、反
応生成物をアガロース電気泳動法で分析した。上記反応
条件で1μgのDNAを完全分解する酵素活性を1単位
とした。
収穫した湿菌体100gを3倍量のMi漣液A(10腸
阿リン酸功リウム緩衝液pH7,4,7鱈2−メルカプ
トエタノ、−ル、4mM EDTA)に懸濁し、超音波
破砕機により菌体を破砕した後、 10,000Xg、
1時間の遠心分離により残渣を除去し、抽出液を得た。
阿リン酸功リウム緩衝液pH7,4,7鱈2−メルカプ
トエタノ、−ル、4mM EDTA)に懸濁し、超音波
破砕機により菌体を破砕した後、 10,000Xg、
1時間の遠心分離により残渣を除去し、抽出液を得た。
この抽出液に最終濃度2%になるようにストレプトマイ
シン硫酸塩水溶液(5〜10%)を加え、30分間攪拌
後15,000Xg、 20分間の遠心を行い、核酸を
除き上清を得る。この上清に硫酸アンモニウムを70%
飽和になるように添加し、生じた沈殿を遠心分!(15
,000Xg、20分1’1ll) ニテ集メタ、:1
7)沈殿を緩衝液B (10+oM トリス塩酸緩衝液
PH7,3゜7mM 2−メルカプトエタノール、
1a+M EDTA、10%(v/v)グリセロール)
に溶解し、同a衝液に対し一夜透析した。あらかじめ緩
衝液Bで平衡化したDEAE−セルロース(ワットマン
DE 52)のカラム(2,5x30 cm)に、透析
内液を吸着させ、緩衝液Bで洗浄後、0〜0.5mM塩
化ナトリウムのり、υD〜U、t M [(じアトリワ
ム源反の画分に粘性が見い出さ4bたに の両分をBWu液C(10%グリセロールを含む緩衝液
A)に−夜透析後、あらかじめ緩衝液Cで平衡化したs
p−セファデックス(ファルマシア)のカラム(3,O
X30cm)に吸着させ、緩衝液Cで洗トリウム濃度の
両分に活性が見い出された。この活性画分を再度、緩衝
液Bに一夜透析し、あらかじめ平衝化したDEAE−セ
ルロースのカラム(1,2X15c+u)に吸着させ、
緩衝液Bで洗浄後0〜0.5M塩化ナトリウムの直線的
濃度勾配を持つ緩衝液13で溶出させると0.05〜0
.2H塩化ナトリウム濃度の両分に制限酵素5p121
の活性が認められ、活性画分(約5千単位)を得た。
シン硫酸塩水溶液(5〜10%)を加え、30分間攪拌
後15,000Xg、 20分間の遠心を行い、核酸を
除き上清を得る。この上清に硫酸アンモニウムを70%
飽和になるように添加し、生じた沈殿を遠心分!(15
,000Xg、20分1’1ll) ニテ集メタ、:1
7)沈殿を緩衝液B (10+oM トリス塩酸緩衝液
PH7,3゜7mM 2−メルカプトエタノール、
1a+M EDTA、10%(v/v)グリセロール)
に溶解し、同a衝液に対し一夜透析した。あらかじめ緩
衝液Bで平衡化したDEAE−セルロース(ワットマン
DE 52)のカラム(2,5x30 cm)に、透析
内液を吸着させ、緩衝液Bで洗浄後、0〜0.5mM塩
化ナトリウムのり、υD〜U、t M [(じアトリワ
ム源反の画分に粘性が見い出さ4bたに の両分をBWu液C(10%グリセロールを含む緩衝液
A)に−夜透析後、あらかじめ緩衝液Cで平衡化したs
p−セファデックス(ファルマシア)のカラム(3,O
X30cm)に吸着させ、緩衝液Cで洗トリウム濃度の
両分に活性が見い出された。この活性画分を再度、緩衝
液Bに一夜透析し、あらかじめ平衝化したDEAE−セ
ルロースのカラム(1,2X15c+u)に吸着させ、
緩衝液Bで洗浄後0〜0.5M塩化ナトリウムの直線的
濃度勾配を持つ緩衝液13で溶出させると0.05〜0
.2H塩化ナトリウム濃度の両分に制限酵素5p121
の活性が認められ、活性画分(約5千単位)を得た。
実施例2
実施例1と同様の方法でスピルリナ・マキシマLITE
X Lll−2342を培養し約110gの湿菌体を得
た。
X Lll−2342を培養し約110gの湿菌体を得
た。
制限酵素の精製も実施例1と同様の方法で行ったところ
5pIlIの活性が認められ約8千単位を得た。
5pIlIの活性が認められ約8千単位を得た。
手続補正書
昭和60年6月10日
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、次の理化学的性質を有する新規制限酵素SplI。 (イ)2本鎖デオキシリボ核酸中の塩基配列【塩基酸配
列があります】 を認識し且つこれを矢印で示したC−G間のホスホジエ
ステル結合を切断し、5′末端に4塩基の長さの1本鎖
を持つDNA断片を生成する。 (ロ)2本鎖デオキシリボ核酸λ−DNAを1ケ所、C
olE1を2ケ所、φX174RFを2ケ所切断する。 (ハ)5〜20mM Mg^2^+で活性化される。 (ニ)NaCl濃度0〜200mMで活性を有する。 2、制限酵素SplI生産能を量するスピルリナ属に属
する藻類を培養し、得られた藻体の抽出液から制限酵素
SplIを採取することを特徴とする新規制限酵素Sp
lIの製造方法。
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP16160984A JPS6140789A (ja) | 1984-08-02 | 1984-08-02 | 新規制限酵素及びその製造方法 |
GB08518457A GB2162852B (en) | 1984-08-02 | 1985-07-22 | Restriction endonuclease |
US06/758,536 US4886756A (en) | 1984-08-02 | 1985-07-24 | Novel restriction endonuclease SplI and process for the production of the same |
DE19853527682 DE3527682A1 (de) | 1984-08-02 | 1985-08-01 | Neue restriktions-endonuklease spli sowie verfahren zu deren herstellung |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP16160984A JPS6140789A (ja) | 1984-08-02 | 1984-08-02 | 新規制限酵素及びその製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6140789A true JPS6140789A (ja) | 1986-02-27 |
JPS6348516B2 JPS6348516B2 (ja) | 1988-09-29 |
Family
ID=15738410
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP16160984A Granted JPS6140789A (ja) | 1984-08-02 | 1984-08-02 | 新規制限酵素及びその製造方法 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4886756A (ja) |
JP (1) | JPS6140789A (ja) |
DE (1) | DE3527682A1 (ja) |
GB (1) | GB2162852B (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6150799U (ja) * | 1984-09-01 | 1986-04-05 |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5165933A (en) * | 1989-02-10 | 1992-11-24 | Kabushikikaisha Kibun | Restriction enzyme inhibitor |
JP4181638B2 (ja) | 1996-12-09 | 2008-11-19 | バイオバイト オーストラリア プロプライエタリー リミテッド | 生物学的制御方法 |
EA017602B1 (ru) * | 2010-03-29 | 2013-01-30 | Ооо "Альфа Технолоджис" | Штамм arthrospira maxima buta для получения биомассы |
-
1984
- 1984-08-02 JP JP16160984A patent/JPS6140789A/ja active Granted
-
1985
- 1985-07-22 GB GB08518457A patent/GB2162852B/en not_active Expired
- 1985-07-24 US US06/758,536 patent/US4886756A/en not_active Expired - Fee Related
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